CN1146432C - 细胞生长调节因子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种由肌细胞和白血细胞分泌或释放的新的物质。这种新的物质具有抑制肿瘤细胞增殖和抑制被激活淋巴细胞增殖的活性。该物质不抑制正常细胞的增殖。据本发明，这种物质可用于治疗或预防癌症，并且，该物质在体液中的，或者在通过个体细胞在其中生长而条件化的液体中的含量，可用于诊断癌症，或用于测定个体发生癌症的危险程度。

Description

细胞生长调节因子
发明领域
本发明总体来说，属于人类医学和兽医学领域，并涉及影响细胞生长和增殖的一些新物质。本发明还涉及这些物质在预防或治疗疾病方面的应用。本发明进一步涉及一种诊断疾病的方法，或者对易患某种疾病或具有患某种疾病的诱因的个体进行普查的方法。
术语汇编
为了使本文叙述简练，将使用几个新造的术语。其中的某些术语和在本文范围内它们应当被理解的方式如下面所述：
“细胞生长调节因子(GR)”-影响细胞生长或增殖的物质。GR对生长或增殖的作用可能是促进细胞的生长或增殖，或者是抑制细胞的生长或增殖。
“内源性GR(EGR)”-由体内细胞分泌或释放出的物质，它能影响体内同种细胞或者其它细胞的生长或增殖。
“抑制细胞GR/EGR”-具有停止或明显减慢细胞生长或增殖作用的GR/EGR，基本上对细胞没有任何破坏作用。抑制细胞EGR典型地通过在细胞周期的一个阶段阻止细胞周期而起作用。
“低分子量-EGR(LMW-EGR)”-分子量小于大约3000道尔顿的EGR。
“肌肉因子(MF)”-由肌细胞分泌或释放的LMW-EGR。
“白血细胞因子(WBF)”-由白血细胞分泌或释放的LMW-EGR。
“源细胞”-分泌或释放EGR的细胞。
“靶细胞”-受EGR作用的细胞。
“条件培养基(CM)”-由于源细胞在其中生长而条件化的培养基。CM因此含有源细胞分泌的EGR。
“肌细胞CM”和“白血细胞CM”-分别由于肌细胞和白血细胞在其中生长而条件化的培养基。肌细胞CM和白血细胞CM分别含有MF和WBF。
上述术语还应该参照下文来解释和理解。
发明背景
大量研究工作涉及到被称为“细胞因子”(cytokines)的EGR的发现、表征、生物检测和临床开发工作。至今发现的所有细胞因子都是蛋白质类物质，具有几千道尔顿至几万道尔顿的分子量范围。细胞因子虽然各具有不同的来源和靶细胞，并具有不同活性模式，但都具有蛋白质类物质的共同特性。
已有报道表明，在实验动物中，运动可显著地抑制肿瘤的生长和发展(S.A.Hoffman等，1962，癌症研究，22：597-599；V.E.Baracos，1989，生理病理化学杂志，67：864-870)。A.Szent-Gyorgyi等(1963，科学，140：1391-1392)曾报导，在包括胸腺、主动脉、肌肉和腱等几种组织的提取物中，含有二种物质，一种促进小鼠腹水瘤的生长(被他们称为“促细胞素”)，另一种抑制其生长(被他们称为“抑细胞素”)。抑细胞素被描述为小分子量物质，相对不稳定，在室温下大约一周内就分解了。而且，根据其分离的方式，这种物质看来是亲脂性的。T.Namba等(1968，英国实验病理学杂志，49：294-301)也描述了肌细胞提取物对腹水瘤细胞的抑制作用，并发现肌肉提取物的抑制活性是可以通过硅膜透析的。加热提取物会影响这种抑制活性，尽管对透析液加热后没有发现任何作用。
E.Watta等(美国专利4,708,948)公开了一种抑制肿瘤生长的大分子量多肽，也是可以从肌肉组织得到的。M.Djaldetti等(美国专利5,242,692)公开了一种来自肌细胞的，能抑制肿瘤细胞增殖的因子。这种因子是从肌细胞培养物的上清液中被分离出的，它具有通过凝胶电泳测定的在25,000-30,000道尔顿范围内的表观分子量。
发明概述
本发明基于一些由肌细胞或者白血细胞分泌、释放或产生的新物质的发现，这些物质具有抑制肿瘤细胞增殖的生物活性，而基本上不影响正常的，非肿瘤细胞的增殖。此外，还发现，这些物质对抑制被激活的免疫细胞的增殖是有效的。
据此，一方面，本发明提供了一种基本上被纯化的细胞生长调节因子它是：
(a)LMW-EGR，一种具有下列特征的物质：
i.它是由肌细胞，特别是肌细胞或白血细胞产生、分泌或释放的，
ii其分子量小于大约3000道尔顿，
iii.不是蛋白质，
iv.可溶于水，
v.对热稳定，
vi.有抑制细胞增殖的生物活性，特别是抑制肿瘤细胞的增殖或抑制被激活的淋巴细胞的增殖；或者
(b)一种(a)类物质的衍生物，也具有抑制细胞增殖的生物活性。
另一方面，本发明提供了这种物质在预防和治疗疾病方面的应用。据此，提供了用于预防疾病或功能紊乱的方法，包括对需要治疗的对象施用有效量的该GR。赋予GR抑制增殖的活性方式之后，典型地在一段时间内对患者定期施用GR。进而，根据本发明的这一方面，本发明提供了一种含有一定量该GR的组合物。该组合物可以是一种含有治疗有效量的GR和药用载体或稀释剂的药物组合物。这种药物组合物可以用于预防疾病或失调，或者用于治疗疾病或失调。该组合物还可以是非处方组合物，例如作为neutraceutical组合物，食品添加剂，保健食品制剂等等。最后，本发明的这一方面还提供了所述GR在制备这些组合物中的应用。
特别优选的是用所述GR治疗或预防癌症，或者在治疗或预防由于免疫系统活动过度而引起的各种病症的范围内，抑制(消除或降低)被激活淋巴细胞的活性，例如用于克服器官排斥作用，治疗自身免疫疾病等等。
本发明还进一步提供了用于诊断癌症，或检查个体癌症状况的方法，或者用于对易发生癌症或具有癌症诱因的个体进行普查的方法，这种方法包从所述个体的体液中，或从所述个体的细胞培养物的上清液中，测定所说的LMW-EGR的含量。
本发明的另一方面是以适当的条件培养基中的活性级分的纯化为基础，制备本发明的GR的方法。
发明描述
新的低分子量EGR的发现是本发明的基础。术语“低分子量”应当被理解为，当通过超滤法测定时，分子量小于大约3000道尔顿，特别是小于大约2000道尔顿，而优选的是小于大约500道尔顿的。技术人员知道，这些分子量都是大致的，不能看作是精确的数值。
已发现本发明的LMW-EGR是非蛋白质类物质，即它们既不是蛋白质，也不是肽，也不是具有在其生物活性中起作用的蛋白质或肽基元的其它物质。(本发明的研究结果不能排除如下可能性：这种LMW-EGR可以以同蛋白质或肽结合或络合的形式存在，但在LMW-EGR作为生长调节剂的活性中，其中的蛋白质或肽基元不起任何作用，或仅有有限的作用)。
根据本发明，至令为止，LMW-EGR是从肌细胞的CM和从白血细胞的CM中得到的。但是据信，根据本发明，LMW-EGR也可以从其它来源得到。因此本发明不局限于MF和WBF。相反地，以本发明的研究结果作为基础，并通过应用标准的技术和已有的有关这种物质的知识，技术人员将不难发现其它的LMW-EGR，这些也应属于本发明的范围。
已发现MF和WBF是肿瘤特异性的抑制细胞的EGR。它们在特异性地抑制肿瘤细胞生长和增殖中，具有同等的生物活性，而对正常细胞、非肿瘤细胞都没有任何显著的作用。此外，还发现MF和WBF都是肿瘤非特异性的(即能有效地抑制各种肿瘤细胞的生长和增殖)，以及种非特异性的(对来自各种动物物种的肿瘤细胞，都显示有抑制生长和增殖的活性)。
换句话说，MF和WBF在抑制癌细胞生长和增殖中，具有广谱性。并且，本发明的研究结果还意味着，从一种动物，特别是从哺乳动物得到的MF或WBF，可以用于另一种动物，特别是哺乳动物的癌症治疗。
应该指出的是，虽然发现MF和WBF是细胞抑制因子，但发现它们对细胞也可能有某种破坏性作用，特别是在长时间暴露之后。例如，在长时间暴露于MF或WBF，以及它们的衍生物之后，靶肿瘤细胞最后可能由于例如细胞凋亡而死亡。
除了抑制肿瘤细胞生长和增殖的活性之外，还发现MF和WBF对抑制淋巴细胞的增殖有活性，证据是它们能够抑制淋巴细胞对分裂素的反应，并能抑制混合淋巴细胞反应(MLR)，表明本发明的GR可能具有免疫抑制活性。
虽然，一旦从一种动物分离出LMW-EGR，就可能从另一种动物找到同源的LMW-EGR。例如，到目前为止，本发明得到的MF都是来自大鼠和人的器官。毫无疑问，从其它动物，特别是哺乳动物，也可能得到同源的MF。与此相类似，至今本发明得到的WBF来自人的器官。毫无疑问，从其它动物，特别是哺乳动物，也可能得到同源的WBF。本发明也应包括这些类似物。
本发明的GR在影响细胞的生长和增殖时，可能是单分子状态，也可能是以累加或协同方式共同作用的一组分子，或者是具有这种活性的分子复合物。
一旦被分离出，就可能通过如化学修饰法制备LMW-EGR的衍生物，这种衍生物将具有类似于LMW-EGR的生物活性，对于具有与LMW-EGR类似生物活性的衍生物或者这种LMW-EGR的相似物，可能过运用与鉴定LMW-EGR相同的生物测定法来鉴定。例如，对于具有抑制肿瘤细胞生长和增殖活性的MF和WBF，通过测定合成的衍生物或来自其它动物的经分级分离的CM，就可以发现有活性的衍生物和类似物，视情况而定，可以测定它们对在体外培养的肿瘤细胞生长或增殖的抑制活性，或者测定抑制MLR的能力。技术人员无疑能在各种情况下选择适当的生物测定法。
该衍生物可以是具有与这种LMW-EGR有类似分子结构的分子，但其中的一个或多个化学基团已经被另一种基团取代；也可以是该LMW-EGR的还原或氧化产物，等等。
通过对需要的患者给予治疗有效量的GR，本发明的GR可用于各种治疗目的。可能被用于该GR的一个优选的治疗指标是对癌症的治疗和预防。在用于治疗时，可用GR对有癌症病史的患者给药，如为了抑制癌症复发。这种治疗将是在以清除或消灭癌症为目的的初始治疗，如化疗、放疗或手术切除之后，继续进行的一种典型的跟踪治疗措施。为了预防，可对未患癌症的人，或尚未诊断有癌症的人，特别是对那些易患癌症，或具有癌症诱因的高危险个体，给予这种GR。高危险个体可能是那些具有患癌症遗传倾向的人，例如被诊断出具有各种已知与癌症有关的基因中的一个基因的人，具有家族性癌症史的人，以及那些由于暴露于各种环境因素，如辐射，暴露于致癌剂等，而处于高危险致癌状态的人，等等。
如果给予的GR具有抑制靶细胞增殖的生物活性，而不是立即破坏靶细胞，那么这种GR可典型地长时间定期给药。但是，如前面已经指出，有可能由于长时间生长受抑制，肿瘤细胞将最终死亡，因此，在一段时间之后将可以停止治疗。
该GR的另一个优选的治疗指标是抑制免疫系统成分的活性。实例是治疗自身免疫性疾病；在移植治疗中的运用，即在移植之后，用于避免器官或组织排斥作用，等等。
用各种动物模型对本发明的GR进行了测定，包括通过皮下、肌肉或腹膜内接种肿瘤细胞而引起肿瘤的原发性肿瘤动物模型，以及通过静脉内接种肿瘤细胞而引起肿瘤的转移性肿瘤动物模型。发现对于这二种动物模型，GR都能有效地抑制肿瘤发展。并发现不论通过非胃肠道给药还是口服给药，GR都能有效地抑制肿瘤发展。众所周知，口服给药比非胃肠道给药具有更高的生理耐受性，因此，用于治疗或预防癌症，特别是涉及需要长时间定期给予GR的治疗或预防方案时，口服给药途径是优选的。
可以将GR配制成药物组合物，其包含有效量的GR和能与该GR配伍，生理上可接受的载体。因为该GR可溶于水，因此生理上可接受的载体，对于非胃肠道给药可以是生理盐水，对于口服给药可以是适于食用的水溶液。此外，对于口服给药，GR可配制成各种剂型，如胶囊、片剂等。并且，GR还可以被冷冻干燥，在临用前与载体或稀释剂混合。
在此使用的术语“有效量”，应该被理解为足以达到预期作用的量。例如，在用于治疗癌症的情况下，有效量是在第一治疗方案中，足以抑制肿瘤细胞生长和增殖的GR量，可以通过例如发病率降低，或癌症转移数量减少，或者与癌症相关的死亡率降低来证明。在用于预防癌症的情况下，有效量是在第一预防给药方式中，足以抑制原发性癌性生长发生的GR量。
除了可将GR配制成药物组合物外，本发明的GR还可以配制成其它类型的组合物，例如食品添加组合物，neutraceutical组合物，非处方“保健品”等等。
根据本发明进行的实验，癌症病人的白血细胞，与正常、健康人的白血细胞相比较，LMW-EGR分泌量低很多。因此，通过测定人体液中(如血清、尿等)，或细胞培养物上清液中(如人的肌细胞或白血细胞)LMW-EGR的含量，就可以诊断人的癌症，并可得到人体癌症状况的指标。此外，测定体液或上述上清液中LMW-EGR的含量，还可以作为对易患癌症或具有患癌症诱因的人进行普查的基础。对LMW-EGR含量的测定，可通过生物学测定法进行，包括测定体液或上清液，或者其适当的分离级分，抑制肿瘤细胞增殖的活性。除了这种生物学测定法之外，技术人员通常都知道，对LMW-EGR的存在还可以通过各种分析法来测定，包括基于运用LMW-EGR特异性抗体的各种免疫学测定法，基于运用适当的化学试剂，如生色试剂的测定方法，还包括光谱测定法或基于辐射吸收的如光吸收测定法，以及各种层析技术等。
另一方面，本发明提供了一种用于纯化生物来源的本发明GR的方法。这方面的方法包括：
(a)使细胞在一定条件下生长，该条件使得细胞能产生、并向其周围的培养基中分泌或释放细胞生长调节因子；
(b)收集该细胞培养物的上清液；
(c)将含有分子量大于约3000道尔顿的物质的上清液级分，与含有分子量小于约3000道尔顿的物质的上清液级分分开，选取后者。
对在步骤(c)中被选取的级分，可通过各种纯化技术作进一步纯化，特别是层析技术，如高压液相色谱技术(HPLC)。
在下面，将通过根据本发明进行的一些实验，以及必要的参考附图，对本发明进行阐述。在这些实验中，证明MF和WBF在体外和体内试验中都具有活性。还描述了对MF的纯化和鉴定方法。技术人员无疑将会理解到，这种阐述不应该被看作是对本发明范围的限定，而应该看作是对在所附的权利要求中限定的本发明全部范围的示例。技术人员根据以上和下面的叙述，无疑将能够在其全部要求保护的范围内，实现本发明。
附图简述
在附图中：
图1-9显示包含在肌细胞CM或白血细胞CM滤液中的MF或WBF的作用，滤膜的截止分子量为3000道尔顿(这种滤出液在此被分别称为“3000道尔顿MF超滤液”和“3000道尔顿WBF超滤液”)。图中，细胞在96孔板中培养，与3000道尔顿MF滤液共同温育，滤液作了几次稀释(“1”-未稀释，“2”-2倍稀释，依此类推)。在所有实验中，都以非条件培养基作为对照。图1-4、6、8和9，以及图7的部分，是通过3H-胸苷的掺入来测定对细胞的穿透作用，纵坐标显示放射活性计数。图5和图7的一部分，是通过细胞计数来测定对细胞增殖的作用，纵坐标显示细胞数量。
图1显示从新生大鼠横纹肌细胞初始培养物得到的2000道尔顿MF超滤液，对两个肿瘤细胞系增殖的影响：鼠黑素瘤细胞系B16(图1A)，人腺癌细胞系HTB-38(图1B)。在此图中，3000道尔顿MF超滤液的活性与原始条件培养基(“原始CM”)的活性进行了比较。
图2显示从新生大鼠横纹肌细胞初始培养物得到的3000道尔顿MF超滤液，对两种正常的非肿瘤细胞的作用：大鼠成纤维细胞(图2A)，鼠骨髓细胞(图2B)。
图3显示从大鼠横纹肌细胞L-8系得到的3000道尔顿MF超滤液，对两个肿瘤细胞系增殖的影响：B16(图3A)，甲基胆蒽诱发的鼠肺肉瘤细胞系MCA-105(图3B)。
图4显示从L-8细胞得到的3000道尔顿MF超滤液，对两类正常细胞的作用：鼠骨髓细胞和大鼠成纤维细胞初始培养物。
图5显示从新生大鼠横纹肌细胞初始培养物得到的3000道尔顿MF超滤液，对大鼠淋巴瘤系Nb2-11C细胞增殖的影响，是通过细胞计数测定的。测定中先使细胞同步生长在G0/G1相，再加入3000道尔顿超滤液、初始CM或对照培养基，然后加入hGH刺激生长。
图6显示从L-8细胞得到的3000道尔顿MF超滤液，对几个肿瘤细胞系增殖的影响。每个结果是以相应实验中对照的百分数表示。
图7显示从人成肌细胞得到的3000道尔顿MF超滤液的作用。B-16和K562细胞的增殖是通过3H-胸苷掺入法来测定，NBT细胞的增殖是通过细胞计数来测定。
图8显示从人淋巴细胞得到的3000道尔顿WBF超滤液，对鼠和人肿瘤细胞增殖的影响。增殖以对照的百分数表示。
图9显示从L-8细胞得到的3000道尔顿MF超滤液，影响淋巴细胞对PHA的反应，以及混合淋巴细胞反应(MLR)。
图10是显示二只暴露腹膜的有代表性的小鼠的照片，其中通过腹膜内注射2×105MCA-105细胞诱发了一个肿瘤。在注入细胞之后，对右边的小鼠通过每天2次腹膜内注射0.5ml含MF的级分进行治疗，该级分是从洗脱制备型反相(RP)C18高压液相色谱(HPLC)柱而得到的(该级分在以下本文中被称为“MF-SP”(见7.6.2))，左边的小鼠注射对照的RPMI培养基。
图11是显示二只暴露腹膜的有代表性的小鼠的照片，其中通过腹膜内注射5×105B-16黑素瘤细胞诱发了一个肿瘤。右边是治疗小鼠的照片，对小鼠每天腹膜内注射一次从L-8细胞得到的3000道尔顿MF超滤液1ml，左边是对照小鼠的照片，对小鼠每天腹膜内注射一次对照PBS培养基。
图12是显示暴露腹膜的有代表性的小鼠的照片，小鼠腹膜内注射了2.5×105MCA-105细胞。图12A显示的是治疗组小鼠，用从L-8细胞得到的3000道尔顿MF  超滤液，每天口服(P.O.)给药1ml(从接种肿瘤细胞的当天开始给药)。图12B显示的是对照组小鼠，同样口服对照RPMI培养基。
图13是显示小鼠离体肺的照片，小鼠静脉内注射了5×106B-16黑素瘤细胞。上排是对照组的肺，对动物每天口服给予1ml对照的PBS溶液。下排是实验组的肺，对动物每天口服给予1ml从L-8细胞得到的3000道尔顿MF滤液。
图14显示来自癌症病人和健康人血中白血细胞上清液的3000道尔顿超滤液，对抑制三个肿瘤细胞系(B-16，SK和K-562)增殖的作用：
图14a显示给予3000道尔顿超滤液之后，与对照相比较，此三个细胞系的增殖；以及
图14b显示以抑制作用百分数表示的散布结果(抑制是增殖的倒数-100％增殖是0％抑制，依此类推，(大于100％增殖的结果也被记作“0％”))。
图15显示通过RP-HPLC柱再次层析含MF的溶液，得到的220nm洗脱分布图(再次层析是用与首次层析相同的柱子，以同样的方式进行的层析)。
图16-21显示从不同的HPLC柱洗脱的不同级分抑制Nb2细胞增殖的活性，通过细胞计数测定。这些图的横坐标显示试管号(关于流速和每管的体积见下文)，纵坐标显示与空白(未加任何溶液到Nb2细胞的生长培养基时生长的细胞，作为100％)相比较的相对细胞数目。
图16和17显示各洗脱液级分抑制NB2细胞增殖的活性，此洗脱液级分是来自制备型RP-HPLC(C-18)柱的二次不同的层析。装柱液是从L-8细胞(在PBS中)得到的3000道尔顿MF超滤液，或者是对照PBS液。在图16中，含MF的溶液-空心圆(○)，对照PBS液-实心圆(●)。图17中，含MF的溶液-实心三角()，对照PBS液-实心圆(●)。
图18显示从分析型RP-HPLC(C-18)柱洗脱的各个级分，对NB2细胞增殖的抑制活性。装入这种柱子的溶液由图16中的级分5和6的混合液组成。MF溶液-实心圆(●)，对照-空心圆(○)。
图19显示从Superdex柱洗脱的各级分抑制Nb2细胞增殖的活性。装柱液是来自图17洗脱液的混合液，由管9-10的250ml液，管10-11的520ml液和660ml级分11-12组成。
图20显示从分析型RP-HPLC柱洗脱的各级分抑制Nb2细胞增殖的活性。装柱液是图17中管6-12的混合液。MF溶液-实心方块(■)，对照为PBS液-空心圆(○)。
图21显示从体积排阻(SE)柱洗脱的各级分抑制Nb2细胞增殖的活性。装柱液是与图17中显示的，从制备型RP-HPLC柱洗脱的不同级分：级分“A”，管6-8-空心圆(○)；级分B，管8-10-实心圆(●)；级分C，管10-12-空心三角()；以及级分D，管12-14-实心三角()。
图22显示从Superdex柱洗脱的各级分抑制Nb2细胞增殖的活性。装柱液是由来自图21的洗脱液各级分组成，如下所示：
图22A显示如下装柱液的结果：级分C的管28-30-空心圆(○)；级分C的管22-23-实心圆(●)；级分B的管29-33-空心三角()，和
图22B显示如下装柱液的结果：级分C的管31-32-实心圆(●)，级分C的管23-26-空心圆(○)；级分B的管29-33-空心三角()。
图23显示从分析型RP-HPLC柱洗脱的级分，抑制Nb2细胞增殖的活性分布图。装柱液是由来自制备型RP-HPLC柱的活性级分(以18％-28％乙腈洗脱的)组成。
图24显示从体积排阻柱洗脱的级分，抑制Nb2细胞增殖的活性分布图。装柱液是来自图23中显示的等分试样级分13-17。
图25显示从亲水性相互作用(CHO)柱洗脱的各级分，抑制Nb2细胞增殖的活性分布图。装柱液是来自图24中显示的等分试样级分27-30的混合液。
图26显示从体积排阻柱得到的活性级分的核磁共振扫描图(在27-32分钟之间洗脱的级分)。
发明详述
下文中，在论述从肌细胞CM和白血细胞CM得到的活性级分的活性时，将常常涉及到“MF”或“WBF”。应该理解，这两种CM可能包含不只一种具有下述活性的因子。实际上，据本发明得到的HPLC分级分离的结果，其中某些如下面所示，就可能按这种方式来解释(虽然也可能有其它的解释)。因此，例如肌细胞CM中就可能包含不只一种具有肿瘤生长抑制作用的因子。这样，例如当有时引用“该MF”等时，不应该认为此肌细胞CM只含有单一的LMW-EGR，因为肌细胞CM实际上可能含有不只一种所有可被称为“MF”的物质。
1.条件培养基
1.1MF
MF是从三种类型肌细胞制备物的条件培养基中得到的：
1.1.1新生大鼠肌肉初级培养物
将取自出生24-48小时新生大鼠后腿的肌肉分离，切成小块。用0.25％trypsinversan液作胰酶消化处理后，将细胞预铺在组织培养皿中，除去成纤维细胞和单核细胞。对细胞计数后，接种于营养丰富的Dulbeco改良Eagle培养基(DMEM)中。5天后，培养物中包含有收缩状态的肌细胞。然后弃去培养基，加入RPMI或PBS培养基。将细胞在RPMI培养基中培养24小时，在PBS中培养8小时或24小时。然后收集上清液，离心，在进一步处理之前一直保存在-20℃的冰箱内。
1.1.2大鼠肌细胞系(L-8)
L-8系(从美国典型培养物保藏中心-ATCC得到，保藏号CRL1769)是新生大鼠骨髓肌成肌细胞系，它包含有能在不添加生长因子的条件下增殖的未分化成肌细胞。将L-8细胞接种在培养皿中，使之在含有4％葡萄糖的RPMI培养基中生长(这种培养基此后将被称为“RPMI”)。3天后分离出培养物，弃去上清液，并以RPMI或磷酸盐缓冲液(PBS)代替，接着再培养24小时，然后收集上清液，如果不立即作进一步处理，则在冰箱内保存于-20℃。
1.1.3人成肌细胞
将从人的活检组织得到的人成肌细胞，在旋转培养瓶中培养，直至达到细胞连生汇合(见美国专利5,130,441)。除去培养基，并以DMEM或PBS液代替，然后将细胞在此溶液中再培养24小时。收集上清液，并通过离心从中分离出细胞。
1.2WBF
WBF是从单核细胞的条件培养基中得到的。单核细胞可按如下方法从静脉血中分离出：用肝素处理过的注射器，从人供血者抽取静脉血20ml。以PBS将此肝素化的血作1∶1稀释，使之在15ml Ficoll-HypaqueTM(Pharmacia，Sweden)或者HistopaqueTM(Sigma，St.Louis，U.S.A.)上分层，并以400×g的速度离心30分钟。收集含单核细胞的介面层，并用PBS洗3次。
将单核细胞在PBS中制成2×106/ml的悬液，在含有5％CO2，95％空气的湿环境中，37℃温育48小时。然后将细胞悬液离心，收集上清液。
2.超滤
用具有500，2000，3000和10000道尔顿截止分子量的滤器(CentriconTM，Amicon，U.S.A.)，对从以上来源的CM进行超滤。
发现在通过具有10000，3000，2000道尔顿截止分子量的膜过滤的超滤液中，以及在通过具有500道尔顿截止分子量的膜过滤的超滤液中，存在MF，以下将要进一步说明。WBF可被超滤通过具有3000道尔顿截止分子量的膜，并发现超滤液中含有WBF。
通过具有500，2000等截止分子量滤器的肌细胞CM超滤液，在此将被称为“500道尔顿MF超滤液”，“2000道尔顿MF超滤液”，等等，通过具有3000道尔顿截止分子量滤器的淋巴细胞CM超滤液，在此将被称为“3000道尔顿WBF超滤液”。
3.MF的WBF在体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用。
3.1方法
3.1.1细胞系
在此体外测定中，测定了MF或WBF对几个肿瘤细胞系和几种非肿瘤细胞的作用。如下是被测定的细胞：
(a)肿瘤细胞系：
HT-29，是从人克隆(ATCC，保藏号HTB-38)产生的腺癌细胞；
MCA-105，是甲基胆蒽诱生的鼠肺肉瘤细胞系；
B16-F1，是鼠黑素瘤细胞系；
SK-28，是人黑素瘤细胞系；
K-562，是人白血病细胞系；
DA3细胞，是乳房癌细胞系；
MCF-7，是乳癌细胞系；
Nb2-11C，是激素依赖性大鼠淋巴瘤细胞系(即这些细胞的生长需要添加生长激素)(Gertler等，1985内分泌学，116：1636-1644)Nb2-SP，是催乳激素非依赖性大鼠淋巴细胞系；
(b)非肿瘤细胞：
鼠骨髓细胞，
初始大鼠成纤维细胞，
IM-9，是人淋巴细胞系。
3.1.2 3H-胸苷掺入测定
将待测细胞(测定3H-胸苷掺入的细胞)接种于96孔板，起始细胞浓度为1×104个细胞/孔。每个孔内已含有RPMI和待测溶液的混合物，它可以是条件培养基(在RPMI或PBS中的肌细胞CM或白血细胞CM)，分级分离的CM，对照RPMI或PBS(即非条件化的)，或者是分级分离的对照RPMI或PBS。将从每种待测溶液得到的结果，与其相应的对照进行比较(例如，在PBS中的分级分离待测溶液与分级分离加PBS相比较，等等)。在37℃温育42小时之后，向每个微孔内加入10μC3H胸苷，加入这种放射性标记物后再温育6小时。然后用液体闪烁计数器测定3H-胸苷的掺入量。
3.1.3细胞计数测定
使Nb2-11C大鼠淋巴瘤细胞系的细胞同步生长，并按迄今所述的方法进行培养(Gertler等，1985，内分泌学，116：1636-1644)，不同的是，细胞是培养在加有5％胎牛血清的RMPI中。使Nb2-11C细胞同步化在G0/G1时相，并按以前所述的方法，对其自身增殖进行监控(Gertler等，同上)。简言之，先将细胞转移至添加有马血清的培养基中，培养过夜。然后将细胞稀释成大约3×105个细胞/ml，并分配到24孔板的许多孔中，0.5ml/孔。再加入相当于0.5ml量的待测溶液，并通过加入hGH启动细胞自身增殖，hGH的最终浓度为2mg/ml。细胞在37℃，在含有5％CO2的空气中培养，培养72小时后，用Coulter计数器进行计数。每个实验重复进行2次。
按类似的方法对Nb2-SP和IM-9细胞系的细胞进行测定。
3.2结果
3.2.1 MF
图1和2显示从新生大鼠横纹肌细胞初级培养物得到的3000道尔顿MF超滤液的测定结果，图3和4显示从L-8细胞得到的3000道尔顿MF超滤液的测定结果。每个图中，横坐标的数字代表稀释度的倒数(“1”-未稀释，“2”-2倍稀释，等等)，纵坐标显示放射活性(每分钟计数-CPM)，对照(每个图左边的直框柱)是以非条件培养基，按与CM同样的方法测定的结果。
如图1和3所示，从大鼠横纹肌细胞(图1)或从L-8横纹肌细胞系(图3)得到的MF能抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞没有这种抑制作用(分别见图2和图4)。并且还可以看到，MF可过滤通过具有3000道尔顿截止分子量的膜，在超滤液中，保留有存在于初始CM中的抗增殖活性的事实证实了这点。从图1和3还可以进一步看到，MF的作用随稀释度增加而降低，进一步表明，这种作用是通过超滤液中的特异性因子所介导的。
图5显示从L-8细胞系得到的初始CM，以及其3000道尔顿MF超滤液的活性，二者都以不同的稀释度进行测定。可以看到，初始CM表现出其超滤液中保留的抗增殖活性。并且此作用随着稀释度增加而降低，再次表明这是一种特异性因子介导的活性。
图6也显示了从L-8细胞得到的3000道尔顿MF超滤液(未稀释)的作用(结果以对照的百分数表示，每次实验中对照被规定为100％)。可以看到，MF对抑制所有被测定的肿瘤细胞系的增殖都有活性。
图7显示从人成肌细胞得到的3000道尔顿超滤液，具有抑制3个细胞系增殖的活性(结果以对照的百分数表示)。B-16和K562细胞系的增殖是通过检测3H-胸苷掺入来测定的，Nb2细胞系的增殖是借助于细胞计数来测定的。可见，人类来源的MF，对所有被测定的肿瘤细胞系的增殖都有抑制活性。
在另一个实验中，将被发现具有抑制肿瘤细胞增殖活性的制备型RP-HPLC柱分离级分(图15中的级分5和6)混合在一起，在45℃下蒸发干燥，然后溶于5ml水中，转移到试管内，再次进行真空干燥，最后溶于2ml水中，并作灭菌处理。以此剂量对这些级分进行测定，测定它们对三个不同的细胞系抑制增殖的能力：Nb2-11C，nb2-SP和IM-9。
结果显示在如下表I中(通过细胞计数作增殖测定)：
                      表I
    细胞     数量(ml/mll)     抑制百分数
    Nb2-110C     0.050.0150.005     493322
    Nb2-SP     0.050.0150.005     462618
    IM-9     0.050.0150.005     117
可见，MF能抑制激素依赖性Nb2-11C肿瘤细胞系及激素非依赖性Nb2-SP肿瘤细胞系的增殖。与此相对比，MF对非肿瘤细胞，人淋巴细胞系IM-9，基本上没有作用。
图8显示3000道尔顿WBF超滤液对鼠和人细胞系增殖的影响。在此再次可见，WBF可以抑制所有被测定的鼠源和人源肿瘤细胞系的增殖。
4.MF和WBF对淋巴细胞PHA应答以及对MLR的体外抑制作用。
当把来自两个个体的淋巴细胞一起培养时，每个个体的HLA抗原将引起导致淋巴细胞增殖的细胞反应(这种增殖与两个个体HLA抗原的差异有直接的关系)。为了显示WBF或MF对这种反应的影响，将来自两个供体的1×106个细胞/ml的单核细胞(细胞制备法如上1.2下所述)温育在含10％FCS的PBS中，并对细胞加入不同稀释度的3000道尔顿MF或WBF超滤液。将此培养物在含5％CO2，95％空气的湿润环境中，37℃温育5天。在温育过程的最后6小时，对每个孔加入1μCi3H-胸苷。收获细胞后用LKB液体闪烁计数器(LKB，Piscataway，NJ，U.S.A.)测定细胞对3H-胸苷的掺入量。
PHA(植物血凝集素)是一种与淋巴细胞的细胞表面糖类结合的促细胞分裂剂，它能诱导淋巴细胞转化成胚泡细胞形式，并进行细胞增殖。为了显示MF或WBF对此PHA诱导反应的影响，将单核细胞以106个细胞/ml的浓度接种于96孔板，其每个孔已加有含10％胎牛血清(IsraelIndustries，Bet-ha-Emek，Israel)和1μg/ml PHA(Wellcome Laboratories，U.K.)的RPMI 0.2ml。在一些孔中，0.2ml RPMI是由一半天然RPMI和一半以RPMI配制的L-8细胞的3000道尔顿MF超滤液组成。此培养物在CO2恒温箱内温育4天，在温育期的最后对细胞加入1μCi3[H]-胸苷，再温育24小时，用Dyatech细胞收集器收获细胞，用LKB闪烁仪计数放射活性。
图9显示MF在抑制淋巴细胞对PHA反应中的作用，以及MF对MLR的影响(显示的是1∶1稀释的结果，以对照的百分数表示)。用WBF试验也得到性质类似的结果。并且MF和WBF的作用都与稀释度成比例(作用随稀释度增加而降低)(结果未显示出)。
5.体内研究
5.1通过腹膜内接种诱发肿瘤(MCA 105)，用MF腹膜内注射治疗
对30只C57BL6/J小鼠腹膜内注射(i.p.)2.5×105个MCA-105细胞。再通过每日2次腹膜内注射在下面(7.5.2.节)被称为“MF-SP”的RP-HPLC级分0.5ml，对小鼠进行治疗。在第33天将小鼠活杀，对其肿瘤病灶进行评估。
图10中描绘出了有代表性的结果，显示出两只开放腹膜的动物，其中图10A中显示的是用MF-SP级分治疗的动物，而图10B中显示的是用对照RPMI培养基治疗的动物。可以看出，在对照动物中可观察到一个非常大的肿瘤生长物(图10B中箭头所指)，而在MF治疗的动物，只能观察到非常小的，难以发觉的肿瘤病灶(图10A中箭头所指的一个)。
5.2通过腹膜内接种诱发肿瘤(B-16黑素瘤)，用腹膜内注射MF进行治疗。
对40只C57BL6/J小鼠腹膜内注射(i.p.)5×105个B-16黑素瘤细胞。其中20只小鼠用作对照，每日腹膜内注射1次PBS溶液。另20只小鼠每日注射1ml从L-8细胞得到的3000道尔顿MF超滤液进行治疗。第15天将小鼠活杀，对动物腹膜上肿瘤生长的情况进行检测。图11中显示了取自各实验组的两只代表性小鼠的开放腹膜，可以看到，在来自对照组的动物中，能发现大量肿瘤病灶，而在治疗组的动物中仅有少量非常小的肿瘤病灶。
5.3通过腹膜内接种诱发肿瘤(MCA-105)，以MF通过腹膜内和口
服给药进行治疗
对30只C57BL6/J小鼠腹膜内注射2.5×105个MCA-105细胞。其中10只小鼠通过每日口服(p.o.)给予1ml从L-8肌细胞得到的3000道尔顿MF超滤液进行治疗，10只小鼠通过每日腹膜内注射相同的溶液进行治疗，另10只小鼠作为对照组，每日以口服RPMI培养基来治疗。
第30天将小鼠活杀，暴露其腹膜，观测其中肿瘤生长的情况。图12显示了取自各组的两只代表性小鼠(图12A-MF治疗的小鼠，图12B-对照小鼠)。从图12A可见，在受MF治疗的动物的腹膜中，没有任何肿瘤生长的迹象，而在对照组动物的腹膜中，显示有大的肿瘤病灶。在此实验中，90％的对照组小鼠出现了肿瘤病灶，而对于以MF腹膜内注射，或口服给药治疗的小鼠，仅有40％出现了肿瘤病灶。
5.4通过肌内接种(DA3乳癌)诱发肿瘤以MF通过腹膜内和口服给药进行治疗
对30只BALB/C小鼠的腿肌内(i.m.)注射1×106个DA3细胞。其中10只小鼠用作对照，每日通过腹膜内注射PBS进行治疗；10只小鼠通过每日腹膜内注射1ml从L-8肌细胞得到的3000道尔顿MF超滤液(在PBS中制备的)进行治疗，而另10只小鼠以同样量的MF溶液，通过口服给药(1ml)进行治疗。小鼠腿中形成了大肿瘤，三周后将小鼠活杀，可发现肺部转移病灶，对肺中的转移病灶进行计数。对照组转移病灶计数为23.4±6，与之相比，腹膜内注射治疗组为6.2±1.3，口服治疗组为2.2±0.6。
5.5通过静脉内接种(B-16黑素瘤)诱发肿瘤，用MF通过口服给药进行治疗
对30只C57BL/6J小鼠静脉内注射5×105个B-16黑素瘤细胞。其中20小鼠从肿瘤接种的当日开始，以1ml从L-8细胞得到的3000道尔顿MF超滤液，通过每日口服给药进行治疗，另10只小鼠作为对照，仅以PBS口服给药。第18天活杀小鼠，在小鼠肺中可看到形成的黑色肿瘤病灶。在图13中可看到两组动物有代表性的肺(上排-对照，下排-MF治疗)。可见，尽管在对+照组的肺中存在很多黑色转移病灶，但在实验治疗组仅能看到少量小病灶。
6.健康个体和癌症病人白血细胞分泌WBF的程度
从23名健康个体的静脉血(样品是从血库获得的)和33名住院癌症病人的静脉血分裂出单核细胞。方法如在1.2中所述。从2×106/ml单核细胞的培养物中收集上清液，然后通过具有3000道尔顿截止分子量的滤器进行超过滤，并收集上清液，如在2中所述。
测定此超滤液对来自3个癌细胞系的癌细胞抑制其生长的能力：B-16鼠黑素瘤细胞，SK人黑素瘤细胞和K-562人白血病细胞系。
结果显示在图14中。如在图14A中所见，虽然来自健康人单核细胞的超滤液显示了对增殖明显的抑制作用，使被测定细胞系的增殖小于50％，但来自癌症病人的超滤液对增殖仅有非常小的，很不显著的抑制作用。如在图14B中可以进一步看到，这二个组之间绝对没有任何重叠部分。
这些结果表明，与健康人淋巴细胞分泌WBF的水平相比较，癌症病人单核细胞分泌水平是相当低的。因此，这些结果表明了测定本发明LMW-EGR含量的诊断价值。此外，高水平WBF也具有重要的治疗作用。
7.MF的表征
7.1生物测定
按以下将要详述的方法，将肌细胞CM分级分离，并用上述的细胞系对各个级分进行测定。通过上述的3H-胸苷摄入或细胞计数法，测定每个级分对细胞生长的影响。
7.2对MF的假定的蛋白质性质的检测
为了确定MF是否是蛋白类物质，对肌细胞CM(从大鼠肌细胞初级培养物得到的)作了一系列处理试验，包括对蛋白水解酶的敏感性，冷冻干燥过程中的稳定性，以及在不同温度下温育的影响。在这些处理之后，通过用原来的培养基稀释，将CM恢复到原来的盐和蛋白质浓度，或者如果被稀释，在评价结果时应该考虑到蛋白质浓度的稀释倍数。所用的测定方法是3H-胸苷摄入测定法。
7.2.1蛋白水解酶的作用
用两个蛋白水解酶制剂，胰蛋白酶和链霉蛋白酶(pronase)进行测定。为了测定胰蛋白酶的作用，采用了两种方法：
(i)在37℃将含MF的溶液与胰蛋白酶(0.5-2μg/ml)共同温育4小时，然后通过加入大约2倍摩尔过量的大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)，终止胰蛋白酶的活性。用非条件化(无-MF)培养基作为对照；
(ii)在37℃将含有MF的溶液与胰蛋白酶(0.5-2μg/ml)共同温育1-4小时，或者在室温下温育过夜，温育之后，在对氨基苯甲脒琼脂糖柱上除去胰蛋白酶。以无MF的培养基作为对照。另一些仅用胰蛋白酶的对照测定显示，在以这种柱-碳酸氢盐缓冲液为层析条件时，没有任何胰蛋白酶活性从该柱被洗脱出。
为了测定链霉蛋白酶的作用，通过使之与固相化在琼脂糖Sepharose凝胶上的链霉蛋白酶相接触来处理肌细胞CM。在此也是用无MF的培养基作对照。结果显示在如下表II中(数字表示与非条件化对照培养基相比较的抑制百分比)
                           表II
实验    胰蛋白酶+STI(a)  胰蛋白酶+柱层析(b) 链霉蛋白酶+Sepherose
细胞类型   未处理   处理     未处理     处理     未处理     处理
HTB 38   35   30     40     40     53     75
MCA   -(c)   -     25     27     62     70
(a)上述胰蛋白酶方法(I)
(b)上述胰蛋白酶方法(ii)
(c)“-”＝未测定
以上结果证明，用胰蛋白酶通过两种方法处理，以及用链霉蛋白酶处理，对MF的肿瘤生长抑制活性，都没有任何显著的影响。
7.2.2冷冻干燥
将预先未作透析处理的肌细胞CM进行冷冻干燥，然后将冷冻干燥物再溶解于水中，恢复到原来的体积。在这种处理之后，MF抑制肿瘤生长的活性没有任何显著的损失，这表明MF对冷冻干燥处理是稳定的。
7.2.3加热处理
将肌细胞CM(预先从大鼠肌细胞培养物中得到的)，在4-100℃的温度范围内处理不同的时间。处理之后，用MCA细胞和HTB细胞对样品进行测定。结果显示在如下表III中(数字表示在温度处理之后MF抑制能力的改变(以％表示))。
                        表III
“-”＝在这种条件下未测定
在另一些实验测定中，对条件培养基的3000道尔顿超滤液作加热煮沸处理，没有引起这种低分子量级分对肿瘤细胞增殖的抑制活性有任何损失。
上述结果表明，在所有被测定的温度下，包括在100℃煮沸，其抑制肿瘤细胞增殖的能力都没有降低。
7.2.4 小结
在所测定的条件下，未见MF对抑制肿瘤细胞生长的能力有任何降低，这显然表明MF不是蛋白质。相反，结果显示，在某些处理之后抑制活性增加了，对于这一点可根据如下事实来解释：含有MF的培养基中包含有行使与MF相作用的蛋白质成分，而这蛋白质成分在处理中被破坏了。
7.3.MF的大小
在具有10，2和0.5KD截止分子量的Amicon膜上，通过超过滤对含有MF的CM进行了分级分离(对每次膜过滤的残留物，用至少1倍量另加的PBS处理后作再次过滤)。在用10KD和2KD膜的情况下，在开始的两个滤液中，基本上得到了全部抑制活性(90％以上)，用0.5KD膜时，在这种滤液中得到了大约80％的活性，某些活性(20％)存留在第二个残留物中。每种情况均用HTB 38和MCA细胞进行抑制活性测定。
通过具有12KD和3KD截止分子量的膜，对含有MF的CM进行透析显示，活性组分可通过这两种膜透析出。
上述结果表明，MF的分子量大约为500道尔顿或者更小些。
7.4用RP-HPLC鉴定MF(从大鼠肌细胞初级培养物中得到的)
将10KD膜的过滤液，在C-18反相(RP)柱(4×250mm)上进行层析。在上柱加样之前，通过在0.1％三氟乙酸(TFA)液中稀释，使滤液恢复到原来的浓度，加样后以5-35％乙腈梯度液进行层析展开(预先已通过测定确认，这二种成分均对MF的抑制活性没有影响)。以HTB-38细胞测定表明，活性成分在0.1％TFA中的15％乙腈中被洗脱出。然后将此活性级分以乙腈梯度液，在同样的柱上进行再次层析，则部分被纯化的MF在如上相同的位置被洗脱出(保留时间约21分钟)。在如头两次层析相同的条件下，对此最后的级分进行了第三次RP层析展开。发现一个单独的抑制峰，它与洗脱分布图中220nm吸收峰位置相符，可见图15。
7.5MF的大量纯化(从大鼠肌细胞初级培养物中得到的MF)
7.5.1.实验方案
将大鼠肌细胞CM在Amicon 10KD膜上进行超滤。再在与制备性HPLC柱相连接的C-18反相(RP)柱(47×300mm)上，对此10KD滤液进行层析。用HTB-38细胞对各级分作细胞增殖测定，并将具有活性的级分在另一C18RP柱(分析型：4×250mm)上作再次层析，用同上述的方法对活性级分进行鉴定。
7.5.2.纯化的MF级分的活性
在7.5.1.节最后步骤中得到的物质被称为“MF-P”，而在第一RP柱之后得到的物质被称为“MF-SP”(这个级分也是在5.1节中测定的)。初始条件培养基(CM)的活性，MF-P和MF-SP级分的活性，以及超滤残留物(R)的活性，均被显示在如下表IV中(活性是以u/ml表示：把在增殖测定中，引起50％抑制的物质量，定义为1u)：
                                表IV
 细胞系     CM     “MF-P”    “MF-SP”     “R”
 HTB-38(a)     18.0     8.4    21.6     -
 HTB-38(a)     -     -    30.0     10.2
 MCA     -     7.4    8.4     5.0
(a)＝用HTB-38细胞的实验分别在两组不同的测定中进行。
“-”＝未测定
可见，所有被测定的级分，对被测定细胞系的增殖都有抑制活性。这也包括R级分，该活性因子可能是在美国专利5,242,692中公开的肿瘤增殖抑制剂。
7.6.通过HPLC表征从L-8细胞系得到的MF
在7.6.1.-7.6.5节中表明了一些代表性HPLC结果。在7.6.1.节中，给出了一个纯化MF的示范性方法。
7.6.1.反相(RP)HPLC
通过RP-HPLC柱(C-18)，对在PBS中的160ml 3000道尔顿MF超滤液(以PBS温育肌细胞8小时后得到的)进行层析。洗脱液是在B-pureTM(Barnstead，Dubuque，Iowa)装置中制备的HPLC级的水，以及HPLC级的乙腈(G.T.Baker，U.S.A.)的梯度液。洗脱液的梯度是在0％乙腈到60％乙腈之间，时间超过30分钟。流速是100ml/分钟。每两分钟收集一个级分(每个级分200ml)。
从每个得到的HPLC级分中取20ml，在浓缩离心机中蒸发至干，然后将  干燥的各级分悬浮于100μl水中，再蒸发干，然后再溶解于2mlPBS中，最后，从每个级分取0.2ml加入含测定细胞的微孔中，通过细胞计数测定法，测定各级分的增殖抑制活性。
图16和17显示出在两次不同的层析中各级分的活性。两种情况下的结果都表明存在特异性抑制成分，这种抑制成分，在图16中是在级分5和6中被洗脱出，在图17中是在级分8-12中被洗脱出。
将图16中的级分5和6合并，在45℃蒸发干，然后溶解于5ml水中，转移至试管中，在真空中再次干燥，再溶解于2ml水中，并灭菌。将1ml这些浓缩的级分，在分析型RP-HPLC(C-18)柱中层析，以100％水至60％乙腈作梯度展开液，时间20分钟，流速1ml/min。每分钟收集1个级分(每个级分1ml)，然后干燥，溶解于0.4ml含有5％HS的RPMI中，并灭菌处理，取0.15ml加入到包含细胞的每个孔中(通过细胞计数法测定活性)。用类似的方法，将PBS液通过HPLC进行分级分离，并测定活性，用作对照。
各洗脱级分的活性显示在图18中。这些结果表明，在级分15中存在特异性抑制成分。
7.6.2以Superdex柱进行HPLC
将图17的活性级分分成2个收集的级分：第一级分称为“ FR1”，是由合并第6-8管的1200ml，第8-9管的550ml，第9-10管的300ml的第10-11管的30ml得到的；第二级分称为“FR2”，是由第9-10管的250ml，第9-11管的520ml，和第11-12管的600ml合并而成。分别使FR1和FR2干燥，再溶解于10ml蒸馏水中。由于离心后得到了不溶解的沉淀，将这些沉淀分别用10ml PBS(对于FR1)和5mlPBS(对于FR2)进一步提取。即使第二次提取之后，仍残留有相当多的沉淀。
结果表明，绝大部分活性存在于FR1中，FR2仅有FR1活性的大约15-20％。与FR1相比较，不溶性沉淀的PBS提取物只存在大约4％的活性。
将2ml FR2干燥，再溶于0.4ml水中。取0.2ml对以PBS平衡的Superdex柱加样。用PBS作展开液，以1ml/min的流速进行柱层析，收集1ml的级分。在分离开始后的0.3分钟开始收集。将收集的洗脱级分灭菌，取0.2ml加至每个细胞培养孔。
从Superdex柱洗脱出的各级分的抑制作用如图19中所示。在级分18-22可见特异性抑制作用。收集组分18-22，在同样的柱上，以同样的条件进行再次层析。再次层析的结果表明，在这些级分中可能存在由两个或多个活性成分组成的混合物(“MFs”)。
用FR1也得到了类似的洗脱分布图，虽然结果似乎表明，FR1中MF的含量与FR2相比较，浓度大约要高出10倍以上。
7.6.3 Superdex HPLC后的分析型RP-HPLC
将级分FR1和FR2混合，取1ml小份对分析型RP-HPLC(C-18)柱加样。收集1ml的级分，干燥后再溶于0.4ml含5％HS的RPMI中，取0.5ml该溶液，加入含有细胞的每个孔中。结果显示在图20中。可见，在第16管有一个尖锐的活性峰。此外，在第4管也有较低的抑制活性。这些结果表明，在肌细胞CM中，可能存在不只一个肿瘤增殖抑制剂。
7.6.4体积排阻(SE)HPLC
将从制备型RP-HPLC得到的级分6-8(“A”)，8-10(“B”)，10-12(“C”)和12-14(“D”)，在含有以聚羟基乙基天冬酰胺(PolyHYDROXYETHYL-ATM，由PolyLC制造)包被的硅胶颗粒的柱上进行层析分离。展开液是一种等浓度(即不具有梯度)溶液，是50μM的甲酸水溶液。
收集0.5ml的级分，干燥后再溶解于0.8ml PBS中。然后每个级分取0.15ml加到每个含细胞的培养孔中。层析结果可在图21中看到。结果表明，在级分6-8中，除了在第32管可能有微弱的活性外，其它都没有活性。在级分B中，在第29-37管可见到非常清楚和宽的活性峰。在级分C中，存在两个清楚的活性峰，一个在第21-23管，另一个在第28-31管。最后，在级分D在第21-22管似乎存在一个单独的活性峰。
7.6.5 SE-HPLC后的Superdex HPLC
将从SE柱洗脱的活性级分合并在一起，在高真空下，在浓缩离心机(HetovacTM VR-1，由Heto，Denmark制造)中干燥，再溶解于0.4ml PBS中，然后取0.2ml样品在以PBS平衡的Superdex柱上进行层析分离。收集1ml的级分，将0.2ml加到每个含细胞的培养孔中。
如图22A中可见，级分B和SE-HPLC第29-33管，在从Superdex柱洗脱的第21-24管中显示抑制活性。该活性分布图可能表明，有可能存在不只一个活性成分，或者该活性成分是以几种形式存在的。
图22B显示在17-21分钟洗脱的一个特异性抑制峰。
7.6.6亲水性相互作用HPLC
将来自显示在后面图25中的体积排阻HPLC等分试样级分27-32合并在一起，干燥后再溶于0.2ml水中。取两份0.085ml的溶液加样注入亲水性相互作用(CHO)HPLC柱(polyGLYCOPLEXTM，由poly-LC制造)中。然后用70％乙腈水溶液进行柱层析展开，流速1ml/min，收集1ml的级分，干燥后溶于0.6ml PBS中，然后每个级分取0.1ml加入96孔板的每一个孔中，在此盐水中进行计数测定(见3.1.3节)。
在图23中可见来自该柱的洗脱液的活性分布情况。可看到，在CHO等分试样中，发现最高的特异性抑制作用在级分2-8中，虽然在级分10还可见到一个次级抑制峰。在级分21-30，还可以观察到以一个宽峰显示的某些微弱活性。
8.MF的纯化
8.1方法
建立了一个纯化MF的方法，由如下步骤组成：
(a)制备条件培养基：
由在PBS中的L-8细胞制备条件培养基，如在1.1.2节中所述。
(b)超滤：
通过具有3000道尔顿截止分子量的膜，对条件培养基进行超滤，如第2节中所述。
(c)制备型RP-HPLC：
然后将3000道尔顿的超滤液，在制备型RP-HPLC，C-18柱上进行层析。典型的步骤是先用HPLC级的水洗柱20分钟，然后以200ml 3000道尔顿的超滤液在柱上加样，并用水继续再洗10分钟。接着用乙腈液对柱展开30分钟以上：展开水溶液的梯度在0％乙腈到60％乙腈之间。展开液的流速大约为100ml/min。活性级分在大约8-14分钟之间从柱中被洗脱出。
然后将活性级分合并在一起，再在旋转蒸发器(RotovapTM，Büchi，Switzerland)中将此合并的级分浓缩，接着进行浓缩离心。
(d)分析型RP-HPLC：
将合并、浓缩和干燥的级分再溶解于5ml水中，再真空干燥，再溶解于2ml水中。然后取1ml这种浓缩的级分，在分析型RP-HPLC，C-18柱中进行层析，展开液是乙腈：水溶液梯度在0％乙腈至60％乙腈之间，展开20分钟，流速1ml/min。对柱加样后用水洗5分钟，水洗之后用乙腈梯度液对柱进行展开。
活性级分在12-19分钟之间从柱中被洗脱出。
然后通过浓缩离心将活性级分浓缩、干燥。
(e)体积排阻层析：
将干燥的级分与甲酸混合，取200ml这种溶液，如7.6.4所述对体积排阻柱加样，展开液和层析条件也同7.6.4所述。27-32分钟之后活性级分开始被洗脱出。
应该说明的是，不同的柱，即使是具有与上述柱类似规格的柱，以及洗脱条件轻微的改变，都可能产生不同的洗脱分布，因而活性级分有可能在与上述报告不同的保留时间之后被洗脱出。但是，如上所述，通过测定每个级分的抑制活性，技术人员将有可能没有任何太大的困难地确定和分离含有本发明GR的纯化级分。
8.2纯化结果
图24显示从分析型RP-HPLC洗脱的级分的抑制活性分布，以及从体积排阻HPLC(图25)洗脱的级分活性，纯化步骤如上8.1节中所述。
9.核磁共振(NMR)分析-MF的可能的低聚糖特性
将在图25中所显示的，从体积排阻柱中洗脱的活性级分干燥，然后再溶解于甲醇中(经过干燥，然后在甲醇中溶解的三次连续的循环)。再将此甲醇提取物蒸发干燥，此制备物再溶解于0.5ml Deutero甲醇中。再将该甲醇提取后的残留物溶解于0.5ml Deutero水中。
NMR谱显示在图26中。可以看到，水级分的NMR扫描显示出一个可能是无意义的峰，而甲醇提取物的NMR扫描，在3-4ppm范围内显示出几个峰。这些峰是C-OH基团质子所特有的，是低聚糖的特征。
这些结果暗示，MF可能是低聚糖。
10.白血细胞CM的3000道尔顿超滤液及其分级分离级分的活性
测定从白血细胞CM得到的3000道尔顿超滤液的活性，并与来自L-8CM的3000道尔顿超滤液的活性相比较。结果显示在如下表V中：
                         表V
 被测定的培养基     剂量(ml)     抑制百分比％
 L-8CM的3000道尔顿超滤液     0.40.30.20.1     4329110
 白血细胞CM的3000道尔顿超滤液     0.40.30.20.1     3221176
将从白血细胞CM得到的3000道尔顿超滤液200ml，如上所述(见7，6.6.节)通过制备型RP-HPLC进行分离。收集200ml的级分。将10ml(200ml中的)等分试样干燥，再溶解于0.6ml PBS中。取其中0.1ml加入每个细胞培养孔。
为了比较，将来自L-8CM的3000道尔顿超滤液也按相同方法进行分级分离。
结果显示在如下表VI中：
             表VI
    级分号         抑制百分数％
    WBF(1)     MF(2)
    234567     453028212     222547584533
(1)白血细胞CM的3000道尔顿超滤液
(2)L-8细胞CM的3000道尔顿超滤液
可以看到，两个等分试样都在级分4-6显示出抑制活性峰。

Claims (21)

1.一种基本上纯化的细胞生长调节因子，它是：
(a)低分子量内源细胞生长调节因子，它可用包括下列步骤的方法获得：
(1)在生长培养基中培养白血细胞或肌细胞；
(2)收集细胞培养物的上清；
(3)将含有分子量大于3000道尔顿的物质的上清液级分，与含有分子量小于3000道尔顿的物质的上清液级分分开，并选取后者；
所述细胞生长调节因子具有下列特征：
i.它是由肌细胞或者白血细胞产生、分泌或释放的，
ii.其分子量小于3000道尔顿，
iii.不是蛋白质，
iv.可溶于水，
v.对热稳定，
vi.具有抑制细胞增殖的生物活性；
(b)(a)中物质的衍生物，具有抑制细胞增殖的生物活性。
2.权利要求1的细胞生长调节因子，其中低分子量内源细胞生长调节因子是由肌细胞或者白血细胞产生、分泌或释放的。
3.权利要求1的细胞生长调节因子，其具有抑制肿瘤细胞增殖，或抑制被激活的淋巴细胞增殖的生物活性。
4.权利要求1的细胞生长调节因子，其具有抑制肿瘤细胞增殖的生物活性，但基本上不影响非肿瘤细胞的增殖。
5.权利要求4的细胞生长调节因子，其具有抑制肿瘤细胞增殖的生物活性，但基本上不影响骨髓细胞的增殖。
6.权利要求4的细胞生长调节因子，其具有抑制淋巴瘤细胞增殖的生物活性，但基本上不影响非肿瘤淋巴细胞的增殖。
7.权利要求1的细胞生长调节因子，其中低分子量内源细胞生长调节因子可从由于肌细胞或者白血细胞在其中生长而条件化的培养基中得到。
8.权利要求1的细胞生长调节因子，其具有低于2000道尔顿的分子量。
9.权利要求8的细胞生长调节因子，其具有500道尔顿或低于500道尔顿的分子量。
10.权利要求1的细胞生长调节因子，其中低分子量内源细胞生长调节因子是由命名为L-8的大鼠肌细胞系分泌或释放的，该细胞系保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号CRL 1769。
11.权利要求1的细胞生长调节因子在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
12.权利要求11的用途，其被用于抑制免疫系统成分的活性。
13.权利要求11的用途，其中该药物是适用于口服给药的剂型。
14.一种含有权利要求1的细胞生长调节因子的组合物。
15.权利要求14的组合物，它是一种含有治疗有效量的权利要求1的细胞生长调节因子，以及药用载体或稀释剂的药剂组合物。
16.权利要求15的组合物，其为适用于口服给药的剂型。
17.一种制备基本上纯化的细胞生长调节因子的方法，其包括：
(a)在生长培养基中培养白血细胞或肌细胞，
(b)收集细胞培养物的上清液，
(c)将含有分子量大于3000道尔顿的物质的上清液级分，与含有分子量小于3000道尔顿的物质的上清液级分分开，选取后者。
18.权利要求17的方法，其包括：
(d)对被选取的级分作进一步层析纯化处理。
19.一种制备基本上纯化的细胞生长调节因子的方法，其包括：
(a)培养肌细胞或白血细胞，
(b)从细胞培养物中收集上清液，
(c)通过具有500-3000道尔顿截止分子量的膜过滤该上清液，
(d)通过反相高压液相色谱柱，层析在(c)中得到的滤液，并选取对肿瘤细胞表现有生长抑制活性的级分。
20.权利要求19的方法，其包括：
(e)通过反相高压液相色谱柱再次层析在步骤(d)中得到的被选取级分，并选取对肿瘤细胞表现有生长抑制活性的级分。
21.权利要求19的方法，其包括：
(e)通过体积排阻层析，层析在步骤(d)中得到的被选取级分，并选取对肿瘤细胞表现有生长抑制活性的级分。
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