JPH05103670A - 新規なタンパク質 - Google Patents
新規なタンパク質Info
- Publication number
- JPH05103670A JPH05103670A JP3271362A JP27136291A JPH05103670A JP H05103670 A JPH05103670 A JP H05103670A JP 3271362 A JP3271362 A JP 3271362A JP 27136291 A JP27136291 A JP 27136291A JP H05103670 A JPH05103670 A JP H05103670A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hhgf
- protein
- amino acid
- protease activity
- chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＣＨＯ細胞を用いた組換えヒト肝細胞増殖因
子（ｈＨＧＦ）の生産において、１本鎖（不活性）型ｈ
ＨＧＦを２本鎖（活性）型ｈＨＧＦに変換する能力を有
する蛋白質を精製、単離し、分子量（約３４，０００〜
約３８，０００）及びＮ末端部分アミノ酸配列を決定し
た。 【効果】 本願蛋白質は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ
ｖｉｔｒｏでのｈＨＧＦの活性調節因子として、また２
本鎖ｈＨＧＦを無血清培養時や試験管内で調製するため
に用いられる。
子（ｈＨＧＦ）の生産において、１本鎖（不活性）型ｈ
ＨＧＦを２本鎖（活性）型ｈＨＧＦに変換する能力を有
する蛋白質を精製、単離し、分子量（約３４，０００〜
約３８，０００）及びＮ末端部分アミノ酸配列を決定し
た。 【効果】 本願蛋白質は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ
ｖｉｔｒｏでのｈＨＧＦの活性調節因子として、また２
本鎖ｈＨＧＦを無血清培養時や試験管内で調製するため
に用いられる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、肝細胞増殖因子（ＨＧ
Ｆ）を特定の位置で切断し、１本鎖型から２本鎖型へ変
換させるプロテアーゼ活性を有する新規なタンパク質に
関する。
Ｆ）を特定の位置で切断し、１本鎖型から２本鎖型へ変
換させるプロテアーゼ活性を有する新規なタンパク質に
関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、組換えＤＮＡ技術により、外来の構造遺伝子を宿主
細胞に導入して得られる形質転換体を培養して、該構造
遺伝子を発現させタンパク質を産生させる方法が実施さ
れている。そして、構造遺伝子が動物由来のものである
場合、天然により近いタンパク質を得るために、宿主細
胞として動物細胞を使用する例が増加している。
年、組換えＤＮＡ技術により、外来の構造遺伝子を宿主
細胞に導入して得られる形質転換体を培養して、該構造
遺伝子を発現させタンパク質を産生させる方法が実施さ
れている。そして、構造遺伝子が動物由来のものである
場合、天然により近いタンパク質を得るために、宿主細
胞として動物細胞を使用する例が増加している。
【０００３】従来、動物細胞培養物から目的とするタン
パク質を取得する場合に用いられる培養液中には、動物
細胞の増殖に必要な血清が約５〜１０％程度経験的に添
加されている従って、培養物中には、血清由来のタンパ
ク質が混在することにより、目的とするタンパク質が種
々の修飾を受けたり、抑制されたり、また、目的とする
蛋白質を精製するのに手間がかかるという問題点があ
る。
パク質を取得する場合に用いられる培養液中には、動物
細胞の増殖に必要な血清が約５〜１０％程度経験的に添
加されている従って、培養物中には、血清由来のタンパ
ク質が混在することにより、目的とするタンパク質が種
々の修飾を受けたり、抑制されたり、また、目的とする
蛋白質を精製するのに手間がかかるという問題点があ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトＨＧ
Ｆ（ｈＨＧＦ）遺伝子を組み込んだＣＨＯ細胞を無血清
培地で培養して、ｈＨＧＦを産生させることを試みた。
５〜１０％の血清存在下では、すべてのｈＨＧＦは２本
鎖の型をとっていたが、無血清培養下で産生されたｈＨ
ＧＦの大半は、１本鎖型のｈＨＧＦであり、約２０〜３
０％のみが２本鎖ｈＨＧＦであった。ｈＨＧＦの生理活
性は、ｉｎｖｉｔｒｏ実験において１本鎖では見られ
ず、２本鎖になった場合に発現することが知られてい
る。
Ｆ（ｈＨＧＦ）遺伝子を組み込んだＣＨＯ細胞を無血清
培地で培養して、ｈＨＧＦを産生させることを試みた。
５〜１０％の血清存在下では、すべてのｈＨＧＦは２本
鎖の型をとっていたが、無血清培養下で産生されたｈＨ
ＧＦの大半は、１本鎖型のｈＨＧＦであり、約２０〜３
０％のみが２本鎖ｈＨＧＦであった。ｈＨＧＦの生理活
性は、ｉｎｖｉｔｒｏ実験において１本鎖では見られ
ず、２本鎖になった場合に発現することが知られてい
る。
【０００５】本発明者らは、ｈＨＧＦは１本鎖で培養液
中に分泌されて、血清中のプロテアーゼ又はＣＨＯ細胞
由来のプロテアーゼによって２本鎖に切断されるものと
考え、活性型の２本鎖ｈＨＧＦを効率的に調製すること
を目的として、ｈＨＧＦの切断に関与するプロテアーゼ
活性を持つタンパク質の精製を試みた。その結果、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約
３４０００ダルトン〜約３８０００ダルトンの、プロテ
アーゼ活性を有する新規のタンパク質を見い出し、本発
明を完成するに至った。
中に分泌されて、血清中のプロテアーゼ又はＣＨＯ細胞
由来のプロテアーゼによって２本鎖に切断されるものと
考え、活性型の２本鎖ｈＨＧＦを効率的に調製すること
を目的として、ｈＨＧＦの切断に関与するプロテアーゼ
活性を持つタンパク質の精製を試みた。その結果、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約
３４０００ダルトン〜約３８０００ダルトンの、プロテ
アーゼ活性を有する新規のタンパク質を見い出し、本発
明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明の要旨は、下記の理化学的性
質を有することを特徴とする新規なタンパク質に存す
る。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量が約３４，０００〜約３８，０００ダルトンである。 ７２８アミノ酸残基より成るヒト肝細胞増殖因子をそ
のアミノ末端から４９４番目のアミノ酸であるアルギニ
ンと４９５番目のアミノ酸であるバリンとの間で特異的
に切断するプロテアーゼ活性を有する。
質を有することを特徴とする新規なタンパク質に存す
る。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量が約３４，０００〜約３８，０００ダルトンである。 ７２８アミノ酸残基より成るヒト肝細胞増殖因子をそ
のアミノ末端から４９４番目のアミノ酸であるアルギニ
ンと４９５番目のアミノ酸であるバリンとの間で特異的
に切断するプロテアーゼ活性を有する。
【０００７】本タンパク質を無血清培養下のｈＨＧＦ生
産時に適量添加することにより、ほぼ１００％２本鎖の
ｈＨＧＦを得ることができ、また、試験管内で本タンパ
ク質を作用させると、１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦ
に変えることができる。本発明をさらに詳細に説明する
に、本発明のプロテアーゼ活性を有する新規なタンパク
質は、以下のような精製段階を経ることにより得られ
る。例えば健常人より採血した血液を、ガラス容器中、
冷蔵庫内で、一晩放置後、生じた血ぺいと細胞を遠心分
離により除去後、０．４μｍの目のフィルターでろ過し
たヒト血清、又は、市販の種々の動物血清（Ｇｉｂｃｏ
社製のウシ胎児血清、ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ社製のウシ血清、ウマ血清、ブタ血清等）を材料とす
る。これら血清を水で１．５〜２倍に希釈後、Ｈｅｐａ
ｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社製
等）等に供する。そのカラムクロマトグラフィーより得
られた当該タンパク質を含むフラクションを疎水クロマ
トグラフィー（たとえば、ファルマシア社製Ｐｈｅｎｙ
ｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム等）にかける。得られた
当該タンパク質を含むフラクションをＡｐｒｏｔｉｎｉ
ｎ固定化アフィニティーカラム（ペンタファーム社製
等）に供し、その後で、ゲルろ過カラムクロマトグラフ
ィー（旭化成社製ＧＳ５２０等）で処理することによ
り、本タンパク質を得ることができる。必要に応じて、
イオン交換カラムクロマトグラフィー、ハイドロキシア
パタイトカラムクロマトグラフィー等を精製のステップ
に組み込むこともできる。
産時に適量添加することにより、ほぼ１００％２本鎖の
ｈＨＧＦを得ることができ、また、試験管内で本タンパ
ク質を作用させると、１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦ
に変えることができる。本発明をさらに詳細に説明する
に、本発明のプロテアーゼ活性を有する新規なタンパク
質は、以下のような精製段階を経ることにより得られ
る。例えば健常人より採血した血液を、ガラス容器中、
冷蔵庫内で、一晩放置後、生じた血ぺいと細胞を遠心分
離により除去後、０．４μｍの目のフィルターでろ過し
たヒト血清、又は、市販の種々の動物血清（Ｇｉｂｃｏ
社製のウシ胎児血清、ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ社製のウシ血清、ウマ血清、ブタ血清等）を材料とす
る。これら血清を水で１．５〜２倍に希釈後、Ｈｅｐａ
ｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社製
等）等に供する。そのカラムクロマトグラフィーより得
られた当該タンパク質を含むフラクションを疎水クロマ
トグラフィー（たとえば、ファルマシア社製Ｐｈｅｎｙ
ｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム等）にかける。得られた
当該タンパク質を含むフラクションをＡｐｒｏｔｉｎｉ
ｎ固定化アフィニティーカラム（ペンタファーム社製
等）に供し、その後で、ゲルろ過カラムクロマトグラフ
ィー（旭化成社製ＧＳ５２０等）で処理することによ
り、本タンパク質を得ることができる。必要に応じて、
イオン交換カラムクロマトグラフィー、ハイドロキシア
パタイトカラムクロマトグラフィー等を精製のステップ
に組み込むこともできる。
【０００８】精製された本発明のタンパク質はＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約３４，０
００ダルトンから約３８，０００ダルトンの間にあり、
単独で、１本鎖ｈＨＧＦを、特定の位置で切断すること
により、２本鎖ｈＨＧＦを生じさせるプロテアーゼ活性
を有する。また、本発明のタンパク質を、還元カルボキ
シメチル化処理後、逆相カラムクロマトグラフィー（ワ
イ エム シー 社製ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ４カラム
等）で処理することにより得られる主要なペプチドは配
列番号：１に記載のＮ末端アミノ酸配列を含む。
ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約３４，０
００ダルトンから約３８，０００ダルトンの間にあり、
単独で、１本鎖ｈＨＧＦを、特定の位置で切断すること
により、２本鎖ｈＨＧＦを生じさせるプロテアーゼ活性
を有する。また、本発明のタンパク質を、還元カルボキ
シメチル化処理後、逆相カラムクロマトグラフィー（ワ
イ エム シー 社製ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ４カラム
等）で処理することにより得られる主要なペプチドは配
列番号：１に記載のＮ末端アミノ酸配列を含む。
【０００９】
【発明の効果】本発明に係わるプロテアーゼ活性を有す
るタンパク質は１本鎖ｈＨＧＦを活性型の２本鎖ｈＨＧ
Ｆに変換する能力を持つため、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでのｈＨＧＦの活性の調節因子として、
また２本鎖ｈＨＧＦを無血清培養時や試験管内で調製す
るために使用される。
るタンパク質は１本鎖ｈＨＧＦを活性型の２本鎖ｈＨＧ
Ｆに変換する能力を持つため、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでのｈＨＧＦの活性の調節因子として、
また２本鎖ｈＨＧＦを無血清培養時や試験管内で調製す
るために使用される。
【００１０】
【実施例】以下の実施例により、本発明をさらにより詳
細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限り、
以下の実施例によって限定されるものではない。 実施例１（ウシ胎児血清を用いての当該タンパク質の精
製とアミノ酸配列解析） ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を水で１．５倍に希釈
し、それをＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
（ファルマシア社製：１．５倍に水で希釈されたダルベ
ッコのＰＢＳで平衡化されている）に添加し、緩衝液Ａ
（１０mM ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファ
ー，pH７．０，０．１Ｍ ＮａＣｌ含）で洗浄後、この
緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（１０mM ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2
ＨＰＯ4 バッファー，pH７．０，０．７Ｍ ＮａＣｌ
含）を用いて、ＮａＣｌ濃度０．１Ｍから０．７Ｍの濃
度勾配溶出を行った。そして、１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖
ｈＨＧＦに変換するプロテアーゼ活性が存在する画分
（約３００〜４５０mM ＮａＣｌ画分）を回収した。こ
の画分を、２Ｍ硫酸アンモニウムと等量混合後、１Ｍ硫
酸アンモニウムで平衡化されたＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社製）に添加した。１
Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄後、硫酸アンモニウム１Ｍか
ら０Ｍへの負の濃度勾配溶出を行い、１本鎖ｈＨＧＦを
２本鎖ｈＨＧＦに変換するプロテアーゼ活性が存在する
画分（約６００〜４００mM硫酸アンモニウム画分）を回
収した。当画分を緩衝液Ｃ（３００mM ＮａＣｌ，５０
mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，pH８．０）に一晩透析後、緩衝
液Ｃで平衡化したＡｐｒｏｔｉｎｉｎ固定化カラム（ペ
ンタファーム社製）に添加した。緩衝液Ｃで洗浄後、緩
衝液Ｄ（０．１Ｎ ＨＣｌ，２０mM ＣａＣｌ2 ）で溶
出した。溶出画分を集め、緩衝液Ｅ（１Ｍ Ｔｒｉｓ／
ＨＣｌ，pH８．０）で中和後、限外ろ過膜で濃縮した。
この濃縮液を、緩衝液Ｃを用いて０．５ml／min の流速
で平衡化したＧＳ５２０カラム（旭化成社製）に添加し
た。分子量約３６，０００ダルトンの位置のピークを分
取し、この標品を用いて以下に述べるアミノ酸配列の解
析を行った。
細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限り、
以下の実施例によって限定されるものではない。 実施例１（ウシ胎児血清を用いての当該タンパク質の精
製とアミノ酸配列解析） ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を水で１．５倍に希釈
し、それをＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
（ファルマシア社製：１．５倍に水で希釈されたダルベ
ッコのＰＢＳで平衡化されている）に添加し、緩衝液Ａ
（１０mM ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファ
ー，pH７．０，０．１Ｍ ＮａＣｌ含）で洗浄後、この
緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（１０mM ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2
ＨＰＯ4 バッファー，pH７．０，０．７Ｍ ＮａＣｌ
含）を用いて、ＮａＣｌ濃度０．１Ｍから０．７Ｍの濃
度勾配溶出を行った。そして、１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖
ｈＨＧＦに変換するプロテアーゼ活性が存在する画分
（約３００〜４５０mM ＮａＣｌ画分）を回収した。こ
の画分を、２Ｍ硫酸アンモニウムと等量混合後、１Ｍ硫
酸アンモニウムで平衡化されたＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社製）に添加した。１
Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄後、硫酸アンモニウム１Ｍか
ら０Ｍへの負の濃度勾配溶出を行い、１本鎖ｈＨＧＦを
２本鎖ｈＨＧＦに変換するプロテアーゼ活性が存在する
画分（約６００〜４００mM硫酸アンモニウム画分）を回
収した。当画分を緩衝液Ｃ（３００mM ＮａＣｌ，５０
mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，pH８．０）に一晩透析後、緩衝
液Ｃで平衡化したＡｐｒｏｔｉｎｉｎ固定化カラム（ペ
ンタファーム社製）に添加した。緩衝液Ｃで洗浄後、緩
衝液Ｄ（０．１Ｎ ＨＣｌ，２０mM ＣａＣｌ2 ）で溶
出した。溶出画分を集め、緩衝液Ｅ（１Ｍ Ｔｒｉｓ／
ＨＣｌ，pH８．０）で中和後、限外ろ過膜で濃縮した。
この濃縮液を、緩衝液Ｃを用いて０．５ml／min の流速
で平衡化したＧＳ５２０カラム（旭化成社製）に添加し
た。分子量約３６，０００ダルトンの位置のピークを分
取し、この標品を用いて以下に述べるアミノ酸配列の解
析を行った。
【００１１】尚、上記の各精製工程において、後述実施
例３に記載の方法で、１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦ
に変換する活性を指標として、分画精製した。上記の精
製されたプロテアーゼ活性を有するタンパク質を、緩衝
液Ｆ（６Ｍ塩酸グアニジン，０．００２Ｍエチレンジア
ミン４酢酸塩、１Ｍトリス塩酸バッファー，pH８．５）
中で、２−メルカプトエタノールにより、４０℃，２時
間還元した後、等濃度のモノヨード酢酸を加え、窒素ガ
ス下、室温、遮光下で１時間反応させ、カルボキシメチ
ル化を行った。反応後、ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ４カラム
（ワイ エム シー 社製）に添加し、アセトニトリル
／イソプロピルアルコール（３／７）濃度１０％から７
０％まで３０分間の濃度勾配溶出を行い、１本の主要な
ピークを分取した。このピークを真空状態で乾燥した
後、５０％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）６０μｌに溶解
し、ポリブレン処理したグラスフィルターに添加し、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４７０Ａシー
クエンサーでエドマン分解し、Ｎ末端域のアミノ酸配列
を決定した。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミ
ノ酸の同定は、三菱化成社製“ＭＣＩ ｇｅｌ ＯＤＳ
ＩＨＵ”（０．４６×１５cm）カラムを用い、酢酸緩
衝液（１０mM酢酸緩衝液，pH４．７，０．０１％ＳＤ
Ｓ，３８％アセトニトリル）による単一溶媒溶出法を流
速１．２ml／分、温度４３℃で行い、ＰＴＨアミノ酸の
検出は２６９nmの吸光度で行った。
例３に記載の方法で、１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦ
に変換する活性を指標として、分画精製した。上記の精
製されたプロテアーゼ活性を有するタンパク質を、緩衝
液Ｆ（６Ｍ塩酸グアニジン，０．００２Ｍエチレンジア
ミン４酢酸塩、１Ｍトリス塩酸バッファー，pH８．５）
中で、２−メルカプトエタノールにより、４０℃，２時
間還元した後、等濃度のモノヨード酢酸を加え、窒素ガ
ス下、室温、遮光下で１時間反応させ、カルボキシメチ
ル化を行った。反応後、ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ４カラム
（ワイ エム シー 社製）に添加し、アセトニトリル
／イソプロピルアルコール（３／７）濃度１０％から７
０％まで３０分間の濃度勾配溶出を行い、１本の主要な
ピークを分取した。このピークを真空状態で乾燥した
後、５０％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）６０μｌに溶解
し、ポリブレン処理したグラスフィルターに添加し、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４７０Ａシー
クエンサーでエドマン分解し、Ｎ末端域のアミノ酸配列
を決定した。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミ
ノ酸の同定は、三菱化成社製“ＭＣＩ ｇｅｌ ＯＤＳ
ＩＨＵ”（０．４６×１５cm）カラムを用い、酢酸緩
衝液（１０mM酢酸緩衝液，pH４．７，０．０１％ＳＤ
Ｓ，３８％アセトニトリル）による単一溶媒溶出法を流
速１．２ml／分、温度４３℃で行い、ＰＴＨアミノ酸の
検出は２６９nmの吸光度で行った。
【００１２】この結果、還元カルボキシメチル化された
このタンパク質から得られる１つのペプチドのＮ末端ア
ミノ酸配列は、後述の配列番号：１に示すようであっ
た。また、還元カルボキシメチル化せずに、当該タンパ
ク質をＹＭＣ ｐａｃｋＣ４カラムに添加し、アセトニ
トリル／イソプロピルアルコール（３／７）濃度１０％
から７０％まで３０分間の濃度勾配溶出を行い、１本の
ピークを分取した。このピークを真空状態で乾燥した
後、同様にＮ末端域のアミノ酸配列を分析した。この結
果、カルボキシメチル化されたペプチドから得られたＮ
末端アミノ酸配列を含む、等モルの２個のアミノ酸が各
位置で検出された。アミノ酸配列を下記に示す。 Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ − − − − − − − −・・・ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｘａａ Ｇｌｕ Ａｌａ （Ｘａａは未同定のアミノ酸） このことより、当該タンパク質は２本鎖のタンパク質で
ある可能性が示された。
このタンパク質から得られる１つのペプチドのＮ末端ア
ミノ酸配列は、後述の配列番号：１に示すようであっ
た。また、還元カルボキシメチル化せずに、当該タンパ
ク質をＹＭＣ ｐａｃｋＣ４カラムに添加し、アセトニ
トリル／イソプロピルアルコール（３／７）濃度１０％
から７０％まで３０分間の濃度勾配溶出を行い、１本の
ピークを分取した。このピークを真空状態で乾燥した
後、同様にＮ末端域のアミノ酸配列を分析した。この結
果、カルボキシメチル化されたペプチドから得られたＮ
末端アミノ酸配列を含む、等モルの２個のアミノ酸が各
位置で検出された。アミノ酸配列を下記に示す。 Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ − − − − − − − −・・・ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｘａａ Ｇｌｕ Ａｌａ （Ｘａａは未同定のアミノ酸） このことより、当該タンパク質は２本鎖のタンパク質で
ある可能性が示された。
【００１３】実施例２（ヒト血清を用いての当該タンパ
ク質の精製とアミノ酸配列解析） 常法により得られたヒト血清を水で１．５倍に希釈し、
それを実施例１と同様の方法でＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅカラムを用いて濃度勾配溶出を行った。そ
して、１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦに変換するプロ
テアーゼ活性が存在する画分（約３００〜４５０mM Ｎ
ａＣｌ画分）を回収した。この画分を実施例１と同様の
方法でＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファ
ルマシア社製）を用いて負の濃度勾配溶出を行い、１本
鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦに変換するプロテアーゼ活
性が存在する画分（約７００〜５００mM硫酸アンモニウ
ム画分）を回収した。以下、実施例１と同様の方法によ
り処理し、分子量約３０，０００ダルトンの位置のピー
クを分取し、この標品を用いて以下に述べるアミノ酸配
列の解析を行った。
ク質の精製とアミノ酸配列解析） 常法により得られたヒト血清を水で１．５倍に希釈し、
それを実施例１と同様の方法でＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅカラムを用いて濃度勾配溶出を行った。そ
して、１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦに変換するプロ
テアーゼ活性が存在する画分（約３００〜４５０mM Ｎ
ａＣｌ画分）を回収した。この画分を実施例１と同様の
方法でＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファ
ルマシア社製）を用いて負の濃度勾配溶出を行い、１本
鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦに変換するプロテアーゼ活
性が存在する画分（約７００〜５００mM硫酸アンモニウ
ム画分）を回収した。以下、実施例１と同様の方法によ
り処理し、分子量約３０，０００ダルトンの位置のピー
クを分取し、この標品を用いて以下に述べるアミノ酸配
列の解析を行った。
【００１４】尚、上記の各精製工程において、後述実施
例３に記載の方法で、１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦ
に変換する活性を指標として、分画精製した。上記の精
製されたプロテアーゼ活性を有するタンパク質のＮ末端
域のアミノ酸配列を実施例１と同様の方法で決定した。
この結果、還元カルボキシメチル化されたこのタンパク
質から得られる１つのペプチドのＮ末端アミノ酸配列
は、後述の配列番号：１に示すようであった。
例３に記載の方法で、１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦ
に変換する活性を指標として、分画精製した。上記の精
製されたプロテアーゼ活性を有するタンパク質のＮ末端
域のアミノ酸配列を実施例１と同様の方法で決定した。
この結果、還元カルボキシメチル化されたこのタンパク
質から得られる１つのペプチドのＮ末端アミノ酸配列
は、後述の配列番号：１に示すようであった。
【００１５】また、還元カルボキシメチル化せずに、当
該タンパク質をＹＭＣ ｐａｃｋＣ４カラムに添加し、
アセトニトリル／イソプロピルアルコール（３／７）濃
度１０％から７０％まで３０分間の濃度勾配溶出を行い
１本のピークを分取した。このピークを真空状態で乾燥
した後、同様にＮ末端域のアミノ酸配列を分析した。こ
の結果、カルボキシメチル化されたペプチドから得られ
たＮ末端アミノ酸配列を含む、等モルの２個のアミノ酸
が各位置で検出された。Ｎ末端アミノ酸配列を下記に示
す。 Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ − − − − − − − −・・・ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｘａａ （Ｘａａは未同定のアミノ酸） このことより、当該タンパク質は２本鎖のタンパク質で
ある可能性が示された。
該タンパク質をＹＭＣ ｐａｃｋＣ４カラムに添加し、
アセトニトリル／イソプロピルアルコール（３／７）濃
度１０％から７０％まで３０分間の濃度勾配溶出を行い
１本のピークを分取した。このピークを真空状態で乾燥
した後、同様にＮ末端域のアミノ酸配列を分析した。こ
の結果、カルボキシメチル化されたペプチドから得られ
たＮ末端アミノ酸配列を含む、等モルの２個のアミノ酸
が各位置で検出された。Ｎ末端アミノ酸配列を下記に示
す。 Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ − − − − − − − −・・・ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｘａａ （Ｘａａは未同定のアミノ酸） このことより、当該タンパク質は２本鎖のタンパク質で
ある可能性が示された。
【００１６】実施例３（当該タンパク質の１本鎖ｈＨＧ
Ｆを２本鎖ｈＨＧＦに変換する活性を測定する方法とそ
の活性） 測定しようとするサンプル１０μｌを、５μｇ１本鎖ｈ
ＨＧＦを含む１００mMＮａＣｌ，５０mMトリス塩酸バッ
ファー，pH８．０溶液４０μｌに添加した。３７℃で３
時間インキュベーション後、この混合液を、還元条件下
でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
電気泳動後、クマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｃ
ＢＢ）で染色し、１本鎖ｈＨＧＦと２本鎖ｈＨＧＦの割
合を比較することで、活性を検出した。
Ｆを２本鎖ｈＨＧＦに変換する活性を測定する方法とそ
の活性） 測定しようとするサンプル１０μｌを、５μｇ１本鎖ｈ
ＨＧＦを含む１００mMＮａＣｌ，５０mMトリス塩酸バッ
ファー，pH８．０溶液４０μｌに添加した。３７℃で３
時間インキュベーション後、この混合液を、還元条件下
でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
電気泳動後、クマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｃ
ＢＢ）で染色し、１本鎖ｈＨＧＦと２本鎖ｈＨＧＦの割
合を比較することで、活性を検出した。
【００１７】また、最終的に精製された当該タンパク質
を１本鎖ｈＨＧＦと上記条件で反応させた後、反応液を
緩衝液Ｆにバッファー置換させ、実施例１と同様の方法
で還元カルボキシメチル化反応を行った。反応後、ＹＭ
Ｃ ｐａｃｋ Ｃ４カラム（ワイ エム シー 社製）
に添加し、アセトニトリル濃度１０％から７０％まで３
０分間の濃度勾配にて溶出を行い各ピークを分取した。
還元カルボキシメチル化された天然の２本鎖ｈＨＧＦと
同じ位置に溶出したピークについて、実施例１と同様の
方法で、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行い、天然のｈＨＧ
Ｆの２本鎖への開裂部位であるＶａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ・・・の配列を確認した。従
って当該プロテアーゼ活性を持つタンパク質は、１本鎖
ｈＨＧＦを、天然の開裂部位である配列のところで切断
することが明らかになった。なお、１本鎖のｈＨＧＦは
後述の参考例に示す方法にて調製した。 実施例４（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動） ウシ胎児血清とヒト血清より実施例１と２に従って精製
されたプロテアーゼ活性を持つ当該タンパク質の見かけ
上の分子量を求めるため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行った。最終的に精製された当該タンパ
ク質を１２．５％のポリアクリルアミド・スラブゲルを
用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に、非
還元下で供した。分子量マーカーとしては、分子量マー
カー「第一」III Ｌａｅｍｍｌｉ法用（第一化学薬品社
製）を用いた。電気泳動後、銀染色試薬（関東化学社
製）を用いて発色させた。当該タンパク質と標準分子量
マーカータンパク質との泳動距離の相対的比較により、
ウシ胎児血清由来のタンパク質はＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動上のみかけの分子量として約３８，
０００ダルトンであり、ヒト血清由来のタンパク質は約
３４，０００ダルトンであった。
を１本鎖ｈＨＧＦと上記条件で反応させた後、反応液を
緩衝液Ｆにバッファー置換させ、実施例１と同様の方法
で還元カルボキシメチル化反応を行った。反応後、ＹＭ
Ｃ ｐａｃｋ Ｃ４カラム（ワイ エム シー 社製）
に添加し、アセトニトリル濃度１０％から７０％まで３
０分間の濃度勾配にて溶出を行い各ピークを分取した。
還元カルボキシメチル化された天然の２本鎖ｈＨＧＦと
同じ位置に溶出したピークについて、実施例１と同様の
方法で、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行い、天然のｈＨＧ
Ｆの２本鎖への開裂部位であるＶａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ・・・の配列を確認した。従
って当該プロテアーゼ活性を持つタンパク質は、１本鎖
ｈＨＧＦを、天然の開裂部位である配列のところで切断
することが明らかになった。なお、１本鎖のｈＨＧＦは
後述の参考例に示す方法にて調製した。 実施例４（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動） ウシ胎児血清とヒト血清より実施例１と２に従って精製
されたプロテアーゼ活性を持つ当該タンパク質の見かけ
上の分子量を求めるため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行った。最終的に精製された当該タンパ
ク質を１２．５％のポリアクリルアミド・スラブゲルを
用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に、非
還元下で供した。分子量マーカーとしては、分子量マー
カー「第一」III Ｌａｅｍｍｌｉ法用（第一化学薬品社
製）を用いた。電気泳動後、銀染色試薬（関東化学社
製）を用いて発色させた。当該タンパク質と標準分子量
マーカータンパク質との泳動距離の相対的比較により、
ウシ胎児血清由来のタンパク質はＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動上のみかけの分子量として約３８，
０００ダルトンであり、ヒト血清由来のタンパク質は約
３４，０００ダルトンであった。
【００１８】実施例５（当該タンパク質の無血清培養へ
の添加） 欧州公開特許第４１２５５７号に記載された方法に従っ
て作製されたヒトＨＧＦ産生組換えＣＨＯ細胞（１×１
０5 cells／ml）を５％牛胎児血清を含有するｅ−ＲＤ
Ｆ培地１５ml，１０cm ｄｉｓｈ中で、５％ＣＯ2 雰囲
気下、３７℃で培養増殖させた。培養約４日後、コンフ
ルエントな状態に達した時点で、実施例１で得た牛胎児
血清由来の当該タンパク質を含む無血清培地ｅ−ＲＤＦ
１５mlに移し換え、更に２日間培養を続けた。培養上清
を回収して、緩衝液Ｇ（０．３ＭＮａＣｌ，１０mM Ｎ
ａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファー，pH７．５）
で平衡化したＳ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマ
シア社製）に添加した。緩衝液Ｇで十分洗浄後、１Ｍ
ＮａＣｌを含む１０mM ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ
4 バッファー（pH７．５）で溶出した。溶出液を集め、
限外ろ過膜により濃縮し、１２．５％ポリアクリルアミ
ド・スラブゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動に、還元下で供した。電気泳動後、ＣＢＢで染色
し、１本鎖ｈＨＧＦと２本鎖ｈＨＧＦの割合いを比較し
た。結果を図１に示す。図中、１は当該タンパク質無添
加の場合を、２は培地に当該タンパク質を約３０ng／ml
添加した場合の結果を表わす。
の添加） 欧州公開特許第４１２５５７号に記載された方法に従っ
て作製されたヒトＨＧＦ産生組換えＣＨＯ細胞（１×１
０5 cells／ml）を５％牛胎児血清を含有するｅ−ＲＤ
Ｆ培地１５ml，１０cm ｄｉｓｈ中で、５％ＣＯ2 雰囲
気下、３７℃で培養増殖させた。培養約４日後、コンフ
ルエントな状態に達した時点で、実施例１で得た牛胎児
血清由来の当該タンパク質を含む無血清培地ｅ−ＲＤＦ
１５mlに移し換え、更に２日間培養を続けた。培養上清
を回収して、緩衝液Ｇ（０．３ＭＮａＣｌ，１０mM Ｎ
ａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファー，pH７．５）
で平衡化したＳ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマ
シア社製）に添加した。緩衝液Ｇで十分洗浄後、１Ｍ
ＮａＣｌを含む１０mM ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ
4 バッファー（pH７．５）で溶出した。溶出液を集め、
限外ろ過膜により濃縮し、１２．５％ポリアクリルアミ
ド・スラブゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動に、還元下で供した。電気泳動後、ＣＢＢで染色
し、１本鎖ｈＨＧＦと２本鎖ｈＨＧＦの割合いを比較し
た。結果を図１に示す。図中、１は当該タンパク質無添
加の場合を、２は培地に当該タンパク質を約３０ng／ml
添加した場合の結果を表わす。
【００１９】参考例 一本鎖型組換えｈＨＧＦ（ｒ−ｈＨＧＦ）生産方法 培養容器としてＴ−１５０フラスコを用いてｒ−ｈＨＧ
Ｆ産生組換えＣＨＯ細胞を５％牛胎児血清を含む基本合
成培地ｅ−ＲＤＦ６０ml中、３７℃で培養増殖させた。
培養約４日後、コンフルエントな状態に達した時点で、
血清を含む培養液を除去し、新しいｅ−ＲＤＦ培地６０
mlを添加し、さらに一日培養した。次の日、その培養液
を除去し、ｅ−ＲＤＦ培地６０mlで細胞を一度洗浄後、
以下の生産培地を添加し、２日間、３７℃で培養するこ
とにより、一本鎖ｒ−ｈＨＧＦを産生させた。
Ｆ産生組換えＣＨＯ細胞を５％牛胎児血清を含む基本合
成培地ｅ−ＲＤＦ６０ml中、３７℃で培養増殖させた。
培養約４日後、コンフルエントな状態に達した時点で、
血清を含む培養液を除去し、新しいｅ−ＲＤＦ培地６０
mlを添加し、さらに一日培養した。次の日、その培養液
を除去し、ｅ−ＲＤＦ培地６０mlで細胞を一度洗浄後、
以下の生産培地を添加し、２日間、３７℃で培養するこ
とにより、一本鎖ｒ−ｈＨＧＦを産生させた。
【００２０】培養後、遠心により細胞を除去した培養上
清を回収した。この培養上清より、２本鎖ｒ−ｈＨＧＦ
精製と同じ条件にて、Ｓ−セファロースカラムにて、一
本鎖ｒ−ｈＨＧＦを精製した。この精製標品は、全ｒ−
ｈＨＧＦ量に対して、一本鎖ｒ−ｈＨＧＦを約９０％含
んでいた。 生産培地 ｅ−ＲＤＦ ６０ml この基本合成培地に以下の物を添加 インスリン １０μｇ／ml トランスフェリン １０μｇ／ml セレナイト １０-8Ｍ エタノールアミン １０-5Ｍ アプロチニン ５０ＫＩＵ／ml メシル酸ナファモスタット（６−アミジノ−２ナフチル
ｐ−グアニジノベンゾアートジメタンスルフォネート）
５０μＭ
清を回収した。この培養上清より、２本鎖ｒ−ｈＨＧＦ
精製と同じ条件にて、Ｓ−セファロースカラムにて、一
本鎖ｒ−ｈＨＧＦを精製した。この精製標品は、全ｒ−
ｈＨＧＦ量に対して、一本鎖ｒ−ｈＨＧＦを約９０％含
んでいた。 生産培地 ｅ−ＲＤＦ ６０ml この基本合成培地に以下の物を添加 インスリン １０μｇ／ml トランスフェリン １０μｇ／ml セレナイト １０-8Ｍ エタノールアミン １０-5Ｍ アプロチニン ５０ＫＩＵ／ml メシル酸ナファモスタット（６−アミジノ−２ナフチル
ｐ−グアニジノベンゾアートジメタンスルフォネート）
５０μＭ
【００２１】［配列表］ 配列番号：１ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント （２本鎖の内の１本のＮ末端フラグメント） 起源：生物名：ヒト，ウシ 組織の種類：血清 配列 Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １ ５ ８
【００２２】 配列番号：２ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント （２本鎖の内の１本のＮ末端フラグメント） 起源：生物名：ウシ 組織の種類：血清 配列 Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｘａａ Ｇｌｕ Ａｌａ １ ５ ８ （Ｘａａは未同定のアミノ酸）
【００２３】 配列番号：３ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント （２本鎖の内の１本のＮ末端フラグメント） 起源：生物名：ヒト 組織の種類：血清 配列 Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｘａａ １ ５ ８ （Ｘａａは未同定のアミノ酸）
【図１】本発明のタンパク質の存在の有無による１本鎖
ｈＨＧＦおよび２本鎖ｈＨＧＦの生成割合を示す図面で
ある。
ｈＨＧＦおよび２本鎖ｈＨＧＦの生成割合を示す図面で
ある。
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とする新規なタンパク質。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量が約３４，０００〜約３８，０００ダルトンである。 ７２８アミノ酸残基より成るヒト肝細胞増殖因子をそ
のアミノ末端から４９４番目のアミノ酸であるアルギニ
ンと４９５番目のアミノ酸であるバリンとの間で特異的
に切断するプロテアーゼ活性を有する。 - 【請求項２】 下記の部分アミノ酸配列を有することを
特徴とする請求項１記載のタンパク質。 Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １ ５
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27136291A JP3213985B2 (ja) | 1991-10-18 | 1991-10-18 | 新規なタンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27136291A JP3213985B2 (ja) | 1991-10-18 | 1991-10-18 | 新規なタンパク質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05103670A true JPH05103670A (ja) | 1993-04-27 |
| JP3213985B2 JP3213985B2 (ja) | 2001-10-02 |
Family
ID=17499018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27136291A Expired - Lifetime JP3213985B2 (ja) | 1991-10-18 | 1991-10-18 | 新規なタンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3213985B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0596524A2 (en) * | 1992-11-05 | 1994-05-11 | Mitsubishi Chemical Corporation | Hepatocyte growth factor HGF converting protease and gene encoding said protease |
| US7045602B2 (en) | 2000-12-05 | 2006-05-16 | Mitsubishi Chemical Corporation | Specific antibody directed to active hepatocyte growth factor activator and method for using the same |
| WO2017159722A1 (ja) * | 2016-03-17 | 2017-09-21 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | 活性型肝細胞増殖因子（ｈｇｆ）の製造方法 |
| US11547743B2 (en) | 2014-04-28 | 2023-01-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Lyophilized formulation of HGF |
-
1991
- 1991-10-18 JP JP27136291A patent/JP3213985B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0596524A2 (en) * | 1992-11-05 | 1994-05-11 | Mitsubishi Chemical Corporation | Hepatocyte growth factor HGF converting protease and gene encoding said protease |
| EP0596524A3 (en) * | 1992-11-05 | 1995-04-05 | Mitsubishi Chem Ind | Protease converting hepatocyte growth factor and gene encoding it. |
| US5466593A (en) * | 1992-11-05 | 1995-11-14 | Mitsubishi Kasei Corporation | Hepatocyte growth factor activating protease and gene encoding the protease |
| US5677164A (en) * | 1992-11-05 | 1997-10-14 | Mitsubishi Chemical Corporation | Hepatocyte growth factor activating protease and gene encoding the protease |
| US7045602B2 (en) | 2000-12-05 | 2006-05-16 | Mitsubishi Chemical Corporation | Specific antibody directed to active hepatocyte growth factor activator and method for using the same |
| US11547743B2 (en) | 2014-04-28 | 2023-01-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Lyophilized formulation of HGF |
| WO2017159722A1 (ja) * | 2016-03-17 | 2017-09-21 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | 活性型肝細胞増殖因子（ｈｇｆ）の製造方法 |
| KR20180127322A (ko) | 2016-03-17 | 2018-11-28 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | 활성 간세포 성장 인자(hgf)를 생성하는 방법 |
| CN109196099A (zh) * | 2016-03-17 | 2019-01-11 | 卫材R&D管理有限公司 | 用于生产活性肝细胞生长因子（hgf）的方法 |
| CN109196099B (zh) * | 2016-03-17 | 2022-01-11 | 卫材R&D管理有限公司 | 用于生产活性肝细胞生长因子(hgf)的方法 |
| AU2017232582B2 (en) * | 2016-03-17 | 2022-07-14 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for producing activated hepatocyte growth factor (HGF) |
| US11548926B2 (en) | 2016-03-17 | 2023-01-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for producing an active hepatocyte growth factor (HGF) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3213985B2 (ja) | 2001-10-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110845603B (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
| Fett et al. | Isolation and characterization of angiogenin, an angiogenic protein from human carcinoma cells | |
| JP3205578B2 (ja) | キメラ繊維芽細胞成長因子 | |
| Hampton et al. | Structural and functional characterization of full-length heparin-binding growth associated molecule. | |
| RU2093519C1 (ru) | Способ энзиматического получения основного фактора роста фибробластов bfgf (10 - 155) и фармацевтическая композиция на его основе | |
| JPH05178897A (ja) | 機能性ポリペプチド | |
| EP0621285B1 (en) | Novel megakaryocyte potentiator | |
| US5731412A (en) | Protein, DNA coding for same and method of producing the protein | |
| US20040053368A1 (en) | Collagen-binding hybrid polypeptide | |
| Caccia et al. | Stabilization of recombinant human basic fibroblast growth factor by chemical modifications of cysteine residues | |
| JP3213985B2 (ja) | 新規なタンパク質 | |
| US5656458A (en) | Expression and processing of amino terminus acetylated FGF's in yeast | |
| KR20030062854A (ko) | 분비형 벡터를 이용한 효모에서의 재조합 단백질의 제조방법 | |
| EP0241136A2 (en) | Human class 1 heparin-binding growth factor | |
| CA2002210C (en) | Expression and processing of authentic fgf's in yeast | |
| JP2829397B2 (ja) | フィブリン結合活性ポリペプチド | |
| Danley et al. | Identification and characterization of a C-terminally extended form of recombinant murine IL-6 | |
| US5807711A (en) | Parenchymal hepatocyte growth factors | |
| JP3610395B2 (ja) | 成熟肝実質細胞増殖因子 | |
| Betbeder et al. | Production of homogeneous basic fibroblast growth factor by specific enzymatic hydrolysis of larger microheterogeneous molecular forms | |
| Fulvia ROLETTO et al. | Escherichia zyxwvutsrqponm | |
| JPH01191695A (ja) | シグナルペプチドをコードしているｄｎａ | |
| JPS63316798A (ja) | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする創傷治療剤 | |
| Rosenberg | 4894440 Method of isolating megakaryocyte stimulatory factor | |
| JPH04128300A (ja) | ヒト神経成長因子蛋白質およびその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080727 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080727 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090727 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090727 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100727 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100727 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110727 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120727 Year of fee payment: 11 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120727 Year of fee payment: 11 |