JPH11510368A

JPH11510368A - ヒトケモカインβ−１３

Info

Publication number: JPH11510368A
Application number: JP9-500382A
Authority: JP
Inventors: リ，ハオドン; セイベル，ジョージ
Original assignee: ヒューマンジノームサイエンシーズ，インコーポレイテッド; スミスクラインビーチャムコーポレイション
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 1999-09-14

Abstract

(57)【要約】ヒトケモカインポリペプチド、およびこのようなケモカインポリペプチドをコードするDNA(RNA)、ならびに組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生する手順を開示する。また、このようなケモカインポリペプチドを、白血病、腫瘍、慢性感染症、自己免疫疾患、線維症性疾患、創傷治癒、および乾癬の処置のために利用する方法を開示する。このようなケモカインポリペプチドに対するアンタゴニスト、および慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、ならびに慢性および急性炎症、および感染性疾患、アレルギー反応、プロスタグランジン非依存性発熱、および骨髄不全を処置するための治療剤としてのそれらの使用をまた、開示する。また、核酸配列の変異、およびポリペプチドの濃度の変化に関連する疾患を検出するための診断アッセイを開示する。また、ケモカインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおける変異を検出するため、および宿主中のポリペプチドのレベルの変化を検出するための診断アッセイを、開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトケモカインβ−１３本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトケモカインポリペプチドとして推定的に同定され、本明細書以下では時にはヒトケモカインβ-13(Ckβ-13)という。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。ケモカインは、また、インタークラインサイトカインといわれ、構造的および機能的に関連するサイトカインのサブファミリーである。これらの分子は、８〜 10kdの大きさである。一般に、ケモカインは、アミノ酸レベルで20％〜75％の相同性を示し、そして２つのジスルフィド結合を形成する４つの保存されたシステイン残基によって特徴づけられる。最初の２つのシステイン残基の配列に基づいて、ケモカインは２つのサブファミリー、αおよびβに分類される。αサブファミリーにおいては、最初の２つのシステインは１つのアミノ酸によって分離され、それゆえ「C-X-C」サブファミリーといわれる。βサブファミリーにおいては、２つのシステインは隣接した位置にあり、それゆえ、「C-C」サブファミリーといわれる。従って、少なくとこのファミリーの９つの異なるメンバーが、ヒトにおいて同定されている。インタークラインサイトカインは、広範な種類の機能を示す。顕著な特性は、異なる細胞型(単球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球、および線維芽細胞を含む) の走化性遊走を誘発する能力である。多くのケモカインは、前炎症性活性を有し、そして炎症反応の間の多くの段階に含まれる。これらの活性として、ヒスタミン放出の刺激、リソソームの酵素およびロイコトリエンの放出、標的免疫細胞の内皮細胞への接着の増強、補体タンパク質の結合の増強、顆粒球接着分子および補体レセプターの発現の誘導、およびレスピラトリーバーストが挙げられる。炎症におけるそれらの状況に加えて、特定のケモカインは他の活性を示すことが示されている。例えば、マクロファージ炎症性タンパク質１(MIP-1)は、造血幹細胞の増殖を抑制し得、血小板因子-４(PF-4)は内皮細胞増殖の強力なインヒビターであり、インターロイキン-８(IL-8)はケラチノサイトの増殖を促進し、そしてG ROはメラノーマ細胞についてのオートクライン成長因子である。多様な生物学的活性に照らせば、ケモカインが多くの生理学的条件および疾患条件(リンパ球の走行、創傷治癒、造血調節、ならびにアレルギー、喘息、および関節炎のような免疫学的傷害を含む)において密接に関係している事は、驚くべき事ではない。「C-C」分岐のメンバーは以下の細胞においてそれらの効果を発揮する：寄生虫を破壊して寄生虫性感染を減少させ、そして呼吸器系の気道における慢性炎症の原因となる好酸球；脊椎動物における腫瘍の形成を抑制する単球およびマクロファージ；Ｔ細胞を誘引するＴリンパ球、およびアレルギー性炎症において役割を果たすヒスタミンを放出する好塩基球。 C-C分岐のメンバーが単核の細胞で優勢に作用し、そしてC-X-C分岐のメンバーが好中球で優勢に作用する一方で、異なる化学誘因特性は、この指標に基づくケモカインに対して指定され得ない。１つのファミリー由来のいくつかのケモカインは、他方の特徴を示す。本発明のポリペプチドは、保存されたシステイン「C-C」領域を有し、そして公知のケモカインと相同なアミノ酸配列を有する。本発明の１つの局面によれば、新規のポリペプチドならびに生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体が提供される。本発明の別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、核酸分子は、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、ならびに生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、それらのアナログおよび誘導体を含む。本発明の別の局面によれば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸分子を含む、核酸プローブが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、前記タンパク質の発現およびその後の前記タンパク質の回収を促進する条件下で、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換え原核宿主細胞および/または組換え真核宿主細胞を培養する工程を包含する組換え技術により、このようなポリペプチドを産生するための工程が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、例えば、固形腫瘍、慢性感染症、白血病、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患、寄生虫感染症、乾癬を処置するため、造血を調節するため、増殖因子活性を刺激するため、血管新生を阻害するため、および創傷治癒を促進するための、治療目的のためのこのようなポリペプチドをコードする、このようなポリペプチドまたなポリヌクレオチドを利用するための工程が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、これは、例えば、特定の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症性および感染性疾患、ヒスタミンおよびIgE媒介アレルギー反応、プロスタグランジン非依存性発熱、骨髄不全、珪粉症、サルコイドーシス、慢性関節リウマチ、および過好酸球増多症候群の治療において、このようなポリペプチドの作用を阻害するために使用され得る。本発明の別の局面によれば、疾患を診断する方法、または本発明の核酸配列における変異およびこのような核酸配列にコードされるタンパク質の変化したレベルに関連する疾患に対する感受性を診断する方法が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DNAの合成およびDNAベクターの製造に関連するインビトロ目的のために利用するための工程が提供される。本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであるはずである。以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により包含される、本発明の範囲を限定することを意味しない。図１は、cDNA配列、および対応するCkβ-13の推定アミノ酸配列を示す。最初の28アミノ酸は、推定成熟ポリペプチドが65アミノ酸を含むような、リーダー配列を示す。アミノ酸に対する標準的な１文字の略語を使用する。配列決定を、37 3自動化DNAシーケンサー(Applied Biosysytems，Inc.)を使用して実施した。図２は、Ckβ-13(上)およびヒトMIP-1αポリペプチド(下)との間のアミノ酸配列相同性を示す。本発明の１つの局面によれば、図１の推定のアミノ酸配列(配列番号２)を有する成熟ポリペプチド、または1995年４月28日にATCC寄託番号第97113号として寄託されたクローン(単数または複数)のcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸(ポリヌクレオチド)が提供される。 Ckβ-13をコードするポリヌクレオチドは、活性化単球cDNAライブラリーから単離された。Ckβ-13は、ケモカインのC-C分岐のメンバーである。これは、ほぼ最初の28アミノ酸残基が推定のリーダー配列であり、その結果成熟タンパク質が 65アミノ酸を含む、93アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、ケモカインポリペプチドに対する構造的相同性、および33％が同一でそして53％が類似する、配列全体が例として単独で使用されるヒトMIP-1αポリペプチドに対する相同性を有する。ケモカインにおける４つの空間的に保存されたシステイン残基が、図１にみられ得るように、本発明のポリペプチドにおいて見出される。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA(このDNAは、cDNA、ゲノム DNA、および合成DNAを包む)の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コード(アンチセンス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１(配列番号１)に示すコード配列または寄託したクローン(単数または複数)のコード配列と同一であり得るか、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１(配列番号１)のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。図１(配列番号２)の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、ならびにリーダーまたは分泌配列、もしくはプロタンパク質配列のような付加的コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列(および必要に応じて付加的コード配列)および非コード配列(例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3'非コード配列)。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに付加的コード配列、および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、図１(配列番号２)の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託したクローン(単数または複数)のcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体、またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体であり得る。従って、本発明は、図１(配列番号２)に示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託したクローン(単数または複数)のcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。この変異体は、図１(配列番号２)のポリペプチドまたは寄託したクローン(単数または複数)のcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体を包含する。本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１(配列番号１)に示すコード配列、または寄託したクローン(単数または複数)のコード配列の、天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子変異体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。本発明はまた、ポリヌクレオチドを含み、ここで、成熟ポリペプチドについてのコード配列は、同一のリーディングフレームにおいて、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド配列(例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための、分泌配列として機能するリーダー配列) に融合し得る。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、そして宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有し、ポリペプチドの成熟形態を形成し得る。これらのポリヌクレオチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、そしてタンパク質の不活性な形態である。一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、あるいはプロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の両方を有するタンパク質を、コードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あるいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主(例えば、COS-7細胞)が使用される場合は、血球凝集素(HA)タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する(Wilson，I.ら、Cell，37:767(1984 ))。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントを意味する；これは、コード領域に先行する領域および後に続く領域(リーダーおよびトレイラー)ならびに個々のコードセグメント(エクソン)の間に介在する配列(イントロン)を含む。全長Ckβ-13遺伝子のフラグメントは、全長の遺伝子を単離するための、およびこの遺伝子と高い配列類似性を有するか、または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するためのcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも30塩基を有し、そして例えば、50またはそれ以上の塩基を含み得る。このプローブはまた、全長の転写産物に対応するcDNAクローン、ならびに調節領域およびプロモーター領域、エクソン、およびイントロンを含む完全なCkβ-13遺伝子を含むゲノムクローン(単数または複数)を同定するために使用され得る。スクリーニングの例として、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のDNA配列を使用することにより、Ckβ-13遺伝子のコード領域を単離することが挙げられる。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、このプローブがライブラリーのどのメンバーとハイブリダイズするかを決定するためにヒトcDNAライブラリー、ゲノムDNAまたはmRNAをスクリーニングするために使用される。本発明はさらに、配列間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、そしてより好ましくは少なくとも95％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95％、そして好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１(配列番号１)のcDNAまたは寄託したcDNA(単数または複数)によりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持する(すなわち、ケモカインポリペプチドとして機能する)ポリペプチドをコードする。あるいは、このポリヌクレオチドは、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、そしてより好ましくは少なくとも50塩基を有するポリペプチドであり得る。これらは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そして、本明細書上記のように、それに対する同一性を有し、そして活性を保持してもよいし、または保持しなくてもよい。例えば、このようなポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドのプローブ、またはそれらの変化体のプローブとして、例えば、そのポリヌクレオチドの回収のために、あるいは診断プローブとして、またはPCR プライマーとして使用され得る。従って、本発明は、配列番号２のポリペプチドならびにそのフラグメント(このフラグメントは少なくとも30塩基、そして好ましくは50塩基である)をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも70％同一性、好ましくは少なくとも90％、そしてより好ましくは少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドに関する。本明細書中でいう寄託物(単数または複数)は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の記載とのいかなるコンフリクトの事象も制御する。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。本発明はさらに、図１(配列番号２)の推定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１(配列番号２)のポリペプチドまたは寄託したcDNAにコードされるポリペプチドをいう場合、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味する。従って、アナログは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を包含する。誘導体またはフラグメントは、例えば、図１のポリペプチドよりも少ないアミノ酸残基を有するが、ヒトケモカインポリペプチドに特有の生物学的活性をなお維持している、スプライス変化体を含み得る。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。図１(配列番号２)のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)１つ以上のアミノ酸残基が保存的アミノ酸残基または非保存的アミノ酸残基(好ましくは保存的アミノ酸残基)で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基は遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは(ii)１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは(iii) 成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような別の化合物と融合されているもの、あるいは(iv) 付加的アミノ酸(例えば、リーダー配列、または分泌配列、あるいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に使用される配列)が、成熟ポリペプチドに融合されているものであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好ましくは均一に精製される。用語「単離された」は、物質が、その元の環境(例えば、それが天然に存在する場合は、天然の環境)から取り去られることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する、天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系において共存する物質の一部または全てから分離されている、同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得、そしてなお、このようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部でないという点で、単離されている。本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド(特に成熟ポリペプチド) 、ならびに配列番号２のポリペプチドと少なくとも70％の類似性(好ましくは少なくとも70％の同一性)、そしてより好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも90％の類似性(より好ましくは少なくとも90％の同一性)、そして、さらにより好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも95％の類似性(さらにより好ましくは少なくとも95％の同一性)を有するポリペプチドを含み、そしてまた少なくとも30アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を一般的に含むこのようなポリペプチドの一部を含む。当該分野に公知であるように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、あるポリペプチドの第２のポリペプチドに対するアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換とを比較することにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメントは、全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。宿主細胞は、本発明のベクター(これは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る)を用いて遺伝子操作される(形質導入されるか、または形質転換されるか、またはトランスフェクトされる)。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、またはCkβ-13 遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培養条件(例えば、温度、pHなど)は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を包含する。このようなベクターは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病)である。しかし、宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は、当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位(単数または複数)に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列(単数または複数)(プロモーター)に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.c oli lacまたはtrp、λファージP_Lプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む。そのベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性(例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばE.coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性)を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含むベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞(例えば、E .coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium)；真菌細胞(例えば酵母)；昆虫細胞(例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9)；動物細胞(例えば、CHO、C OSまたはBowes黒色腫)；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。さらに詳細には、本発明はまた、先に広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包む。構築物は、ベクター(例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター)を包含し、このベクターの中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列(例えば、プロモーターを包む)を含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE70、pQE 60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSK S、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；pTRC99a、pKK223-3、pKK233- 3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、p0G44、pXT1、pSG(S tratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、使用され得る。プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特によく知られた細菌プロモーターとして、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_Lおよびtrpが挙げられる。真核生物プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインIを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞(例えば、哺乳動物細胞)または下等真核細胞(例えば、酵母細胞)であり得るか、あるいは宿主細胞は原核細胞(例えば、細菌細胞)であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis,L.，Dibner,M.，Battey,I.，Basic Methods in Molecular Biology，1986)。宿主細胞中の構築物を用いて、従来の様式で組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 第２版，Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)(この開示は、本明細書中に参考として援用される)に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNA のシス作動エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例として、複製起点のbp100〜270の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー(例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子、およびS.cerevis iae のTRP1遺伝子)、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、解糖酵素(例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK))、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質のペリプラズム空間または細胞外の培地への分泌を指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴(例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製)を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望により宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Upp sala，Sweden)およびpGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)を包含する。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは適切な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘導)により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の簡便な方法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23: 175(1981)に記載されるサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株(例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株)が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５'フランキング非転写配列を含む。SV40スプライス部位、およびポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用され得る。ポリペプチドは、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の生成物であり得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主(例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞により)から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のための研究試薬および材料として使用され得る。本発明のポリペプチドを使用して、癌の化学療法の間の補助的な防御処置として骨髄幹細胞コロニー形成を阻害し得る。Ckβ-13ポリペプチドは、骨髄幹細胞のような造血細胞の増殖および分化を阻害し得る。分化の決定付けられている始原細胞(例えば、顆粒球、およびマクロファージ/単球)の集団における阻害効果は、白血病細胞の増殖を阻害するために治療的に使用し得る。本発明のポリペプチドは、皮膚中のランゲルハンス細胞がケモカインを産生すると見出されているため、乾癬(ケラチノサイト過剰増殖によって特徴づけられる)の処置のために、表皮のケラチノサイトの増殖を阻害使用するために使用され得る。本発明のポリペプチドは、また、宿主防御細胞(例えば、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージ)の侵入および活性化を、走化性を介して刺激することにより、および腫瘍の血管新生を阻害することにより、固形腫瘍(例えば、カポジ肉腫)を処置するために使用され得る。それらはまた、殺菌性白血球の誘引および活性化を介して、耐性の慢性および急性感染症(例えば、ミコバクテリウム感染症)に対する宿主の防御を増強するために使用し得る。本発明のポリペプチドは、また、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患およびリンパ球性白血病の処置のために、IL-2の生合成を阻害することによってＴ細胞の増殖を阻害するために使用され得る。 Ckβ-13はまた、また、デブリ(debris)を浄化するおよび結合組織促進炎症性細胞の補充、そしてまた過剰のTGF-β媒介線維症の制御の両方を介して、創傷治癒を刺激し、そして創傷治癒の間の瘢痕化を妨げるために使用され得る。これと同じ様式で、Ckβ-13はまた、肝硬変、骨関節炎、および肺線維症を含む他の線維性疾患を処置するためにも用いられ得る。本発明のポリペプチドはまた、住血吸虫症、旋毛虫症、および回虫症におけるような、組織に侵入する寄生虫の幼虫を殺すという特有の機能を有する好酸球の存在を増加させる。これらは、また、例えば化学療法の後に骨髄から成熟白血球を放出するために、種々の造血始原細胞の活性化および分化を調節することにより、造血を調節するために使用され得る。本発明のポリペプチドを使用して、また、例えば癌の処置において、アポトーシスのために、望まれない細胞を標的化し得る。このようなポリヌクレオチドにコードされるポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、科学的研究、DNAの合成、およびDNAベクターの作製に関連するインビトロの目的のために、ならびにヒト疾患の処置のための治療法および診断法の設計のために利用し得る。このポリペプチドはまた、末梢血に骨髄幹細胞を動員(これは、幹細胞の単離を容易にする)するために使用され得る。単離された幹細胞は、高用量の化学療法の後に、骨髄をコロニー形成するために使用し得る。本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列における変異の存在に関連する疾患またはこのような疾患に対する感受性を検出するための診断的アッセイの一部としてCkβ-13遺伝子の使用に関する。このような疾患(例えば、腫瘍および癌)は、ヒトケモカインポリペプチドの発現不足に関連する。本発明の遺伝子において変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞(例えば、血液、尿、唾液、組織生検、および剖検材料など)から得られ得る。ゲノムDNAが、検出のために直接使用され得るか、または分析の前にPCR(Saikiら、Nature，324：163-166(1986)) を使用して酵素的に増幅され得る。RNAまたはcDNAもまた、同じ目的のために使用され得る。例として、Ckβ-13をコードする核酸に相補的なPCRプライマーが、 Ckβ-13変異を同定および分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入が、正常遺伝子型との比較において増幅産物のサイズの変化によって検出され得る。ポイントミューテーションが、増幅DNAを放射標識されたCkβ-13RNA、あるいは放射標識されたCkβ-13アンチセンスDNA配列とハイブリダイズすることによって同定され得る。完全に適合した配列は、RNaseA消化によりまたは融点の違いにより、適合していない２本鎖と区別され得る。 DNA配列の差異に基づく遺伝的試験は、変性試薬を用いてまたは用いずに、ゲル中でのDNAフラグメントの電気泳動移動度の変化を検出することによって達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動によって可視化され得る。異なる配列のDNAフラグメントは、異なるDNAフラグメントの移動度がゲルにおいて、それらの特異的融点または部分的融点に従って異なる位置に遅らせられる、変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別され得る(例えば、Myersら、Scie nce，230:1242(1985)を参照のこと)。特定の位置での配列の変化はまた、RNase、およびS1防御、または化学的切断法のようなヌクレアーゼ防御アッセイ(例えば、Cottonら、PNAS，USA，85:4397- 4401(1985))によって示され得る。従って、特異的DNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNアーゼ防御、化学的切断、直接的DNA配列決定、または制限酵素の使用(例えば、制限酵素断片長多型性解析(RFLP))、およびゲノムDNAのサザンブロットのような方法によって達成され得る。より簡便なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はインサイチュの分析によってもまた検出され得る。本発明はまた、正常コントロール組織サンプルと比較してポリペプチドの過剰発現が、例えば、腫瘍などの疾患の存在または疾患に対する感受性を検出し得るので、種々の組織における本発明のポリペプチドのレベルの変化を検出するための診断アッセイに関する。宿主由来のサンプル中の本発明のポリペプチドのレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者に周知であり、そしてこのようなアッセイとして、放射免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELISAアッセイおよび「サンドイッチ」アッセイが挙げられる。ELISAアッセイ(Coliganら、Current Protocols in Immunology，1(2)，第６章、(1991)) は、最初に、Ckβ-13抗原に特異的な抗体(好ましくはモノクローナル抗体)を調製する工程を含む。さらに、レポーター抗体が、モノクローナル抗体に対して調製される。レポーター抗体に、放射活性、蛍光、または本実験例中では、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような、検出可能な試薬と結合させられる。サンプルを宿主から取り出し、そしてサンプル中のタンパク質と結合する固体支持体( 例えば、ポリスチレンディッシュ)上でインキュベートする。次いで、ディッシュ上の任意のフリーのタンパク質結合部位を、BSAのような非特異的タンパク質と共にインキュベートすることによって覆う。次に、モノクローナル抗体をディッシュ内でインキュベートし、その間にモノクローナル抗体がポリスチレンディッシュに結合した任意のCkβ-13タンパク質に結合する。全ての結合していないモノクローナル抗体を、緩衝液で洗浄して除去する。今度は西洋ワサビペルオキシダーゼ結合させたレポーター抗体をディッシュ内に配置し、その結果、レポーター抗体がCkβ-13ポリペプチドに結合した任意のモノクローナル抗体に結合する。次いで、結合していないレポーター抗体を洗浄して除去する。次いで、ペルオキシダーゼ基質をディッシュに添加し、そして所定の時間内の発色の量が、標準曲線と比較した場合に患者のサンプルの所定の用量内に存在するCkβ-13タンパク質の量の測定値となる。競合アッセイが使用され得、ここではCkβ-13ポリペプチドに特異的な抗体が固体支持体に結合され、そして標識されたCkβ-13ポリペプチドおよび宿主由来のサンプルが固体支持体を通過し、そして例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーによって検出された標識の量が、サンプル中のCkβ-13ポリペプチドの量に相関付けられ得る。「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイに類似している。「サンドイッチ」アッセイにおいて、Ckβ-13ポリペプチドは固体支持体を通過し、そして固体支持体に結合した抗体に結合させる。次いで、２次抗体をCkβ-13ポリペプチドに結合させる。次いで標識されそして２次抗体に対して特異的な３次抗体を固体支持体に通過させ、そして２次抗体に結合させ、そして量が定量され得る。本発明は、本発明のポリペプチドについてのレセプターを同定するための方法を提供する。レセプターをコードする遺伝子は、例えば、リガンドパニングおよびFACSソーティング(Coliganら、Current Protocols in Immun.，1(2)，第５章、(1991))のような当業者に公知の多数の方法によって、同定され得る。好ましくは、発現クローニングを使用し、ここで、ポリアデニル化RNAをこのポリペプチドに応答する細胞から調製し、そしてこのRNAから作製されたcDNAライブラリーをプールに分割し、そしてこれを使用してこのポリペプチドに応答しないCOS 細胞または他の細胞をトランスフェクトする。スライドガラス上で増殖させたトランスフェクトした細胞を標識されたポリペプチドに曝す。このポリペプチドは種々の手段(部位特異的プロテインキナーゼについての認識部位のヨウ素化または封入を含む)によって標識され得る。固定およびインキュベートに続いて、スライドガラスをオートラジオグラフィー分析に供する。陽性のプールが同定され、そしてサブプールをイエンテラティブ(interative)サブプールリングおよび再スクリーニング工程を使用して調製しそして再トランスフェクトし、最終的に推定のレセプターをコードする単一のクローン(単数または複数)を生じる。レセプター同定のための別のアプローチとして、標識されたポリペプチドが、レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和性結合され得る。架橋した材料を、PAGE分析により分解し、そしてＸ線フィルムに曝す。ポリペプチドのレセプターを含む標識された複合体が切除され得、ペプチドフラグメントに分解され得、そしてタンパク質ミクロ配列決定に供され得る。ミクロ配列決定から得たアミノ酸配列を使用して、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するため、cDNAライブラリーをスクリーニングするための変性オリゴヌクレオチドプローブのセットをデザインする。本発明は、本発明のポリペプチドに対するアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、本発明のポリペプチドに対するレセプターに結合して活性化する化合物であり、一方でアンタゴニストは、このようなレセプターに結合し、そしてそして阻害するかまたは単にこのようなレセプターについて、Ckβ-13と競合する。走化性は、本発明のポリペプチドにより化学誘引された細胞を、細胞を入れるのに十分な直径(約５μm)の孔を有するフィルター上に配置することによってアッセイされ得る。潜在的なアゴニストの溶液を、上部区画中の適切なコントロール培地と共にチャンバーの下部に配置し、このようにして、アゴニストの濃度勾配を、経時的に多孔性膜内にまたは多孔性膜を通って移動する細胞を計数することによって測定する。アンタゴニストについてアッセイする場合は、本発明のポリペプチドを下部のチャンバーに配置し、そして潜在的なアンタゴニストを添加して、細胞の走化性が阻害されるかどうか測定する。あるいは、このポリペプチドのレセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、この化合物の存在下で、本発明の標識された(例えば放射活性)ポリペプチドと共にインキュベートする。次いで、この化合物のこの相互作用をブロックする能力を測定する。本発明のポリペプチドに対する潜在的なアンタゴニストの例として、抗体、またはいくつかの場合においては、オリゴヌクレオチドが挙げられ、これはこのポリペプチドに結合する。潜在的なアンタゴニストの別の例は、このポリペプチドのネガティブ優性変異体である。ネガティブ優性変異体は、野生型ポリペプチドのレセプターに結合するが、生物学的活性を保持できないポリペプチドである。アンチセンス技術を使用して調製されたアンチセンス構築物はまた、潜在的なアンタゴニストである。アンチセンス技術が、３重鎖ヘリックス形成、あるいはアンチセンスDNAまたはRNAを介する遺伝子の発現を制御するために使用され得、この方法は共に、ポリヌクレオチドのDNAまたはRNAへの結合に基づいている。例えば、ポリヌクレオチド配列の５'コード部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードし、約10〜40塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。DNAオリゴヌクレオチドが転写に関わる遺伝子の領域に相補的であるように設計される(３重鎖ヘリックス、Leeら、Nucl．Acids Res.，6:30 73(1979)；Cooneyら、Science，241:456(1988)；およびDervanら、Science，251 :1360(1991)を参照のこと)。それにより、本発明のポリペプチドの産生および生成を妨げる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでそのmRNAにハイブリダイズし、そしてそのmRNA分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする (antisense-Okano，J．Neurochem.，56:560(1991)；遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド、CRC Press，Boca Raton，F L(1988))。上記のオリゴヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの産生を阻害するために、アンチセンスRNAまたはDNAがインビボで発現され得るように、細胞に送達され得る。別の潜在的なアンタゴニストは、このポリペプチドのペプチド誘導体であり、これはこのポリペプチドの天然にまたは合成的に改変されたアナログであり、生物学的機能を失っているが、なお、このポリペプチドのレセプターを認識して結合し、それゆえ効果的にこのレセプターをブロックする。ペプチド誘導体の例として、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。アンタゴニストを使用して、特定の自己免疫疾患および慢性炎症性疾患、ならびに感染性疾患において、マクロファージおよびその前駆体、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球、およびいくつかのＴ細胞サブセット(例えば、活性化Ｔ細胞およびCD8細胞傷害性Ｔ細胞、ならびにナチュラルキラー細胞)の走化性および活性化を阻害し得る。自己免疫疾患の例として、多発性硬化症、およびインシュリン依存性糖尿病が挙げられる。またそのアンタゴニストは、単核食細胞の補充および活性化を妨げることにより、珪胚症、類肉腫症、特発性肺線維症を含む感染性疾患を処置するために使用され得る。それらはまた好酸球の生成および遊走を阻害することによって、特発性好酸球増多症症候群を処置するために使用され得る。内毒素性ショックもまた、マクロファージの遊走およびそれらの本発明のポリペプチドの産生を阻害することによるアンタゴニストにより処置され得る。このアンタゴニストはまた、単球の動脈壁への浸潤を妨げることによって、アテローム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、ケモカイン誘導の肥満細胞および好塩基球の脱顆粒およびヒスタミンの放出を阻害することにより、ヒスタミン媒介アレルギー反応および免疫学的障害(後期アレルギー反応、慢性蕁麻疹、およびアトピー性皮膚炎を含む)を処置するために使用され得る。アレルギー性喘息、鼻炎、および湿疹のようなIgE媒介アレルギー反応もまた、処置され得る。このアンタゴニストはまた、単球の創傷領域への誘引を妨げることにより、慢性および急性炎症をまた処置するために使用され得る。これらはまた、慢性および急性炎症性肺疾患が肺における単核食細胞の滞留(sequestration)に関連しているため、正常な肺のマクロファージ集団を調節するために使用され得る。アンタゴニストはまた、患者の関節における単球の滑液への誘引を妨げることにより、慢性関節リウマチを処置するために使用され得る。単球の流入および活性化は、退行性関節症および炎症性関節症の両方の病因において重要な役割を果たしている。このアンタゴニストは、IL-1およびTNFに主に帰する有害カスケードを阻止するために使用され得、それは他の炎症性サイトカインの生合成を阻止する。このようにして、このアンタゴニストは炎症を妨げるために使用され得る。このアンタゴニストはまた、ケモカインに誘導されるプロスタグランジン非依存性発熱を阻害するために用いられ得る。このアンタゴニストはまた、例えば再生不良性貧血および骨髄形成異常症候群のような、骨髄不全の症例を処置するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、肺における好酸球の蓄積を妨げることにより喘息およびアレルギーを処置するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、喘息の肺の顕著な特徴である上皮下基底膜の線維症を処置するために使用され得る。このアンタゴニストは、例えば、本明細書以下で記載する薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物において使用され得る。本発明のポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて使用され得る。このような組成物は、治療的有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含有する。このようなキャリアとして、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。処方物は、投与の様式に適合しなければならない。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む、薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器(単数または複数)に添付されるのは、薬学的製品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により定められる様式の注意書形態であり得、この注意書はヒト投与のための製造、使用、または販売の機関による承認を反映する。さらに、このポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、他の治療的化合物に関連して使用され得る。薬学的組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内、または皮内経路のような、簡便な様式において投与され得る。薬学的組成物は、特定の症状の処置および／または予防についての有効量において投与される。一般に、このポリペプチドは、少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そしてほとんどの場合、約８mg/kg体重/日を超過しない量で投与される。ほとんどの場合、投与経路、症状などを考慮に入れて、その用量は１日約10μg/kg〜約１mg/kg 体重である。本発明のポリペプチド、およびポリペプチドであるアゴニストまたはアンタゴニストは、このようなポリペプチドのインビボでの発現により本発明に従って使用され得、そしてこれは「遺伝子治療」としばしばいわれる。従って、例えば、患者由来の細胞は、エクスビボでポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)で操作され得、次いで操作された細胞をこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供する。そのような方法は、当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順により操作され得る。同様に、細胞は、例えば、当該分野で公知の手順により、インビボでのポリペプチドの発現のためにインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス粒子を産生するプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法による本発明のポリペプチドを投与するためのこれらおよび他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであるはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外、例えば、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後にインビボで細胞を操作するために使用され得るアデノウイルスであり得る。上記で述べたレトロウイルスプラスミドベクターが誘導され得るレトロウイルスとして、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス由来である。ベクターは１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターとして、レトロウイルスLTR；SV40プロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(Millerら、Biotechniques，第７巻、No.9，980-990(198 9)に記載される)、または他の任意のプロモーター(例えば、真核細胞プロモーターのような細胞プロモーター(ヒストン、pol III、およびβアクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない))が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターとして、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から、当業者に明らかである。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターとして、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス(C MV)プロモーターのような異種プロモーター；呼吸性シンシチウムウイルス(RSV) プロモーター；MMTプロモーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスLTR(上記の改変レトロウイルスLTRを含む)；βアクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得る。レトロウイルスプラスミドベクターは、プロデューサー細胞株を形成するために、パッケージング細胞株を形質導入するために使用され得る。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞株の例として、PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA1 2、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、およびDAN細胞株(Miller，Humman Gene Therapy，第１巻、5-14頁(1990)に記載される)が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこれらはその全体が本明細書中で参考として援用される。ベクターは当該分野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質導入し得る。このような手段として、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO₄沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。別の手段において、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム中にカプセル化され得るか、または脂質と結合され得、次いで宿主に投与され得る。プロデューサー細胞株は、このポリペプチドをコードする核酸配列(単数または複数)を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子が、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核細胞は、このポリペプチドをコードする核酸配列(単数または複数)を発現する。形質導入され得る真核細胞として、胚性幹細胞、胚性癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、、内皮細胞、および気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の配列はまた、染色体の同定のために有用である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてこれとハイブリダイズされ得る。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ(反復多型)に基づく染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマーキングするためにはほとんど利用されていない。本発明の染色体に対するDNA のマッピングは、これらの配列の疾患に関連する遺伝子への関連づけにおける重要な第１段階である。簡潔にいうと、配列は、cDNA由来のPCRプライマー(好ましくは15〜25塩基対) の調製により、染色体にマッピングされ得る。３'非翻訳領域のコンピューター分析は、ゲノムDNAにおいて１つ以上のエクソンに及ばず、従って増幅工程を複雑にしているプライマーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングのために使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅したフラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に割り当てるための迅速な手順である。同一のオリゴヌクレオチドプライマーと共に本発明を使用して、副位置づけ(sublocalization)が、類似の様式において、特定の染色体または大きなゲノムクローン(単数または複数)のプール由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。その染色体に対するマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略として、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソーティッドした染色体を用いる予備スクリーニング、および構築染色体特異的cDNAライブラリーとのハイブリダイゼーションによる予備選択が挙げられる。 cDNAクローン(単数または複数)の分裂中期核酸の広がりへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)が、１つの段階における正確な染色体の位置づけを提供するために使用され得る。この技術は、500または600塩基の短いcDNAを用いて使用され得る。この技術の総説については、Vermaら、Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的位置は、遺伝的マップデータに相関され得る。このようなデータは、例えば、V. McKusick，Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryのオンライン入手可能である)に見出される。次いで、同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係は、連鎖分析(物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝)によって同定される。次に、疾患にかかった個体とかかっていない個体との間のcDNAまたはゲノム配列における差異を決定する必要がある。変異が疾患にかかった個体のいくつかまたは全てで認められるが正常な個体においては認められないならば、その変異がその疾患の原因となるようである。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の分解能を用いて、疾患に関連する染色体領域に正確に位置づけられるcDNAは、50と500との間の潜在的な原因遺伝子の１つであり得る(このことは、１メガベースマッピング分解能および20kbあたり１つの遺伝子を想定する)。このポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、あるいはそれらのアナログ、もしくはそれらを発現する細胞が、それらに対する抗体を産生するための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラの、１本鎖の、そしてヒト化された抗体、ならびにFabフラグメント、もしくはFab発現ライブラリーの産物を含む。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して産生される抗体は、このポリペプチドの動物への直接注入により、またはこのポリペプチドの動物(好ましくはヒトでない動物)への投与によって得られ得る。次いで、こうして得られた抗体はそれ自身そのポリペプチドに結合される。この様式において、このポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を産生するために使用され得る。次いで、このような抗体は、このポリペプチドを発現する組織からこのポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養物により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例として、ハイブリドーマ技術(Koh lerおよびMilstein、1975，Nature，256:495-497)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、1983，Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら、 1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，7 7-96頁)が挙げられる。１本鎖の抗体の産生のために記載された技術(米国特許第4,946,778号)が、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する１本鎖抗体を作製するために適合され得る。また、トランスジェニックマウスが本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現するために使用され得る。本発明は、以下の実施例についての参考と共にさらに記載される；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことが理解されるべきである。全ての部または量は、特に記載のない限りは、重量によるものである。以下の実施例の理解を容易にするために、特定の頻繁に生じる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、先行する小文字のｐおよび／またはそれに続く大文字および／または数字よって示される。本明細書中の出発プラスミドはいずれも市販されており、制限されない基準においては公的に入手可能であるか、または刊行されている手順で入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが、当該分野で公知であり、そして当業者に明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列にのみ作用する制限酵素を用いるDNAの酵素的切断をいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は市販されており、そしてその反応条件、補因子、および他の必要条件は、当業者に公知のように使用された。分析的目的のために、代表的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントが、約20μlの緩衝液中の約２単位の酵素と共に使用される。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のためには、代表的には５〜50μg のDNAがより大きな用量において20〜250単位の酵素で消化される。特定の制限酵素についての適切な緩衝液および基質の量は、製造業者によって特定される。約１時間、37℃のインキュベート時間が通常使用されるが、供給者の指示により変化し得る。消化後、反応物はポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動され、所望のフラグメントが単離される。切断されたフラグメントのサイズ分離が、Goeddel，D.ら、Nucleic Acids Res .,8:4057(1980)に記載の８％ポリアクリルアミドゲルを使用して実施される。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成され得る１本鎖のポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいう。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でATPと共にリン酸塩を付加しなければ他のオリゴヌクレオチドと結合しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントと結合する。「結合」は、２本鎖核酸フラグメントの間のホスホジエステル結合を形成する工程をいう(Maniatis，T.ら、同上，146頁)。他に提供されなければ、結合は、0 .5μgの連結されるべきDNAフラグメントのほぼ当モル量あたり10単位のT4 DNAリガーゼ(「リガーゼ」)で、公知の緩衝液および条件を使用して達成され得る。他に述べない限りは、形質転換は、Graham，F.およびVan der Eb.，A.，Virol ogy，52:456-457(1973)の方法に記載に従い実施された。実施例１ Ck β-13の細菌発現および精製 Ckβ-13をコードするDNA配列(ATCC寄託番号第97113号)を、プロセスされたCk β-13核酸配列(推定のシグナルペプチド配列を除く)の５'および３'末端配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅する。Ckβ-13遺伝子に対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ５'および３'末端に付加した。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５'CCCGCATGCCCAACATGGAAGACAG３' (配列番号３)を有し、SphI制限酵素部位(太字)、それに続く成熟タンパク質をコードする配列の第２のヌクレオチドから始まる16ヌクレオチドのCkβ-13コード配列を含む。ATGコドンは、SphI部位に含まれる。ATGに続く次のコドンにおいて、最初の塩基は、SphI部位由来であり、そして残りの２塩基は推定成熟タンパク質の最初のコドン(残基29)の２番目および３番目の塩基に相当する。３'配列、な配列を含み、そしてそれに終止コドンに先立つ遺伝子特異的配列の18ヌクレオチドが続く。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9(Qiagen，Inc．Chatswort h，CA)上の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性(Amp^r)、細菌の複製起点(ori)、IPTG調節可能プロモーターオペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-9をSphI およびBamH1で消化する。増幅配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列でインフレームに挿入する。次いで、連結混合物を用いて、E ．coli株M15/rep4(Qiagen,Inc.)をSambrook，J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)に記載の手順により形質転換する。M15/rep4は、lacIリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性(Kan^r)を付与するプラスミドpREP4の多数のコピーを含む。形質転換体をLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、そして制限酵素分析により確認する。所望の構築物を含むクローン(単数または複数)を、Amp(10 0μg/ml)とKan(25μg/ml)との両方を補充したLB培地における液体培養で一晩(O/ N)増殖させる。O/N培養物を用いて1:100〜1:250の比で大きな培養物に接種する。細胞を、600の光学密度(O.D.⁶⁰⁰)が0.4と0.6との間になるまで増殖させる。次いで、IPTG(「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」)を加えて１mMの最終濃度にする。IPTGは、lacIリプレッサーを不活性化することにより、P/Oを解放(clear)し遺伝子発現の増加を誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離により収穫する。細胞ペレットをカオトロピック薬剤６ＭグアニジンHCl中でpH5.0で可溶化する。澄明後、可溶化されたCkβ-13を6- ヒスタグを含むタンパク質による堅い結合を可能とする条件下で、ニッケル−キレートカラム上でのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製する(Hochuli, Eら、J．Chromatography 411: 177-184(1984))。Ckβ-13(純度98％より大きい) を６ＭグアニジンHClでカラムから溶出する。GnHClを除くタンパク質の再生は、いくつかのプロトコルによって達成され得る(Jaenicke，R.およびRudolph，R.， Protein Structure-A Practical Approach，IRL Press，New York(1990))。最初に、透析工程を利用して、GnHClを除去する。あるいは、Niキレートカラムから単離した精製タンパク質を、減少する直線GnHCl勾配が進む第２のカラムに結合させ得る。タンパク質をカラムに結合している間に再生し、次いで、250mMのイミダゾール、150mMのNaCl、25mMのpH7.5のトリスHCl、および10％のグリセロールを含む緩衝液で溶出する。最後に、可溶性タンパク質を５mMの重炭酸アンモニウムを含むストレージ緩衝液で透析する。実施例２ COS 細胞における組換えCkβ-13の発現プラスミド、Ckβ-13 HAの発現を、ベクターpcDNAI/Amp(Invitrogen)から誘導する。ベクターpcDNAI/Ampは以下を含む：１)SV40複製起点、２)アンピシリン耐性遺伝子、３)E．coli複製起点、４)ポリリンカー領域、SV40イントロンそしてポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。完全なCkβ-13前駆体、およびその３'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化する。それゆえ、組換えタンパク質発現はCMVプロモーター下で指示される。HAタグは、先に記載されたようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する(I．Wilson、H．Nim an、R．Heighten、A Cherenson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984，Cell 3 7，767)。標的タンパク質へのHAタグの融合により、HAエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。プラスミド構築ストラテジーを以下に記述する： Ckβ-13をコードするDNA配列(ATCC寄託番号第97113号)を、２つのプライマー CT３'(配列番号５)は、HindIII部位、それに続く開始コドンに対してマイナス部 XbaI部位、翻訳停止コドン(下線)、HAタグ、およびCkβ-13コード配列の最後の2 1ヌクレオチド(停止コドンは含まない)に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、HindIII部位、インフレーム融合したHAタグが続くCkβ-13コード配列、HA タグに隣接する翻訳終止停止コドン、およびXbaI部位を含む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター(pcDNA3/Amp)を、HindIIIおよびXbaI制限酵素により消化し、そして連結する。連結混合物を、E．coli SURE株(Stratagene Cloning Syst ems，La Jolla，CA)に形質転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体より単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限分析で試験する。組換えCkβ-13 ポリペプチドの発現のために、COS細胞をDEAE-DEXTRAN法により発現ベクターでトランスフェクトする(J．Sambrook、E．Fritsch、T．Maniatis、Molecular Clo ning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。Ckβ-1 3 HAタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出する。(E．Ha rlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labor atory Press，(1988))。細胞を、トランスフェクションの２日後、³⁵S-システインで８時間標識する。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤(RIPA 緩衝液(150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tr is(pH7.5))で溶解する(Wilson，I.ら、同上 37:767(1984))。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体により沈降させる。沈降したタンパク質をSDS-PAGEによって分析する。実施例３バキュロウイルス発現系を用いるCkβ-13のクローニングおよび発現全長のCkβ-13タンパク質をコードするDNA配列(ATCC寄託番号第97113号)を、遺伝子の５'および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する：７)を有し、そしてBamHI制限酵素部位(太字中)、それに続く真核細胞における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する６ヌクレオチド(Kozak，M.，J．Mol．Bi ol.,196,947-950，(1987))、およびCkβ-13遺伝子の最初の18ヌクレオチド(翻訳開始コドンである「ATG」に下線)を含む。し、制限エンドヌクレアーゼAsp718の切断部位,およびCkβ-13遺伝子の３'非翻訳配列に相補的な18ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販のキット(「Genecle an」 BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)を用いて、１％アガロースゲルより単離する。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718で消化し、そして再び１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメントを、F2と称する。ベクターpRG1(pVL941ベクターの変異体、下記)をバキュロウイルス発現系を用いるCkβ-13タンパク質の発現のために用いる(総説について、Summers，M.D.およびSmith，G.E．1987，A manual of methods for baculovirus vectors and in sect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bu lletin No．1555を参照のこと)。この発現ベクターは、Autographa californica 核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強いポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718の認識部位を含む。シミアンウイルス(SV )40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E．coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、その後ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクト野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列で両端で隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ得る。例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1である(Luckow，V.A.およびSummers，M.D.、Vi rology，170:31-39)。プラスミドを制限酵素BamHIおよびAsp718で消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、市販のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc．La Jolla，CA)を使用して、DNAを１％アガロースゲルより単離する。このベクターDNAをV2と称する。フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連結する。次いで、E．coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIおよびAsp7 18を用いて、Ckβ-13遺伝子を有するプラスミド(pBac-Ckβ-13)を含む細菌を同定する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認する。５μgのプラスミドpBac-Ckβ-13を、リポフェクション法(Felgnerら Proc．N atl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987))を用いて、1.0μgの市販の線状化したバキュロウイルス(「BaculoGold^TMbaculovirus DNA」，Pharmingen，San Dieg o，CA.)とともにコトランスフェクトする。 1μgのBaculoGold^TMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBac-Ckβ-13を、50 μlの血清非含有グレース培地(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、10μlリポフェクチンおよび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非含有グレース培地１mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞( ATCC CRL 1711)に滴下して加える。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振とうする。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのグレース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続ける。４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith(前出)による記載と同様にプラークアッセイを行う。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単離を可能にする、「Blue Gal」(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)を有するアガロースゲルを用いる。(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Life Te chnologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養法およびバキュロウイルス学の使用者ガイド(９〜10頁)においても見い出され得る)。連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加し、そして青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁する。寒天を、簡単な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を使用して、35mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存する。 Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、感染多重度(MOI)２で組換えバキュロウイルスV-Ckβ-13で感染させる。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)に置き換える。42時間後、５μCiの³⁵ Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン(Amersham)を添加する。細胞を、さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化する。実施例４遺伝子治療を介する発現線維芽細胞を、被験体から皮膚生検によって得る。得られた組織を組織培養培地中に入れ、そして小さい切片に分けた。組織の小さな切片を、組織培養フラスコの湿った表面上に置き、各フラスコ中に約10切片を入れる。フラスコを上下に回転させ、しっかりと密閉し、室温に一晩放置する。室温で24時間後、フラスコを逆転させ、そして組織塊をフラスコの底に固定したまま維持し、そして新鮮な培地(例えば、10％ FBS、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むハムF12培地) を添加する。次いで、これを37℃で約１週間インキュベートする。このとき、新鮮な培地を添加し、そしてその後数日ごとに交換する。さらに２週間の培養後、線維芽細胞の単層が生じる。単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコに大きく(scale)する。モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復に隣接するpMV-7(Kirschmeier，P .T.ら、DNA，7: 219-25(1988))をEcoRIおよびHindIIIを用いて消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分離し、そしてガラスビーズを用いて精製する。本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、それぞれ5'および3'末端配列に対応するPRCプライマーを用いて増幅する。5'プライマーは、EcoRI部位を含み、そして3'プライマーは、HindIII部位をさらに含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス直鎖状骨格、ならびに増幅されたEcoRIおよびHindIIIフラグメントを、T4 DNAリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を使用して、細菌HB101を形質転換し、次いで、これを、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する目的のために、カナマイシン含有寒天プレート上に播種する。両栄養性pA317またはGP+am12パッケージング細胞を、10％仔ウシ血清(CS)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)における組織培養中で、集密的密度に増殖させる。次いで、遺伝子を含むMSVベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターで形質導入する。この時点でパッケージング細胞は、遺伝子を包含する感染性ウイルス粒子を産生する(この時点でパッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれる)。新鮮な培地を形質導入プロデューサー細胞に添加し、その後、集密プロデューサー細胞の10cmプレートから培地を回収する。感染性ウイルス粒子を含む消費された培地を、ミリポア(millipore)フィルターで濾過し、剥離したプロデューサー細胞を除去し、そして次いでこの培地を用いて線維芽細胞を感染させる。培地を、線維芽細胞の半集密的プレートから除去し、そして迅速にプロデューサー細胞からの培地に置き換える。この培地を除去し、そして新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高い場合、事実上全ての線維芽細胞が感染され、そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、選択マーカー(例えば、neo、またはhi s )を有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。次いで、操作された線維芽細胞は、単独、あるいはサイトデックス３マイクロキャリアービーズ上で集密的に増殖させた後のいずれかで、宿主に注入される。その後、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、従って、特に記載がなければ、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＢＧＣ０７Ｋ 14/52 ＡＤＡ 16/24 ＡＤＵＣ１２Ｑ 1/68 ＡＡＥＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｐ 39/395 ＡＤＺＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 45/00 ＡＢＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 48/00 ＡＤＶＡＤＡＣ０７Ｋ 14/52 ＡＢＧ 16/24 ＡＢＦＣ１２Ｑ 1/68 ＡＥＤＧ０１Ｎ 33/53 ＡＢＥ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リ，ハオドンアメリカ合衆国メリーランド 20878, ガイザースバーグ，ルトレッジドライブ 11033 (72)発明者セイベル，ジョージアメリカ合衆国ペンシルバニア 19087, セイントデイビッズ，コーンウォールサークル 11

Claims

【特許請求の範囲】１．単離されたポリヌクレオチドであって、以下： (a) 配列番号２に記載のアミノ酸-28〜アミノ酸65を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (b) 配列番号２に記載のアミノ酸１〜アミノ酸65を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (c) 該ポリヌクレオチド(a)または(b)とハイブリダイズし得、かつ少なくとも7 0％がそれらと同一であるポリヌクレオチド；および (d) 該ポリヌクレオチド(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチドフラグメント、から成る群から選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．配列番号２のアミノ酸-28〜65を含むポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。４．配列番号２のアミノ酸1〜65を含むポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。５．単離されたポリヌクレオチドであって、以下： (a) ATCC寄託番号97113に含まれるDNAによって発現されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (b) 該ポリヌクレオチド(a)とハイブリダイズし得、かつ少なくとも70％がそれらと同一であるポリヌクレオチド；および (c) 該ポリヌクレオチド(a)または(b)のポリヌクレオチドフラグメント、から成る群から選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。６．請求項２のDNAを含む、ベクター。７．請求項６に記載のベクターで遺伝操作された宿主細胞。８．請求項７に記載の宿主細胞から、前記DNAによってコードされるポリペプチドを発現させる工程を包含する、ポリペプチドを産生する方法。９．請求項６に記載のベクターで細胞を遺伝操作する工程を包含する、ポリペプチドを発現し得る細胞を産生する方法。１０．ポリペプチドであって、(i)配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体；および(ii)AT CC寄託番号97113のcDNAによってコードされるポリペプチド、ならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体から成る群から選択されるポリペプチド。１１．請求項１０に記載のポリペプチドの活性を模倣するする化合物。１２．請求項１０に記載のポリペプチドの活性に拮抗する化合物。１３．モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体からなる群より選択されるメンバーを含む、請求項１０に記載のポリペプチドに対する抗体。１４．Ckβ-13が必要である患者を処置するための方法であって：該患者に治療的有効量の請求項１０に記載のポリペプチドを投与する工程、を包含する、方法。１５．前記治療的有効量の前記ポリペプチドが、該ポリペプチドをコードしそしてインビボで該ポリペプチドを発現するDNAを患者に提供することによって投与される、請求項１３に記載の方法。１６．Ckβ-13ポリペプチドを阻害することが必要である患者を処置する方法であって：患者に治療的有効量の請求項１２に記載の化合物を投与する工程を包含する、方法。１７．請求項１０に記載のポリペプチドの発現不足に関連する疾患または疾患に対する感受性を診断する方法であって：該ポリペプチドをコードする核酸配列における変異を検出する工程を包含する、方法。１８．診断方法であって：宿主由来のサンプル中の請求項１０に記載のポリペプチドの存在を分析する工程を含む、診断方法。１９．請求項１０に記載のポリペプチドに対するアゴニストとして活性な化合物を同定するための方法であって： (a) 細胞が請求項１３に記載のポリペプチドに応答して、正常に遊走する条件下で、スクリーニングされるべき化合物と、該細胞を含む反応混合物とを混合させる工程；および該化合物がアゴニストとして有効である場合、同定するために該細胞の遊走の程度を決定する工程、を包含する方法。２０．Ckβ-13ポリペプチドが工程(a)の混合物において添加され、そして遊走の程度の決定がアンタゴニストとして有効な化合物を同定する、請求項１８に記載の方法。