CN111793716A - 一种检测2019新型冠状病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。本发明设计一套由一对外引物、一对内引物和一对环引物构成的引物组，该引物组仅能特异性扩增2019新型冠状病毒的基因组序列；检测方法灵敏度高，最低检测极限可达到10¹拷贝/μL；本发明提供的检测方法操作简单，不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需要恒温水浴即可反应，反应条件温和，而且可以通过肉眼观察浑浊、琼脂糖凝胶电泳或者添加荧光物质进行荧光检测等丰富的途径判定检测结果，适合基层检测单位的现场检测。

Description

一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检 测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

2019新型冠状病毒肺炎是由2019新型冠状病毒感染人以后以发热、乏力、干咳为主要表现的疾病。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状，重症患者多在发病1周后出现呼吸困难和(或)低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等，重型、危重型患者病程中可为中低热，甚至无明显发热，轻型患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现。经呼吸道飞沫和接触传播是主要的传播途径，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能。

目前对于2019新型冠状病毒的检测可分为三种方法：

1、一般检查：要特别关注外周血淋巴细胞计数和D-二聚体、CRP,肝酶、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酶、肌红蛋白和肌钙蛋白也可增高。

2、病原学检查:采用实时荧光定量多聚酶链反应(RT-PCR)或新一代测序技术(next generation sequencing technology,NGS)方法”进行核酸检测。

3、血清学检测:新型冠状病毒特异性IgM抗体多在发病3～5d后阳性,IgG抗体滴度恢复期较急性期有4倍及以上增高。

此外通过胸部影像学观察到有肺炎者在发病早期可见多发小斑片影及间质改变,以肺外带明显,病情进展者发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影,严重者可出现肺实变,胸腔积液少见。上述检测方法虽可以有效的检测确诊病例，但是耗时久且需要借助复杂的仪器、严苛的实验条件和相关专业知识，不适合基层单位的现场检测。

申请人中国农业科学院北京畜牧兽医研究所于2020年3月3日提出了发明专利申请CN202010138116.7，公开了一种新型冠状病毒可视化恒温快速检测试剂盒，以新型冠状病毒(2019-nCoV)的特异性核酸序列为靶基因，设计LAMP扩增引物，基于环介导等温扩增技术的高特异性、高敏感性、简便的优势，建立了一套新型冠状病毒恒温快速核酸扩增技术检测方法，基于该检测方法构建了可视化恒温新型冠状病毒快速检测试剂盒。该发明试剂盒可将浓度为5拷贝/μl的标准质粒有效检出，反应时间仅为30min。该发明试剂盒可实现快速、准确检测新型冠状病毒的目的，具有良好的应用前景。然而该发明的LAMP检测方法的特异性有待进一步确认。

申请人复旦大学附属华山医院于2020年1月20日提出了发明专利申请CN202010067653.7，公开了一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合和试剂盒，该引物组合选自如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:6所示的引物组1、如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:10所示的引物组2、如SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:14所示的引物组3、如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:18所示的引物组4、如SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:22所示的引物组5、如SEQ ID NO:24～SEQID NO:27所示的引物组6、如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:31所示的引物组7、如SEQ ID NO:32～SEQ ID NO:35所示的引物组8中的任一种或几种。该发明将上述引物组合与LAMP技术结合，不但可以通过肉眼观察到检测结果，无需复杂的辅助设备，简单易用，而且可通过荧光染料法实现检测结果半定量，检测灵敏度高，为该新型冠状病毒相关疾病的诊断以及治疗药物的研究提供了便利而快速的手段。然而该方法针对冠状病毒229E、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63的特异性有待进一步确认。

所以，本发明要解决的技术问题是：提供一种检测2019新型冠状病毒并且灵敏度高、特异性好的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。

发明内容

本发明针对2019新型冠状病毒常规核酸检测手段不便、对仪器的依赖性比较强，不能实现现场检测，并且现有的LAMP检测技术特异性不强的技术问题，提供一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。

本发明目的在于提供一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测引物组；

本发明另一目的在于提供一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测试剂盒；

本发明再一目的在于提供一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法，设计一套由一对外引物、一对内引物和一对环引物构成的引物组，该引物组仅能特异性扩增2019新型冠状病毒的基因组序列；检测方法灵敏度高，最低检测极限可达到10¹拷贝/μL；本发明提供的检测方法操作简单，不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需要恒温水浴即可反应，反应条件温和，而且可以通过肉眼观察浑浊、琼脂糖凝胶电泳或者添加荧光物质进行荧光检测等丰富的途径判定检测结果，适合基层检测单位的现场检测。

本发明的技术方案为：

一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测引物组，所述引物组包含一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物：

2019nCov_F3 GGTGTTTATTACCCTGACAAAG(SEQ ID NO:1)

2019nCov_B3 GTACCAAAAATCCAGCCTC(SEQ ID NO:2)

内引物：

2019nCov_FIP CATGGAACCAAGTAACATTGGAAAATTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTC(SEQID NO:3)

2019nCov_BIP CTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGACTTCTCAGTGGAAGCA(SEQ ID NO:4)

环引物：

2019nCov_LF AGGTAAGAACAAGTCCTG(SEQ ID NO:5)

2019nCov_LB GTCCTACCATTTAATG(SEQ ID NO:6)。

一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含上述引物组。

进一步地，所述试剂盒还包含Bst DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品为含新型冠状病毒S基因的质粒DNA，阴性对照品为去离子水。

进一步地，所述外引物、环引物、内引物的摩尔比为1:1:2。

进一步地，所述LAMP反应液包括10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO₄水溶液。

一种利用上述引物组检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)环介导等温扩增反应：以步骤(1)中提取的待测样品DNA为模板进行环介导等温扩增反应；

(3)结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳判断待测样品中是否含有2019新型冠状病毒。

进一步地，所述LAMP反应体系为：8μL引物、1μL Bst DNA聚合酶、3μL dNTP、2.5μL10×Bstbuffer、2μL Mg2+/Mn2+混合物、2μL待测样品DNA，用无菌水补齐到25μL。

进一步地，所述LAMP反应条件为63～68℃下反应30～60min。

进一步地，步骤(3)中通过肉眼观察方法为：当反应管未变浑浊，则说明待测样品中未检测到2019新型冠状病毒；当反应管变浑浊，则说明待测样品中检测到2019新型冠状病毒。

进一步地，步骤(3)中通过琼脂糖凝胶电泳判断方法为：当反应管的琼脂糖凝胶电泳无条带，则说明待测样品中未检测到2019新型冠状病毒；当反应管的琼脂糖凝胶电泳有条带，则说明待测样品中检测到2019新型冠状病毒。

本发明的有益效果如下：

1、本发明基于LAMP技术特异性高的特点，所设计的引物仅能特异性扩增2019新型冠状病毒的基因组序列，且引物设计科学，避免了引物二聚体的形成，保证了反应的顺利进行；选取2019新型冠状病毒的保守基因S片段作为检测的目标基因，该S基因高度保守，可以保证检测结果的准确性，避免漏检的出现，选取区域特异性强，避免了假阳性出现。

2、本发明提供的检测2019新型冠状病毒LAMP检测方法灵敏度高，最低检测极限是10¹拷贝/μL，高于现有技术报道的LAMP检测方法。

3、本发明提供的检测方法操作简单，不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需要恒温水浴即可反应，反应条件温和；而且可以通过肉眼观察浑浊、琼脂糖凝胶电泳或者添加荧光物质进行荧光检测等丰富的途径判定检测结果，适合基层检测单位的现场检测。

附图说明

附图1为实施例1中阳性质粒验证图；其中：M：Marker；1，PCR鉴定S基因片段；

附图2为实施例1中阳性质粒的LAMP检测结果图；其中：1：阳性质粒S基因作为模板进行检测；2：检测去离子水；

图3为实施例1中阳性质粒的LAMP检测结果电泳图；其中：M：Marker；1：阳性质粒S基因作为模板进行检测；2：检测去离子水；

图4为LAMP检测方法特异性试验结果电泳图；其中：M：Marker；1：2019新型冠状病毒；2：冠状病毒229E；3：冠状病毒OC43；4：冠状病毒SARS；5：冠状病毒NL63；

图5为LAMP检测方法灵敏度试验结果电泳图；其中：M：Marker；1：质粒1×10⁵拷贝/μL；2：质粒1×10⁴拷贝/μL；3：质粒1×10³拷贝/μL；4：质粒1×10²拷贝/μL；5：质粒1×10¹拷贝/μL；6：质粒1×10⁰拷贝/μL。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

以下实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。

实施例1

一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测引物组，所述引物组根据Genebank公布的2019新型冠状病毒基因序列，通过http：//PrimerExplorer.jp设计得到，由苏州金唯智生物科技有限公司合成，所述引物组包含一对外引物、一对内引物和一对环引物，所述引物组序列如下所示：

外引物：

2019nCov_F3 GGTGTTTATTACCCTGACAAAG(SEQ ID NO:1)

2019nCov_B3 GTACCAAAAATCCAGCCTC(SEQ ID NO:2)

内引物：

2019nCov_FIP CATGGAACCAAGTAACATTGGAAAATTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTC(SEQID NO:3)

2019nCov_BIP CTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGACTTCTCAGTGGAAGCA(SEQ ID NO:4)

环引物：

2019nCov_LF AGGTAAGAACAAGTCCTG(SEQ ID NO:5)

2019nCov_LB GTCCTACCATTTAATG(SEQ ID NO:6)。

一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含上述引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照品和阴性对照品，所述外引物、环引物、内引物的摩尔比为1:1:2，所述阳性对照品为含新型冠状病毒S基因的质粒DNA，阴性对照品为去离子水，所述LAMP反应液包括10mM dNTP、10×Thermopol反应缓冲液、150mM MgSO₄水溶液。

一种利用上述引物组检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法，包括如下步骤：

(1)样品DNA提取

含新型冠状病毒S基因的质粒DNA由山东大学王培会教授惠赠，S基因的核苷酸序列为：

ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACATAA(SEQ ID No:7)；

将上述含新型冠状病毒S基因的质粒DNA溶解稀释至1.0×10⁶拷贝/uL；

(2)阳性质粒的鉴定

采用外引物2019nCov_F3、2019nCov_B3对上述含新型冠状病毒S基因的质粒DNA进行PCR扩增，验证质粒的正确性，阳性质粒验证图如附图1所示；其中：M：Marker；1：PCR鉴定S基因片段；结果表明，S基因片段大小为221bp，目的基因大小正确、电泳条带清晰、无杂带。

(3)环介导等温扩增反应：配置反应体系，所述反应体系如下表1所示，将浓度为1.0×10³拷贝/uL的阳性质粒作为检测对象，置于恒温容器中进行环介导等温扩增反应，经试验确定LAMP反应温度为65℃，最佳反应时间为50min。

(4)通过肉眼观察白色浑浊和凝胶电泳相结合，判断检测结果。阳性质粒的LAMP检测结果图如附图2所示；其中：1：阳性质粒S基因作为模板进行检测；2：检测去离子水；其中管1显示白色浑浊，阳性质粒检测为阳性，阴性对照品检测为阴性；阳性质粒的LAMP检测结果电泳图如附图3所示；其中：M：Marker；1：阳性质粒S基因作为模板进行检测；2：检测去离子水；其中阳性质粒检测结果出现梯状条带，检测为阳性。

表1 LAMP检测方法反应体系

检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法的特异性试验

使用常规方法提取2019新型冠状病毒核酸、冠状病毒229E核酸、冠状病毒OC43核酸、冠状病毒SARS核酸、冠状病毒NL63核酸提取物作为模板，采用实施例1中的引物组和LAMP反应体系和反应条件进行检测，观察检测结果，检测结果如附图4以及下表2所示。

表2 LAMP检测方法特异性试验结果

样品种类	LAMP结果
		2019新型冠状病毒核酸	阳性
冠状病毒229E核酸	阴性
		冠状病毒OC43核酸	阴性
冠状病毒SARS核酸	阴性
		冠状病毒NL63核酸	阴性

附图4为LAMP检测方法特异性试验结果电泳图，其中：M：Marker；1：2019新型冠状病毒；2：冠状病毒229E；3：冠状病毒OC43；4：冠状病毒SARS；5：冠状病毒NL63；

实验结果表明，用该LAMP检测方法检测冠状病毒229E、冠状病毒OC43、冠状病毒SARS、冠状病毒NL63的核酸提取物，结果全为阴性。检测已知2019新型冠状病毒核酸，结果为阳性；证明本发明检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法具有较好特异性。

检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法的灵敏度试验

取2019新型冠状病毒阳性冻干质粒，用去离子水将质粒充分溶解稀释至1×10⁶拷贝/uL，将稀释到1×10⁶拷贝/ul的质粒分别稀释至1×10⁶拷贝/u、1×10⁵拷贝/u、1×10⁴拷贝/u、1×10³拷贝/u、1×10²拷贝/u、1×10¹拷贝/uL、1×10⁰拷贝/uL，分别对不同拷贝数的质粒进行LAMP扩增和PCR扩增。观察检测结果，检测结果如附图5以及下表3所示。

表3 LAMP检测方法灵敏度试验中第一套引物试验结果

质粒浓度(拷贝/uL)	LAMP结果	PCR检测结果
			1×10<sup>0</sup>	阴性	阴性
1×10<sup>1</sup>	阳性	阴性
			1×10<sup>2</sup>	阳性	阴性
1×10<sup>3</sup>	阳性	阴性
			1×10<sup>4</sup>	阳性	阳性
1×10<sup>5</sup>	阳性	阳性

附图5为LAMP检测方法灵敏度试验结果电泳图；其中：M：Marker；1：质粒1×10⁵拷贝/μL；2：质粒1×10⁴拷贝/μL；3：质粒1×10³拷贝/μL；4：质粒1×10²拷贝/μL；5：质粒1×10¹拷贝/μL；6：质粒1×10⁰拷贝/μL。

结果显示，LAMP检测方法从质粒浓度1×10⁶拷贝/uL至1×10¹拷贝/uL，均可扩增到预期的阳性，可测的质粒最低浓度为10¹拷贝/uL，而PCR检测的灵敏度为10⁴拷贝/uL，相比而言，LAMP检测的灵敏度提高了1000倍。

检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法灵敏度比较试验

在检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法灵敏度比较试验中，设置2个对照组与实施例1中引物组比较灵敏度，试验方法与上述检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法的灵敏度试验的方法一样，所述2个对照组的引物序列如下表4所示：

表4灵敏度比较试验对照组引物设置

所述2个对照组与实施例1中的引物组比较灵敏度的试验结果如下表5所示：

表5 LAMP检测方法灵敏度比较试验结果

以上试验结果可知，实施例1中设计的引物组，对2019新型冠状病毒S基因阳性质粒的灵敏度可达到10¹拷贝/μL，相比对照组的引物，本发明实施例1的引物组具有更高的灵敏度，本发明所述引物组中环引物对于LAMP检测方法的灵敏度具有重要的影响。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggtgtttatt accctgacaa ag 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtaccaaaaa tccagcctc 19

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

catggaacca agtaacattg gaaaattttc agatcctcag ttttacattc 50

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctctgggacc aatggtacta agaggacttc tcagtggaag ca 42

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

aggtaagaac aagtcctg 18

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gtcctaccat ttaatg 16

<210> 7

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

caaaaagaaa ttgaccg 17

Claims (10)

1.一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测引物组，其特征在于，所述引物组包含一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物：

2019nCov_F3 GGTGTTTATTACCCTGACAAAG(SEQ ID NO:1)

2019nCov_B3 GTACCAAAAATCCAGCCTC(SEQ ID NO:2)

内引物：

2019nCov_FIP

CATGGAACCAAGTAACATTGGAAAATTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTC(SEQ ID NO:3)

2019nCov_BIP CTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGACTTCTCAGTGGAAGCA(SEQ ID NO:4)

环引物：

2019nCov_LF AGGTAAGAACAAGTCCTG(SEQ ID NO:5)

2019nCov_LB GTCCTACCATTTAATG(SEQ ID NO:6)。

2.一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含Bst DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照品和阴性对照品。

4.根据权利要求2所述的一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述外引物、环引物、内引物的摩尔比为1:1:2。

5.根据权利要求3所述的一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液包括10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄水溶液。

6.一种利用权利要求1所述的引物组检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)环介导等温扩增反应：以步骤(1)中提取的待测样品DNA为模板进行环介导等温扩增反应；

(3)结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳判断待测样品中是否含有2019新型冠状病毒。

7.根据权利要求6所述的一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP反应体系为：8μL引物、1μL Bst DNA聚合酶、3μL dNTP、2.5μL 10×Bstbuffer、2μLMg2+/Mn2+混合物、2μL待测样品DNA，用无菌水补齐到25μL。

8.根据权利要求6所述的一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP反应条件为63～68℃下反应30～60min。

9.根据权利要求6所述的一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法，其特征在于，步骤(3)中通过肉眼观察方法为：当反应管未变浑浊，则说明待测样品中未检测到2019新型冠状病毒；当反应管变浑浊，则说明待测样品中检测到2019新型冠状病毒。

10.根据权利要求6所述的一种检测2019新型冠状病毒的LAMP检测方法，其特征在于，步骤(3)中通过琼脂糖凝胶电泳判断方法为：当反应管的琼脂糖凝胶电泳无条带，则说明待测样品中未检测到2019新型冠状病毒；当反应管的琼脂糖凝胶电泳有条带，则说明待测样品中检测到2019新型冠状病毒。

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