CN104293909A - 甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选hsf靶dna的方法 - Google Patents

甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选hsf靶dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选HSF靶DNA的方法，本发明的方法采用染色质免疫沉淀(ChIP)与分子克隆技术相结合的方法在体内分离和鉴定了拟南芥热激转录因子HSF结合的靶DNA。首先热激诱导拟南芥叶片的HSF与靶DNA结合，接着甲醛处理使HSF与靶DNA共价交联，然后用HSF抗体进行染色质免疫沉淀，染色质免疫沉淀DNA经过衔接头介导的PCR扩增并进行分子克隆，最后进行测序，并将测序结果在基因组数据库中分析、鉴定靶DNA片段在基因组上的位置及对应的HSF靶基因。甲醛交联/染色质免疫沉淀技术与分子克隆相结合是筛选热激转录因子(HSF)的靶DNA的理想方法。

Description

甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选HSF靶DNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体而言，涉及筛选转录因子结合的靶DNA的方法。 
背景技术
筛选热激因子(HSF)的靶DNA是研究基因表达的转录调控机理的一个重要领域。目前研究蛋白质与DNA相互作用的常见的方法主要有电泳迁移率变动分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)，DNase Ⅰ足迹法(DNase Ⅰ footprinting)，酵母单杂交系统(Yeast One-Hybrid System)等；另外，生物信息学的方法也可以预测DNA上的转录因子结合位点的保守序列。这些筛选特异性位点的方法的应用大大促进了该领域的研究，但它们都存在一定的局限性。首先，每次分离转录调控蛋白结合的靶DNA片段，是依赖蛋白质与靶DNA片段的特异性高亲和力，因此只能得到一些亲和力高的DNA片段，很难富集亲和力弱的靶DNA片段。其次体外蛋白质与DNA的结合不足以充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，体内可以通过其它因素刺激或抑制结合位点。因为，高等生物的基因组DNA和DNA上的结合蛋白共同组成染色质结构，用以上所提到的方法分析得到的某段DNA与蛋白质的相互作用的结果，在体内则很可能由于染色质高级结构的存在，而使DNA与蛋白质难以接近。因此，在生理状态下，这段DNA很可能并不与其相对应的因子相结合，是没有功能的，反之亦然。另外，染色质结构本身是动态的，DNA与非组蛋白在生理状态下的相互作用通常是瞬时的，以上方法难以捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事件。与其他方法相比，染色质免疫沉淀技术则可以找出在生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况，因此染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)是一种在体内研究DNA-蛋白质相互作用的理想的方法。采用染色质免疫沉淀技术可以很好地筛选热激因子(HSF)的靶DNA。 
在生理状态下把细胞内的蛋白质和DNA共价交联在一起，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合体，用Protein-A/G-Agarose/Sepharose特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，用不含Dnase的Rnase和ProteinaseK解除交联，纯化DNA，通过对目的片断的检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。染色质免疫沉淀技术目前是筛选HSF靶DNA的较好方法。 
在蛋白质与靶DNA序列的结合后，靶DNA的分析方法有许多种。如果目的蛋白的靶序列是已知或怀疑某个序列是目的蛋白的靶序列，可以采用狭缝杂交和实时定量或半定量PCR；如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因组上的分布情况，找出反式作用因子的结合位点，可以采用Southern杂交、克隆技术和DNA芯片方法。2000年Ren et al成功地开创性结合应用早期用于分析蛋白质-DNA的相互作用的甲醛交联/免疫沉淀技术与基因组芯片杂交技术。Solano et al(2003)则用普通紫外光交联/免疫沉淀，并结合对靶DNA的克隆测序技术，系统性鉴定了果蝇的发育同源蛋白。然而，如何在全基因组范围内筛选拟南芥热激因子HSF1结合的靶DNA是本领域亟待解决的技术难题。 
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选HSF靶DNA的方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案： 
1、一种甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选HSF靶DNA的方法，其特征在于包括如下步骤： 
步骤一、热激处理拟南芥幼苗； 
步骤二、甲醛处理使HSF与靶DNA共价交联； 
步骤三、染色质免疫沉淀获得HSF的靶DNA； 
步骤四、染色质免疫沉淀DNA经过衔接头介导的PCR扩增后进行分子克隆及测序； 
步骤五、将测序结果在基因组数据库中分析、鉴定靶DNA片段在基因组上的位置。 
在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述步骤一中，热激处理拟南芥幼苗具体步骤为： 
取南芥幼苗放入培养缓冲液(SIB:0.5mMK2HPO4，0.5mMKH2PO4,pH6.0和0.1％蔗糖)39℃的水浴中震荡培养30min。 
在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述步骤二中，甲醛处理使HSF与靶DNA共价交联的具体步骤包括： 
将热激处理和未处理的南芥幼苗，在室温下浸入交联缓冲液中(0.4mM蔗糖,10mM Tris-HCl(PH8),1mMEDTA,1mMPMSF,1％甲醛),在真空下培养15min后加入终浓度为100mM甘氨酸在真空下培养5min以终止交联反应。南芥幼苗用无菌去离子水冲洗后，冻入液氮中，于-70℃下保存。 
在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述步骤三中，染色质免疫沉淀获得HSF的靶DNA的具体步骤包括： 
(1)破碎细胞 
(1.1)南芥幼苗加入3倍体积的裂解缓冲液1(50mMHEPES-KOH，pH7.5，140mMNaCl，1mM EDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mMPMSF)在研钵中研磨(在液氮中进行)。然后转移到10ml的离心管中。 
(1.2)超声波切断拟南芥基因组DNA，便其DNA片段化为100bp—600bp。超声波振幅为60％，每次30s，共处理20次。(注意:细胞破碎过程中每次间隙时用液氮冷却破碎液) 
(1.3)12000rpm，4℃，离心5min收集上清液并过0.22um孔径的滤膜，滤液可直接进行染色质免疫共沉淀或液氮冷冻-70℃保存。 
(2)HSF抗血清与拟南芥细胞上清液共培养 
加60μl HSF抗血清(云南大学单克隆中心制备)于上述拟南芥细胞上清液中，4℃共培养4h。对照实验中加等体积的PBS缓冲液。 
(3)封闭和洗涤蛋白A琼脂糖胶 
在1.5ml Eppendorf管中加入60μl50％悬浮的蛋白A琼脂糖胶(Santa Cruz)，每次以1ml裂解缓冲液1(50mM HEPES-KOH，pH7.5，140mM NaCl，1mM EDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mM PMSF)洗涤两次，1000rpm，4℃，离心1min，收集蛋白A琼脂糖胶。再加1ml1％BSA(溶于PBS)于上述蛋白A琼脂糖胶中，4℃共培养6h封闭其非特异性位点。 
用1ml裂解缓冲液1洗封闭后的蛋白A琼脂糖胶，1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。重复洗涤一次，离心收集沉淀。 
(4)蛋白A琼脂糖胶和抗体共温育后的拟南芥细胞共培养 
蛋白A琼脂糖胶沉淀转入与抗体共温育后的拟南芥细胞破碎液[(1)制备]中，4℃冰浴培养30min—1h。1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。 
(5)洗脱免疫沉淀DNA和蛋白质复合物 
(5.1)加1.4ml裂解缓冲液1于免疫沉淀DNA和蛋白质复合物[(4)制备]中，置于4℃冰浴 上洗脱5min。1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。重复洗涤一次，离心收集沉淀。 
(5.2)加1.4ml裂解缓冲液2(50mM HEPES-KOH，pH7.5，500mM NaCl，1mM EDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mM PMSF)，在4℃冰浴上洗脱5min。1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。重复洗涤一次，离心收集沉淀。 
(5.3)加1.4ml洗涤液(10mM Tris-HCI，pH8.0，0.25M LiCl，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，1mM EDTA)，在4℃冰浴上洗脱5min。1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。将沉淀转移到另一干净的1.5ml Eppendorf管中，重复洗涤一次，离心收集沉淀。 
(5.4)加1.4ml TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)，在4℃冰浴上洗脱5min,1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。 
(5.5)加40μl洗脱缓冲液(1％[w/v]SDS and0.1M NaHCO3,pH7.5)于上述沉淀中，60℃震荡10min,洗脱HSF结合的DNA。12000rpm,4℃，离心1min，收集洗脱液。再加60μl洗脱缓冲液重复洗涤一次，离心收集洗脱液。 
(6)KlenowDNA聚合酶和蛋白酶K处理免疫沉淀DNA和蛋白质复合物 
在0.5ml的Eppendorf管中依次加入上述试剂和免疫沉淀复合物,混匀后并短暂离心，在25℃反应30min，75℃加热10min。 
加入等体积(102μl)1mg/ml蛋白酶K(溶于50mM Tris,10mM EDTA,0.3％SDS,pH7.5),60℃水浴过夜。 
(7)免疫沉淀DNA的分离纯化 
(1)向上述获得的免疫沉淀DNA洗脱液中加入等体积的苯酚/氯仿(1:1)混合物，涡旋混匀。 
(2)14000rpm离心3min，将上清转至新的1.5ml离心管中。 
(3)加等体积苯酚/氯仿(1:1)，混匀后14000rpm离心3min。 
(4)取上清，加等体积氯仿抽提，14000rpm离心3min。 
(5)上清转至1.5ml离心管中。 
(6)加1/10体积的醋酸钠，2.5倍体积100％的乙醇及20μg糖元，-20℃，静置过夜。 
(7)14000rpm离心30min。 
(8)去上清，用70％酒精洗沉淀。 
(9)14000rpm离心30min。 
(10)抽干，加入20μ1TE缓冲液(或无菌水)溶解沉淀，-20℃保存。 
(8)PCR分析免疫沉淀DNA 
(8.1)引物设计 
根据己发表的拟南芥热激基因及非热激基因的全基因序列分别设计HSP18.2启动子区引物. 
AtHSP18.2/-229u:5’-ATTTTTCTTGGCATTTCAGG-3’ 
AtHSP18.2/-243d:5’-GCATTTCGGTCTTGTTTCA-3’(52℃) 
(8.2)PCR反应 
反应体系如下： 
PCR扩增的参数为:94℃预变性5min，然后以94℃20s为变性参数，52℃20s为退火参数，72℃10s为延伸参数，循环数为25。经10％DNA聚丙烯酰氨凝胶分析PCR产物。 
(8.3)DNA-PAGE检测PCR产物 
按以下配方配制凝胶:30％丙烯酰胺2.5ml,5x TBE buffer(445mM Tris,445mM硼酸,10rnM EDTA,pH8.0)750μl,100μ110％的过硫酸氨(APS)和5μl的TEMED。凝固后加入1xTBE电泳缓冲液淹没凝胶的加样孔。取10μ1PCR产物和2μl6x Loading Buffer混合 后点样，在100V恒压条件下电泳60min,EB染色2-3min后凝胶成像仪观察并照相。 
在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述步骤四中，染色质免疫沉淀DNA经过衔接头介导的PCR扩增后进行分子克隆及测序的具体步骤包括： 
(1)免疫沉淀DNA两端加人工接头及扩增 
在两个0.5ml的Eppendorf管中，分别加入10μl100μM的引物I:5'-AGAAGCTTGAATTCGAGCAGTCAG-3’、引物Ⅱ:5’-CTGCTCGAATTCAAGCTTCT-3'，95℃变性5min，混合两管引物短暂离心，室温复性1h，形成双键人工接头DNA分子，含EcoRI酶切位点。在0.5ml Eppendorf管中依次加入下列试剂,混匀并短暂离心，在16℃低温水浴锅连接16h。连接反应结束时，于65℃加热反应混合液15min，以灭活连接酶。 
(2)验证 
以引物II:5’-CTGCTCGAATTCAAGCTTCT-3'为上下游引物，PCR扩增已进行了接头连接反应的DNA，分析DNA片段两端是否连接上人工接头DNA分子。 
在0.3ml的PCR管中依次加入上述试剂，混匀并短暂离心，加入10μl矿物油，再次短暂离心，置于PCR扩增仪上进行扩增反应，反应程序:94℃预变性5min，然后以94℃1min为变性参数，55℃1min为退火参数，72℃1min为延伸参数，循环数为35。以1.2％的琼脂 糖凝胶电泳分析5μlPCR增产物。 
(3)对处理过的免疫沉淀DNA进行PCR扩增，并纯化PCR产物。 
在0.3ml的PCR管中依次加入下列试剂，混匀并短暂离心，加入10μl矿物油，再次短暂离心，置于PCR扩增仪上进行扩增反应，反应程序:94℃预变性5min，然后以94℃1min为变性参数，55℃1min为退火参数，72℃1min为延伸参数，循环数为35。 
以1.2％的琼脂糖凝胶电泳PCR的扩增产物，用DNA片段纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。 
(4)对免疫沉淀的靶DNA片段处理后进行克隆 
(4.1)HSF体内结合的DNA片段连接到pUC19载体上 
(4.1.1)EcoRI酶切pUC19载体 
在1.5ml Eppendorf讨管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在30℃水浴锅中酶切3h。反应体系为: 
经苯酚/氯仿(1:1)抽提后，pUC19被沉淀，溶于5μl的灭菌双蒸水中。 
(4.1.2)PUC19(被EcoRI酶切)去磷酸化反应 
在1.5ml Eppendorf管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在50℃水浴锅中对 PUC19(被EcoRI酶切)去磷酸化反应30min，反应体系为: 
(4.1.3)苯酚/氯仿(1:1)抽提终止去磷酸化反应，pUC19被沉淀，溶于5μl灭菌水中。 
(4.1.4)EcoRI酶切PCR扩增产物(2.2.4.1.3制备)。 
在1.5ml Eppendorf讨管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在30℃水浴锅中酶切3h。反应体系为: 
经苯酚/氯仿(1:1)抽提后，DNA被沉淀，溶于7.5μl的灭菌双蒸水中。 
(4.1.5)经EcoRI酶切的PCR扩增HSF的靶DNA与经EcoRI酶切并磷酸化过的pUC19载体的连接 
在0.5ml Ependrf管中依次加入下列试剂，混匀短暂离心，在16℃低温水浴锅中连接16h。连接产物经苯酚/氯仿(1:1)抽提，DNA被沉淀并溶于10μlTE缓冲液中。 
(4.2)重组DNA克隆入大肠杆菌 
(4.2.1)Amp+/IPTG/X-Gal/LB平板的制备 
LB固体培养基灭菌后，冷却至55℃，向100mlLB培养基中加入100μl的20mg/ml X-Gal，100μl的100mM IPTG和Amp抗生素(终浓度达100μg/ml)，混匀后铺成平板即为Amp+/IPTG/X-Gal/LB平板。 
(4.2.2)感受态细胞制备 
挑取一环冻存的宿主菌(Escherichia coli DH5α)，于无抗性的LB平板上划线，37℃培养过夜。在平板上挑一个单菌落，接于5ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。取2ml培养物分别转接于两瓶含有50ml的LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃，220rpm震荡培养2h到对数期。收集菌液于两支50ml的离心管中，冰上放置30min，然后离心4,000rpm，10min收集菌体。加入预先冰冷的CaCl2(0.1M/L)10ml小心悬浮，再次冰浴15-30min。4,000rpm，10min离心，收集菌体，各加2.5ml的预先冰冷的CaCl2，悬浮细胞，合并两管。冰上放置片刻(5min)。制备的感受态细胞可直接用于转化，或加入2ml的灭菌甘油，然后按每管200μl分装，液氮冷冻，-70℃保存。 
(4.2.3)连接产物的转化实验和蓝白色菌落筛选 
(1)10μl的连接产物和50μlE.coliDH5a感受态细胞混匀，冰浴培养30min。 
(2)42℃热休克90s，迅速放置到冰上5min。 
(3)加入800μlLB培养基，37℃，100rpm培养1h。 
(4)5000rpm，离心5min去多余的上清液，保留100μl以悬浮细胞。 
(5)涂Amp+/IPTG/X-Gal/LB平板两个，待菌液吸干后，倒置于37℃恒温培养箱中培养16h。 
(6)白色菌落，可能是克隆。 
(5)对克隆DNA进行测序 
(5.1.1)对白色菌落进行质粒提取 
用质粒提取试剂盒进行提取。该试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。 
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 
(2)取1–5ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm(13,400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。 
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 
(4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6–8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。 
(5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(13,400×g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 
(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入无菌1.5ml收集管中。 
(7)向吸附柱CP3中加入700μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 
(8)向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液。 
(9)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶切反应实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 
(10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(13,400×g)离心1min将质粒溶液收集到离心管中。 
(5.1.2)EcoR Ⅰ酶切质粒DNA 
在1.5ml Eppendorf讨管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在30℃水浴锅中酶切5h。反应体系为: 
(5.1.3)对可以酶切的质粒进行测序 
DNA序列分析在ABI377测序仪上进行。采用四色荧光双脱氧末端终止测序方法进行测序反应。测序引物为pUC19载体两端通用引物。 
(1)测序PCR 
反应条件：96℃10s→50℃5s→60℃4min25个循环。 
(2)PCR产物纯化 
第一次纯化PCR产物：75％的异丙醇＝1：4(约28μl)避光沉淀30min，3250rpm离心30min，弃上清液。第二次纯化PCR产物：75％的异丙醇＝1：8(约56μl)避光沉淀10min，3250rpm离心10min，弃上清液。94℃干燥约5min后冷却，加10μl灭菌水。 
(3)上样测序 
在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述步骤五中，将测序结果在基因组数据库中分析、鉴定靶DNA片段在基因组上的位置的具体步骤包括： 
序列提交到NCBI中数据库中，比对分析。HSF的结合片段在拟南芥基因组的定位是通过BLASTn程序把拟南芥基因组与结合片段进行比较。结合片段在2.5kb范围内最近的下游转录因子被认为是HSF潜在的靶基因。HSF潜在的靶基因是通过拟南芥基因组观察(build7.0)与BLASTn程序共同确定的。 
本方法的优势： 
甲醛交联/染色质免疫沉淀技术与分子克隆相结合是一种在体内研究DNA-蛋白质相互作用的方法，与其他方法相比，甲醛交联/染色质免疫沉淀技术则可以克服体外研究DNA-蛋白质相互作用的局限，具体表现在以下几个方面：首先，每次分离转录调控蛋白结合的靶DNA片段，不仅能得到一些亲和力高的DNA片段，还能富集亲和力弱的靶DNA片段。其次体内蛋白质与DNA的结合可以充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，找出在 生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。当甲醛交联/染色质免疫沉淀技与分子克隆技术相结合，可以用于在全基因组中高通量的筛选已知转录因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况。因此，甲醛交联/染色质免疫沉淀技术与分子克隆相结合是筛选热激转录因子(HSF)的靶DNA的理想方法。 
附图说明
图1甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选HSF靶DNA的流程示意图； 
图2染色质免疫沉淀技术筛选HSF靶DNA的验证； 
图3染色质免疫沉淀技术筛选HSF靶DNA的扩增；[1：免疫沉淀DNA通过linker-mediated PCR扩增产物。M:DNA标志(Marker)。] 
图4拟南芥HSF的靶DNA文库； 
图5EcoR Ⅰ酶切质粒DNA。[对白色菌落进行质粒提取,EcoR Ⅰ酶切质粒DNA，取2μg在1％(w/v)琼脂糖胶上电泳，用溴化乙锭染色。1-12为不同白色菌落提取的质粒酶切片段。M:DNA标志(Marker)。] 
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明内容做进一步详细描述： 
如图1所示，一种甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选HSF靶DNA的的方法，其特征在于，包括如下步骤： 
步骤一、热激处理拟南芥幼苗； 
步骤二、甲醛处理使HSF与靶DNA共价交联； 
步骤三、染色质免疫沉淀获得HSF的靶DNA； 
步骤四、染色质免疫沉淀DNA经过衔接头介导的PCR扩增后进行分子克隆及测序； 
步骤五、将测序结果在基因组数据库中分析、鉴定靶DNA片段在基因组上的位置。 
试验例：一种甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选HSF靶DNA的方法，。包括如下步骤： 
步骤一：热激处理拟南芥幼苗的具体步骤包括： 
取南芥幼苗放入培养缓冲液(SIB:0.5mMK2HPO4，0.5mMKH2PO4,pH6.0和0.1％蔗糖)39℃的水浴中震荡培养30min。 
步骤二：甲醛处理使HSF与靶DNA共价交联的具体步骤包括： 
将热激处理和未处理的南芥幼苗，在室温下浸入交联缓冲液中(0.4mM蔗糖,10mM Tris-HCl(PH8),1mMEDTA,1mMPMSF,1％甲醛),在真空下培养15min后加入终浓度为100mM甘氨酸在真空下培养5min以终止交联反应。南芥幼苗用无菌去离子水冲洗后，冻入液氮中，于-70℃下保存。 
步骤三：染色质免疫沉淀获得HSF的靶DNA的具体步骤包括： 
(1)破碎细胞 
(1.1)南芥幼苗加入3倍体积的裂解缓冲液1(50mMHEPES-KOH，pH7.5，140mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mM PMSF)在研钵中研磨(在液氮中进行)。然后转移到10ml的离心管中。 
(1.2)超声波切断拟南芥基因组DNA，便其DNA片段化为100bp—600bp。超声波振幅为60％，每次30s，共处理20次。(注意:细胞破碎过程中每次间隙时用液氮冷却破碎液) 
(1.3)12000rpm，4℃，离心5min收集上清液并过0.22um孔径的滤膜，滤液可直接进行染色质免疫共沉淀或液氮冷冻-70℃保存。 
(2)HSF抗血清与拟南芥细胞上清液共培养 
加60μlHSF抗血清(云南大学单克隆中心制备)于上述拟南芥细胞上清液中，4℃共培养4h。对照实验中加等体积的PBS缓冲液。 
(3)封闭和洗涤蛋白A琼脂糖胶 
在1.5mlEppendorf管中加入60μl50％悬浮的蛋白A琼脂糖胶(SantaCruz)，每次以1ml裂解缓冲液1(50mM HEPES-KOH，pH7.5，140mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mMPMSF)洗涤两次，1000rpm，4℃，离心1min，收集蛋白A琼脂糖胶。再加1ml1％BSA(溶于PBS)于上述蛋白A琼脂糖胶中，4℃共培养6h封闭其非特异性位点。 
用1ml裂解缓冲液1洗封闭后的蛋白A琼脂糖胶，1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。重复洗涤一次，离心收集沉淀。 
(4)蛋白A琼脂糖胶和抗体共温育后的拟南芥细胞共培养 
蛋白A琼脂糖胶沉淀转入与抗体共温育后的拟南芥细胞破碎液[(1)制备]中，4℃冰浴培养30min—1h。1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。 
(5)洗脱免疫沉淀DNA和蛋白质复合物 
(5.1)加1.4ml裂解缓冲液1于免疫沉淀DNA和蛋白质复合物[(4)制备]中，置于4℃冰浴上洗脱5min。1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。重复洗涤一次，离心收集沉淀。 
(5.2)加1.4ml裂解缓冲液2(50mMHEPES-KOH，pH7.5，500mMNaCl，1mM EDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mMPMSF)，在4℃冰浴上洗脱5min。1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。重复洗涤一次，离心收集沉淀。 
(5.3)加1.4ml洗涤液(10mM Tris-HCI，pH8.0，0.25MLiCl，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，1mMEDTA)，在4℃冰浴上洗脱5min。1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。将沉淀转移到另一干净的1.5ml Eppendorf管中，重复洗涤一次，离心收集沉淀。 
(5.4)加1.4ml TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)，在4℃冰浴上洗脱5min,1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀。 
(5.5)加40μl洗脱缓冲液(1％[w/v]SDSand0.1MNaHCO3,pH7.5)于上述沉淀中，60℃震荡10min,洗脱HSF结合的DNA。12000rpm,4℃，离心1min，收集洗脱液。再加60μl洗脱缓冲液重复洗涤一次，离心收集洗脱液。 
(6)KlenowDNA聚合酶和蛋白酶K处理免疫沉淀DNA和蛋白质复合物 
在0.5ml的Eppendorf管中依次加入上述试剂和免疫沉淀复合物,混匀后并短暂离心，在25℃反应30min，75℃加热10min。 
加入等体积(102μl)1mg/ml蛋白酶K(溶于50mMTris,10mMEDTA,0.3％SDS,pH7.5),60℃水浴过夜。 
(7)免疫沉淀DNA的分离纯化 
(1)向上述获得的免疫沉淀DNA洗脱液中加入等体积的苯酚/氯仿(1:1)混合物，涡旋混匀。 
(2)14000rpm离心3min，将上清转至新的1.5ml离心管中。 
(3)加等体积苯酚/氯仿(1:1)，混匀后14000rpm离心3min。 
(4)取上清，加等体积氯仿抽提，14000rpm离心3min。 
(5)上清转至1.5ml离心管中。 
(6)加1/10体积的醋酸钠，2.5倍体积100％的乙醇及20μg糖元，-20℃，静置过夜。 
(7)14000rpm离心30min。 
(8)去上清，用70％酒精洗沉淀。 
(9)14000rpm离心30min。 
(10)抽干，加入20μ1TE缓冲液(或无菌水)溶解沉淀，-20℃保存。 
(8)PCR分析免疫沉淀DNA 
(8.1)引物设计 
根据己发表的拟南芥热激基因及非热激基因的全基因序列分别设计HSP18.2启动子区引物. 
AtHSP18.2/-229u:5’-ATTTTTCTTGGCATTTCAGG-3’ 
AtHSP18.2/-243d:5’-GCATTTCGGTCTTGTTTCA-3’(52℃) 
(8.2)PCR反应 
反应体系如下： 
PCR扩增的参数为:94℃预变性5min，然后以94℃20s为变性参数，52℃20s为退火参数，72℃10s为延伸参数，循环数为25。经10％DNA聚丙烯酰氨凝胶分析PCR产物。 
(8.3)DNA-PAGE检测PCR产物 
按以下配方配制凝胶:30％丙烯酰胺2.5ml,5x TBEbuffer(445mM Tris,445mM硼酸,10rnMEDTA,pH8.0)750μl,100μ110％的过硫酸氨(APS)和5μl的TEMED。凝固后加入1xTBE电泳缓冲液淹没凝胶的加样孔。取10μlPCR产物和2μl6x LoadingBuffer混合后点样，在100V恒压条件下电泳60min,EB染色2-3min后凝胶成像仪观察并照相。 
步骤四：染色质免疫沉淀DNA经过衔接头介导的PCR扩增后进行分子克隆及测序的具体步骤包括： 
(1)免疫沉淀DNA两端加人工接头及扩增 
在两个0.5ml的Eppendorf管中，分别加入10μl100μM的引物I:5'-AGAAGCTTGAATTCGAGCAGTCAG-3’、引物Ⅱ:5’-CTGCTCGAATTCAAGCTTCT-3'，95℃变性5min，混合两管引物短暂离心，室温复性1h，形成双键人工接头DNA 分子，含EcoRI酶切位点。在0.5ml Eppendorf管中依次加入下列试剂,混匀并短暂离心，在16℃低温水浴锅连接16h。连接反应结束时，于65℃加热反应混合液15min，以灭活连接酶。 
(2)验证 
以引物II:5’-CTGCTCGAATTCAAGCTTCT-3'为上下游引物，PCR扩增已进行了接头连接反应的DNA，分析DNA片段两端是否连接上人工接头DNA分子。 
在0.3ml的PCR管中依次加入上述试剂，混匀并短暂离心，加入10μl矿物油，再次短暂离心，置于PCR扩增仪上进行扩增反应，反应程序:94℃预变性5min，然后以94℃1min为变性参数，55℃1min为退火参数，72℃1min为延伸参数，循环数为35。以1.2％的琼脂糖凝胶电泳分析5μl PCR增产物。 
(3)对处理过的免疫沉淀DNA进行PCR扩增，并纯化PCR产物。 
在0.3ml的PCR管中依次加入下列试剂，混匀并短暂离心，加入10μl矿物油，再次短暂离心，置于PCR扩增仪上进行扩增反应，反应程序:94℃预变性5min，然后以94℃1min为变性参数，55℃1min为退火参数，72℃1min为延伸参数，循环数为35。 
以1.2％的琼脂糖凝胶电泳PCR的扩增产物，用DNA片段纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。 
(4)对免疫沉淀的靶DNA片段处理后进行克隆 
(4.1)HSF体内结合的DNA片段连接到pUC19载体上 
(4.1.1)EcoRI酶切pUC19载体 
在1.5ml Eppendorf讨管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在30℃水浴锅中酶切3h。反应体系为: 
经苯酚/氯仿(1:1)抽提后，pUC19被沉淀，溶于5μl的灭菌双蒸水中。 
(4.1.2)PUC19(被EcoRI酶切)去磷酸化反应 
在1.5ml Eppendorf管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在50℃水浴锅中对PUC19(被EcoRI酶切)去磷酸化反应30min，反应体系为: 
(4.1.3)苯酚/氯仿(1:1)抽提终止去磷酸化反应，pUC19被沉淀，溶于5μl灭菌水中。 
(4.1.4)EcoRI酶切PCR扩增产物(2.2.4.1.3制备)。 
在1.5ml Eppendorf讨管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在30℃水浴锅中酶切3h。反应体系为: 
经苯酚/氯仿(1:1)抽提后，DNA被沉淀，溶于7.5μl的灭菌双蒸水中。 
(4.1.5)经EcoRI酶切的PCR扩增HSF的靶DNA与经EcoRI酶切并磷酸化过的pUC19载体的连接 
在0.5mlEpendrf管中依次加入下列试剂，混匀短暂离心，在16℃低温水浴锅中连接16h。连接产物经苯酚/氯仿(1:1)抽提，DNA被沉淀并溶于10μlTE缓冲液中。 
(4.2)重组DNA克隆入大肠杆菌 
(4.2.1)Amp+/IPTG/X-Gal/LB平板的制备 
LB固体培养基灭菌后，冷却至55℃，向100mlLB培养基中加入100μl的20mg/ml X-Gal，100μl的100mMIPTG和Amp抗生素(终浓度达100μg/ml)，混匀后铺成平板即为Amp+/IPTG/X-Gal/LB平板。 
(4.2.2)感受态细胞制备 
挑取一环冻存的宿主菌(Escherichia coli DH5α)，于无抗性的LB平板上划线，37℃培养过夜。在平板上挑一个单菌落，接于5ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。取2ml培养物分别转接于两瓶含有50ml的LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃，220rpm震荡培养2h到对数期。收集菌液于两支50ml的离心管中，冰上放置30min，然后离心4,000rpm，10min收集菌体。加入预先冰冷的CaCl2(0.1M/L)10ml小心悬浮，再次冰浴15-30min。4,000rpm，10min离心，收集菌体，各加2.5ml的预先冰冷的CaCl2，悬浮细胞，合并两管。冰上放置片刻(5min)。制备的感受态细胞可直接用于转化，或加入2ml的灭菌甘油，然后按每管200μl分装，液氮冷冻，-70℃保存。 
(4.2.3)连接产物的转化实验和蓝白色菌落筛选 
(1)10μl的连接产物和50μl E.coliDH5a感受态细胞混匀，冰浴培养30min。 
(2)42℃热休克90s，迅速放置到冰上5min。 
(3)加入800μlLB培养基，37℃，100rpm培养1h。 
(4)5000rpm，离心5min去多余的上清液，保留100μl以悬浮细胞。 
(5)涂Amp+/IPTG/X-Gal/LB平板两个，待菌液吸干后，倒置于37℃恒温培养箱中培养16h。 
(6)白色菌落，可能是克隆。 
(5)对克隆DNA进行测序 
(5.1.1)对白色菌落进行质粒提取 
用质粒提取试剂盒进行提取。该试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高 盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。 
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 
(2)取1–5ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm(13,400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。 
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 
(4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6–8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。 
(5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(13,400×g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 
(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入无菌1.5ml收集管中。 
(7)向吸附柱CP3中加入700μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 
(8)向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液。 
(9)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶切反应实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 
(10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(13,400×g)离心1min将质粒溶液收集到离心管中。 
(5.1.2)EcoRⅠ酶切质粒DNA 
在1.5ml Eppendorf讨管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在30℃水浴锅中酶切5h。反应体系为: 
(5.1.3)对可以酶切的质粒进行测序 
DNA序列分析在ABI377测序仪上进行。采用四色荧光双脱氧末端终止测序方法进行测序反应。测序引物为pUC19载体两端通用引物。 
(1)测序PCR 
反应条件：96℃10s→50℃5s→60℃4min25个循环。 
(2)PCR产物纯化 
第一次纯化PCR产物：75％的异丙醇＝1：4(约28μl)避光沉淀30min，3250rpm离心30min，弃上清液。第二次纯化PCR产物：75％的异丙醇＝1：8(约56μl)避光沉淀10min，3250rpm离心10min，弃上清液。94℃干燥约5min后冷却，加10μl灭菌水。 
(3)上样测序 
步骤五：将测序结果在基因组数据库中分析、鉴定靶DNA片段在基因组上的位置的具体步骤包括： 
序列提交到NCBI中数据库中，比对分析。HSF的结合片段在拟南芥基因组的定位是通过BLASTn程序把拟南芥基因组与结合片段进行比较。结合片段在2.5kb范围内最近的下游 转录因子被认为是HSF潜在的靶基因。HSF潜在的靶基因是通过拟南芥基因组观察(build7.0)与BLASTn程序共同确定的。 
试验结果： 
1、染色质免疫沉淀技术的确定 
拟南芥小苗热胁迫诱导HSF1与DNA结合，甲醛交联，用HSF1抗体进行免疫沉淀。为了确定本实验所采用的染色质免疫沉淀技术是否可行，我们必须验证免疫沉淀富集HSF1结合序列是否合理。为此，我们用已知HSF1的靶基因HSP18.2启动子进行验证。在我们实验中，以全基因组DNA为模板的PCR产物作为阳性对照，分别以未经甲醛交联和未加抗体这两个处理获得的免疫沉淀DNA为模板的PCR作为阴性对照。结果如图2，采用位于HSP18.2启动子区的引物，热胁迫的免疫沉淀DNA有很清晰的信号，而其它样品的信号消失。这个结果表明HSP18.2启动子序列在免疫沉淀中得到极大的富集，说明目前的实验方案可用于分析蛋白质与已知靶DNA序列的结合，免疫沉淀DNA可用于下一步的克隆。 
2、免疫沉淀DNA的分子克隆 
免疫沉淀DNA通常量很少，直接克隆效果不好，为此，我们给免疫沉淀DNA加上接头，用linker-mediatedPCR进行进一步扩增，扩增的片段长度如图3所示，扩增免疫沉淀DNA的片段范围大约100—300bp。扩增的免疫沉淀DNA纯化后可用于直接克隆。首先用EcoRI酶切纯化的PCR扩增产物，然后连接到被EcoRI酶切并去磷酸化的PUC19的载体上，并把连接产物转化至大肠杆菌DH5a，建立HSF1结合序列文库(图4)。 
3、分析HSF1结合序列文库 
在1个HSF1结合序列文库中，挑选白色菌落，进行质粒提取，并用EcoRⅠ进行酶切，结果如图5。结果发现并非所有的白色菌落都含有插入片段，如克隆2、5、11没有插入片段，属于假阳性克隆。对文库中的全部白色菌落进行质粒提取并酶切，发现有40个克隆经酶切后有插入片段。这40个克隆被测序，序列分析发现，有21个不同片段(表1)。从表1可以看出，这21个片段在有8个片段是重复的，例如片段3、片段4、片段12和片段20重复2次、片段5重复4次、片段8重复7次、片段9重复3次、片段14重复5次，这些克隆片段的范围为65至332bp。 
表1测序结果在基因组数据库中分析 
其中，HSF1结合的片段用粗体表示，EMSA探针序列用下划线标出，TTC/GAA,AGGGG boxes用大写字母表示，相同克隆出现次数在()内，基因组位点在[]内，NI:尚未确定 
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。 
。

Claims (6)

1.一种甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选HSF靶DNA的方法，其特征在于包括如下步骤： 
步骤一、热激处理拟南芥幼苗； 
步骤二、甲醛处理使HSF与靶DNA共价交联； 
步骤三、染色质免疫沉淀获得HSF的靶DNA； 
步骤四、染色质免疫沉淀DNA经过衔接头介导的PCR扩增后进行分子克隆及测序； 
步骤五、将测序结果在基因组数据库中分析、鉴定靶DNA片段在基因组上的位置。 
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤一中，热激处理拟南芥幼苗具体步骤为： 
取南芥幼苗放入培养缓冲液(SIB:0.5mMK2HPO4，0.5mMKH2PO4,pH6.0和0.1％蔗糖)39℃的水浴中震荡培养30min。 
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤二中，甲醛处理使HSF与靶DNA共价交联的具体步骤包括： 
将热激处理和未处理的南芥幼苗，在室温下浸入交联缓冲液中(0.4mM蔗糖,10mM Tris-HCl(PH8),1mMEDTA,1mMPMSF,1％甲醛),在真空下培养15min后加入终浓度为100mM甘氨酸在真空下培养5min以终止交联反应；南芥幼苗用无菌去离子水冲洗后，冻入液氮中，于-70℃下保存。 
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤三中，染色质免疫沉淀获得HSF的靶DNA的具体步骤包括： 
(1)破碎细胞 
(1.1)南芥幼苗加入3倍体积的裂解缓冲液1(50mMHEPES-KOH，pH7.5，140mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mM PMSF)在研钵中研磨(在液氮中进行)；然后转移到10ml的离心管中； 
(1.2)超声波切断拟南芥基因组DNA，便其DNA片段化为100bp—600bp；超声波振幅为60％，每次30s，共处理20次； 
(1.3)12000rpm，4℃，离心5min收集上清液并过0.22um孔径的滤膜，滤液可直接进行染色质免疫共沉淀或液氮冷冻-70℃保存； 
(2)HSF抗血清与拟南芥细胞上清液共培养 
加60μlHSF抗血清于上述拟南芥细胞上清液中，4℃共培养4h；对照实验中加等体积的PBS缓冲液； 
(3)封闭和洗涤蛋白A琼脂糖胶 
在1.5mlEppendorf管中加入60μl50％悬浮的蛋白A琼脂糖胶，每次以1ml裂解缓冲液1(50mMHEPES-KOH，pH7.5，140mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mMPMSF)洗涤两次，1000rpm，4℃，离心1min，收集蛋白A琼脂糖胶；再加1ml1％BSA(溶于PBS)于上述蛋白A琼脂糖胶中，4℃共培养6h封闭其非特异性位点； 
用1ml裂解缓冲液1洗封闭后的蛋白A琼脂糖胶，1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀；重复洗涤一次，离心收集沉淀； 
(4)蛋白A琼脂糖胶和抗体共温育后的拟南芥细胞共培养 
蛋白A琼脂糖胶沉淀转入与抗体共温育后的拟南芥细胞破碎液中，4℃冰浴培养30min—1h；1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀； 
(5)洗脱免疫沉淀DNA和蛋白质复合物 
(5.1)加1.4ml裂解缓冲液1于免疫沉淀DNA和蛋白质复合物中，置于4℃冰浴上洗脱5min；1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀；重复洗涤一次，离心收集沉淀； 
(5.2)加1.4ml裂解缓冲液2(50mMHEPES-KOH，pH7.5，500mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mMPMSF)，在4℃冰浴上洗脱5min；1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀；重复洗涤一次，离心收集沉淀； 
(5.3)加1.4ml洗涤液(10mMTris-HCI，pH8.0，0.25MLiCl，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，1mMEDTA)，在4℃冰浴上洗脱5min；1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀；将沉淀转移到另一干净的1.5ml Eppendorf管中，重复洗涤一次，离心收集沉淀； 
(5.4)加1.4ml TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)，在4℃冰浴上洗脱5min,1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀； 
(5.5)加40μl洗脱缓冲液(1％[w/v]SDSand0.1MNaHCO3,pH7.5)于上述沉淀中，60℃ 震荡10min,洗脱HSF结合的DNA；12000rpm,4℃，离心1min，收集洗脱液；再加60μl洗脱缓冲液重复洗涤一次，离心收集洗脱液； 
(6)KlenowDNA聚合酶和蛋白酶K处理免疫沉淀DNA和蛋白质复合物 
在0.5ml的Eppendorf管中依次加入上述试剂和免疫沉淀复合物,混匀后并短暂离心，在25℃反应30min，75℃加热10min； 
加入等体积(102μl)1mg/ml蛋白酶K(溶于50mMTris,10mMEDTA,0.3％SDS,pH7.5),60℃水浴过夜； 
(7)免疫沉淀DNA的分离纯化 
1)向上述获得的免疫沉淀DNA洗脱液中加入等体积的苯酚/氯仿(1:1)混合物，涡旋混匀； 
2)14000rpm离心3min，将上清转至新的1.5ml离心管中； 
3)加等体积苯酚/氯仿(1:1)，混匀后14000rpm离心3min； 
4)取上清，加等体积氯仿抽提，14000rpm离心3min； 
5)上清转至1.5ml离心管中； 
6)加1/10体积的醋酸钠，2.5倍体积100％的乙醇及20μg糖元，-20℃，静置过夜； 
7)14000rpm离心30min； 
8)去上清，用70％酒精洗沉淀； 
9)14000rpm离心30min； 
10)抽干，加入20μ1TE缓冲液(或无菌水)溶解沉淀，-20℃保存； 
(8)PCR分析免疫沉淀DNA 
(8.1)引物设计 
根据己发表的拟南芥热激基因及非热激基因的全基因序列分别设计HSP18.2启动子区引物. 
AtHSP18.2/-229u:5’-ATTTTTCTTGGCATTTCAGG-3’ 
AtHSP18.2/-243d:5’-GCATTTCGGTCTTGTTTCA-3’(52℃) 
(8.2)PCR反应 
反应体系如下： 
PCR扩增的参数为:94℃预变性5min，然后以94℃20s为变性参数，52℃20s为退火参数，72℃10s为延伸参数，循环数为25；经10％DNA聚丙烯酰氨凝胶分析PCR产物； 
(8.3)DNA-PAGE检测PCR产物 
按以下配方配制凝胶:30％丙烯酰胺2.5ml,5xTBEbuffer(445mMTris,445mM硼酸,10rnMEDTA,pH8.0)750μl,100μ110％的过硫酸氨(APS)和5μl的TEMED；凝固后加入1xTBE电泳缓冲液淹没凝胶的加样孔；取10μ1PCR产物和2μl6xLoadingBuffer混合后点样，在100V恒压条件下电泳60min,EB染色2-3min后凝胶成像仪观察并照相。 
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤四中，染色质免疫沉淀DNA经过衔接头介导的PCR扩增后进行分子克隆及测序的具体步骤包括： 
(1)免疫沉淀DNA两端加人工接头及扩增 
在两个0.5ml的Eppendorf管中，分别加入10μl 100μM的引物I:5'-AGAAGCTTGAATTCGAGCAGTCAG-3’、引物Ⅱ:5’-CTGCTCGAATTCAAGCTTCT-3'，95℃变性5min，混合两管引物短暂离心，室温复性lh，形成双键人工接头DNA分子，含EcoRI酶切位点；在0.5ml Eppendorf管中依次加入下列试剂,混匀并短暂离心，在16℃低温水浴锅连接16h；连接反应结束时，于65℃加热反应混合液15min，以灭活连接酶； 
(2)验证 
以引物II:5’-CTGCTCGAATTCAAGCTTCT-3'为上下游引物，PCR扩增已进行了接头连接反应的DNA，分析DNA片段两端是否连接上人工接头DNA分子，循环数为35；以1.2％的琼脂糖凝胶电泳分析5μl PCR增产物； 
(3)对处理过的免疫沉淀DNA进行PCR扩增，并纯化PCR产物； 
在0.3ml的PCR管中依次加入下列试剂，混匀并短暂离心，加入l0μl矿物油，再次短暂离心，置于PCR扩增仪上进行扩增反应，反应程序:94℃预变性5min，然后以94℃lmin为变性参数，55℃l min为退火参数，72℃l min为延伸参数，循环数为35； 
以1.2％的琼脂糖凝胶电泳PCR的扩增产物，用DNA片段纯化试剂盒对扩增产物进行纯化； 
(4)对免疫沉淀的靶DNA片段处理后进行克隆 
(4.1)HSF体内结合的DNA片段连接到pUC19载体上 
(4.1.1)EcoRI酶切pUC19载体 
在1.5ml Eppendorf讨管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在30℃水浴锅中酶切3h；经苯酚/氯仿(1:1)抽提后，pUC19被沉淀，溶于5μl的灭菌双蒸水中； 
(4.1.2)PUC19(被EcoRI酶切)去磷酸化反应 
在1.5ml Eppendorf管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在50℃水浴锅中对PUC19(被EcoRI酶切)去磷酸化反应30min，反应体系为： 
(4.1.3)苯酚/氯仿(1:1)抽提终止去磷酸化反应，pUC19被沉淀，溶于5μl灭菌水中； 
(4.1.4)EcoRI酶切PCR扩增产物(2.2.4.1.3制备)； 
在1.5ml Eppendorf讨管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在30℃水浴锅中酶切3h；经苯酚/氯仿(1:1)抽提后，DNA被沉淀，溶于7.5μl的灭菌双蒸水中； 
(4.1.5)经EcoRI酶切的PCR扩增HSF的靶DNA与经EcoRI酶切并磷酸化过的pUC19载体的连接 
在0.5ml Ependrf管中依次加入下列试剂，混匀短暂离心，在16℃低温水浴锅中连接16h；连接产物经苯酚/氯仿(1:1)抽提，DNA被沉淀并溶于10μl TE缓冲液中； 
(4.2)重组DNA克隆入大肠杆菌 
(4.2.1)Amp+/IPTG/X-Gal/LB平板的制备 
LB固体培养基灭菌后，冷却至55℃，向100mlLB培养基中加入100μl的20mg/ml X-Gal，l00μl的l00mM IPTG和Amp抗生素(终浓度达100μg/ml)，混匀后铺成平板即为Amp+/IPTG/X-Gal/LB平板； 
(4.2.2)感受态细胞制备 
挑取冻存的宿主菌(Escherichia coli DH5α)，于无抗性的LB平板上划线，37℃培养过夜；在平板上挑一个单菌落，接于5ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；取2ml培养物分别转接于两瓶含有50ml的LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃，220rpm震荡培养2h到对数期；收集菌液于两支50ml的离心管中，冰上放置30min，然后离心4,000rpm，10min收集菌体；加入预先冰冷的CaCl2(0.1M/L)10ml小心悬浮，再次冰浴15-30min；4,000rpm，10min离心，收集菌体，各加2.5ml的预先冰冷的CaCl2，悬浮细胞，合并两管；冰上放置片刻(5min)；制备的感受态细胞可直接用于转化，或加入2ml的灭菌甘油，然后按每管200μl分装，液氮冷冻，-70℃保存； 
(4.2.3)连接产物的转化实验和蓝白色菌落筛选 
(1)l0μl的连接产物和50μl E.coli DH5a感受态细胞混匀，冰浴培养30min； 
(2)42℃热休克90s，迅速放置到冰上5min； 
(3)加入800μlLB培养基，37℃，l00rpm培养1h； 
(4)5000rpm，离心5min去多余的上清液，保留100μl以悬浮细胞； 
(5)涂Amp+/IPTG/X-Gal/LB平板两个，待菌液吸干后，倒置于37℃恒温培养箱中培养16h； 
(6)白色菌落是克隆； 
(5)对克隆DNA进行测序 
(5.1.1)对白色菌落进行质粒提取 
用质粒提取试剂盒进行提取；该试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA； 
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； 
(2)取1–5ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm(13,400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)； 
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀； 
(4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6–8次使菌体充分裂解；注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA；此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏； 
(5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀；12,000rpm(13,400×g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀； 
(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，尽量不要吸出沉淀；12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入无菌1.5ml收集管中； 
(7)向吸附柱CP3中加入700μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中； 
(8)向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液； 
(9)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除； 
(10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(13,400×g)离心1min将质粒溶液收集到离心管中； 
(5.1.2)EcoRⅠ酶切质粒DNA 
在1.5ml Eppendorf讨管中依次加入下列试剂，混匀后并短暂离心，在30℃水浴锅中酶切5h； 
(5.1.3)对可以酶切的质粒进行测序 
DNA序列分析在ABI377测序仪上进行；采用四色荧光双脱氧末端终止测序方法进行测序反应； 
(6)PCR产物纯化 
第一次纯化PCR产物：75％的异丙醇＝1：4(约28μl)避光沉淀30min，3250rpm离心30min，弃上清液；第二次纯化PCR产物：75％的异丙醇＝1：8(约56μl)避光沉淀10min，3250rpm离心10min，弃上清液；94℃干燥约5min后冷却，加10μl灭菌水； 
(7)上样测序。 
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤五中，将测序结果在基因组数据库中分析、鉴定靶DNA片段在基因组上的位置的具体步骤包括： 
序列提交到NCBI中数据库中，比对分析；HSF的结合片段在拟南芥基因组的定位是通过BLASTn程序把拟南芥基因组与结合片段进行比较；结合片段在2.5kb范围内最近的下游转录因子被认为是HSF潜在的靶基因；HSF潜在的靶基因是通过拟南芥基因组观察(build7.0)与BLASTn程序共同确定的。 
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