WO1995023861A1

WO1995023861A1 - MEGACARYOPOIETINE HUMAINE ET ISOLEMENT DE CELLE-CI, CLONAGE D'ADNc, ET PREPARATION DE LA PROTEINE RECOMBINEE

Info

Publication number: WO1995023861A1
Application number: PCT/CN1995/000015
Authority: WO
Inventors: Xue-Fun Gu; Zhong-Chao Han; Qing-Xiang Shen
Original assignee: Shanghai Beite Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 1994-03-04
Filing date: 1995-03-06
Publication date: 1995-09-08
Also published as: CN1107891A; AU1888095A

Description

人促巨核细胞生成素及其纯化、 cDNA克隆和

重组蛋白质的制备方法和应用

[技术领域]

本发明涉及一种新的造血细胞生长刺激因子，即人促巨核细胞生成素（Human megakaryopoietin, 简称 MPO)，更具体地说，涉及 MPO 的分离纯化、氨基酸顺序测定和其生物活性，以及编码这些蛋白质的 DNA分子的克隆及其在宿主细胞中的表达。

[背景技术]

巳知造血细胞是能增殖、分化，进一步产生成熟血细胞的前体细胞，有髓系造血细胞和淋巴系造血细胞之分，髓系造血细胞包括红细胞、白细胞和巨核细胞三个系列。红细胞主要负责体机组织中氧气、二氧化碳和一些营养物质或废物的交换。白细胞主要负责抵御感染的功能，巨核细胞则产生血小板，后者在机体止血和凝血中起关鍵作用。

已知造 '血细胞均来自一共同的多能干细胞，后者具有自我复制更新的能力，并在一定的条件下能进一步分化增殖为各系定向祖细胞。这些造血干细胞和祖细胞在体外培养体系中具有不同的增殖能力和细胞表型，据此可加以鉴别和分类。

已知造血是一个复杂的过程，受许多因子调节，包括各种细胞介素 (Interleukin)，集落形成刺激因子（Colony- forming Stimulating Factor , 简称 CSF，例如有 GM- CSF，G-CSF，M- CSF)和其它细胞生长刺激因子，如干细胞因子（Stem Cell Factor)，促红细胞生成素（Erythropoietin，简称 EPO)和成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factor, 简称 FGF)。对巨核细胞血小板生成有刺激作用的因子有 IL1， IL3 , IL6， IL11 , GM-CSF, SCF和 FGF (韩忠朝等，中华血液杂志， 14: 159 - 161 , 1993； Caen &. Han , C R Acad Sci Paris , 316 : 925— 930， 1993)。这些因子均巳采用基因重组技术生产，少数巳用于临床试验或治疗，但它们对提高巨核细胞和血小板数量的作用不明显。此外，替换页（细第 26条) 这些因子的活性十分广泛，临床应用指征不明确，且具有一定的副作用。

已知再生障碍性贫血或化疗诱发骨髓衰竭的病人的血清和尿中含有很强的能促进巨核细胞生长和分化，增加血小板生成的活性物质，许多研究者试图去鉴别、分离这种物质，并已经分离纯化出一种血小板生成素（Thrombopoietin，又称 c-MPL Ligand)，由 353个氨基酸残基组成。人 c-MPL Ligand的 cDNA克隆由 1，774个核苷酸组成，末端连接 -poly (A)+，与促红细胞生成素有 23%的序列相同，纯化的 c-MPL Ligand的分子量为 28K-32K或 18K-20K (SDS-PAGE分析），因两者的序列相同，所以来自一共同的前体蛋白。该因子对巨核细胞的生长成熟有促进作用，但主要作用^ "生长的晚期阶段（de Sauvage 等， Nature , 369： 533-538 ; Bartley等， Cell , 77 : 1196— 1244 ; LoK等， Nature 369 : 565-568) »

〔发明的描述〕

本发明的目的在于提供一种新的细胞生长刺激因子，该因子来源于再生障碍性患者的血清和尿，具有促进造血干细胞向巨核细胞分化生长、调节巨核细胞生长、分化和成熟的活性。经小鼠体内外试验和人体骨髓体外培养分析，该因子促进造血干细胞向巨核细胞分化、巨核细胞集落形成，增大巨核细胞体积，刺激血小板的生成；该因子还促进多能干细胞的增殖.，可用于治疗各种血小板减少症和全血细胞减少症。按其生物学特征，取名为人促巨核细胞生成素（Megakaryopoietin，以下简称 MPO)。

本发明的另一个目的在于，建立一套 MPO的纯化方法。

本发明的还有一个目的在于，建立一套 MPO的 cDNA克隆方法和采用重组 DNA技术，通过现在通用的表达体系，生产有活性的重组人 MPO的方法。

本发明包括 MPO的纯化方法。在本发明的下述几个实施例中，将亲和层析（麦胚凝集素亲和层析和肝素亲和层析）与其他常规分离法相结合，从再障性病人的尿和血清中分离纯化出人促巨核细胞生成素。使用发明的分离纯化方法，从表达 MPO 的昆虫和中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞培养液中同样地可以分离纯化出有刺激巨核细胞生长作用的蛋白质。因此，本发明的分离纯化方法是有效的 MPO分离纯化方法。本发明的分离方法技术新颖、重复性好，产率也高。

在本发明的实施例中，使用的其他常规分离方法，包括提取、浓缩、沉淀、凝胶层析和高效液相层析，也可以包括电泳或其他类似的方法以及洗涤、搅拌、振荡、过滤等。

在本发明的实施例中，使用麦胚凝集素偶联的琼脂糖和肝素偶联的琼脂糖，将非亲和性的部分分离开来，极有效地提高了含 MPO的蛋白质部分的单位特异性活性，有利于其后的用高效液相层析进行的分离。使用的载体除琼脂糖外.，也可以是任何能与麦胚凝集素或肝素偶联的其他支承物或载体，如共知的聚苯乙烯、葡聚糖、天然或改性的纤维素、聚丙烯酰胺等。

MPO纯化方法中各分离步骤的最佳组合和最佳分离纯化条件，本领域的技术人员可以通过常规实验方法加以确定。

本发明还包括编码 MPO的 DNA分子的克隆及其在宿主细胞中的表达。在 *发明的下述一个实施例中，确定了纯化的人促巨核细胞生成素的分子量范围和氨基酸序列。并在另二个实施例中，根据蛋白质顺序，设计出相应的核苷酸引物，在人胚肝 cDNA文库中克隆出 MPO的 cDNA，并测出其核苷酸顺序，继后在毘虫和中国仓鼠卵巢（CHO)细胞体系中表达出有活性的重组蛋白质因子。

在对人尿 MPO用反相高效液相层析（HPLC)进行最后的分离后得到的产物中，我们发现二个活性高的组分，经 ¹²⁵ I标记后作聚丙酰胺电泳分析，其分子量在还原状态下（加二巯基醇）为 24— 32Kd，在非还原状态下为 35— 45Kd。将 35— 45Kd MPO蛋白用 2%胰蛋白酶消化处理，经氨基酸序列分析，确定了 MP〇蛋白的氨基酸序列。

根据获得的氨基酸序列，用巳知的遗传密码推测与氨基酸相应的核苷酸，我们设计了多对变性引物进行 P C R扩增。 '其中一对变性引物在以胚肝 cDNA文库为模板的扩增中莸得一条特异性扩增带，变性引物序列如下： TGYAAYTGYG AYTAYAAYTG YCARCAYTAY ATGGA; 2 ) TTYGGNGGNT TRTTYTTYTT YTGNTTYTTY CANTADCT。所获特异扩增带的 cDNA经序列测定，证实与 MPO的氨基酸序列吻合。

此特异性 cDNA扩增产物用 DIG-dUTP标记，将其作为探针筛选人胚肝 cDNA文库。在直径为 14cm的琼脂平板中播下 4一 5万个克隆，用尼龙膜转移，尼龙膜经变性及缓冲处理后与标记的 cDNA探针杂交，经洗脱及荧光显影，在 X光底片上荻得图象。

由于使用的 cDNA文库的质粒为 λ-ΖΑΡ。筛选到的阳性克隆可以用 R408辅助噬菌体进行茵体内 pBluescript的切除，在含有氨苄青霉素的 LB平板上克隆，再经多次亚克隆和 DNA测序，获得 MPO cDNA 序列，经比较截止 1995年 2月的基因和氨基酸资料库（cDNA序列与 EMBL,Genbank比较，氨基酸序列与 Swissprot资料库比较），未见有相同的 cDNA序列。

然后，根据获得的 MPO cDNA，构建含 MPO cDNA的转移载体，在宿主细胞中表达 MPO。用 EcoRI和 pstl酶解质粒 pGEM-MPO (本实验室构建），回收 MPO cDNA片段，克隆入 pVL 1392的 EcoRI和 Pstl位点之^，产生的质粒 pVL 1392 MPO与 8₃(：111000101^线性化的病毒基因组 DNA共转染 Sf9 昆虫细胞，根据被转染的细胞形态的变化，筛选出重组病毒 AcNPV-MPO。重组病毒转染昆虫细胞 4至 8天后，其上清液经初步分离纯化，其蛋白组份比未转染的昆虫细胞培养上清液多出一分子量为 45Kd的蛋白质，且对巨核细胞集落形成有明显的刺激作用。

用 EcoRI和 BamHI酶解 pGEM-MPO，用 LMP Agarose 回收 MPO cDNA片段，真核表达载体 pSV2-dhfr用 Hind HI酶解。将 MPO 基因片段和 Hind II酶切过的 pS V2-dhf r填平后连接，产生质粒 pS V2- MPO。随后用 pSV2-MPO转染 CHO-dhfr-细胞，从中挑取 dhfr+克隆 69个，用 PCR方法产生 237bp片段，经 [³²P]标记后作为探针，杂交阳性，证实 MPO基因的存在。部分克隆作氨甲喋呤 (MTX)加压，以扩增基因，增加表达量。加压后的细胞裂解液作 SDS-PAGE分析。条件培养液经生物活性测定，证实对巨核细胞集落形成有明显的刺激作用。上述的克隆，克隆分离，鉴别，定性和测序的程序在后面的实施例中将更详细地描述。

MPO也可以通过其它类型的重组细胞而产生，如原核细胞的大肠杆菌，或其它真核细胞，比如酵母细胞。构建适当的携带编码 MPO cDNA的表达载体，用来转化宿主细胞（如大肠杆菌或酵母细胞)或感染昆虫细胞，以产生重组的 MPO的方法，在本领域是共知的。例如，可参见 Ausubel 等人编著的 " Current Protocols in Molecular Biology "Current Protocols， 1993 ; 和 Sambrook等人编著的" Molecular Cloning : A Laboratory Manual " , 第二版， Cold Spring Harbor Press , 1989。 .

本发明还涉及 MPO的活性突变蛋白和活性片段，还涉及由融合于另一多肽或蛋白质的天然 MPO , 或它们的活性突变蛋白或它们的活性片段组成的融合蛋白，融合蛋白发挥相似的促进巨核细胞生长分化的生物学活性。

将构建的含编码 MPO、它们的活性片段、突变蛋白或融合蛋白的 DNA , 和搡纵转录与翻译调控信号的 DNA序列的载体导入真核生物宿主细胞中.。为了能选出已导入的 DNA稳定地整合入染色体中的细胞，可以使用一种或多种标记以选择含表达载体的宿主细胞。标记可以将营养缺陷型宿主，提供耐致命物质（如抗菌素）的能力，提供抗重金属如铜的耐性，或类似的性能。可选择'的标记基因可以直接连于待表达的基因顺序，也可以通过共转染一起引入同一细胞。也需要一些额外的因子以最理想地合成出单链结合蛋白 _mRNA。这些因子可以包括拼接信号，以及转录启动子，增强子和终止信号。

为了表达 MPO蛋白、它们的活性片段或衍生物，最好将待引入已选择好的细胞的 DNA分子插入到一个能在受体宿主中自主复制的质粒或病毒载体中。

在选择特定质粒或病毒载体中的重要因素包括：能方便地识别并将含有载体的受体细胞从不含载体的受体细胞中选择出来；在特定宿主中所期望的载体的拷贝数目；是否有利于使载体在不同种的宿主细胞之间 "穿梭"。理想的真核生物质粒包括 pVL1392、_PSV2等或它们的衍生物。这些质粒是本领域中共知的。

一旦制备好含目的基因的表达载体，可以通过一系列合适的方法中的任何一种将表达载体引入适当的宿主细胞，如通过转化、转染、脂质体载体转染、接合作用、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀法.、直接显微注射法等。

用于本发明的宿主细胞可以是原核或真核生物的。理想的原核生物宿主包括细菌如大肠杆菌（£. CoZ )、芽孢杆菌属 CBa 〃 )、链霉素属 ( Streptojnyces )、假单孢菌属 ( Pseudomonas )、沙门菌属 (Salmonella )、沙雷菌属 Serratia ) 等。在这些条件下，蛋白质将不被糖基化。原核生物宿主必须可与表达质粒中的复制子和控制顺序相容。

然而，因为 ΜΡΟ是糖基化的蛋白，所以真核生物宿主优于原核生物宿主。理想的真核生物宿主是哺乳动物细胞，如人、猴、小鼠和中囯仓鼠卵巢（CHO)细胞，因为这些细胞可提供蛋白质分子翻译后的修饰，包括正确的折叠，形成正确的二硫鍵以及在正确的位点糖基化。同样，酵母细胞和昆虫细胞也可进行翻译后肽的修饰，包括高度的甘露糖基化。有许多使用强启动子顺序和高拷贝数目质粒的重组 DNA 策略，可用来在酵母和昆虫细胞中产生所期望的蛋白质。酵母细胞识别克隆的哺乳动物基因产物上的引导顺序并分泌带引导顺序的肽。引入载体后，宿主细胞在选择培养基上生长，选择含载体的细胞。克隆的基因顺序的表达导致产生 ΜΡΟ或它的融合蛋白或突变蛋白、或其活性片段。

此处所用的术语"突变蛋白"指 ΜΡΟ的类似物，其中一个或多个天然 ΜΡΟ或其活性片段的氨基酸残基被不同的氨基酸残基所替换或缺失，或者一个或多个氨基酸残基被加入到天然 ΜΡΟ的顺序中。而且，与天然的 ΜΡΟ的活性片段相比，没有显著改变所得到的产物的活性。这些突变蛋白可以用已知的人工合成和 /或定点诱变技术或任何其它已知的适合用于该目的的技术来制备。

任何一种这样的突变蛋白最好具有与 ΜΡΟ的氨基酸顺序足够一样的氨基酸顺序，从而使其具有与 ΜΡΟ或其活性片段实质上相似的活性。

在较佳的具体例子中，任何这样的突变蛋白与 MPO至少具有 40%的一致性或同源性。更佳的具有至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%或最佳的具有至少 90%—致性或同源性。

根据本发明所能使用的 M P〇、多肽或它们的活性片段的突变蛋白，或者为其编码的核酸，包括一系列有限的实质上对应的置换肽或多聚核苷酸顺序，它们可以由本领域的一般熟练技术人员，依据此处给出的说明和指导，通过适当的实验方法常规地获得。

根据本发明，较佳的突变蛋白的改变是那些已知的"保守的 "置换。 MPO或多肽或它们的活性片段的保守的氨基酸置换可以包括一组同义氨基酸，这些氨基酸 ^有足够相似的物化性能使得组中氨基酸之间的置换会保留该分子的生物学功能〔Grantham , Science , Vol , 185， pp. 862-864 (1974)〕。已经清楚，在上述限定的顺序中也可以插入或缺失一些氨基酸而不改变其功能，尤其是如果插入或缺失只包括少数氨基酸例如小于 30个，较佳的小于 10个，并且不去除或替换对功能构象至关重要的氨基酸如 Cys 残基时〔 Anfinsen， "Principles That Govern The Folding of Protein Chains，，， Science， Vol.， 181， PP. 223-230 (1973)〕。这样的缺失和 /或插入而形成的蛋白质和突变蛋白归于本发明的范围。

本发明的突变蛋白包括由核酸如 DNA或 RNA编码的蛋白质，这些核酸在严谨条件下会与编码本发明的 MPO的 DNA或 RNA杂交。本发明还包括一类核酸，它能作为探针用于鉴别和纯化所期望的核酸。此外，该核酸是主要的候选对象，以确定它是否编码一种具有本发明的 MPO功能活性的蛋白质。

本发明的重要用途在于：

(1)可以采用已经建立的分离方法从人或动物的尿和血清中大量纯化天然 MPO。由于天然人 MPO主要于存在于再生障碍性贫血病人的血和尿中（Hoffman , Blood , 74 : 1196— 1212 , 1989， Han et al , Int J Hematol , 54 : 3— 14， 1991)来源有限，不易大量制备，但假如将某些动物如牛、狗，猎或老鼠进行照射，造成继发性再生障碍性贫血，然后制备血清，再采用本发明的方法纯化分离 MPO，则来源充足；

(2)按照本发明所述的 MPO的 cDNA克隆方法，可以设计出与 MPO不完全相同的变性引物进行 PCR扩增，从而进一步莸得 MPO 的类似物的 cDNA。

(3)根据本发明提供的 MPO cDNA序列，采用重组 DNA技术，可通过现在通用的各种表达体系，如大肠杆菌，酵母菌，昆虫或哺乳类动物细胞的表达，大量生产重组的 MPO及其变异物。我们在昆虫和 CHO细胞成功表达出重组人 MPO便充分证明了这一用途；

(4) MPO和其突变因子作为造血细胞生长因子，可广泛用于研究血细胞的生长调节并可用作体外造血干细胞和祖细胞、巨核细胞和血小板生长和大量扩增的重要试剂。

(5)整个 MPO蛋白质分子或其活性多肽片段或该因子的突变蛋白单独可制作成药物治疗各种原因引起的血小板减少和全血细胞减少；

(6) MPO蛋白质分子或其活性多肽片段或该因子的突变蛋白与一些能增加其活性的物质（如粘多糖或脂）组成的复合制剂可用作药物，治疗各种原因引起的血小板减少和全血细胞减少；

(7) MPO蛋白质分子或其活性多肽片段或该因子的突变蛋白与一些造血细胞生长因子（SCF， EPO , TPO， GM-CSF和 IL3 )体外合用，对红系和粒系祖细胞的生长也有作用，因此与治疗有效量的这些生长因子配伍合用，可治疗其它全血细胞减少症。

(8) MPO和其突变因子可用作抗原在鼠、兔子和羊等动物身上制备单克隆和多克隆抗体， MPO及其抗体可配备成试剂盒，用于 MPO 水平测定和定位，可作为与巨核细胞和血小板有关疾病的诊断和科研试剂，抗 MPO抗体还可用于因 MPO水平增高引起的有关疾病的治疗药物，

(9) MPO及其抗体，可用作鉴别分离 MP〇受体的重要工具，这可通过目前通用的受体鉴别分离方法来进行。

[附图说明] 图 1 一个阳性克隆的亚克隆原位杂交图。黑点表示阳性克隆。图 2 克隆质粒 pGEM-MPO结构示意图。

图 3 多角体病毒表达载体 pVL 1392-MPO构建示意图。

图 4 肝素柱分离峰 I的 SDS-PAGE银染分析结果。

Lane 1：实验样品； Lane 2：对照样品。箭头指表达产物

MPO条带。

图 5 表达质粒 pSV2-MP〇构建示意图。

图 6 含 MPO基因的 CHO细胞裂解液的 SDS-PAGE银染分析结果。

Lane 1：实验样品； Lane 2 :对照样品。箭头指产物 MPO条

[最佳实施方式]

下面，结合实施例，对本发明作进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。

实施例 1 人尿 MPO的分离纯化

收集再障病人的尿 55升，随即用 Amicon的 YM10过滤器将尿超滤浓缩。然后用 Sephadex G50层析脱盐。将所得的蛋白部分用 3M氯化胍处理，再按下列流程所示方法分离纯化。

MPO分离流程（流程 1)

1. 氯化胍（3M)处理

2. 乙醇沉淀（60— 90%饱和）

. PBS透析

3. 麦胚凝集素（WGA)—Sepharose 6MB (Pharmacia LKB)

含 0.2M乙酰葡糖胺的 PBS洗脱

I

4. 反相 HPLC— C₁₈柱（美囯 VYDDC公司， Cat^tt218TP510)

溶剂： Α:0.1%三氟醋酸

Β:70%乙腈一 0.1%三氟醋酸流速：0.5ml/分， 1.5ml/管从 A液— B液线性梯度洗脱 40分钟

5. Superose 6— HPLC (Pharmacia LKB)

PBS作为缓冲液

γ

6. ·肝素一 Sepharose CL-6B柱（Bio—Rad).

2M NaCl洗脱

、,收集蛋白峰

7. 反相 HPLC― Nucleosil C₄柱（4.6 X 30mm ,

日本 TOUZART &. Matignon公司产品）或反相 HPLC— C₈柱（4.6X30mm，

美国 Applied Biosystems产品）每步分离后，采用小鼠骨髓体外血浆凝块法（Han et al, Br J Haematol, 81:1— 5， 1992)对所有的组份都作活性分析，具有明显刺激巨核细胞生长的组份随即进行下一步的分离纯化，人尿促巨核细胞生成素的纯化与活性分析结果见表 I。表 1 :人尿促巨核细胞生成素分离纯化及活性分析分离步骤 (活性部位）特异性活性总纯化指数

集落数 /mg

1.尿蛋白（Sephadex G50后） 3 1 .

2.酒精沉淀物 (60— 90%饱和度） 300 30

3. 麦胚凝集素柱 (亲和部分） 4100 ¾1400

4.反相 HPLC— C18(20— 26管） 7600 ¾2530

5. Superose— 6层析柱

(1)(20— 22管) 12000 4000

(2)(35-37管） 11000 ¾3300

6-肝素柱 (亲和部分）

(1)5— (1)组份 86000 ¾28700

(2)5— (2)组份 49000

7.反相 HPLC—C4

(1)6— (1)组份 (8— 9管） 143000 ¾47700

(2)6— (2)组份 (8—9管) 138000 46000 骨髓细胞来自 Balb/c小鼠。巨核细胞培养和鉴别方法按文献^^^^ ^^!^^， 1 一 5， 1992)进行。 o>

从表 1的'结果可知，通过流程 1的 MPO分离纯化方法，人尿中促巨核细胞生成素明显地得到了分离、纯化。

实施例 2 人血清 MPO的分离纯化

收集再障病人的血清 550毫升，经 3M氯化胍处理后，按流程 1所示的方法进行人血清促巨核细胞生成素的分离纯化。其活性分析方法同实施例 1，结果如下：

表 2. 人血清促巨核细胞生成素纯化及活性分析分离步骤 (活性部位）特异性活性总纯化指数

巨核细胞集落数 /mg

1.血清 10 1

2. 乙醇沉淀物 (60— 90%饱和度） 400 40

3.麦胚凝集素亲和层析 (亲和部分） 5000 500

4.反相 HPLC— C18(第 23—25管） 9500 950

5. Superose— 6层析（第 20—22管) 17000 1700

6.肝素亲和层析 (亲和部分） 3000 3000

6.反相 HPLC— C4(第 8—9管) 68000* 6800*

*因蛋白量很小，其浓度为估计值^ 从表 2的结果可知，与人尿 MPO—样，人血清 MPO也可以通过流程 1所示的方法进行分离纯化。

实施例 3 MPO氨基酸序列的分析

在实施例 1 中经反相 HPLC— Nucleosi C₄柱或 C₈柱分离得到的产物中，我们发现二个活性高的组分，经 ¹²⁵ I标记后作聚丙酰胺电泳分析，其分子量在还原状态下（加二巯基醇）为 24— 32Kd和 7— 13Kd (表 1的 35-37管），在非还原状态下为 35-45Kd和 7— 13Kd。

将上述 35— 45Kd的 MPO蛋白质 30微克用 2%胰蛋白酶消化处理后，用美国 Applied Biosystems公司的 473型氨基酸序列分析仪进行氨基酸序列分析。其结果如序列 1所示。

实施例 4 MPO的 cDNA分子克隆

根据实施例 3中 MPO的氨基酸序列中的二条肽序列：1)DATC- NCDYNC QHYMECCPD; 2) SPKPPNKKKT KKVIESEE , 用巳知的遗传密码推测与氨基酸相应的核苷酸，我们设计了多对变性引物进行 PCR 扩增。其中一对变性引物为： 1 ) TGYAAYTGYG AY- TAYAAYTG YCARCAYTAY ATGGA; 2)TTYGGNGGNT TRT- TYTTYTT YTGNTTYTTY CANTADCT (其中 Y = C. Y，R = A. G，N = A. C. G. T，D=G. A. T)。在以胚肝 cDNA文库为模板的扩增中获得一条特异性扩增带。所获特异扩增带经 DNA序列测定（见序列 2)证实与氨基酸序列吻合（见序列 1)。

此特异性 cDNA扩增产物用 DIG-dUTP (BOEHRING产品）标记，作为探针筛选人胚肝 cDNA文库。在直径为 14cm的琼脂平板中播下 4一 5万个克隆，用尼龙膜转移，尼龙膜经变性及缓冲处理后与.标记的 cDNA探针杂交，经洗脱及荧光显影，在 X光底片上获得图象（图 1)。在 100万个克隆中共筛选出 2个阳性克隆。

由于使用的 cDNA文库的质粒为 λ- ZAP，筛选到的阳性克隆可以用 R408辅助噬菌体进行体内 pBluescript的切除，在含有氨苄青霉素的 LB平板上克隆，再经多次亚克隆和 DNA测序，荻得了序列 2所示的 MPO cDNA序列，ΜΡΟ ς _ΝΑ全长 1389bp，编码 441个氨基酸残基（序列 1) ,经比较 1995年的基因资料库（见前述），未见有相同的 cDNA序列。

我们采用重组 DN A技术，在昆虫细胞和中国仓鼠卵巢（CHO )细胞中表达出有刺激巨核细胞生长活性的 MPO。

实施例 5 MPO在毘虫细胞中的表达

含 MPO cDNA转移载体的构建和重组病毒的筛选

分子克隆主要参考 Sambrook等的方法（Sambrook， T. et al. Molecular Cloning： A Laboratory Manual , 1989， Cold Spring Harbor Laboratory , New York.：)。 pGEM质粒购自 Promrga公司。将 MPO cDNA克隆入 pGEM，构成质粒 pGEM- MPO。此为 MPO cDNA 来源（见图 2)。用 EcoRI和 Pstl酶解质粒 pGEM-MPO，回收 MPO cDNA片段，克隆入昆虫细胞表达质粒 pVL 1392的 EcoRI和 Pstl位点处（图 3)。经琼脂糖电泳鉴定 cDNA插入方向，有 1. 4Kb片段出现，说明 cDNA插入方向是正确的，构建成的质粒称作 pVL1392-MPO. 在这种情况下， MPO cDNA 的表达受控于 AcNPV多角体病毒启动子，以非融合蛋白形式表达。用产生的重组质粒 pVL 1392-MPO和 BaculoGold™线性化的病毒基因组 DN A (Parmigen公司）共转染 Sf 9 昆虫细胞 (Christopher Christopher , DNA cloning： A practical approach 1985 , 3 : 163 , IRL Press , Oxford. )。借助于倒置显微镜观察被转染的细胞形态的变化，筛选出重组病毒 AcNPV-MPO。抽提重组病毒基因组 DNA，用一对引物 [(1)GATGGCATGGAAAACACTTCCCC (MK2， 22mer); (2)TCGAAGGACTCAAAGCAGCGGC(MKR2，22mer)。用 Applied Biosys- tems DNA 合成仪合成。 ]，作 PCR 扩增，产生 237bp 片段；用 Boehringer Mannheim Biochemicals的随机引物试剂盒和 Amersham 公司的 0-³²P]-dATP制备 ³²P标记的 MPO cDNA，将其作探针，进行杂交分析，结果均为阳性，这进一步证实重组病毒含有 MPO cDNA插入物，产生的重组病毒称作 AcNPV-MPO。

MPO cDNA在昆虫细胞中的表达及其产物的初步分离

在无血清培养基（Sf-900，Gibco公司产品）中培养昆虫细胞。用重组病毒 AcNP V-MPO感染 ¾ 细胞 144小时后，收集培养液，超离心 (100, 000 X g)45分钟，取上清液，作肝素一 Sepharose CL-6B (简称肝素）柱和麦胚凝集素一 Sepharose 6MB (简称 WGA)柱分离纯化。肝素柱（Pharmacia公司产品） 1. 0 X 20cm， 200ml样品过柱二次后，柱先用 PBS 淋洗，后分别以含 0. 5MNaCl 和 1. OMNaCl 的磷酸缓冲液 (pH7. 2)洗脱，分别合并洗脱峰，对 0. 01 %NH₄HC0₃溶液透析，冰冻干燥后备用。 . WG A柱（Pharmacia公司产品） 2 X 15cm， 200ml样品过柱二次后，柱先用 PBS淋洗，后以含 0. 5M 乙酰葡糖胺的 PBS溶液洗脱，合并洗脱峰，对 0. 01 %NH₄HCO₃溶液透析，冰冻干燥备用。经肝素柱和 WGA柱分离的样品作 SDS-PAGE分析（Chen , W. et al. J. Biol. Chem.， 266 :4082 , 1991)和生物活力测定。

肝素柱分离峰 I产物的电泳结果（图 4)，与对照相比，至少多一分子量为 45Kd的额外条带。生物活性测定表明，昆虫细胞表达的 MPO 有促进巨核细胞集落形成的作用，加入不同的粗纯化物，与对照相比，均有 40%的促进作用（见表 3)。 O 95/23 表 3. 表达 MPO的昆虫细胞培养液对小鼠巨核细胞的作用

加入量 (μΐ) 巨核细胞集落 /10i

种植细胞

PBS 100 29+5

不表达 MPO的昆虫细胞培养液 10 9士 3

100 3士 1 表达 MPO的昆虫细胞培养液 10 78士 6*

100 87士 5* 有 *者表示与 PBS组或与不表达的细胞培养组比较, P<0.05。

本实验结果为二次实验的平均值。实施例 6 MPO在 CHO细胞中的表达

表达载体的构建

质粒的提取和酶解， DNA片段的分离纯化、体外重组及转化均按文献 (SambrQok , T. et al. Molecular Cloning： A Laboratory Manual , 1989， Cold Spring Harbor Laboratory , New York.：)报道的方法进行。

进行 DNA重组与扩增的宿主细菌 JM103和真核表达载体 pSV2-dfhr为 Gibco-BRL公司产品，表达宿主细胞 CHO-dhfr—，购自美国 ATCC公司。 pGEM- MPO为 MPO cDNA的来源，DNA限制性内切酶购自 Promega 公司，随机引物标记试剂盒系 Boehringer Mannheim Biochemicals产品。〔a— ³²P〕-dATP为 Amersham公司产品。细胞培养基和胎牛血清为 Gibco产品，聚合酶反应（PCR)引物为： (1)0八丁00。八丁〇0八八八0八(丁丁0 0 (1^1：2，2211½1")和（ I ) TC- GAAGGACTCAAAGCAGCGGC ( MKR2 , 22mer ) , 用 Applied Biosystems DNA合成仪合成。

pGEM-MPO经 EcoRI和 BamHI酶切，用 LMP琼脂糖回收基因片段， pSV2 dhir用 Hind II酶解。 MP〇基因片段和 Hind I酶切过的 pSV2-dhfr经填平后连接，产生质粒 pSV2-MPO. 用 Apal酶解产生 1872bp和 4531bp片段，说明 MPOcDNA片段插入方向正确，基因表达受控于 SV40早启动子（图 5)。

细胞培养、转染及氨甲喋呤加压扩增和 MPO的表达

CHO-dhfr"细胞先培养于非选择性培养液（Ham's F12 + 150μ ml脯氨酸 + 10%胎牛血清 + 100IU/ml青霉素 + 100μ_δ/ιη1链霉素）中， 37'C，5%C0₂孵箱培养。转染前一天，取对数生长期细胞， 0. 1%胰蛋白酶 (Sigma )消化， 60mm培养皿中接种 1 X 10⁹细胞，培养 20— 24 小时，转染前 3小时换液一次，用磷酸钙沉淀法（Christopher , R. B. and Christopher C G. H. A pratical approach 3 : 163， 1985. IRL Press， Oxford. )将质粒导入细胞，继续培养 2 小时后，换成选择性培养液（DMEM + 150 g/ml脯氨酸 + 10%透析胎牛血清 + 100IU/ml青霉素 + 100 g/ml链霉素）、每 3— 4天换液一次，12— 20 天后计 dhfr⁺细胞集落，计转染效率，并用细胞集落分离器挑出集落，建立克隆培养，逐渐增加氨甲喋呤（Methotrexate MTX , Sigma)浓度进行加压扩增。

挑取 69个 dhfr+克隆，用与实施例 5相同方法进行 PCR扩增，产生 237bp片段；用 [³²P]标记探针，杂交阳性，证实 MPO基因的存在，挑选出其中 9个克隆作 MTX加压，以扩增基因，增加表达量，细胞株用 0. 025μΜ和 0. 05μΜ MTX 加压，细胞裂解液作 SDS-PAGE分析 (Chen , W. et al. J. Biol. Chem, 266 : 4082， 1991)，与仅用 pSV2- dhfr质粒转染所得的细胞相比， CHO-MPO至少多一分子量为 49Kd 的额外条带（图 6)。条件培养液作活性测定，证实对巨核细胞集落形成有明显的刺激作用，具体结果见表 4。表 4. 表达 MPO的 CHO细胞培养液对小鼠巨核细胞生长的作用加入量 (μ) 巨核细胞集落

/10⁵种植细胞

PBS 50 27±3

不表达 MP0的 CH0细胞培养液 50 31士 3

表达 MP0的 CH0细胞培养液 50 67±4* 有 *者表示与 PBS组或与不表达 ΜΡΟ的细胞培养液比较, Ρ<0. 05。

本实验结果为二次实验的平均值。实施例 7 人尿 ΜΡΟ对 CFU-MK和 CFU-GM生长的作用

将本发明纯化的人尿 ¾ O对 Balb/c小鼠骨髓巨核细胞祖细胞 (CFU-MK )，粒单细胞祖细胞（CFU-GM )和红细胞祖细胞（BFU-E ) 生长的作用，按 Han等报道的方法（Br J Haematol , 1990； 74： 395- 401)进行体外实验分析，发现人尿 MPO对小鼠骨髓巨核细胞生长有明显的刺激作用，具体结果见表 5。

表 5 因子浓度 CFU-MK CFU-GM BFU-E

(ng/ml) (/2X10⁵细胞)

DMPO 0 2±0.5 4±0.9 0

2)MPO 10 21±3.0* 5±1 0

3)MPO 50 46±4.1* 6士 1 2±0.5

4)IL3 50 43±3.2 32±5 3士 0.5

5HL3+MPO 50+50 72士 5.4* # 42士 3 3士 0.8

6)IL6 20 18±1.6 15+3 1士 0.3

7)IL6+MPO 20+50 57士 1.2* # 8士 1 . 1.5土 0.4

8)EP0 1U 12土 3 7土 2 33士 2

9)EPO+MPO 1U+50 ""· 66±5# 13士 2 55+2#

10)SCF 20 11士 2 10土 1 3士 1

1DSCF+MP0 20+50 56+3 22±2# 8土 2

* 与 MPO空白组对照， P<0.05。

# 与加同一因子，但未加 MPO组对照， P〈0.05。实施例 8 人尿 MPO对正常人 CFU-MK和 CFU-GM作用

采用已报道的方法（Han et al, Blood 75:1234— 1239,1990)进行人骨髓 CFU-MK和 CFU-GM的培养。在培养时，加入本发明的人尿 MPO，发现人尿 MPO对人骨髓巨核细胞生长有明显的刺激作用。具体结果见表 6。值得指出的是肝素的加入，使 MPO的活性明显增强，提示肝素与 MPO合用可产生协同作用。

表 6

MPO 肝素 CFU-MK CFU-GM

浓度 (_ng/ml) (fg/ml) 集落数 /2X10⁵细胞集落数 /2X10^!

0 0 1±0.2 13±0.7

10 0 7士 2 14±1

50 0 28土 3* 14+2

100 0 48±2* 19+3

0 10 2±0.3 12土 2

10 10 31+3* 16士 3

50 10 42土 5* 15士 2

100 10 65±5* 16士 3 显著性测验，均为 P<0.05，其中，有 *者， P<0.01。实施例 9 人尿 MPO对小鼠巨核细胞直径的影响

已知巨核细胞直径是判断巨核细胞成熟程度的指标之一。我们采用已报道的方法（Han et al, Br. J. Haematol.，81:1— 5， 1992)，在进行小鼠巨核绅胞培养时，加入人尿 MPO，发现人尿 MPO能增加巨核细胞的直径，对巨核细胞的成熟有促进作用。具体结果见表 7。

表 7 未加 MPO组加 MPO(50ng/ml)组加 MPO(100n_g/ml)组巨核细胞直径 (μπι) 28+4 39±3* 42±4* 每组共测量了 200个巨核细胞，数据以平均数土标准差表示。

有 *者表示与未加 ΜΡΟ组比较, Ρ<0.01。釆用 Student's t test检测。实施例 10 人尿 MPO对小鼠巨核细胞和血小板生成的体内作用

使用实施例 1 中用 Superose— 6分离后的第一组份（第 20—22 管）作为试验用人尿 MPO组份。在每只 Balb/c小鼠的腹腔内注射 MPO组份 100μ_§/次，每日二次，共注射 4天。对照组小鼠则以同样方式注射 PBS。最后一次注射后第 4天，取小鼠血用细胞计数器计算末梢血细胞数量，同时取骨髓作祖细胞（CFU-MK和 CFU-GM)和巨核细胞数量分析。整个分析采用文献报道方法（Han等， C R Acad Sci Paris 313 : 553-558 , 1991)，其结果见表 8。

表 8 骨體 (/10⁵细胞)

CFU-MK 巨核细胞 CFU-GM 血小板白细胞血红蛋白

万 /10¾m /10³mm g/100ml

PBS 34土 3 159±12 44士 3 908士 24 2500±400 15士 2

MPO 67±5 * 288il3 * ^51+ 1240土 35* 3500+350 15土 3 有 *者表示与 PBS组对比, P<0.05，采用 Student's t test检剁。由上述试验结果可见， MP〇不但在体外能刺激巨核细胞生长，注射入体内也能刺激巨核细胞和血小板的生长，因此有希望成为治疗血小板减少症的药剂。

实施例 11 MPO扩增正常小鼠造血干细胞和对人脐带血单个细胞分化的作用

本发明所述的 MPO还可用作体外和离体体内造血干细胞扩增试剂，包括单用扩增巨核细胞，与其它因子合用扩增各系的祖细胞。应用 MPO体外扩增小鼠造血干细胞的结果见表 9，而应用 MPO体外扩增人 CD34+细胞和糖蛋白为 l b/ H a阳性细胞的结果见表 10。

表 9

注：小鼠骨髓细胞 (10⁶细胞 /ml)预先与上述因子孵肓 48小时,然后按 Han方法 (J. Lab & Clin Med, 1994； 123:610— 616)在含 2%再障猪血清的血浆凝块体系中培养 10天，检测各种集落的数量。

表 10

注：人脐带血单个细胞分离后在含或不含 MPO的液体培养基中培养 7 天，经洗涤后，细胞分别与荧光标记的抗 CD34抗体，抗 CD34a抗体和 SCF孵育 40分钟，洗涤后用 FACS (荧光激活细胞分离仪）分析结果。

上述具体实施例的描述揭示了本发明的一般性质，从而使其他技术人员通过应用目前的知识，为了各种应用能容易地修饰和 /或改动这些具体实施例而没有背离本发明的一般构思，因而这些改动和修饰应是属于这些公开例子的等价事例的范围和内涵之中。应理解，此处所采用的措辞或术语是为了便于描述，而不起限制作用。

PC

3861

TKVKK MQKLENDESSDE KTPHQPE ALQDSKESDE 序列 1 :人 MPO的氨基酸序列

ATTKP WVLPSSYFFEIE AAAAMKPEC KIISKSPSE TTTTTGPRAKKPSPCEEP D TTHTAAGSDECESES L.

TAVmvGGGSPCRSP PPPx

TTTKHKKKPPRLLP IE TTVKSCNKPLCDD YDIE TKVHGRNKLPPPNELDF U TTTAKRKGCNPPPKS LE VLPAKHKPPPL LYSPEF

LS

1

TTRPTVKPsRCSPPPPI b

TTVP VAKAPSPSNKDE TTALKKCAKKKSP FEE TTTTKQ VKKRYPEELE

2

TTTTAXQSSXHCPEIPP O TTAAΛ QKXCKPEP-CPSL

TTTC VGKKPKKPCPEDP

τ τ τ τ V T G κ ρ R S p s Y？ p

TTTTQKGTOPCDS SNIPN-

2 AVAAKQHPPKPCYNFESP 5

序列 2:人 MP〇 cDNA的核苷鲛序列

1 TTTCAGGTAC CGTAGGTACC CTTGCCGTAA AGGATGGCAT

41 GGAAAACACT TCCCAT TAC CTGTTGTTGC TGCTG1CTGT

81 TTTCGTGATT CAGCAAGTTT CATCTCAAGA TTTATCAAGC

121 TGTGCAGGGA GATGTGGGGA AGGGTATTCT AGAC-ATGCCA

161 CCTGCAACTG TGATTATAAC TGTCAACACT ACATGGAGTG

201 CTGCCCTGAT TTCAAGAGAG TCTGCACTGC GGAGCTTTCC

241 TGTAAAGGCC GCTGCTTTGA GTCCTTCGAG AGAGGGAGGG

281 AGTGTGACTG CGACGCCCAA TGTAAGAAGT ATGACAAGTG

321 CTGTCCCGAT TATGAGAGTT TCTGTGCAGA AGTGCATAAT

361 CCCACATCAC CACCATCTTC AAAGAAAGCA CCTCCACCTT

401 CAGGAGCATC TCAAACCATC AAATCAACAA CCAAACGTTC

441 ACCCAAACCA CCAAACAAGA AGAAGACTAA GAAAGTTATA

481 GAATCAGAGG AAATAACAGA AGTAAAAGAT AACAAGA GA

521 ACAGAACTAA AAAGAAACCT ACCCCCAAAC CACCAGTTGT

561 AGATGAAGCT GGAAGTGGAT TGGACAATC-G TGACTTCAAG

601 GTCACAACTC CTGACACGTC TACCACCCAA

641 TCAGCACATC TCCCA7\GATC ACAACAGCAA ΛΛ(Γ(:ΛΛΤΛΛΛ

681 TCCCAGACCC AGTCTTCCAC CTAATTCTGA TACATCTA A

721 GAGACGTCTT TGACAGTGAA TAAAGAGACA ACAGTTGAAA

761 CTAAAGAAAC TACTACAACA

801 TGGAAAAGAG AAGACTACTT CCGCTAAAGA GACACAAAGT

841 ATAGAGAAAA CATCTGCTAA AGATTTAGCA CCCACATCTA

381 AAGTGCTGGC TAAACCTACA CCCAAAGCTG

921 CAAAGGCCCT GCTCTCACCA CTCCCAAGGA GCCCACGCCC

961 ACCACTCCCA AGGAGCCTGC ATCTACCACA CCCAAAGAGC

1001 CCACACCTAC CACCATCAAG TCTGCACCCA CCACCCCCAA

1041 GGAGCCTGCA CCCACCACCA CCAAGTCTGC ACCCACCACT

1081 CCCAAGGAGC CTGCACCCAC CACCACCAAG GAGCCTGCAC

1121 CCACCACTCC CAAGGAGCCT GCACCCACCA CCACCAAGGA

1161 GCCTGCACCC ACCACCACCA AGTCTCACCC ACCACTCCCA

1201 AGGAGCTGCA ？ TGCACCCAA CCAACTCCCA

12¾1 AGGAGCCTCA CCCACCACTC CCAAGGAGCC TGCACCCACC

1281 AACCAAGGAG CCTGCACCCA CCACTCCCAA AGAGCCTGCA

1321 CCCACTGCCC CCAAGAAGCC TGCCCCTCTA CCCCCTCTAG

1361 AGCC?????? 7ΛΛΛΛΛΛΑΛΛ ΛΛΛΛΛ

Claims

1. 一种人促巨核细胞生成素 MPO，其特征在于，为含有图 2所列氨基酸序列的蛋白质或其活性片断。

2. —种 MPO的纯化方法，其特征在于，包括以与麦胚凝集素偶联的载体和与肝素偶联的载体为层析载体的亲和层析分离。

3. 根据权利 2所述的 MPO的纯化方法，其特征在于，与麦胚素凝集素和肝素偶联的载体为琼脂糖。

4. 编码 MPO的 DNA分子，其特征在于，含

(A) 图 3所示核苷酸序¾_的全部；或

(B) 图 3所示核苷酸序列的一部分；或

(C) 能与（A)或（B)杂交的核苷酸序列。

5. 一种 MPO的 cDNA克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据 MPO的氨基酸序列，用已知的遗传密码推测出与这些氨基酸相应的核苷酸；

2)设计变性引物进行 PCR扩增；

3)用特异性 cDNA扩增产物作为探针从人 cDNA文库中筛选出 MPO的 cDNA。

6. 根据 4又利要求 5所述的方法，其特征在于，所述人 cDNA文库为人胚肝 cDNA文库。

7. —种用子表达 MPO的质粒，其特征在于，含权利要求 4所述的 DNA分子。

8. 根据权利要求 7所述的质粒，其特征在于，所述质粒选自 pGEM,pVL1392和 pSV2。

9. 一种在宿主细胞中表达 MPO的方法，其特征在于，使用权利要求 7或 8所述的质粒。

10. 根据权利要求 9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是真核细胞。

11. 根据杈利要求 10所述的方法，其特征在于，所述真核细胞是哺 95/23861 乳类动物细胞。

12. 根据权利要求 11所述的方法，其特征在于，所述哺乳类动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

13. 根据权利要求 10所述的方法，其特征在于，所述真核细胞是毘虫细胞。

14. 根据权利要求 13所述的方法，其特征在于，所述昆虫细胞是 Sf9细胞。

15. 重组 MPO，其特征在于，由权利要求 9一 14中任一项所述的方法产生。

16. 一种药用组合物，其特征在于，包含 MPO和 /或其突变蛋白。

17. 根据权利要求 16所 ϋ的药用组合物，其特征在于，还包括细胞因子和血细胞生长因子。

18. 根据权利要求 17所述的药用组合物，其特征在于，所述细胞因子和血细胞生长因子选自干细胞因子、白介素 3、6和 11、促红细胞生成素、粒单以及粒细胞集落形成刺激因子和血小板第 4 因子。

19. 根据杈利要求 16— 18中任一项所述的药用组合物，其特征在于，还包括多糖物质。

20. 根据权利要求 19所述的药用组合物，其特征在于，多糖物质为肝素。

21. 一种用于研究造血细胞生长调节或 ΜΡΟ受体的试剂，其特征在于，含有 ΜΡΟ和 /或其突变蛋白。

22. 一种用于制备抗 ΜΡ〇的单克隆或多克隆抗体的抗原，其特征在于，所述抗原是 ΜΡΟ或其突变蛋白。

23. —种抗体，其特征在于，是用权利要求 22所述的抗原制备的。

24. 一种用于扩增巨核细胞和血小板的试剂，其特征在于，含 ΜΡΟ 和 /或 ΜΡΟ突变蛋白。

25. 一种用于扩增造血干细胞、巨核细胞和血小板，治疗血小板减少症和 /或全血细胞减少症的药物，其特征在于，所述药物选自 ΜΡΟ、 MPO突变蛋白和根据权利要求 16— 20中任一项所述的药用组合物。