CN111269999A - 一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用 - Google Patents

一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111269999A
CN111269999A CN202010083418.9A CN202010083418A CN111269999A CN 111269999 A CN111269999 A CN 111269999A CN 202010083418 A CN202010083418 A CN 202010083418A CN 111269999 A CN111269999 A CN 111269999A
Authority
CN
China
Prior art keywords
human
primer
microsporidian
universal primer
kinds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010083418.9A
Other languages
English (en)
Inventor
包佳玲
莫碧莹
潘国庆
周泽扬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest University
Original Assignee
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest University filed Critical Southwest University
Priority to CN202010083418.9A priority Critical patent/CN111269999A/zh
Publication of CN111269999A publication Critical patent/CN111269999A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用，本发明能够通用检测四种常见人微孢子虫，即肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、毕氏肠微孢子虫、和海伦脑炎微孢子虫。本发明构建含有样品DNA和通用引物的PCR反应体系，PCR反应后进行凝胶电泳，根据电泳结果判断是否含有微孢子虫，显著提高了PCR法检测的特异性。

Description

一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及 应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用。
背景技术
微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物。是引起微孢子虫病的真菌类病原[1]。在已知并被命名的1200多个微孢子虫中,共有8个属中的14个虫种可以感染人，其中较为常见的4种微孢子虫分别是：肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoonintestinalis)，兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)，毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)和海伦脑炎微孢子虫(Encephalitozoon hellem)。由于微孢子虫是一种机会性感染病原，HIV患者、肿瘤患者、移植受者、肺结核患者等免疫力低下的人群更容易受其感染。微孢子虫可侵染肠道、肝、肺、脑等部位，引起患者的慢性腹泻、肝炎、角膜炎、脑炎、血液系统性感染等症状，严重影响人类健康[2]。
早期微孢子虫检测方法主要依赖于镜检法，凭借检测人的经验来判断。随着科学技术的发展，目前微孢子虫的主要检测方法有如下几种：荧光染色法、改良三色染色法、基于免疫学的ELISA检测法、以及基于分子生物学的实时定量PCR法等[3]。其中分子生物学方法因其速度快、准确性高等特点成为微孢子虫检测的金标准。目前检测人微孢子虫的分子生物学方法多是基于微孢子虫核糖体RNA内转录间隔区(ITS)，可以对微孢子虫进行种间的鉴别。市面上还没有能够同时检测4种常见人微孢子虫的方法，目前只有一种针对毕氏肠微孢子虫 (Enterocytozoon bieneusi)的试剂盒。该试剂盒针对毕氏肠微孢子虫的ITS设计引物，应用实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)对毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)进行检测。
由于微孢子虫的SSUrRNA在进化过程中具有保守性强的特点，且其序列中含有可变区和高变区，既可以用于设计微孢子虫检测通用引物，又可以用于进行微孢子虫种间的鉴别[4]。 1995年，Daniel P.Fedorko等人根据4种常见人微孢子虫SSUrRNA的编码DNA设计了一对通用引物，能够检测这4种人微孢子虫(Forward：5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC-3’；Reverse：5’-CCTCTCCGGAACCAAACCCTG-3’)[5]，但该引物存在检测特异性低的缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物，包含：
正向引物：5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGACGT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物：5’-CCTCTCCGGAACCAAACCCTGAT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述的四种人微孢子虫为肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、毕氏肠微孢子虫、和海伦脑炎微孢子虫。
2、一种试剂盒，含有上述通用引物。
优选的，所述试剂盒还包含聚合酶r-Taq、DNAMaker、阳性对照和双蒸水，所述阳性对照为四种人微孢子虫SSUrRNA的DNA片段。
3、一种试纸条，含有经化学修饰的上述通用引物，使得正向引物和反向引物分别带上生物素Biotin和羧基荧光素FAM标签。
优选的，所述试纸条还包含聚合酶r-Taq、阳性对照、双蒸水、预包埋核酸侧向层析试纸条、试纸条缓冲液；所述阳性对照为四种人微孢子虫SSUrRNA的DNA片段。通用引物经化学修饰后，扩增后产物带有双标签；核酸侧向层析试纸条样品垫包埋与金颗粒偶联的FAM抗体，检测线(T线)包埋链霉亲和素(SA)，质控线包埋FAM二抗；若扩增体系中带有目的片段，则片段上带有的FAM标签在样品垫与FAM抗体及金颗粒复合物结合，随着层析作用向前移动，经过检测线时生物素被链霉亲和素拦截，通过金颗粒的积累而显红色，而未与扩增产物结合的FAM抗体及金颗粒偶联物继续向前移动，经质控线时被其二抗拦截而显红色。
进一步优选的，所述试纸条缓冲液为SSC缓冲液，包含：3M氯化钠，300mM柠檬酸钠，pH 7.0。
4、上述通用引物、试剂盒或试纸条在四种人微孢子虫同时检测中的应用。
5、一种同时检测四种人微孢子虫的方法，具体步骤如下：构建含有样品DNA和通用引物的PCR反应体系，PCR反应后进行凝胶电泳，根据电泳结果判断是否含有微孢子虫。
优选的，所述样品DNA为人粪便提取总DNA。
优选的，所述PCR反应体系还包含阳性对照，即四种人微孢子虫SSUrRNA的编码DNA片段。
优选的，PCR反应体系包含：样品DNA作为模板50ng，通用引物的正向引物和反向引物各5pmol，聚合酶r-Taq 12.5μl，以双蒸水补齐总体积25μl。
优选的，PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；最后72℃延伸10min。
优选的，采用质量体积分数1％琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，电泳结果呈阳性，则判断为含有微孢子虫。
本发明的有益效果在于：
本发明在文献引物(Daniel P.Fedorko等人设计的人微孢子虫通用引物，Forward： 5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC-3’；Reverse：5’-CCTCTCCGGAACCAAACCCTG-3’) 基础上，在上下游3’端加各两个碱基，以提高PCR扩增的特异性。具体优势如下：
1、本发明能够通用检测4种常见人微孢子虫：利用PCR法验证申报引物能够对4种常见人微孢子虫进行检测，模板分别为：合成毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)SSUrRNA 的编码DNA片段(270bp)、合成肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)SSUrRNA的编码DNA片段(310bp)、合成兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)SSUrRNA的编码 DNA片段(308bp)、以及合成海伦脑炎微孢子虫(Encephalitozoon hellem)SSUrRNA的编码 DNA片段(319bp)。本发明的通用引物能够对上述4种模板进行有效扩增，并且凝胶电泳结果显示扩增片段与预期一致。
2、本发明显著提高了PCR法检测的特异性：使用酵母(Saccharomycescerevisiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、隐球菌(Cryptococcus neoformans)和家蚕微孢子虫(Nosema bombycis) 的基因组模板作为阴性对照；海伦脑炎微孢子虫(Encephalitozoon hellem)的基因组模板作为阳性对照；分别使用文献引物作为对照组和本发明的通用引物进行PCR法扩增，凝胶电泳比较两种引物对上述模板的扩增效率，证明本发明的通用引物使PCR法检测人微孢子虫的特异性得到显著提高。
3、使用试纸条检测有如下优势：(1)检测灵敏度与PCR法相比更高；(2)检测时间更短。PCR扩增后，只需将PCR产物加到核酸侧向层析试纸条上，30s即可判读结果。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为使用合成毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)SSUrRNA的编码DNA片段、合成肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)SSUrRNA的编码DNA片段、合成兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)SSUrRNA的编码DNA片段、以及合成海伦脑炎微孢子虫(Encephalitozoon hellem)SSUrRNA的编码DNA片段作为模板，用本发明的通用引物进行PCR法检测的核酸凝胶电泳图。
图2为使用酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、隐球菌 (Cryptococcus neoformans)、家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)和海伦脑炎微孢子虫 (Encephalitozoon hellem)的基因组作为模板，分别用文献引物和新设计的申报引物进行PCR 法检测的凝胶电泳图。
图3为对图2凝胶电泳图的扩增条带进行灰度分析结果。
图4a和图4b为本发明的通用引物对HIV患者粪便总DNA样本进行PCR检测的凝胶电泳图。
图5为使用本发明通用引物对正常人粪便模拟带毒样本进行PCR检测的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例中的PCR反应体系包含：样品DNA作为模板50ng，通用引物的正向引物和反向引物各5pmol，总体积25μl。
PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；最后72℃延伸10min。
PCR反应产物采用质量体积分数1％琼脂糖凝胶电泳检测。
文献引物(Daniel P.Fedorko等人设计的人微孢子虫通用引物，正向引物： 5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC-3’；反向引物：5’-CCTCTCCGGAACCAAACCCTG-3’) 作为对照组。
实施例1：
使用合成毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)SSUrRNA的DNA片段、合成肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)SSUrRNA的DNA片段、合成兔脑炎微孢子虫 (Encephalitozoon cuniculi)SSUrRNA的DNA片段、以及合成海伦脑炎微孢子虫(Encephalitozoon hellem)SSUrRNA的DNA片段作为模板，用本发明的通用引物进行PCR 法检测，凝胶电泳图见图1。Marker为Trans2K Plus DNA Marker。
四种人微孢子虫SSUrRNA的编码DNA片段为合成公司合成，各片段序列如下：Enterocytozoon bieneusi SSUrRNA编码DNA片段：
CACCAGGTTGATTCTGCCTGACGTAGATGCTAGTCTCTGAGATTAAGCCATGCATGTCAG TGAAGCCTTACGGTGGAACGGCGAACGGCTCAGTAATGTTGCGGTAATTTGGTCTCTGT GTGTAAACTAACCACGGTAACCTGTGGCTAAAAGCGGGGAATAAGGCGCAACCCTATCA GCTTGTTGGTAGTGTAAAGGACTACCAAGGCCATGACGGGTAACGGGAAATCAGGGTTT GGTTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGATGGCTCCC，如SEQ ID NO.3所示；
Encephalitozoon intestinalis SSUrRNA编码DNA片段：
AGATTTTTGATGGGGGGTAGCACCAGGTTGATTCTGCCTGACGTGGATGCTATTCTCTGG GACTAAGCCATGCATGTTGATGAACCTTGTGGGGGATTGACGGACGGCTCAGTGATAGT ACGATGATTTGGTTGGCGGGAGAGCTGTAACTGCGGGAAACTGCAGGTAGGGGGCTAG GAGTGTTTTTGACACGAGCCAAGTAAGTTGTAGGCCTATCAGCTGGTAGTTAGGGTAAT GGCCTAACTAGGCGGAGACGGGAGACGGGGGATCGGGGTTTGATTCCGGAGAGGGAGC CTGAGAGATGGCTACT，如SEQ ID NO.4所示；
Encephalitozoon cuniculi SSUrRNA编码DNA片段：
GTGATTGTGTGTGTGTGGGGCATCAGGTTGATTCTGCCTGACGTGGATGCTATTCTCTGG GGCTAAGCCATGCATGCTTGTGAACTCTTTGTGGGGGATTAGCGGACGGCTCAGTGATA GCACGATGATTTGTTTGCGGGATGAGCAGTAGCTGCGGGAAACTGCAGATAGTGGTCTG CCCCTGTGGGGGTTGGCAAGTAAGTTGTGGGCCTATCAGCTGGTAGTTAGGGTAATGGC CTAACTAGGCGCAGACGGGATACGGGGGATCAGGGTTTGGTTCCGGAGAGGGAGCCTG AGAGATGGCTACT，如SEQ ID NO.5所示；
Encephalitozoon hellem SSUrRNA编码DNA片段：
TGATGTGTGTGAGTTTTTAGCATCAGGTTGATTCTGCCTGACGTGGATGCTATTCTCTGG GGCTAAGCCATGCATGTTTATGAAGCCTTTATGGGGGATTGACGGACGGCTCAGTGATAG TACGATGATTTGATTGGGAGCCTGGATGTAACTGTGGGAAACTGCAGGTAAGTTCTGGG GGTGGTAGTTTGTAGCTACTGCGTACCGAGTAAGTTGTAGGCCTATCAGCTGGTAGTTAG GGTAATGGCCTAACTAGGCGGAGACGGGAGACGGGGGATCAGGGTTTGATTCCGGAGA GGGAGCCTGAGAGATGGCTACT，如SEQ ID NO.6所示。
实施例2：
使用1、酵母(Saccharomyces cerevisiae)；2、肠杆菌(Escherichia coli)；3、隐球菌 (Cryptococcus neoformans)；4、家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的基因组模板作为阴性对照； 5、海伦脑炎微孢子虫(Encephalitozoon hellem)的基因组模板作为阳性对照；6、无模板为空白对照，分别使用对照组引物和本发明的通用引物进行PCR法扩增，凝胶电泳比较两种引物对上述模板的扩增效率，凝胶电泳图见图2(对照组引物在扩增别的模板时会出现杂带，本发明的通用引物无杂带)，对图2凝胶电泳图的扩增条带进行灰度分析(使用软件Graphpad Prism 进行灰度分析)，结果如图3所示。结果证明本发明的通用引物使PCR法检测人微孢子虫的特异性得到显著提高。
实施例3：
使用本发明的通用引物检测HIV患者粪便总DNA样本，共检测30个样本，其中PCR结果为阳性的有19个。将阳性条带送测序，结果均检出微孢子虫，准确率100％。患者样本来自重庆市公共卫生医疗救治中心临床采集的HIV检测出现阳性(但尚未开始高效抗逆转录病毒治疗-HAART)、并且有持续性腹泻症状的患者，由患者粪便所提取的总DNA。
图4a和图4b示出了本发明的通用引物对HIV患者粪便总DNA样本进行PCR检测的凝胶电泳图。表1示出了对凝胶电泳图中呈阳性的条带进行第二代DNA测序(将阳性条带送上海生工Sangon Biotech进行测序)的结果。
表1.对凝胶电泳图中呈阳性的条带进行第二代DNA测序的结果
Figure BDA0002381162620000061
Figure BDA0002381162620000071
实施例4：
将不同数量的人微孢子虫(0、10、102、103、104、105、106、107、108)添到200mg健康人粪便中，再提取总DNA作为模板，用本发明的通用引物进行检测。申报引物检测的最低限度为：每200mg粪便中含有106个人微孢子虫。
使用本发明通用引物对正常人粪便模拟带毒样本进行PCR检测的凝胶电泳图，如图5所示。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【参考文献】
[1]Bing Han and Louis M.Weiss.Microsporidia:Obligate IntracellularPathogens within the Fungal Kingdom[J]. Microbiol Spectr.2017,5(2).
[2]Ze-Dong Wang,Quan Liu,Huan-Huan Liu,et al.Prevalence ofCryptosporidium,microsporidia and Isospora infection in HIV-infected people:aglobal systematic review and meta-analysis[J].Parasites& Vectors.2018,11:28.
[3]汪燕,熊亮,马振刚.微孢子虫检测方法研究进展[J].蚕业科学,2019.
[4]崔玉娟.分子诊断技术在病原微生物检测中的应用进展[J].天水师范学院学报,2017.
[5]Daniel P.Fedorko,Nancy A.Nelson,CharlesP.Cartwright.Identification of Microsporidia in Stool Specimens by Using PCRand Restriction Endonuclease[J].Journal of Clinical Microbiology,1995,p.1739–1741。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用
<130> 2020
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
caccaggttg attctgcctg acgt 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
cctctccgga accaaaccct gat 23
<210> 3
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
caccaggttg attctgcctg acgtagatgc tagtctctga gattaagcca tgcatgtcag 60
tgaagcctta cggtggaacg gcgaacggct cagtaatgtt gcggtaattt ggtctctgtg 120
tgtaaactaa ccacggtaac ctgtggctaa aagcggggaa taaggcgcaa ccctatcagc 180
ttgttggtag tgtaaaggac taccaaggcc atgacgggta acgggaaatc agggtttggt 240
tccggagagg gagcctgaga gatggctccc 270
<210> 4
<211> 310
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
agatttttga tggggggtag caccaggttg attctgcctg acgtggatgc tattctctgg 60
gactaagcca tgcatgttga tgaaccttgt gggggattga cggacggctc agtgatagta 120
cgatgatttg gttggcggga gagctgtaac tgcgggaaac tgcaggtagg gggctaggag 180
tgtttttgac acgagccaag taagttgtag gcctatcagc tggtagttag ggtaatggcc 240
taactaggcg gagacgggag acgggggatc ggggtttgat tccggagagg gagcctgaga 300
gatggctact 310
<210> 5
<211> 308
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
gtgattgtgt gtgtgtgggg catcaggttg attctgcctg acgtggatgc tattctctgg 60
ggctaagcca tgcatgcttg tgaactcttt gtgggggatt agcggacggc tcagtgatag 120
cacgatgatt tgtttgcggg atgagcagta gctgcgggaa actgcagata gtggtctgcc 180
cctgtggggg ttggcaagta agttgtgggc ctatcagctg gtagttaggg taatggccta 240
actaggcgca gacgggatac gggggatcag ggtttggttc cggagaggga gcctgagaga 300
tggctact 308
<210> 6
<211> 319
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
tgatgtgtgt gagtttttag catcaggttg attctgcctg acgtggatgc tattctctgg 60
ggctaagcca tgcatgttta tgaagccttt atgggggatt gacggacggc tcagtgatag 120
tacgatgatt tgattgggag cctggatgta actgtgggaa actgcaggta agttctgggg 180
gtggtagttt gtagctactg cgtaccgagt aagttgtagg cctatcagct ggtagttagg 240
gtaatggcct aactaggcgg agacgggaga cgggggatca gggtttgatt ccggagaggg 300
agcctgagag atggctact 319

Claims (8)

1.一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物，其特征在于，包含：
正向引物：5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGACGT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物：5’-CCTCTCCGGAACCAAACCCTGAT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的通用引物，其特征在于，所述的四种人微孢子虫为肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、毕氏肠微孢子虫、和海伦脑炎微孢子虫。
3.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的通用引物。
4.一种试纸条，其特征在于，含有经化学修饰的权利要求1所述通用引物，使得正向引物和反向引物分别带上生物素Biotin和羧基荧光素FAM标签。
5.权利要求1所述通用引物、权利要求3所述试剂盒或权利要求4所述试纸条在四种人微孢子虫同时检测中的应用。
6.一种同时检测四种人微孢子虫的方法，具体步骤如下：构建含有样品DNA和权利要求1所述通用引物的PCR反应体系，PCR反应后进行凝胶电泳，根据电泳结果判断是否含有微孢子虫。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系包含：样品DNA作为模板50ng，通用引物的正向引物和反向引物各5pmol，聚合酶r-Taq 12.5μl，以双蒸水补齐总体积25μl。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；最后72℃延伸10min。
CN202010083418.9A 2020-02-09 2020-02-09 一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用 Pending CN111269999A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010083418.9A CN111269999A (zh) 2020-02-09 2020-02-09 一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010083418.9A CN111269999A (zh) 2020-02-09 2020-02-09 一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111269999A true CN111269999A (zh) 2020-06-12

Family

ID=70995133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010083418.9A Pending CN111269999A (zh) 2020-02-09 2020-02-09 一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111269999A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104498599A (zh) * 2014-12-11 2015-04-08 华南农业大学 一组微孢子虫分子通用检测引物及其试剂盒
CN104946747A (zh) * 2015-05-29 2015-09-30 中国水产科学研究院东海水产研究所 一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用
CN105154576A (zh) * 2015-10-26 2015-12-16 西南大学 快速检测家蚕微孢子虫的引物对及其试剂盒和检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104498599A (zh) * 2014-12-11 2015-04-08 华南农业大学 一组微孢子虫分子通用检测引物及其试剂盒
CN104946747A (zh) * 2015-05-29 2015-09-30 中国水产科学研究院东海水产研究所 一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用
CN105154576A (zh) * 2015-10-26 2015-12-16 西南大学 快速检测家蚕微孢子虫的引物对及其试剂盒和检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AL-HERRAWY等: "Microsporidial Spores in Fecal Samples of Some Domesticated Animals Living in Giza, Egypt", 《IRAN J PARASITOL》 *
FEDORKO DP等: "Identification of microsporidia in stool specimens by using PCR and restriction endonucleases", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *
周立社等: "《分子生物检验技术》", 30 March 2013 *
王永宾等: "微孢子虫检测技术的研究进展", 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 *
王见杨等: "九种微孢子虫核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)基因拷贝数的研究", 《蚕业科学》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111270012B (zh) 一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒
CN108060269B (zh) 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用
Wang et al. Potential risk of blood transfusion‐transmitted brucellosis in an endemic area of C hina
CN102822189A (zh) 用于核酸的序列特异性纯化和多重复合体分析(multiplex analysis)的方法和组合物
CN112981011B (zh) 一种检测SARS-CoV-2的引物组合物及其应用
Sauvage et al. Viral metagenomics applied to blood donors and recipients at high risk for blood-borne infections
JP2012080884A (ja) 核酸検出
CN108676920A (zh) 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法
CN111286559A (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
CN105018628A (zh) 鉴别布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的试剂盒
CN110093432B (zh) 一种用于区分结核杆菌和BCG疫苗的sRNA标志物及其用途
CN102329888A (zh) 一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量PCR检测方法及其试剂盒
CN110923361A (zh) 基于数字pcr用于血源筛查的引物、探针及试剂盒
CN104946753A (zh) 用于牛支原体检测的特异性引物对、检测试剂盒及其使用方法和应用
CN111719015A (zh) 一种人类免疫缺陷病毒hiv-1的检测试剂盒
WO2011006449A1 (zh) 日本血吸虫的反转座子及其用途
CN111269999A (zh) 一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用
CN107236827B (zh) 猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法
CN102108420A (zh) 一种检测登革1型病毒的荧光定量pcr试剂盒
CN114672596A (zh) 一种检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对、检测试剂盒及应用
CN113502341A (zh) 梅毒螺旋体16s RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
CN103882149A (zh) 猪细环病毒i型和ii型的双重实时荧光pcr检测方法
CN111793716A (zh) 一种检测2019新型冠状病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN111690769A (zh) 一种猪细小病毒7型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法
CN113293235B (zh) 一种用于蛙病毒检测的引物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination