CN114395029A - 一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及蛋白提取技术领域，具体公开了一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，所述大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，包括配制处理液对大肠杆菌进行预处理后离心，收集获得预处理菌体；利用蔗糖高渗溶液对预处理菌体进行处理后离心，最后用硫酸镁溶液进行处理后离心，即得所需的周质蛋白；上述方法先采用处理液对大肠杆菌的外膜进行干扰，从而使外膜失去完整性，失去了对渗透压的保护作用，再利用高浓度蔗糖溶液造成高渗透压让细胞收缩，最后利用低浓度的硫酸镁处理细胞，从而在保证大肠杆菌内膜完整性的前提下，诱导在细胞周质的蛋白充分释放，显著提高周质蛋白的提取纯度和提取率。
Description
技术领域
本申请涉及蛋白提取技术领域，更具体地说，它涉及一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法。
背景技术
由于大肠杆菌（Escherichiacoli）遗传背景清楚，操作简单，便于进行大规模培养等，因此常用于表达基因工程的重组蛋白，其在医药、农业等行业的应用非常广泛，是大多数科学研究及应用中实现蛋白表达的首选宿主。细胞周质（Periplasm）是由大肠杆菌内膜和外膜组成的双层膜结构，其氧化环境能提供一个适合外源蛋白正确折叠的环境。在大肠杆菌周质空间表达重组蛋白有着众多的优点，由于周质空间的蛋白含量低，蛋白酶活性要比胞质中低，使所表达的目的蛋白能避免胞内降解从而稳定地存在，有利于目的蛋白的浓缩。
在周质蛋白提取过程中，若内膜破损，会导致胞浆内核酸、脂质以及杂蛋白等物质释放出来，从而给后期目的蛋白的分离纯化带来困难。所以周质蛋白提取需要定向释放的技术，该技术的关键在于只破坏大肠杆菌外膜而不损害内膜，最终使大肠杆菌中内膜和外膜之间的蛋白定向释放至提取液中。
相关技术中，采用将菌体与Tris、EDTA溶液混匀后，室温条件进行长时间搅拌，获得周质空间蛋白提取液。上述方法操作过程简单，但是提取过程中的长时间搅拌(至少12h)，容易导致菌体破裂，从而导致得到的提取液过于粘稠，影响后期分离纯化；且该方法对周质蛋白的提取效率不高，有待进一步提升。因此，针对大肠杆菌周质蛋白的定向释放技术，急需研究出一种提取纯度高、提取率高的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法。
发明内容
为了提高大肠杆菌细胞周质蛋白的提取纯度和提取率，本申请提供了一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法。
本申请提供了一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，采用如下的技术方案：
一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，具体包括以下制备步骤：
S1、配制处理液，按含量规格50mL:1g，将大肠杆菌加入到处理液中，于30-40℃的温度下，静置处理20-40min，然后置于离心机中离心，弃去上清液，收集剩余菌体，得预处理菌体；
S2、按含量规格10mL:1g，取蔗糖高渗溶液和预处理菌体，用蔗糖高渗溶液充分悬浮预处理菌体，并用移液器轻柔吹打10-20min后，离心弃去上清液，收集剩余菌体，得高渗处理菌体；
S3、按含量规格20mL:1g，取2-7mM的硫酸镁溶液和高渗处理菌体，将硫酸镁溶液预冷至0-4℃后充分悬浮高渗处理菌体，并在冰上用移液器吹打10-30min后，离心收集上清液，即得所需的周质蛋白。
通过采用上述技术方案，上述方法先采用处理液对大肠杆菌的外膜进行干扰，从而使外膜失去完整性，失去了对渗透压的保护作用，再利用高浓度蔗糖溶液造成高渗透压让细胞收缩，最后利用低浓度的硫酸镁处理细胞，从而在保证大肠杆菌内膜完整性的前提下，诱导在细胞周质的蛋白充分释放，显著提高周质蛋白的提取纯度和提取率。
优选的，所述步骤S1中处理液包括10-20重量份的醋酸溶液、5-10重量份的壳聚糖和0.5-1.2重量份的负载纳米银。
通过采用上述技术方案，本申请采用醋酸溶液、壳聚糖和负载纳米银混合制得处理液，所得处理液能够有效抑制大肠杆菌的生长，对大肠杆菌的外膜进行干扰，优先破坏大肠杆菌外膜的选择渗透性屏障，从而使外膜失去完整性，通过控制三者的复配比例，能够可控的选择对大肠杆菌的外膜进行破坏处理，控制渗透屏障破坏程度。
优选的，所述负载纳米银由以下方法制得：
避光配制5-10mM的硝酸银溶液，将羟基磷灰石微粉加入到硝酸银溶液中，超声震荡混合1-2h后，在3000-4000rpm下离心10-20min，收集微粉，去离子水洗涤后，干燥即得所需的负载纳米银。
通过采用上述技术方案，本申请通过将羟基磷灰石加入到硝酸银溶液中，超声震荡后离心、洗涤制得负载纳米银；所得负载纳米银生物相容性好，细胞毒性小，对大肠杆菌细胞膜结构的干扰性强。
优选的，所述步骤S1中处理液的pH值为3.8-5.2。
通过采用上述技术方案，通过控制处理液的配比，处理液的pH值和处理时间，能够可控的选择对大肠杆菌的外膜进行破坏处理，控制渗透屏障破坏程度。
优选的，所述步骤S1中的大肠杆菌由以下方法培养而得：
（1）取100μL大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化，取1μL含欲表达蛋白的质粒与融化后的大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴20-40min后，置于35-45℃的温度下，水浴1-2min，再次冰浴1-2min后，加入100mL的LB液体培养基，于37±2℃摇床培养40-60min，然后在6000-8000rpm下离心3-8min，弃去上清液，收集剩余菌体重悬获得菌液；
（2）吸取10μL步骤（1）中重悬后的菌液于LB固体培养基上，并用涂布棒涂抹均匀，最后置于37±2℃的恒温箱中培养8-16h；
（3）从LB固体培养基中挑取适宜的菌落，加入100mL的LB液体培养基，置于37±2℃摇床培养14-16h，然后在6000-8000rpm下离心3-8min，弃去上清液，即得所需的大肠杆菌。
优选的，所述欲表达蛋白为22kD 的重组人生长激素。
通过采用上述技术方案，上述培养方法操作简便，菌体存活率高，欲表达蛋白产量高，最终获得的目的蛋白含量高。
优选的，所述步骤S1中离心条件为：在4000-5000rpm下离心5-10min。
优选的，所述步骤S1中离心条件为：在4500rpm下离心8min。
优选的，所述步骤S2中离心条件为：在1500-2500rpm下离心8-15min。
优选的，所述步骤S2中离心条件为：在2000rpm下离心12min。
优选的，所述步骤S3中离心条件为：于0-4℃的环境下，在1500-2500rpm下离心30-50min。
优选的，所述步骤S3中离心条件为：于4℃的环境下，在2000rpm下离心40min。
通过采用上述技术方案，本申请通过将提取操作过程中的离心条件控制在上述范围内，能够保证在准确获取目的产物的同时，加速操作进程，缩短处理周期。
优选的，所述步骤S2中蔗糖高渗溶液由以下方法配制而得：
将蔗糖溶解于pH为8.0的30mM的Tris溶液中，配制得到浓度为30-50%的蔗糖高渗溶液。
通过采用上述技术方案，配制所需浓度的蔗糖高渗溶液，对预处理菌体进行处理，利用高渗透压实现细胞收缩，进而为后续的渗透压冲击提供前提条件。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请提供的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，能够实现优先破坏大肠杆菌外膜的选择渗透性屏障，对大肠杆菌的外膜进行干扰，从而使外膜失去完整性，失去了对渗透压的保护作用，再利用高浓度蔗糖溶液造成高渗透压让细胞收缩，最后利用低浓度的硫酸镁处理细胞，从而在保证大肠杆菌内膜完整性的前提下，诱导在细胞周质的蛋白充分释放，显著提高周质蛋白的提取纯度和提取率。
本申请提供的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，方法操作过程简单，提取周期短，能够得到纯度和浓度都较高的目的蛋白，且不需要昂贵的仪器、设备和试剂，成本低廉，值得推广。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
制备例1-5提供了处理液的制备方法，以下以制备例1为例进行说明。
避光配制8mM的硝酸银溶液，将羟基磷灰石微粉加入到硝酸银溶液中，超声震荡混合1.5h后，在3500rpm下离心15min，收集微粉，去离子水洗涤后，干燥即得所需的负载纳米银；
将15g的醋酸溶液、8g的壳聚糖和0.8g的负载纳米银混合均匀制得所需的pH值为4.5的处理液。
制备例 2-5，同制备例1，不同之处仅在于：负载纳米银的制备参数和处理液的原料选用质量不同，具体见表1。
表1：
| 条件参数/原料用量 | 制备例1 | 制备例2 | 制备例3 | 制备例4 | 制备例5 |
| 硝酸银溶液配制浓度 | 8mM | 5mM | 6mM | 9mM | 10mM |
| 超声混合时间 | 1.5h | 1h | 1.2h | 1.8h | 2h |
| 离心转速 | 3500rpm | 3000rpm | 3200rpm | 3800rpm | 4000rpm |
| 离心时间 | 15min | 20min | 18min | 12min | 10min |
| 醋酸溶液用量 | 15g | 10g | 12g | 18g | 20g |
| 壳聚糖用量 | 8g | 5g | 6g | 9g | 10g |
| 负载纳米银用量 | 0.8g | 0.5g | 0.6g | 1g | 1.2g |
| pH值 | 4.5 | 3.8 | 4.2 | 4.8 | 5.2 |
制备例6-10提供了大肠杆菌的培养方法，以下以制备例6为例进行说明。
制备例6
（1）取100μL大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化，取1μL含欲表达蛋白的质粒与融化后的大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴30min后，置于40℃的温度下，水浴1.5min，再次冰浴1.5min后，加入100mL的LB液体培养基，于37℃摇床培养50min，然后在7000rpm下离心5min，弃去上清液，收集剩余菌体重悬获得菌液；
（2）吸取10μL步骤（1）中重悬后的菌液于LB固体培养基上，并用涂布棒涂抹均匀，最后置于37℃的恒温箱中培养8-16h；
（3）从LB固体培养基中挑取适宜的菌落，加入100mL的LB液体培养基，置于37℃摇床培养15h，然后在7000rpm下离心5min，弃去上清液，即得所需的大肠杆菌。
制备例 7-10，同制备例6，不同之处仅在于：大肠杆菌的培养条件参数不同，具体见表2。
表2
| 条件参数 | 制备例6 | 制备例7 | 制备例8 | 制备例9 | 制备例10 |
| 第一次冰浴时间 | 30min | 20min | 25min | 35min | 40min |
| 水浴温度 | 40℃ | 35℃ | 38℃ | 42℃ | 45℃ |
| 水浴时间 | 1.5min | 2min | 1.8min | 1.2min | 1min |
| 再次冰浴时间 | 1.5min | 1min | 1.2min | 1.8min | 2min |
| 第一次摇床培养温度 | 37℃ | 35℃ | 36℃ | 38℃ | 39℃ |
| 第一次摇床培养时间 | 50min | 40min | 45min | 55min | 60min |
| 第一次离心转速 | 7000rpm | 6000rpm | 6500rpm | 7500rpm | 8000rpm |
| 第一次离心时间 | 5min | 8min | 6min | 5min | 3min |
| 固体培养基培养温度 | 37℃ | 35℃ | 36℃ | 38℃ | 39℃ |
| 固体培养基培养时间 | 12h | 16h | 14h | 10h | 8h |
| 第二次摇床培养温度 | 37℃ | 35℃ | 36℃ | 38℃ | 39℃ |
| 第二次摇床培养时间 | 15h | 16h | 15.5h | 14.5h | 14h |
| 第二次离心转速 | 7000rpm | 6000rpm | 6500rpm | 7500rpm | 8000rpm |
| 第二次离心时间 | 5min | 8min | 6min | 5min | 3min |
实施例1-5提供了一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，以下以实施例1为例进行说明。
实施例1
本申请提供了一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，采用如下的技术方案：
一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，具体包括以下步骤：
S1、配制处理液，按含量规格50mL:1g，将大肠杆菌加入到处理液中，于30℃的温度下，静置处理40min，然后置于离心机中，在4000rpm下离心10min，弃去上清液，收集剩余菌体，得预处理菌体；
S2、将蔗糖溶解于pH为8.0的30mM的Tris溶液中，配制得到浓度为30%的蔗糖高渗溶液；
按含量规格10mL:1g，取蔗糖高渗溶液和预处理菌体，用蔗糖高渗溶液充分悬浮预处理菌体，并用移液器轻柔吹打10min后，在1500rpm下离心15min，离心弃去上清液，收集剩余菌体，得高渗处理菌体；
S3、按含量规格20mL:1g，取2mM的硫酸镁溶液和高渗处理菌体，将硫酸镁溶液预冷至0℃后充分悬浮高渗处理菌体，并在冰上用移液器吹打10min后，于0℃的环境下，在1500rpm下离心50min，离心收集上清液，即得所需的周质蛋白。
实施例 2-5，同实施例1，不同之处仅在于：提取过程中的具体条件参数不同，具体见表3。
表3：
| 条件参数 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 |
| 处理液制备例 | 制备例2 | 制备例3 | 制备例1 | 制备例4 | 制备例5 |
| 大肠杆菌制备例 | 制备例7 | 制备例8 | 制备例6 | 制备例9 | 制备例10 |
| 处理温度 | 30℃ | 32℃ | 35℃ | 38℃ | 40℃ |
| 处理时间 | 40min | 35min | 30min | 25min | 20min |
| 步骤S1离心转速 | 4000rpm | 4200rpm | 4500rpm | 4800rpm | 5000rpm |
| 步骤S1离心时间 | 10min | 9min | 8min | 6min | 5min |
| 蔗糖高渗溶液浓度 | 30% | 35% | 40% | 45% | 50% |
| 高渗处理吹打时间 | 10min | 12min | 15min | 18min | 20min |
| 步骤S2离心转速 | 1500rpm | 1800rpm | 2000rpm | 2200rpm | 2500rpm |
| 步骤S2离心时间 | 15min | 13min | 11min | 10min | 8min |
| 硫酸镁溶液浓度 | 2mM | 3mM | 4mM | 5mM | 7mM |
| 预冷温度 | 0℃ | 1℃ | 2℃ | 3℃ | 4℃ |
| 低渗处理吹打时间 | 10min | 15min | 20min | 25min | 30min |
| 步骤S3离心温度 | 0℃ | 1℃ | 2℃ | 3℃ | 4℃ |
| 步骤S3离心转速 | 1500rpm | 1800rpm | 2000rpm | 2200rpm | 2500rpm |
| 步骤S3离心时间 | 50min | 45min | 40min | 35min | 30min |
分别采用本申请实施例1-5中的提取方法提取大肠杆菌细胞周质蛋白，对提取的目的蛋白rhGH 的定量检测结果见表4。
表4：
| 定量结果 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 |
| 目的蛋白提取量（μg/mL） | 579.41 | 603.85 | 665.38 | 624.77 | 593.12 |
| 目的蛋白纯度（%） | 90.96 | 92.68 | 92.47 | 93.11 | 92.19 |
为了验证处理液预处理操作对大肠杆菌细胞周质蛋白的提取影响，申请设置了对比例1-4，其中：
对比例1，同实施例3，不同之处仅在于：对比例1中减少了步骤S1的预处理步骤。
对比例2，同实施例3，不同之处仅在于：对比例2中处理液仅采用15g的醋酸溶液、8g的壳聚糖和0.8g 8mM的硝酸银溶液混合均匀制得。
对比例3，同实施例3，不同之处仅在于：对比例3中处理液仅采用15g的醋酸和8g的壳聚糖混合均匀制得。
对比例4，同实施例3，不同之处仅在于：对比例4中处理液仅采用0.8g 8mM的硝酸银溶液。
分别采用本申请对比例1-4中的提取方法提取大肠杆菌细胞周质蛋白，对提取的目的蛋白rhGH 的定量检测结果见表5。
表5：
| 定量结果 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 |
| 目的蛋白提取量（μg/mL） | 665.38 | 227.12 | 552.70 | 398.74 | 416.63 |
| 目的蛋白纯度（%） | 92.47 | 48.60 | 86.01 | 73.58 | 80.35 |
实验结果：由表4和表5可知，本申请提供的一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，可以得到纯度和浓度都较高的目的蛋白，采用本申请的处理液对提取大肠杆菌进行预处理，能够大大提高目的蛋白的提取率和提取纯度。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、配制处理液，按含量规格50mL:1g，将大肠杆菌加入到处理液中，于30-40℃的温度下，静置处理20-40min，然后置于离心机中离心，弃去上清液，收集剩余菌体，得预处理菌体；
S2、按含量规格10mL:1g，取蔗糖高渗溶液和预处理菌体，用蔗糖高渗溶液充分悬浮预处理菌体，并用移液器轻柔吹打10-20min后，离心弃去上清液，收集剩余菌体，得高渗处理菌体；
S3、按含量规格20mL:1g，取2-7mM的硫酸镁溶液和高渗处理菌体，将硫酸镁溶液预冷至0-4℃后充分悬浮高渗处理菌体，并在冰上用移液器吹打10-30min后，离心收集上清液，即得所需的周质蛋白。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤S1中处理液包括10-20重量份的醋酸溶液、5-10重量份的壳聚糖和0.5-1.2重量份的负载纳米银。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述负载纳米银由以下方法制得：
避光配制5-10mM的硝酸银溶液，将羟基磷灰石微粉加入到硝酸银溶液中，超声震荡混合1-2h后，在3000-4000rpm下离心10-20min，收集微粉，去离子水洗涤后，干燥即得所需的负载纳米银。
4.根据权利要求2所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤S1中处理液的pH值为3.8-5.2。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤S1中的大肠杆菌由以下方法培养而得：
（1）取100μL大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化，取1μL含欲表达蛋白的质粒与融化后的大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴20-40min后，置于35-45℃的温度下，水浴1-2min，再次冰浴1-2min后，加入100mL的LB液体培养基，于37±2℃摇床培养40-60min，然后在6000-8000rpm下离心3-8min，弃去上清液，收集剩余菌体重悬获得菌液；
（2）吸取10μL步骤（1）中重悬后的菌液于LB固体培养基上，并用涂布棒涂抹均匀，最后置于37±2℃的恒温箱中培养8-16h；
（3）从LB固体培养基中挑取适宜的菌落，加入100mL的LB液体培养基，置于37±2℃摇床培养14-16h，然后在6000-8000rpm下离心3-8min，弃去上清液，即得所需的大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述欲表达蛋白为22kD 的重组人生长激素。
7.根据权利要求1所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤S1中离心条件为：在4000-5000rpm下离心5-10min。
8.根据权利要求1所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤S2中蔗糖高渗溶液由以下方法配制而得：
将蔗糖溶解于pH为8.0的30mM的Tris溶液中，配制得到浓度为30-50%的蔗糖高渗溶液。
9.根据权利要求1所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤S2中离心条件为：在1500-2500rpm下离心8-15min。
10.根据权利要求1所述的大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤S3中离心条件为：于0-4℃的环境下，在1500-2500rpm下离心30-50min。
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| CN110240722A (zh) * | 2019-06-29 | 2019-09-17 | 华南理工大学 | 一种荷载小麦醇溶蛋白/纳米银的壳聚糖复合抗菌膜及其制备方法 |
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2022
- 2022-03-03 CN CN202210202794.4A patent/CN114395029B/zh active Active
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