CN1256081C - 鸦胆子油乳注射液的制备方法 - Google Patents

鸦胆子油乳注射液的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种鸦胆子油乳注射液的制备方法，鸦胆子油乳注射液每100ml乳剂中含有纯鸦胆子油5～20g、药用可接受的乳化剂0.75～2.5g、及与人体等渗剂量药用可接受的等渗剂，余量为水。主要制备特点是将油相成分和水相分别溶解，在制剂过程中尽可能杜绝杂质的产生，一定的温度下乳化制成初乳，再进行均质，至乳剂颗粒粒径达到50～300nm。这种方法制备的鸦胆子油乳注射液正以商品名安体康注射液申报新药，这种鸦胆子油乳注射液可以确保制剂可以直接静脉滴注，并提高用药的安全剂量，充分发挥注射用乳剂的定向分布与淋巴系统指向作用，进而充分发挥其对癌症的治疗作用。

Description

鸦胆子油乳注射液的制备方法
(一)技术领域
本发明涉及一种抗恶性肿瘤的中药静脉油乳注射剂，特别是一种以纯鸦胆子油为主要成分、经纳米技术制成可直接静脉注射、具有抗癌与杀伤转移癌细胞作用的油乳注射剂。
(二)背景技术
鸦胆子系苦木科植物鸦胆子的果实，主要功能为清热、躁湿、杀虫、解毒、腐蚀螯疣。鸦胆子有毒，其毒性成分存在于水溶性苦味部分，其固定油几乎无毒性。1950年以来，不少学者用鸦胆子油治疗外耳道乳头状瘤、喉乳头状瘤、宫颈癌等，取得一定的抗癌苗头。1976年起，沈阳药学院研制成鸦胆子油水包油乳注射剂(下称沈阳鸦胆子油乳剂)，现成的卫生部质量标准为：WS3-B-2739-97。用此乳剂一次10～30ml，加入灭菌生理盐水250ml，稀释后静脉滴注，30天为一疗程，试治疗肺癌、肝癌、胃腺癌等388例，大部分病人用药后出现症状缓解，周身状况改善，生存期延长；小部分病人出现肿块缩小，转移灶缩小或消失，达到临床近期痊愈。1989年南、北方22个医院应用鸦胆子油乳治疗肺癌脑转移100例，90％病例症状改善，颅内高压缓解，瘫肢功能有所恢复，生存期延长。上述事实充分证明鸦胆子油乳剂具有肯定的抗癌疗效。但沈阳鸦胆子油乳剂存在不足之处：
1.不能直接静脉滴注。由于乳剂颗粒太大，质量标准中规定最大颗粒不超过15微米，需加入生理盐水中稀释后才能静脉滴注，这样使得临床应用不方便，如不加稀释直接静脉滴注必然引起心、脑等重要脏器微血管栓塞，每日最大剂量也只能用到30ml。其制剂中本身纯鸦胆子油的含量为10％，实际成人每日纯鸦胆子油的摄入量最大只有3ml，按体重折算为0.06ml/kg。从小鼠抗癌有效剂量按体重计算可达20ml/kg，按体积表面积计算小鼠为15.15ml/m2，成人剂量可达25ml/1.65m2。不论按体重计算或体表面积计算，剂量偏低。如生理盐水中加入鸦胆子油乳注射剂的容量增加，还会造成破乳。
2.不能发挥注射用乳剂的定向分布作用。近年研究表明，注射用乳剂静脉给药后可被网状内皮系统与肺脏内巨噬细胞所吞噬，并能较长时间滞留在肺脏、肝脏、脾脏等脏器内，使包于乳剂内相的抗癌药在上述脏器的癌变部位达至较高的浓度，从而形成抗癌药在某些脏器内的定向分布，可以提高抗癌疗效。注射用乳剂还有淋巴指向性，优先向淋巴系统移行，因淋巴液在淋巴管内的流速比血液在血管内流速慢100倍，故对淋巴液中转移的癌细胞杀灭作用有利。抗癌药在淋巴系统浓度高，而血液中浓度相应降低，可减低抗癌药的毒性反应。沈阳鸦胆子油乳剂经生理盐水稀释后静脉滴注，明显减弱了脏器定向分布作用及淋巴指向性，使肺肝、淋巴结等组织内药物浓度减少，从而减弱了抗癌作用及对转移癌细胞的杀伤作用。
3.沈阳鸦胆子油乳剂经250ml生理盐水稀释后静脉滴注所提供的能量有限，机体未能充分利用。
4.以往的作为主药成份的纯鸦胆子油纯度不高，致使鸦胆子油乳剂的使用安全性受影响。
中国专利申请CN1368268公开了一种纳米鸦胆子油制剂药物，它是以纳米鸦胆子油60～150份、纳米豆磷脂10～25份为原料按比例配制，采用微波萃取、减压浓缩、超音速射流技术喷雾干燥等步骤制成药物制剂，然后依照中国药典2000年版二部的质量标准，制成丸剂、片剂、颗粒剂、注射剂等，它的特点是应用现代材料技术制成纳米药物，但专利只是提供了一种材料技术，鸦胆子油制剂药物的药理药效未能以数据说明。安全性及有效性无从可知；它的配方中没有静脉乳必须辅加的等渗剂，配方也不合理。
综上所述造成现有技术中鸦胆子油乳注射剂缺陷的根本原因是：1.制备鸦胆子油乳注射剂过程中没有控制杂质的产生；2.制备的乳剂颗粒太粗，使人体难以接受，且而造成破乳现象发生；3.作为原料的纯鸦胆子油的提取纯化技术不合理，没有彻底除去水溶性成份，从而将鸦胆子中有毒的毒性成分带入了制剂中。
(三)发明内容
本发明的目的是为了克服上述鸦胆子油乳注射剂的不足，提供了一种通过彻底纯化原料鸦胆子油，采用合理的制剂技术制成纳米级的乳剂颗粒，并防止制剂过程中杂质的产生的鸦胆子油乳注射剂的制备方法。以确保制备的鸦胆子油乳静脉注射液可以直接静脉滴注，同时提高用药的安全剂量并可以充分发挥注射用乳剂的定向分布与淋巴系统指向作用。
为实现上述目的，本发明所制备的鸦胆子油乳注射液的构思如下：
①改进鸦胆子油乳的制备工艺，探索乳化剂的筛选、配比、均质速率、时间，避免杂质产生，要求乳粒颗粒直径平均小于300nm，提高鸦胆子油乳注射液安全性与有效性。
②提取纯度100％的鸦胆子油，鸦胆子一般记载是具有有毒的植物，经现在的研究明确，鸦胆子的有毒成份是在水溶部分，而油溶部分是无毒性的，因此，鸦胆子的纯度关系到毒性问题，必须完全除去水溶性成份，控制水份及挥发物含量如不含任何植物残留物如叶绿素、溶解性的纤维素等等。
为此，本发明设计了如下鸦胆子油乳注射液的制备方法：
鸦胆子油乳注射液每100ml乳剂中含有纯鸦胆子油5～20g、药用可接受的乳化剂0.75～2.5g及与人体等渗剂量药用可接受的等渗剂，余量为水，并包括以下步骤：a.油相制备：取处方量的纯鸦胆子油及乳化剂，加热、搅拌使完全混匀，通氮消泡，保温在65℃～95℃；
b.水相制备：另取处方量的等渗剂加足量的注射用水，加热至油相的相同温度，注入均质机内，升压至5000～7000psi，使水相均匀混合；
c.将油相慢慢加入水相，制成初乳，进行均质，至粒径达到50～300nm，制成体系稳定的乳剂；
d.将c步骤生成的乳剂灌封、灭菌。
以上制备中的区别于现有技术的关键步骤为：步骤a中的通氮消泡，只有在油相充分消泡后才可能在油相与水相乳化时保证颗粒到达纳米级的粒度，另外通氮也可杜绝杂质的产生；步骤b及步骤C中的均质；油相水相分别制备，然后进行混合乳化，这样同时可保证油水混合乳化充分，粒度细微。这是现有技术中没有注意到的。
进一步，步骤a中的油相的温度保温在70℃。
步骤c中的均质反复进行6～9次。
鸦胆子油乳注射液所用的药用可接受的乳化剂可以下式之一：①卵磷脂、②大豆磷脂、③大豆卵磷脂、④聚甘油棕榈酸，其中优选卵磷脂。
鸦胆子油乳注射液所用的药用可接受的等渗剂可以选用下式之一：①药用甘油、②山梨醇、③木糖醇，其中优选药用甘油。
鸦胆子油乳注射液的优选制备方法：鸦胆子油乳注射液每100ml乳剂中含有纯鸦胆子油5～20g、作为乳化剂的卵磷脂0.75～2.5g、作为等渗剂的药用甘油2.0～5.0g，并包括以下步骤：
a.油相制备：取处方量的纯鸦胆子油及卵磷脂，加热、搅拌使完全混匀，通氮气消泡，保温在70℃；
b.水相制备：另取处方量的药用甘油加足量的注射用水，加热至油相的相同温度，注入均质机内，升压至5000～7000psi，使水相均匀混合；
c.将油相慢慢加入水相，制成初乳，进行均质，反复均质6～9次，至粒径达到100～300nm，制成体系稳定的乳剂；
d.将c步骤生成的乳剂充氮、灌封、灭菌。
上述优选方法中的步骤d的充氮可保证灌封前的制剂不再被空气所氧化，从而确保油乳注射剂的杂质尽可能少。其中鸦胆子油乳注射液的最优配比是：每100ml鸦胆子油乳注射液中含有纯鸦胆子油10g、作为乳化剂的卵磷脂1.2g、作为等渗剂的药用甘油2.25g。
为保证作为原料的鸦胆子油的纯度，本发明还提供了纯鸦胆子油的制备方法，按如下步骤制备：
(1)粉碎：选适量鸦胆子果实粉碎成粗粉；
(2)石油醚萃取：按鸦胆子粗粉重量(公斤)：石油醚体积(升)比例为1∶6～9加入石油醚，在密闭容器中浸泡8～10小时，过滤，收集滤液；
(3)粗油制备：蒸馏步骤(2)所得滤液，加热回收石油醚，直到无液滴流出为止，得墨绿色鸦胆子粗油；
(4)精制：将步骤(3)所得墨绿色鸦胆子粗油加热至70℃～95℃，再加入重量为所述粗油体积(升)1～10％经干燥的活性炭(公斤)，搅拌充分后减压抽提得黄色粗油，将得到的黄色粗油加热至70℃～95℃，加入重量为黄色粗油体积(升)的3～12％经干燥的高岭土(公斤)，搅拌充分后减压抽提得鸦胆子油；
(5)纯化：将上步得到的鸦胆子油在100～115℃条件下减压通氮0.5～2小时，得纯鸦胆子油。
更优选的纯鸦胆子油的制备方法按如下步骤进行：
(1)粉碎：选适量鸦胆子果实粉碎成粗粉；
(2)石油醚萃取：按鸦胆子粗粉重量(公斤)：石油醚体积(升)比例为1∶8加入石油醚，在密闭容器中浸泡8～10小时，过滤，收集滤液；
(3)粗油制备：蒸馏步骤(2)所得滤液，加热回收石油醚，直到无液滴流出为止，得墨绿色鸦胆子粗油；
(4)精制：将步骤(3)所得墨绿色鸦胆子粗油加热至80℃～85℃，再加入重量(公斤)为所述粗油体积(升)3～5％经干燥的活性炭，搅拌充分后减压抽提得粗油，将得到的粗油加热至80℃～85℃，加入重量(公斤)为所述黄色粗油体积5～8％经干燥的高岭土，搅拌充分后减压抽提得鸦胆子油；
(5)纯化：将上步得到的鸦胆子油在115℃条件下700mmHg减压通氮1小时，得纯鸦胆子油。
用本发明方法法制得的鸦胆子油乳静脉注射液的有益效果主要体现在：
1.用本发明方法制得的鸦胆子油乳静脉注射液的乳粒直径为100～300nm，可直接静脉滴注，不需稀释，方便使用。
2.用本发明方法制得的鸦胆子油乳静脉注射液，注射后可发挥定向分布作用，可在肺脏、肝脏、脾脏等脏器内有较高浓度。且滞留时间较长，对癌变部位可以充分发挥杀伤作用，提高抗癌疗效。
3.用本发明方法制得的鸦胆子油乳静脉注射液还有淋巴指向性：静脉注射后优先向淋巴系统转移，因淋巴液在淋巴管内的流速比血液在血管内的流速慢百倍，故在淋巴液与淋巴结内能蓄积较高的药物浓度，而癌细胞转移主要在淋巴系统内，所以高的浓度可以有效杀伤转移的癌细胞，防止癌症转移；同时降低了血液中药物浓度，减低了血液中药物浓度而减低药物的周身毒性。
4.用本发明方法制得的鸦胆子油乳静脉注射液，每日允许使用的剂量30mL提高到100～200mL，即每次用量提高了3.3～6.6倍，从而增强了抗癌作用，对小鼠三种移植性肿瘤S180、heps肝癌与Lewis肺癌，等同剂量比较，本发明提供的鸦胆子油乳静脉注射液其抗癌作用强于沈阳鸦胆子油乳剂。
5.用本发明方法制得的鸦胆子油乳静脉注射液，长毒试验稳定，beagle狗每日静脉注射本发明提供的鸦胆子油乳静脉注射液1.8g/kg体重(即20mL/Kg体重相当于临床成人用量10倍)，连续给药60天，对造血系统、肝、肾功能、心率、心电图等均无明显影响。对心、肝、肾、骨髓、肺等24个脏器的组织结构没有引起病理变化，并无致突变作用与生殖毒性。说明本发明提供的鸦胆子油乳静脉注射液安全性大。
6.用本发明方法制得的鸦胆子油乳静脉注射液，做急性毒性试验表明，其毒性明显减少。沈阳鸦胆子油乳静脉注射液小鼠的半数致死量小，为6.25g/Kg体重，本发明提供的鸦胆子油乳静脉注射液小鼠静脉注射半数致死量为7.3388g/Kg体重。
7.用本发明方法制得的鸦胆子油乳静脉注射液，对小鼠Lewis肺癌足趾皮下接种后自发转移肺的抑制率有50.5％。并对小鼠Hep肝癌肺包膜下接种后干组织内转移也被抑制，达到I级(即肝内只有1～2个转移灶)。
8.用本发明方法制得的鸦胆子油乳静脉注射液可提供癌症病人高能营养物质，每mL为4.6J(约1.1kCa)，每天输液100mL。可给癌症患者提供充分的能量。
9.本发明同时提供了较好的提取纯化纯鸦胆子油的方法，保证了极低的纯鸦胆子油的水份含量，使本发明的原料的纯度大大提高，从而可彻底杜绝鸦胆子的水溶性毒性给制剂带来的毒性。
(四)附图说明
图1为本注射发明鸦胆子油乳注射液前后猫的心电图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1制备纯鸦胆子油
一、按如下步骤制备：
a.粉碎：选用成熟干燥、大小均匀的鸦胆子果实，剪除茎梗杂质后用粉碎机将鸦胆子果实粉碎成粗粉，称重45kg；
b.石油醚萃取：按鸦胆子粗粉重量加入8倍体积的石油醚60～90℃AR 360L，在密闭容器中浸泡9小时，每小时充分搅拌2次，过滤，收集滤液。取滤渣，再加6倍体积的石油醚60～90℃AR 270L，重复以上步骤，合并两次滤液；
c.粗油制备：常压蒸馏上述滤液，在80℃～100℃时回收石油醚60～90℃AR，直到无液滴流出为止，得墨绿色鸦胆子粗油11.25L；
d.精制：上述粗油加热至80℃，再加入重量为粗油体积的4％、经160℃烘烤1小时的活性炭0.45kg，以180转/分的速度搅拌，30分钟后减压抽提得黄色粗油9.68L，将得到的黄色粗油加热至80℃，加入重量为黄色粗油体积7％、经160℃烘烤1小时的高岭土0.63kg，以180转/分的速度搅拌，30分钟后减压抽提得鸦胆子油8.3L；e.纯化：将上步得到的鸦胆子油在115℃条件下700mmHg减压通氮1小时，得纯鸦胆子油7.8L，在充氮情况下，装瓶备用。
二、检验：
(1)纯鸦胆子油的含量测定：
a.三油酸甘油酯检测方法：精密量取本品1g，置25ml量瓶中，加石油醚(60～90℃)稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取三油酸甘油酯对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典1ml中含有4mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱分析法(中国药典1995年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液1μl、对照品溶液1μl、2μl，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)一醋酸乙酯(16∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中薰至斑点清晰，取出，于105℃烘2～3分钟，取出，在薄层板上覆盖相同大小的玻璃板，四周用胶布密封，照薄层色谱法(中国药典1995年版一部附录VI B薄层扫描法)进行扫描，波长：λS＝400nm，λR＝650nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。
b.油酸检测方法照气相色谱法(中国药典1995年版一部附录VI E)测定色谱条件与系统适用性试验，以5％苯基95％甲基聚硅氧烷为固定相，毛细血管柱(25M×0.25μm(交联)：柱温为250℃。理论板数按油酸峰计算，应不低于2500，油酸与内标物峰的分离度应大于2。
校正因子测定取正十六酸适量，精密称定，加正己烷溶解并定量稀释成每1ml中含6.2mg的溶液，作为内标溶液。另取油酸对照品约10mg，精密称定，置10ml棕色量瓶中，精密加入内标溶液1ml，加正己烷适量溶解并稀释至刻度，摇匀。量取0.5μl注入液相色谱仪，计算校正因子。
测定法精密称取本品0.5g，置10ml量取中，精密加入内标溶液1ml，加正己烷稀释至刻度，摇匀。量取0.5μl注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
(2)其它项目检测：
c石油醚取本品，参照中国药典1995年版一部附录VIII P有机溶剂残留量测定法第二法(定空进样法)试验，使用5％苯基甲基聚硅氧烷毛细血管柱，柱温45℃，含石油醚应不得过0.01％。
d水分与挥发物不得过1.0％(中国药典1995年版一部附录IX H第一法)
e杂质不得过0.05％(中国药典1995年版一部附录IX N)
f相对密度应为0.910～0.920(中国药典1995年版一部附录IX N)
g灼烧残渣：不得过0.1％(中国药典1995年版一部附录IX J)
按上述检验方法将实施例1所制得的纯鸦胆子油进行质量检验，结果如下表1：
表1
Figure C20031010832900081
1 0.916 0.015 0.10 0.04 小于0.01％ 924 21.9
实施例2
制备含量为100mg/ml的鸦胆子油乳注射液30L
按如下步骤制备：
取实施例1所制备的纯鸦胆子油3kg、作为乳化剂的卵磷脂0.36kg、作为等渗剂的药用甘油0.75kg，包括以下步骤：
a.油相制备：取处方量的纯鸦胆子油及卵磷脂，加热、搅拌使完全混均，通氮气消泡，保温在70℃；
b.水相制备：另取处方量的药用甘油加注射用水至30L，加热至油相的相同温度，注入均质机内，升压至5000psi，使水相均匀混合；
c.将油相慢慢加入水相，制成初乳，进行均质，反复均质6次，取少许测乳剂粒径，至粒径达到100nm，制成体系稳定的乳剂；
d.将c步骤生成的乳剂充氮、100ml/瓶灌封、于115℃，15磅/寸2压力灭菌30分钟即为成品。
实施例3
制备含量为50mg/ml的鸦胆子油乳注射液10000ml
按如下步骤制备：
取实施例1所制备的纯鸦胆子油500g、作为乳化剂的大豆磷脂80g、作为等渗剂的山梨醇500g，包括以下步骤：
a.油相制备：取处方量的纯鸦胆子油及大豆磷脂，加热、搅拌使完全混匀，通氮气消泡，保温在65℃；
b.水相制备：另取处方量的山梨醇加注射用水至10000ml，加热至油相的相同温度65℃，注入均质机内，升压至7000psi，使水相均匀混合；
c.将油相慢慢加入水相，制成初乳，进行均质，反复均质6次，取少许测乳剂粒径，至粒径达到200nm，制成体系稳定的乳剂；
d.将c步骤生成的乳剂充氮、100ml/瓶灌封、于115℃，15磅/寸2压力灭菌30分钟即为成品。
实施例4
制备含量为100mg/ml的鸦胆子油乳注射液10000ml
按如下步骤制备：
取实施例1所制备的纯鸦胆子油1000g、作为乳化剂的大豆卵磷脂150g、作为等渗剂的木糖醇500g，包括以下步骤：
a.油相制备：取处方量的纯鸦胆子油及大豆卵磷脂，加热、搅拌使完全溶解，通氮气消泡，保温在80℃；
b.水相制备：另取处方量的木糖醇加注射用水至10000ml，加热至油相的相同温度，注入均质机内，升压至5500psi，使水相均匀混合；
c.将油相慢慢加入水相，制成初乳，进行均质，反复均质7次制成体系稳定的乳剂；
d.将c步骤生成的乳剂充氮、100ml/瓶灌封、于115℃，15磅/寸2压力灭菌30分钟即为成品。
实施例5
制备含量为180mg/ml的鸦胆子油乳注射液10000ml
按如下步骤制备：
取实施例1所制备的纯鸦胆子油1800g、作为乳化剂的聚甘油棕榈酸120g、作为等渗剂的药用甘油250g，包括以下步骤：
a.油相制备：取处方量的纯鸦胆子油及聚甘油棕榈酸，加热、搅拌使完全混匀，通氮气消泡，保温在90℃；
b.水相制备：另取处方量的药用甘油加注射用水至10000ml，加热至油相的相同温度，注入均质机内，升压至6000psi，使水相均匀混合；
c.将油相慢慢加入水相，制成初乳，进行均质，反复均质5次，取少许测乳剂粒径，至粒径达到300nm，制成体系稳定的乳剂；
d.将c步骤生成的乳剂100ml/瓶灌封、于115℃，15磅/寸2压力灭菌30分钟即为成品。
实施例6鸦胆子油乳注射液含量测定
为观察鸦胆子油中的油溶性活性成份是否提取完全，本发明选取鸦胆子油中含有的三油酸甘油酯、油酸两项指标检测其在制成的鸦胆子油乳注射液中的含量，以确定油容性的活性成份提取完全。
一.方法：
(1)三油酸甘油酯：分别取本发明实施例2～5、实施例8和实施例10所得鸦胆子油乳注射液约5克，精密称定，加丙酮20ml，超声处理2分钟，加石油醚(60～90℃)提取三次(20、15、10ml)。合并提取液，水浴浓缩至适量。加石油醚(60～90℃)定容至50ml，作为供试品溶液。另取三油酸甘油酯对照品，加石油醚(60～90℃)定量制成每1ml中约含有4mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典1995年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液1μl，对照品溶液1μl、2μl，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(16∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中薰至斑点清晰，取出，105℃烘2～3分钟，在薄层板上覆盖相同大小的玻璃板，周围用胶布固定。照薄层色谱法(中国药典1995年版一部VIB薄层扫描法)进行扫描，波长：λs＝400nm，λR＝650nm。测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。
(2)油酸：照气相色谱法(中国药典1995年版一部附录VIE)测定。
色谱条件与系统适用性试验：以5％苯基95％甲基硅氧烷为固定相，毛细管柱(25m×0.25mm ID)，0.25μm(交联)，柱温为250℃，理论板数按油酸峰计算，应不低于2500，油酸与内标峰的分离度应大于2。
校正因子测定：取十六酸适量，精密称定，加正己烷溶解并定量稀释成每1ml约含0.6mg的溶液，作为内标液。另取油酸对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，分别精密量取上述内标液与对照液各1ml，摇匀，取0.5注入气相色谱仪，计算，校正因子。
测定法：分别取本发明实施例2～5、实施例8、实施例10所得鸦胆子油乳注射液约1g，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，加入内标液2ml，密塞，摇匀，100℃加热8小时，冷却至室温，精密加入正己烷4ml，摇匀2分钟，离心(4000转/分)5分钟，取上清液0.5μl，注入气相色谱仪，计算，即得。
二.试验数据
本发明实施例2～5、实施例8、实施例10所得鸦胆子油乳注射液含量测定数据如表2所示：
              表2鸦胆子油乳注射液含量测定结果
Figure C20031010832900111
三.结论
按各实施例制备的含纯鸦胆子油的量计算，最终产品各实施的油酸、三油酸甘油酯的提取率是大致相同的，说明本发明方法制备所得的鸦胆子油乳注射剂含有的油溶性成份较稳定。
实施例7鸦胆子油乳注射液加速实验
取实施例2所得鸦胆子油乳注射液，置于37～40℃的温度条件下保存三个月，分别在第0、1、2、3个月后，按照《中药新药研究指南》的要求，对鸦胆子油乳注射液的各项指标进行考察，结果见表3：
             表3实施例2所得鸦胆子油乳注射液加速实验
Figure C20031010832900121
结果表明，在温度37～40℃条件下，分别在第0、1、2、3个月后，按照《中药新药研究指南》的要求，对鸦胆子油乳注射液的各项指标进行考察，测定结果表明各项指标均符合要求。相当于样品保存二年内质量稳定。
实施例8
制含量180mg/ml的鸦胆子油乳注射液3000ml
按如下步骤制备：
取实施例1所制备的纯鸦胆子油540g、作为乳化剂的卵磷脂60g、作为等渗剂的药用甘油80g，包括以下步骤：
a.油相制备：取处方量的纯鸦胆子油及卵磷脂，加热、搅拌使完全混均，通氮气消泡，保温在70℃；
b.水相制备：另取处方量的药用甘油加注射用水至3000ml，加热至油相的相同温度，注入均质机内，升压至6000psi，使水相均匀混合；
c.将油相慢慢加入水相，制成初乳，进行均质，反复均质6次，取少许测乳剂粒径，至粒径达到200nm，制成体系稳定的乳剂；
d.将c步骤生成的乳剂充氮、100ml/瓶灌封、于115℃，15磅/寸2压力灭菌30分钟即为成品。
实施例9鸦胆子油乳注射液急性毒性试验
(1)：急性毒性试验：
小鼠静脉鸦胆子油乳注射液一次静脉注射LD50的测定：
受试动物：NIH小鼠，19～22只，雌雄各半，浙江大学医学院实验动物中心提供，实验温度25～28℃。
实验试剂：本发明鸦胆子油乳注射液实施例8，其中每180mg/ml。
实验方法：根据预试，将小鼠分组，每组雌雄各5只，组间剂量1∶0.75，静脉注射后部分小鼠即刻至几分钟出现惊厥、抽搐、呼吸衰竭而死亡，死亡小鼠进行解剖，心、肺、肝、肾等主要脏器肉眼未见异常。几分钟内不死的小鼠，不再死亡。存活小鼠观察2周，未见死亡。
试验结果：按Bliss机率单位法计算(医学统计程序，上海科学技术出版社)。结果见表4～1
          表4-1小鼠静脉鸦胆子油乳注射液一次静脉注射LD50的测定
  给药剂量(mg/kg)   对数剂量(X)   N(只)   死亡动物(只)   死亡率(％)   机率单位(Y)   LD50及可信限
  12708   4.1041   10   10   100   9.2044   LD507.388g/kg可信限6.306～8.656g/kg
  9540   3.9795   10   6   60   7.4659
  7200   3.8573   10   5   50   4.7345
  5400   3.7324   10   2   20   2.0803
  4050   3.6075   10   1   10   0.5938
  3024   3.4806   10   0   0   0.1022
由表中数据得鸦胆子油乳注射液小鼠静脉注射LD50为7.388g/kg，可信限6.306～8.656g/kg。而沈阳药学院研制得鸦胆子油乳注射液一次静脉注射LD50为6.25g/kg(数据来源：苏兴仁、程秀娟等，《鸦胆子抗肿瘤的研究》，JOURNAL OF SHENYANG COLLEGE OFPHARMACY，1979年10月，15～22)。本品的LD50高于沈阳药学院的注射液，毒性明显降低。
(2)鸦胆子油乳注射液溶血试验：
取实施例2制得的鸦胆子油乳注射液进行溶血试验。
受试动物：日本大耳白兔，浙江医科大学试验动物中心提供。实验方法：取兔血用3.8％枸橼酸钠抗凝，用生理盐水洗三次，配成2％红细胞生理盐水溶液。取试管9支，在试管中放2％红细胞生理盐水5mL，然后每3管各加蒸馏水、生理盐水、鸦胆子油乳注射液1mL，混匀，37℃水浴孵育30min，离心、去上清。每管沉淀的红细胞用1mL生理盐水稀释。吸取该液20μl加红细胞稀释液2ml，计数红细胞。
结果：见表4-2，鸦胆子油乳注射液组红细胞数与生理盐水组比较无差异，说明鸦胆子注射液对兔红细胞无溶血现象。蒸馏水组红细胞数比生理盐水组低，表明有溶血现象。
                 表4-2鸦胆子油乳注射液溶血试验
  组别   红细胞数(×1010/L)
  2％红细胞生理盐水5ml   蒸馏水1ml   194±10.5
  同上   生理盐水1ml   273±18.1
  同上  鸦胆子油乳注射液1ml   260±26.0
                   与蒸馏水组比较*P＜0.0.5
结论：鸦胆子油乳注射液对家兔红细胞无溶血反应。
(3)鸦胆子油乳注射液过敏试验：
取实施例2制得的鸦胆子油乳注射液进行过敏试验。
受试动物：DHP/ZMU1豚鼠，浙江医科大学试验动物中心提供。
试验方法：豚鼠体重270±30g，鸦胆子油注射组每只间日腹腔注射鸦胆子油乳注射液0.5ml，连续3次。于第一次注射后14日及21日各自取豚鼠3只，戊巴比妥钠麻醉，鸦胆子油乳注射液组静脉注射鸦胆子油乳注射液1ml，卵白蛋白组静脉注射0.05％卵白蛋白1ml攻击，观察是否出现过敏反应或死亡。
结果见表3-3，卵白蛋白致敏的豚鼠在致敏14日及21日进行攻击，在抗原攻击后0.5～2min出现呼吸困难、发绀、抽搐，在15min内6只豚鼠3只死亡。鸦胆子油乳注射液致敏的豚鼠子在致敏的14日及21日进行攻击，均未发生速发型过敏反应。
             表4-3鸦胆子油乳注射液的豚鼠速发型过敏反应情况
序号 攻击前呼吸次数                          攻击后表现
  呼吸   发绀   流涕   抽搐   死亡
                           致敏14日卵白蛋白攻击
  1.   53   呼吸抑制痉挛性呼吸   +   -   +   死亡
  2.   90   呼吸抑制痉挛性呼吸   +   -   +   死亡
  3.   82   呼吸困难   +   +   -   未死
                           致敏后14日鸦胆子油乳注射液攻击
  4.   72   无异常表现     -    -     -   未死
  5.   60   无异常表现     -    -     -   未死
  6.   78   无异常表现     -    -     -   未死
                           致敏后21日卵白蛋白攻击
  7   98   呼吸抑制痉挛性呼吸   +   -   +   死亡
  8   66   呼吸困难   +   +    -   未死
  9   100   呼吸困难   +   -    -   未死
                           致敏21日鸦胆子油乳注射液攻击
  10.   70   无异常表现    -   -   -   未死
  11.   74   无异常表现    -   -   -   未死
  12.   68   无异常表现    -   -   -   未死
(4)鸦胆子油乳注射液热原试验：
取实施例2制得的鸦胆子油乳注射液进行热原试验
受试动物：日本大耳白兔，浙江医科大学实验动物中心提供。
试验方法：健康兔2.15～2.35Kg，3只(2雌1雄)，预检合格。室温25-28℃。试验前1小时停止供食，测定其正常体温后，自耳静脉缓缓注入鸦胆子油乳注射液10ml，然后每隔1小时测体温1次，共3次。试验结果见表4-4。
      表4-4鸦胆子油乳注射液热原实验
  1#   2#   3#
  注射前   38.9   39.0   38.7
  注射后1小时   39.0   38.9   39.1
  2小时   39.4   39.4   39.0
  3小时   39.0   39.4   39.0
  升温度数   0.5   0.4   0.4
结论：热原试验结果表明鸦胆子油乳注射液热原限度符合中华人民共和国药典规定。
实施例10
制备含量为90mg/ml的鸦胆子油乳注射液30L
按如下步骤制备：
取实施例1所制备的纯鸦胆子油2700g、作为乳化剂的卵磷脂450g、作为等渗剂的药用甘油750g，包括以下步骤：
a.油相制备：取处方量的纯鸦胆子油及卵磷脂，加热、搅拌使完全混均，通氮气消泡，保温在70℃；
b.水相制备：另取处方量的药用甘油加注射用水至30000ml，加热至油相的相同温度，注入均质机内，升压至5000psi，使水相均匀混合；
c.将油相慢慢加入水相，制成初乳，进行均质，反复均质7次，取少许测乳剂粒径，至粒径达到300nm，制成体系稳定的乳剂；
d.将c步骤生成的乳剂充氮、100ml/瓶灌封、于115℃，15磅/寸2压力灭菌30分钟即为成品。
实施例11鸦胆子油乳注射液长期毒性试验
一.受试动物：6月龄beagle狗，体重6.5±0.8kg，购于上海市新冈实验动物场。
二.饲养条件：狗房采用自然光照和自然通风，每只狗处8M2的房子内，房子分内外两室，使狗能自由活动。狗在实验全过程食用的饲料由浙江大学医学院实验动物中心提供。每只狗一天的饲料：干料两，生牛肉3两(煮熟后喂)，每日定时喂。狗在是眼前驯养2周后检测心、肝、肾和血液学指标一次，给肠虫清(中美天津史克制药有限公司生产)每狗2片，2周后再检测一次心、肝、肾等功能，确定正常后作为试验狗。
三.实验试剂：本发明实施例10的鸦胆子油乳注射液，含量90mg/ml，对照物为脂肪乳注射液(商品名：英脱利匹特，华瑞制药有限公司生产)。
实验方法：
1.剂量：静脉注射给予鸦胆子油乳注射液，高剂量为20ml/kg(按体重计算，临床成人(50kg)剂量每日为100ml)、中剂量为10ml/kg、低剂量为6ml g/kg，分别为临床成人用量的10、5和3倍，对照物脂肪乳剂量为20ml/kg。
2.给药途径和方法：将醒狗固定于特制的架子上，剃去将作静脉注射部位的毛，用2％碘酒消毒，75％乙醇脱碘，用一次性塑料输液管给狗注输。先用生理盐水给狗注射，待确定针头进入静脉后，再换上鸦胆子油乳注射液或对照物。开始输注的速度为10滴(约1ml)/min，之后逐步加快至50～60滴/min。每日给药一次，每周7次，于每天上午8时左右给药。每7天称体重一次，根据体重调整给药量。
3.分组：beagle狗16只，按体重、性别随机分成4组，每组4只，雌雄各半，分室饲养。
4.实验周期：本试验的给药观察时间为60天，为临床疗程的3倍。
四.实验数据：
1.血液学检查：给药后不同时间，对血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、白细胞总数(WBC)、中性白细胞(DC)、淋巴细胞(PL)、嗜酸性细胞。血小板计数及凝血时间的检测结果均在正常范围内，详见表5。
2.血液生化学指标检查
给药后检测血清总胆红素(BILIT)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门氡氨酸氨基转换酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血糖(GLU)、总胆固醇(T-CHO)和三酸甘油脂(TRIG)等指标，各组结果见表6。经单因素方差分析统计处理，本发明鸦胆子油乳注射液与对照组比较，各项指标均未见明显差异性(P＞0.05)。各指标中仅见本发明鸦胆子油乳注射液各组在输注过程中丙氨酸氨基转换酶ALT和肌酐Cr值有升高趋势，但无明显量效关系，与对照组比较P＞0.05。停药后3周检查，丙氨酸氨基转换酶(ALT)和肌酐(Cr)值增高趋势恢复，与对照组比较基本相同。其他各项指标均在正常范围内。
五.试验结果：经统计学处理显示，本发明鸦胆子油乳注射液高、中、低三个剂量组的血液学、血液生化学指标与脂肪乳对照组比较均无明显差异，但对丙氨酸氨基转换酶(ALT)和肌酐(Cr)值有升高趋势，停药3周复查，可完全恢复，表明本发明鸦胆子油乳注射液在用药期间对肝肾功能有一定的影响。实验证明本发明鸦胆子油乳注射液是一个低毒抗癌药物。油乳注射液是目前抗癌药中较为推崇的一种剂型，它不但能提高药效和增加机体的能量，而且能降低毒性反应。
表5给药第四和第八周每组动物数n＝4；停药后三周每组动物数n＝2；
统计方法：Dunnett′s method；各组与对照组比较P＞0.05
  给药后时间   对照组   高剂量组   中剂量组   低剂量组
                                        血红蛋白(g/L)
  第四周   135.3±11.4   129.5±15.2   116.0±9.3   131.4±19.3
  第八周   135.8±14.2   120.0±7.30   115.7±4.0   120.8±25.2
  停三周   143.0±9.9   122.0±1.41   135.5±2.36   133.5±14.9
                                       红细胞(1012/L)
  第四周   6.20±0.37   6.40±0.88   5.63±0.56   6.55±0.82
  第八周   7.10±1.11   6.70±0.40   6.93±1.05   7.36±0.90
  停三周   7.93±1.88   7.04±1.81   7.64±1.42   7.95±0.95
                                       白细胞总数(109/L)
  第四周   15.2±4.03   14.0±2.66   16.4±2.18   16.9±3.12
  第八周   16.2±3.98   13.3±3.97   13.1±2.95   16.8±3.42
  停三周   15.4±0.71   15.8±4.28   13.5±0.99   14.1±0.04
                                        中性白细胞(％)
  第四周   60.3±7.93   59.8±4.35   70.3±10.8   67.3±6.37
  第八周   53.0±8.64   64.7±11.3   62.7±19.6   55.0±5.35
  停三周   60.0±5.66   62.5±6.36   55.0±12.5   63.0±7.07
                                        淋巴细胞(％)
  第四周   39.5±7.94   39.3±2.99   27.3±11.5   32.3±5.91
  第八周   45.8±9.78   34.5±10.4   29.7±8.96   45.0±6.48
  停三周   38.0±7.07   36.0±8.49   34.0±6.97   36.5±7.78
                                       嗜酸性白细胞(％)
  第四周   0.50±0.58   0.50±1.00   1.75±0.05   0.50±0.58
  第八周   1.00±1.41   1.75±1.50   1.33±1.16   0.50±0.58
  停三周   2.00±1.41   1.00±1.41   1.50±2.12   0.50±0.71
                                       血小板(109/L)
  第四周   323.0±14.7   440.5±27.5   420.5±60.7   390.5±64.9
  第八周   441.5±60.7   457.0±66.7   537.3±21.2   517.5±94.9
  停三周   514.0±62.2   481.0±32.6   560.0±72.1   510.0±51.0
                                       凝血时间(sec)
  第四周   77.0±15.9   67.5±11.1   62.0±26.8   56.5±7.72
  第八周   131.3±28.4   118.3±28.3   101.7±71.5   100.0±53.3
  停三周   57.0±18.4   52.0±2.83   44.5±14.9   59.5±30.4
表6给药第四和第八周每组动物数n＝4；停药后三周每组动物数n＝2；
统计方法：Dunnett′s method；各组与对照组比较P＞0.05
表6
  给药后时间   对照组   高剂量组   中剂量组   低剂量组
                                      血清总胆红素(μmol/L)
  第四周   2.98±0.87   2.18±2.38   2.18±0.88   2.20±1.47
  第八周   6.63±5.24   4.20±1.23   1.23±0.82   4.30±2.44
  停三周   4.80±3.54   3.10±0.42   3.25±1.49   5.20±0.57
                                    丙氨酸氨基转换酶(ALT IU/L)
  第四周   25.3±6.18   62.5±42.3   44.8±12.2   39.0±25.7
  第八周   32.5±9.33   40.0±29.4   60.9±31.9   61.3±32.6
  停三周   39.0±19.8   28.5±9.19   34.5±26.2   28.0±7.07
                                  天门氡氨酸氨基转换酶(AST IU/L)
  第四周   16.3±2.87   15.5±2.89   19.0±3.65   21.0±2.58
  第八周   19.3±4.08   28.3±16.3   35.0±12.9   37.0±15.1
  停三周   19.5±6.35   20.5±2.12   20.0±4.24   23.5±3.54
                                       碱性磷酸酶(ALP IU/L)
  第四周   58.3±12.8   61.3±13.1   77.0±31.8   50.5±19.3
  第八周   32.3±5.38   33.8±10.5   44.8±12.1   31.5±11.5
  停三周   25.5±6.36   37.0±9.90   37.5±16.3   27.0±14.1
                                        血清总蛋白(TP g/L)
  第四周   62.1±5.31   58.4±9.14   65.4±9.06   64.7±7.68
  第八周   63.7±6.30   62.9±8.61   69.5±5.02   61.2±4.42
  停三周   70.3±3.46   70.7±0.91   70.5±1.58   66.7±2.37
                                        血清白蛋白(ALB g/L)
  第四周   26.7±2.06   24.2±2.40   25.5±2.85   24.6±1.82
  第八周   26.7±3.74   25.0±2.36   24.6±3.30   24.0±2.12
  停三周   32.1±1.79   29.1±0.33   30.3±1.03   27.5±1.13
                                        尿素氮(BUG mmol/L)
  第四周   6.86±3.85   7.15±2.01   7.74±1.10   5.90±1.92
  第八周   4.34±1.31   7.06±1.90   7.91±1.09   7.59±0.81
  停三周   5.54±1.12   7.97±2.14   8.82±1.42   9.40±1.11
                                        肌酐(Crμmol/L)
  第四周   38.4±11.5   42.5±11.6   45.9±11.4   42.5±8.2
  第八周   39.2±29.1   66.1±24.9   60.1±15.9   65.0±23.8
  停三周   20.5±14.2   18.6±2.98   23.9±3.32   19.3±6.40
                                         血糖(GLU mmol/L)
  第四周   4.04±0.93   3.79±0.48   4.36±0.43   4.64±0.43
  第八周   2.81±0.74   2.87±0.78   2.83±0.40   3.56±0.20
  停三周   3.27±0.88   3.68±0.06   3.62±0.25   3.06±0.37
                                      总胆固醇(T-CHO mmol/L)
  第四周   4.45±0.44   4.50±1.11   4.20±1.08   3.85±0.78
  第八周   5.18±1.14   5.78±0.96   5.03±1.02   5.30±0.86
  停三周   3.55±0.07   2.90±0.28   3.45±0.92   4.20±0.00
                                      三酸甘油脂(TRIG mmol/L)
  第四周   0.30±0.08   0.27±0.06   0.28±0.05   0.30±0.08
  第八周   0.38±0.22   0.20±0.08   0.20±0.00   0.30±0.14
  停三周   0.25±0.07   0.20±0.00   0.25   4.20±0.07
实施例12
鸦胆子油乳注射液一般药理学试验
一.受试动物：NIH小鼠，雌雄各半，体重为18～22g；家猫，体重2.3～3.9kg，均由浙江大学医学院实验动物中心提供。
二.试验试剂：本发明实施例10鸦胆子油乳注射液，含量90mg/ml，对照药物英脱利匹特，华瑞制药有限公司产品。
三.试验仪器：XZ-4型小鼠自主活动计激器，中国医学科学院药物研究所产品；XDH-3型心电图仪，上海医用电子仪器厂产品；台式自动平衡记录仪，上海大华仪器厂产品。
四.实验方法：
1.小鼠自主活动计数试验：将小鼠按体重均匀分成4组，每组12只，雌雄各半，分别以0.6g/kg、1.8g/kg、英脱利匹特对照组和生理盐水对照组；注射后10min和2h将小鼠逐只放入计数器内，记录10分钟后的活动次数，4组同步进行。
2.小鼠戊巴比妥钠诱导睡眠试验：将小鼠按体重均匀分成4组，每组16只，雌雄各半，分别以0.6g/kg、1.8g/kg、英脱利匹特对照组和生理盐水对照组；分别以0.067ml/10g和0.2ml/10g体重鼠尾静脉注射给药。注射1h后再以戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射，记录睡眠时间超过1分钟的小鼠个数(睡眠以小鼠翻政反射消失为准)。
3.猫呼吸、血压和心电图观察：将猫分成2组，每组4只，雌雄各半。以戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉猫。麻醉后行气管插管，然后将猫置于特制的密闭体积容积描记器中，用皮管的一端连接气管插管，另一端通向描记器外令其自然呼吸，猫呼吸引起描记器内的容积和频率变化，用压力换能联接记录仪进行描记。血压测定采用直接法(股动脉插管法)。心电图测定II导联，上述实验操作完成后，待动物状况稳定，先作2次基线描记。第2次基线描记后，颈外静脉插管联接恒速注射机以2ml/min速度静脉注射鸦胆子油乳注射液，剂量分别为0.36g/kg(n＝4)和1.8g/kg(n＝4)。记录给药后15min、45min、1h、2h、3h、4h的呼吸、血压和心电图。
统计方法：采用Sigma Stat软件包进行单因素方差分析和x2检验。
五.试验数据：
1.鸦胆子油乳注射液对小鼠自主活动的影响：鸦胆子油乳注射液0.6g/kg或1.8g/kg静脉给药10min后小鼠的自主活动次数与生理盐水组比较活动次数明显减少(P＜0.05)，与英脱匹特组比较有减少趋势，但统计学无明显差异(P＞0.05)。鸦胆子油乳注射液注射2h后各组之间比较均无明显差异，表明鸦胆子油乳注射液可引起短暂的抑制作用。实验数据见表7-1：
表7-1鸦胆子油乳注射液对小鼠自主活动的影响(mean±SD)
  组别   N                    活动数
  10min   2h
  生理盐水组   12   495.8±87.6   327.8±85.2
  英脱匹特组   12   402.4±66.6   265.5±80.0
  鸦胆子乳油注射液0.6g/kg   12   361.8±83.9*   223.1±90.5
  鸦胆子乳油注射液1.8g/kg   12   289.3±202.2*   205.3±73.4
         统计方法Dunnet t’s，与对照组比较*P＜0.05
2.鸦胆子油乳注射液对小鼠戊巴比妥钠诱导睡眠的影响：鸦胆子油乳注射液0.6g/kg和1.8g/kg给小鼠静脉注射对戊巴比妥钠诱导睡眠无明显影响，实验数据见表7-2
    表7-2鸦胆子油乳注射液对小鼠戊巴比妥钠诱导睡眠的影响
  组别   n   睡眠数(只)   睡眠百分率(％)
  生理盐水组   16   11   68.375
  英脱匹特组   16   11   68.75
  鸦胆子乳油注射液0.6g/kg   16   11   68.75
  鸦胆子乳油注射液1.8g/kg   16   13   81.25
                  χ2检验，与对照组比P＞0.05
3.鸦胆子油乳注射液对猫心血管、呼吸系统的影响：鸦胆子油乳注射液大剂量1.8g/kg给猫静脉注射1、2、3、4h测定平均动脉压比给药前(基线血压)有明显下降，而小剂量组0.36g/kg则无明显影响，结果见7-3及图1。鸦胆子油乳注射液大剂量组有减慢心率趋向，但统计学处理无显著性差异(P＞0.05)，小剂量组用药前后比较无影响，心电图II导联的P波、P-R间期、QRS波、QRS间期、ST段、T波，呼吸频率和潮气量均无影响。
表7-3鸦胆子油乳注射液对猫心血管、呼吸系统的影响(mean±SD)
  时间   0.36g/kg组(n＝4)   1.8g/kg组(n＝4)
  平均动脉压(mmHg)   心率(次/分)   呼吸频率(次/分)   潮气量(ml)   平均动脉压(mmHg)   心率(次/分)   呼吸频率(次/分)   潮气量(ml)
  0m   126.6±13.0   121.8±38.7   26.6±7.1   12.0±1.7   126.7±12.1   160.6±32.1   20.0±6.5   6.93±0.15
  15m   131.1±11.3   112.2±45.5   30.3±11.0   10.3±2.1   120.0±10.0   132.3±40.5   24.3±8.1   7.30±1.13
  30m   126.6±17.2   120.3±46.5   32.6±13.1   12.7±1.8   122.7±11.6   128.0±20.9   22.6±5.8   7.46±1.42
  45m   122.3±17.7   124.3±43.7   30.6±11.2   11.3±2.3   118.6±5.7   121.3±26.1   23.0±5.2   8.09±2.70
  1h   122.1±17.1   130.3±46.9   27.3±8.1   11.4±1.9   104.6±5.1*   118.6±6.1   23.6±4.0   6.97±1.42
  2h   134.6±15.3   138.3±36.1   30.6±9.5   11.6±1.2   94.0±6.9*   144.6±18.2   31.1±17.5   6.93±0.55
  3h   140.7±10.8   127.3±47.4   31.6±11.6   11.2±1.1   98.6±1.2*   136.6±22.3   31.3±20.0   6.40±0.72
  4h   133.3±11.5   126.6±51.1   30.3±7.4   10.3±0.5   95.3±7.6   125.3±31.4   28.3±15.8   7.53±0.91
统计方法：给药后与给药前配对t检验，每组动物数n＝4
六.结论：鸦胆子油乳注射液0.6g/kg或1.8g/kg静脉给药10min后小鼠的自主活动次数与生理盐水组比较明显减少(P＜0.05)，可在2h后恢复；但对戊巴比妥钠诱导睡眠无明显影响。胆子油乳注射液0.36g/kg和1.8g/kg对猫心电图各波形、呼吸频率及潮气量无明显影响，但1.8g/kg组在给药1h后可明显降低平均动脉压，并有减慢心率趋向，2h后恢复。上述结果表明鸦胆子油乳注射液大剂量静脉注射有轻度的镇静、降压和减慢心率作用。通过本实验，向临床建议在注射鸦胆子油乳注射液时要注意病人的心率和血压变化。
实施例13鸦胆子油乳注射液药效学试验
一.试验材料
1.动物：ICR小鼠，浙江省实验动物中心供给；C57小鼠，由中科院上海实验动物中心供给。
2.瘤源：小鼠S180、小鼠hepS肝癌，浙江省医学科学院研究院药物所供给；小鼠Lewis肺癌，中科院上海药物研究所供给。
3.细胞株：G6入肺癌细胞株与SMMC7721人肝癌细胞株，取自浙江大学生物系；MKN28人胃腺癌细胞株，取自浙江大学医学院肿瘤研究所。
4.药源：
(1)受试药  实施例10鸦胆子油乳注射液  90mg/ml
(2)氟脲嘧啶(5-FU)  250mg/10ml  南通制药厂生产
(3)环磷酰胺(CTX)  10mg/瓶  上海华联制药公司生产
(4)顺氯氨铂(DDP)  10mg/瓶  锦州制药一厂生产
(5)阿霉素(ADM)  10mg/瓶  浙江海门制药厂生产
(6)黄芪  购自浙江省中医药研究院中药房
(7)脂肪乳注射液  华瑞制药有限公司生产
(8)RPM1640培养基  Sigma公司生产
(9)小牛血清  杭州四季青生物工程公司生产
(10)ConA Sigma公司生产  制备成1mg/ml储存备用
(11)3H-TdR  中科院上海核子研究所
(12)闪烁液PPO、POPOP，上海试剂一厂生产。PPO 4g，POPOP 0.4g，甲苯加至1000ml，40℃水浴过夜，暗室保存备用。
5.仪器
(1)CO2培养箱  美国Forna  Scientitfic公司生产
(2)超净工作台 YJ-875  江苏吴江净化设备总厂生产
(3)倒置显微镜37XA  上海光学仪器厂生产
(4)∑960全自动酶标仪  美国METERTECH公司生产
(5)DyQ-02型多头细胞收集仪  绍兴坡塘机械厂生产
(6)液体闪烁仪  美国Pachard  Tricard公司生产
二.试验方法和结果
(一)抗癌作用
1.体外对肿瘤细胞的抑制作用：将已生长成单层的G6、SMMC7721和MKN28细胞，用ATV酶消化下来，调正细胞浓度密度至4×105/ml，加入96孔培养板中，每孔0.1ml，置37℃5％CO2饱和湿度条件下的CO2培养箱过夜，待细胞贴壁良好后，每孔中加入经用含10％小牛血清的1640培养液比稀释的药物0.1ml。鸦胆子乳油注射液浓度由0.013mg～22.5mg/ml，脂肪乳注射液浓度也由0.013mg～22.5mg/ml，氟脲嘧啶(5-FU)由0.0031mg～6.25mg/ml，环磷酰胺(CTX)由0.005mg～10mg/ml。每一浓度重复二个样本。将已加好药物的培养板放置37℃5％CO2饱和湿度条件下的CO2培养箱中继续培养48小时。在倒置显微镜下观察细胞形态，培养完毕后，弃全部上清液，每孔加入1％结晶紫染色液0.1ml，染色5分钟后，用轻微的水流冲洗去培养孔的染液系未贴壁细胞，轻微甩干培养板上的水分，在空气中自然燥干，每孔中加入1％SDS0.1ml，于微量振荡器上轻微振荡培养板，直至细胞内燃料完全溶解，将培养板放入酶标仪，选定570nm处测定每孔光吸收值(OD值)，比较各孔OD值，计算细胞杀伤(IR)率(％)，确定药物半数致死浓度(LC50)细胞杀伤率(％)＝(对照孔OD值-待测样品OD值)/对照孔OD值×100％半致死浓度为细胞杀伤率为50％时的样品浓度。
实验数据见表8-1、表8-2、表8-3：
表8-1鸦胆子油乳注射液对MKN28人胃腺癌细胞的杀伤作用
CTX   药物浓度(mg/ml)   10   5   2.5   1.25   0.625   0.312   0.156   0.078   0.039   0.0195   0.010   0.005
  杀伤百分率(％)   96.1   95.9   97.6   89.4   85.7   90.5   86.9   77.0   71.8   59.0   45.8   31.2
  药物浓度(mg/ml)   22.5   11.25   5.63   2.81   1.41   0.71   0.35   0.18   0.08   0.04   0.02   0.013
  脂肪乳剂   杀伤百分率   23.7   18.7   18.1   18.3   9.8   10.2   6.5   0   0   0   0   0
  鸦胆子油乳注射液   杀伤百分率   96.4   94.7   90.3   85.6   72.7   69.9   53.3   47.6   24.8   16.2   12.1   17.5
表8-2鸦胆子油乳注射液对G6人肺癌细胞细胞的杀伤作用
5-FU   药物浓度(mg/ml)   6.25   3.12   1.56   0.78   0.40   0.20   0.10   0.05   0.025   0.0125   0.00625   0.0031
  杀伤百分率(％)   99.0   95.2   97.0   94.9   94.3   83.7   84.4   78.8   62.5   53.5   28.5   5.7
  脂肪乳剂   药物浓度(mg/ml)   22.5   11.25   5.63   2.81   1.41   0.71   0.35   0.18   0.08   0.04   0.02   0.013
  杀伤百分率   17.8   11.8   10.9   11.6   5.7   8.6   0   0   0   0   0   0
  鸦胆子油乳注射液   杀伤百分率   93.8   90.9   83.9   79.5   71.7   63.3   58.8   52.8   25.9   19.7   0   0
表8-3鸦胆子油乳注射液对SMMC7721人肝癌细胞细胞的杀伤作用
  CTX   药物浓度(mg/ml)   10   5   2.5   1.25   0.625   0.312   0.156   0.078   0.039   0.0195   0.010   0.005
  杀伤百分率(％)   96.9   98.6   98.7   81.5   87.7   91.8   83.1   72.2   72.6   58.2   34.8   13.5
  药物浓度(mg/ml)   22.5   11.25   5.63   2.81   1.41   0.71   0.35   0.18   0.08   0.04   0.02   0.013
  脂肪乳剂   杀伤百分率   37.1   27.7   27.0   20.6   17.6   12.0   2.5   0   0   0   0   0
  鸦胆子油乳注射液   杀伤百分率   97.8   94.7   93.1   82.7   69.8   68.4   52.5   47.3   24.4   13.0   0   0
(1)对MKN28人胃腺癌细胞的杀伤作用：
正常生长的MKN28人胃腺癌细胞形态较大，呈不规则多边形，易成堆生长，细胞内有明显的泡状颗粒。
当鸦胆子乳油注射液浓度达到43.95μg/ml时，细胞部分受抑制(16.2％)，细胞内出现较大的空泡和颗粒，部分细胞变形。
当鸦胆子乳油注射液浓度达到351.56μg/ml时，抑制率达53.3％，细胞出现变形，部分细胞溶解死亡，胞内物质释放。
当浓度达到32812.5μg/ml以上时，大部分细胞致死，细胞破碎，碎片成堆，见不到完整的细胞。而相应浓度的脂肪乳注射液细胞生长正常。
环磷酰胺(CTX)浓度为19.5μg/ml时，抑制率在59.0％，表现出较明显的抑制作用。
鸦胆子乳油注射液对MKN28人胃腺癌细胞的杀伤结果表明，鸦胆子乳油注射液对MKN28人胃腺癌细胞的LC50约在351.6μg/ml。
(2)对G6人肺癌细胞细胞的杀伤作用：
G6人肺癌细胞细胞正常情况下细胞表面光滑，无皱纹和颗粒，细胞间连接紧密。
当鸦胆子乳油注射液浓度达到43.95μg/ml时，G6细胞的生长收到受抑制(19.7％)，但大部分细胞仍生长正常，有少量碎片出现。
当鸦胆子乳油注射液浓度达到175.78μg/ml时，一半多的细胞生长受到抑制(52.8％)，部分细胞出现溶解性死亡，碎片较多。
当浓度达到2812.5μg/ml以上时，绝大多数细胞生长受到抑制(80％以上)，随着浓度的增加，G6细胞生长几乎全部受到抑制，细胞基本溶解，看不到完整的细胞，碎片成堆。而相应浓度的脂肪乳注射液(710μg/ml)，却只有8.6％的细胞受到抑制，此中抑制主要是随着脂肪乳注射液浓度的增加，抑制率并未明显增加，可能是脂肪乳高浓度破坏了细胞生长的培养液条件而引起的。细胞无异常变化，仍能正常生长。
氟脲嘧啶(5-FU)表现出较强的抑制作用，当其浓度为12.5μg/ml时，抑制率约为63.3％。
鸦胆子乳油注射液对G6人胃腺癌细胞的杀伤结果表明，鸦胆子油乳注射液对G6人肺癌细胞的LC50约为175.78μg/ml。
(3)对SMMC7721人肝癌细胞的杀伤作用：
正常生长的SMMC7721人肝癌细胞表面光滑，无皱折，胞内无颗粒，细胞连接紧密。
当鸦胆子乳油注射液浓度达到43.95μg/ml时，细胞仍能贴壁生长，但部分细胞生长已经受到限制(13.0％)。
当鸦胆子乳油注射液浓度达到351.56μg/ml时，细胞明显受到抑制，多数细胞呈圆形，细胞开始悬浮萎缩，碎片增多。有52.5％的细胞被抑制。
当浓度达到2812.5μg/ml以上时，细胞80％以上被抑制，细胞溶解死亡，碎片成堆。而相应浓度即31μg/ml的脂肪乳注射液，细胞生长正常。
环磷酰胺(CTX)浓度为19.5μg/ml时，有58.2％细胞被抑制，表现出较强的抑制作用。
实验结果表明鸦胆子乳油注射液对SMMC7721人肝癌细胞的半数致死浓度LC50约为351.56μg/ml。
2.对动物移植性肿瘤的抑制作用：
(1)对小鼠S180的抑制作用：
在无菌条件下制作1∶4稀释的S180细胞悬液，每鼠腋窝皮下注入0.2ml，24小时后按体重随机分组。于停药次日处死动物，称体重，解剖皮下瘤块，称瘤重，并计算肿瘤抑制率。
鸦胆子乳油注射液设1.8g/kg、0.9g/kg和0.45g/kg三个剂量组，尾静脉给药，每日一次，连续10天。阳性对照药为环磷酰胺(CTX)50mg/kg(或40mg/kg)，腹腔注射一次给药。另设脂肪乳注射液对照和生理盐水对照。
按疗效评价公式计算抑瘤率
肿瘤抑瘤率＝(C-T)/C×100％
试验数据见表9
试验结果显示，鸦胆子乳油注射液0.9g/kg、1.8g/kg两个剂量组对小鼠S180显示较强的抑制，并呈剂量依赖关系(P分别为＜0.05，＜0.01)。
                            表9-1对小鼠S180的抑制作用
  组别   剂量(g/kg)   给药途径   动物(只)         体重(克，X±SD)   瘤重(克，X±SD)   抑瘤率(％)
  始   末   始   末
  对照组脂肪乳CTX鸦胆子油乳注射剂   等容积生理盐水20ml/kg50ml/kg0.450.91.8   iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10   121212121212   121212121212   19.8±0.719.6±0.819.8±0.719.6±0.819.8±0.619.6±0.9   23.0±0.822.8±0.720.4±1.023.1±1.323.1±1.022.7±1.1   1.912±0.381.849±0.390.761±0.21**1.699±0.381.540±0.36*1.272±0.34** 60.2011.1419.4633.47
  对照组脂肪乳CTX鸦胆子油乳注射剂   等容积生理盐水20ml/kg50ml/kg0.450.91.8   iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10   101010101010   101010101010   19.8±0.919.8±0.919.8±0.919.8±0.919.8±0.920.0±0.8   22.2±1.122.8±0.720.2±1.221.9±1.020.3±0.619.4±0.9   2.199±0.292.2104±0.391.073±0.28**1.959±0.251.754±0.27*1.527±0.42** 51.2110.9120.2432.56
  对照组脂肪乳CTX鸦胆子   等容积生理盐水20ml/kg50ml/kg0.450.91.8   iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10   101010101010   101010101010   19.8±0.820.0±0.720.0±0.819.8±0.719.8±0.719.9±0.7   21.1±1.521.6±0.922.2±1.320.7±1.020.6±1.219.8±1.4   2.7956±0.472.8716±0.581.2594±0.18**2.5387±0.352.2798±0.44*1.8718±0.52** 54.599.1918.4533.04
与对照组比较  *P＜0.05    **P＜0.01
(2)对小鼠HepS肝癌的抑制作用：
在无菌条件下制作HepS细胞悬液，余操作同(1)。鸦胆子油乳注射液三个剂量和阳性药对照均同(1)。
实验结果见表9-2。试验重复三批，结果相近。
实验结果显示，鸦胆子油乳注射液0.9g/kg、1.8g/kg两个剂量组对小鼠HepS肝癌显示较好的抑制率(P分别为＜0.05，＜0.01)，并呈剂量依赖关系。
                              表9-2对小鼠HepS肝癌的抑制作用
  次数   组别   剂量(g/kg)   给药途径      动物(只)   体重(克，X±SD)   瘤重(克，X±SD)   抑瘤率(％)
始 末 始 末
  1   对照组脂肪乳CTX鸦胆子油乳注射液   等容积生理盐水20ml/kg40ml/kg0.450.91.8   iV×10iV×10iV10iV×10iV×10iV×10   101010101010   101010101010   19.5±0.519.5±0.619.1±0.619.3±0.519.0±0.519.3±0.5   21.7±1.221.5±1.022.1±0.922.3±1.122.2±0.622.2±0.9   2.804±0.4692.919±0.4121.3037±0.23**2.451±0.4442.213±0.365*1.889±0.259** 53.5112.5921.0833.01
  2   对照组脂肪乳CTX鸦胆子油乳注射液   等容积生理盐水20ml/kg40ml/kg0.450.91.8   iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10   101010101010   101010101010   19.7±0.819.7±0.819.7±0.819.7±0.819.8±0.919.8±0.9   21.2±1.021.5±1.420.8±1.021..±1.021.8±1.020.3±0.9   2.147±0.352.113±0.410.9936±0.268**1.916±0.211.648±0.284*1.4175±0.34** 53.7210.7621.5633.98
  3   对照组脂肪乳CTX鸦胆子油乳注射液   等容积生理盐水20ml/kg40ml/kg0.450.91.8   iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10   101010101010   101010101010   18.9±0.718.9±0.719.1±0.919.0±0.819.1±0.819.0±0.8   21.1±1.021.5±1.022.4±1.021.1±0.421.4±1.121.2±0.5   2.4504±0.2512.45056±0.451.0698±0.13**2.1299±0.181.8818±0.263*1.1.536±0.44** 56.3413.0823.2037.32
与对照组比较*P＜0.05   **P＜0.01
(3)对小鼠Lewis肺癌的抑制作用：
在无菌条件下制作Lewis肺癌细胞悬液，接种于C57小鼠腋窝皮下0.2ml/只。余操作及分组和给药方案均同(1)。
实验结果见表9-3。试验重复三批，结果相近。
实验结果显示，鸦胆子油乳注射液0.9g/kg、1.8g/kg两个剂量组对小鼠Lewis肺癌显示显著的抑制作用(P分别为＜0.05，＜0.01)，并与剂量呈依赖关系。
表9-3对小鼠Lewis肺癌的抑制作用
  次数   组别   剂量(g/kg)   给药途径   动物(只)   体重(克，X±SD)   瘤重(克，X±SD)   抑瘤率(％)
始   末   始   末
  1   对照组脂肪乳CTX鸦胆子油乳注射液   等容积生理盐水20ml/kg40ml/kg0.450.91.8   iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10   101010101010   101010101010   18.3±0.418.4±0.518.4±0.518.3±0.418.3±0.518.2±0.4   19.2±0.818.5±0.718.4±0.918.0±1.118.1±0.518.0±0.7   1.9456±0.3651.9126±0.4330.7463±0.162**1.6740±0.3641.4609±0.286*1.1240±0.263** 61.6413.9624.9142.23
  2   对照组脂肪乳CTX鸦胆子油乳注射液   等容积生理盐水20ml/kg40ml/kg0.450.91.8   iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10   101010101010   101010101010   19.0±0.819.0±0.819.0±0.819.0±0.819.0±0.919.1±0.7   18.9±0.919.5±0.719.3±1.120.1±0.919.1±0.619.0±0.8   1.8440±0.1741.8088±0.3900.8430±0.173**1.6540±0.3301.4097±0.343*1.1404±0.234** 54.2910.3423.5538.17
  3   对照组脂肪乳CTX鸦胆子油乳注射液   等容积生理盐水20ml/kg40ml/kg0.450.91.8   iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10iV×10   101010101010   101010101010   19.7±0.519.7±0.519.8±0.619.8±0.619.8±0.619.8±0.6   21.1±1.021.5±1.022.4±1.021.1±0.421.4±1.121.2±0.5   1.6085±0.4061.5933±0.3330.7862±0.122**1.3926±0.561.2202±0.221*0.9519±0.204** 51.1213.4224.1440.82
               与对照组比较  *P＜0.05 **P＜0.01
(二)增效作用
(1)对荷S180小鼠化疗的增效作用：
方法：ICR小鼠150只，分15组，每鼠腋皮下接种无菌条件下制作的S180细胞悬液0.2ml。24小时候随机分组，每组10只。鸦胆子乳油注射液三个剂量组(即0.45g/kg、0.9g/kg和1.8g/kg)分别与肺癌联合用药的三个化疗药物环磷酰胺(CTX)40mg/kg、顺氯氨铂(DDP)5mg/kg、阿霉素(ADM)5mg/kg合用。单用鸦胆子乳油注射液1.8g/kg，脂肪乳注射液20mg/kg和对照组生理盐水20mg/kg。给药期满24小时后称取体重和瘤重，计算抑瘤率。
实验数据见表10-1。
                              表10-1鸦胆子油乳注射液合并化疗药对S180的抑制作用
  组别   剂量(g/kg)   给药途径   动物(只)   体重(克，X±SD)   瘤重(克，X±SD)   抑瘤率(％)
  始   末   始   末
  对照组脂肪乳鸦胆子   等容积生理盐水20mg/kg1.8g/kg   iV×10iV×10iV×10   101010   101010   20.7±0.820.7±0.820.8±0.9   22.9±1.223.4±1.322.7±1.1   1.919±0.221.898±0.271.314±0.29** 31.53
  CTX鸦胆子+CTX鸦胆子+CTX鸦胆子+CTX   40mg/kg0.45g/kg40mg/kg0.9g/kg40mg/kg1.8g/kg40mg/kg   iP×1iV×10iP×1iV×10iP×1iV×10iP×1   10101010   10101010   21.0±0.920.8±0.820.8±0.920.9±0.9   22.5±1.021.6±1.222.3±1.022.7±1.0   0.9361±0.15**0.9095±0.23**0.8420±0.11**0.7012±0.11****   51.2252.6156.1264.35
  DDP鸦胆子+DDP鸦胆子+DDP鸦胆子+DDP   5mg/kg0.45g/kg5mg/kg0.9g/kg5mg/kg1.8g/kg5mg/kg   iP×1iV×10iP×1iV×10iP×1iV×10iV×1   10101010   10101010   20.8±0.720.7±0.820.8±0.920.8±0.9   23.1±1.023.0±1.322.8±1.522.4±0.8   1.101±0.29**1.0717±0.28**0.950±0.29**0.8028±0.19***   42.6344.1550.5058.17
  ADM鸦胆子+ADM鸦胆子+ADM鸦胆子+ADM   5mg/kg0.45g/kg5mg/kg0.9g/kg5mg/kg1.8g/kg5mg/kg   iV×1iV×10iV×1iV×10iV×1iV×10iV×1   10101010   10101010   20.8±0.720.9±0.820.7±0.820.7±0.8   23.8±1.323.9±1.323.7±1.422.3±1.9   0.9631±0.24**0.925±0.11**0.8517±0.13**0.6913±0.306***   49.8151.8055.6263.98
**与对照组比较P＜0.01，与化疗药组比较**P＜0.01  *P＜0.01
试验结果说明鸦胆子油乳注射液分别合并化疗药物环磷酰胺(CTX)、顺氯氨铂(DDP)、阿霉素(ADM)治疗S180均有不同程度地提高抑瘤作用。鸦胆子乳油注射液1.8g/kg剂量组与化疗药合用与相应的化疗药物单用比较，有显著差异(P＜0.05)。证实鸦胆子乳油注射液对环磷酰胺(CTX)、顺氟氨铂(DDP)、阿霉素(ADM)的抗癌作用有增效作用。
(2)对荷S180小鼠放疗的增效作用：
小鼠在接种S180细胞悬液24小时候随机分组并给药。于第6天，除脂肪乳注射液和鸦胆子油乳注射液两个组外，全部试验小鼠仰卧固定，以肿瘤部位对着放射源，全身接受60CO照射，总剂量为500rad，同时继续给药。在照射7天后，处死动物称取体重，剥离瘤块称重并计算抑瘤率。
由表10-2可见，0.9g/kg合用60Co有提高60Co抑瘤趋向，但统计不显著。鸦胆子油乳注射液1.8g/kg合用60Co能明显提高60Co对S180的抑瘤作用，与单用60Co比较有显著差别(P＜0.05)。与对照组比较差异非常显著(P＜0.01)。实验证明鸦胆子油乳注射液能增强60Co的抑瘤作用。
                               表10-2鸦胆子油乳注射液合用60Co对S180的抑制作用
  组别   剂量(g/kg)   给药途径      动物(只)     体重(克，X±SD)   瘤重(克，X±SD)   抑瘤率(％)
  始   末   始   末
  对照组脂肪乳鸦胆子60Co鸦胆子+60Co鸦胆子+60Co   等容积生理盐水20mg/kg1.8g/kg500rad0.9g/kg500rad1.8g/kg500rad   iV×11iV×11iV×11×1iV×11×1iV×11×1   121212121212   121212121212   20.121.321.121.321.321.0   21.622.921.219.720.520.4   2.012±0.362.020±0.331.371±0.30**1.360±0.129**1.243±0.26**1.067±0.25** 32.1832.4038.2246.97
与对照组比较**P＜0.01，与单60Co组比较**P＜0.05与对照组比较计算抑瘤率
(三)对荷瘤动物免疫功能的影响：
无菌条件下常规操作制成S180细胞悬液，每鼠腋皮下接种0.2ml，24小时后随机分组，每组10只。各组连续给药10天，第11天进行下列试验：
(1)对T淋巴细胞转化功能的影响：
取小鼠脾脏细胞，制成1×107/ml的细胞悬液，取0.1ml加入96孔培养板中，每鼠复四孔，其中两孔加入诱导剂ConA(终浓度为5μg/ml)，另两孔不加刺激剂作为非诱导孔对照，将培养板放置于CO2培养箱中培养72小时(5％CO2，37℃)，于培养终止前12小时，每孔加入3H-TdR 1μci，培养终止后收集细胞，在液闪仪上测定每孔cpm值，结果用平均CPM值表示，并计算刺激指数(SI)
SI＝加诱导剂孔平均CPM值/非刺激孔平均CPM值
结果：见表11-1，实验结果表明荷瘤小鼠T淋巴细胞转换功能较正常小鼠明显降低，而鸦胆子油乳注射液1.8g/Kg与黄芪20.0g/Kg水煎剂两个组均能明显提高荷瘤小鼠的T淋巴细胞转化功能(P＜0.05)
             表11-1对荷瘤小鼠T淋巴细胞转化功能的影响
  组别   剂量(/Kg)   动物数(只)   T淋巴细胞转化Cpm(X±SD)   刺激指数(X±SD)
  对照   等容积生理盐水   10   10654±5497   7.85±4.92
  脂肪乳   20ml   10   11565±4725   9.03±3.73
  黄芪   20g   10   18316±7186*   14.28±7.66*
  鸦胆子   0.45g0.9g1.8g   101010   12748±427613342±1027518437±5491*   6.92±2.637.87±3.6713.82±4.54*
  正常小鼠 等容积生理盐水   10   31457±11058**   19.73±7.91**
                  与对照组比较*P＜0.05*P＜0.01
(2)对白介素2(IL-2)活性的影响
方法：将鸦胆子油乳注射液各组小鼠于停药后24小时处死，无菌条件下取出脾脏，制成1×107/ml细胞悬液。取出24孔组织培养液板，每孔加入细胞悬液1ml，同时加入Con A 5μg，每鼠2孔，培养板置5％CO2孵育箱37℃培养48个小时，然后终止培养。2500rpm 10分钟，收集培养上清夜，置-6℃保存备用。IL-2火星测定采用CTLL2微量测定法，即将收集的上清液按1∶2稀释，加入96孔培养板中，每孔100μl每一样本2孔，然后将CTLL2细胞用无IL-1培养液洗涤2次，配成1×106/ml细胞悬液，取100μl加入上述96孔培养板总，置5％CO2孵育箱37℃培养22小时，然后每孔加入1μCi 3H-TdR(3.7×104Bq)，继续培养至28小时。收集细胞，检测细胞3H-TdR参入量(cpm)，结果用复孔的cpm的均值表示，并按标准rIL-2曲线换算成U/ml表示。
结果见表10-2，可见荷瘤小鼠组IL-2活性明显降低，与正常小鼠比较，有明显差异(P＜0.001)。荷瘤小鼠经鸦胆子油乳注射液治疗后，三个剂量组IL-2活性均有明显提高，与荷瘤小鼠组比较，有明显差异(P＜0.05～0.001)，并呈剂量依赖关系。证实鸦胆子油乳注射液对荷瘤小鼠淋巴细胞诱生IL-2活性具有明显提高作用。
               表11-2对荷瘤小鼠IL-2活性的的影响
  组别   剂量(g/kg)   n   cpm   U/ml
  S180模型对照   等容积生理盐水   10   1187±642   36±19
  脂肪乳注射液   20ml   10   1063±500   32±15
  黄芪   20   10   1394±397   42±12
  鸦胆子   0.450.91.8   101010   1938±833*2564±513***2366±390***   58±25*77±15***71±12***
  正常小鼠   等容积生理盐水   10   3036±737***   81±22***
               与模型对照*P＜0.05  ***P＜0.001
(3)对NK细胞活性的影响：
无菌条件下常规操作制成S180细胞悬液，每鼠腋皮下接种0.2ml，24小时后随机分组，每组10只。各组连续给药10天，第11天进行下面的试验：
将鸦胆子乳油注射液各组小鼠停药后24小时处死，无菌条件下取出脾脏，制成1×107/ml细胞悬液，取100μl加入96孔培养板中，每样本2孔，再加入以3H-TdR标记的YAC-1细胞(1×105/ml)100μl，同时设无脾细胞的YAC-1细胞对照孔，置5％CO2孵育箱，37℃培养16小时，收集细胞，测定每孔的cpm值。以细胞毒指数(CI％)表示杀伤活性。试验数据见表11-3。
细胞毒指数(CI％)＝[1-(脾细胞+YAC细胞Xcpm)/(1640+YAC细胞孔Xcpm)]×100％
试验结果可见荷瘤小鼠的NK细胞活性降低，与正常小鼠比较有显著差异(P＜0.05)。荷瘤小鼠经鸦胆子油乳注射液治疗后，0.9g/kg、1.8g/kg两组的NK细胞活性均有明显提高，并呈剂量依赖关系。
              表11-3对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响
  组别   剂量(g/kg)   N   细胞毒指数(CI％)
  S180模型对照   等量生理盐水   10   30.1±7.9
  鸦胆子油乳注射液   0.450.91.8   101010   25.4±6.334.5±3.4*36.1±4.1*
  脂肪乳注射液   20ml   10   27.4±6.3
  黄芪   20   10   29.4±8.7
  正常鼠   等量生理盐水   10   40.7±9.3*
                  与模型对照比较*P＜0.05
(4)对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响：
小鼠接种S180细胞悬液24小时后随机分组，鸦胆子油乳注射液分0.45、0.9、1.8g/kg三个剂量组静脉给药，疗程10天，设立黄芪阳性对照、脂肪乳注射液对照，末次给药后1小时注入5％鸡红细胞生理盐水1ml，4小时后再注射生理盐水2ml，轻揉小鼠腹部，取腹腔液滴片，37℃温育30min，待干，以姬姆萨-瑞氏染色法染色，油镜观察。每片观察100个巨噬细胞，按已吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，算出吞噬百分率，同时记录每个巨噬细胞所吞噬鸡红细胞数，求吞噬指数。
结果见表11-4。可见荷瘤小鼠腹腔吞噬功能较正常小鼠较低。鸦胆子油乳注射液三个剂量组对荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能无明显影响。
                 表11-4对荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
  组别   剂量(g/kg)   N   吞噬百分列率   吞噬指数
  S180模型对照   等容积生理盐水   10   20.8±7.25   0.23±0.09
  鸦胆子油乳注射液   0.450.91.8   101111   22.5±7.3528.5±9.7922.4±5.37   0.24±0.080.31±0.120.24±0.06
  脂肪乳注射液   20ml   11   21.8±8.94   0.24±0.12
  黄芪   20   10   32.3±11.09*   0.35±0.12*
  正常鼠   等容积生理盐水   12   26.2±5.41   0.28±0.06
                        与对照组比较*P＜0.05
从以上试验来看，鸦胆子油乳注射液对荷瘤小鼠的T淋巴细胞的分化与繁殖、对淋巴细胞诱生IL-2活性具有明显提高作用；对NK细胞活性亦有明显促进作用；但对巨噬细胞的吞噬功能无明显影响。为什么巨噬细胞的吞噬功能不受鸦胆子油乳注射液的影响，这是由于巨噬细胞吞噬了脂肪颗粒，不能再吞噬鸡红细胞所造成。该试验法不能反映鸦胆子油乳注射液的作用。鸦胆子油乳注射液对荷瘤小鼠的细胞免疫功能、IL-2及NK细胞活性均有促进作用，这是有利于肿瘤治疗的。
三.结论：鸦胆子油乳注射液是中药鸦胆子果实中提取的有效部位，制成油/水型乳剂，可供直接静脉滴注的一种新型制剂。具有肯定的抗癌作用，体外实验证明本品对G6人肺癌细胞、MKN28人胃腺癌细胞及SMMC7721均有杀伤作用，半数致死浓度分别为175μg/ml、351μg/ml与351μg/ml。对小鼠移植性肿瘤S180、HepS肝癌和Lewis肺癌均有明显抑制作用，抑瘤率在30％以上。与肺癌联合用药方案中常用三个化疗药物环磷酰胺、阿霉素与顺氯氨铂合用，本品可分别提高这三个药物的抑瘤效果；与60Co合用，亦能提高其抑瘤效果。提示本品对化疗与放疗有增效作用。本品对荷瘤小鼠的T淋巴细胞的分化与繁殖有促进作用，对荷瘤小鼠淋巴细胞诱生IL-2活性有明显提高作用。对NK细胞活性也有明显提高作用，但对巨噬细胞的吞噬功能无明显影响。本品对免疫功能的增强作用，有利于肿瘤治疗。
实施例14鸦胆子油乳注射液炽灼残渣测定
本发明尽可能控制成品中炽灼残渣的量，炽灼残渣值越小，说明成品中相应的杂质的量越少。这样才能保证鸦胆子油乳注射液的纯度。按中国药典1995年版一部IXJ的方法测定。
试验数据：本发明实施例2～5、实施例8、实施例10所得鸦胆子油乳注射液炽灼残渣值如表12所示：
               表12鸦胆子油乳注射液炽灼残渣值
Figure C20031010832900311
结论：中国药典对注射剂的检验标准是炽灼残渣不得超过0.1％，本发明鸦胆子油乳注射液炽灼残渣的数值远小于该标准。
实施例15鸦胆子油乳注射液稳定性试验
分别取实施例2、实施例3、实施例4和实施例5制备的鸦胆子油乳注射液，置室温条件下，保存3个月，分别在第0、1、2、3月后，按照《中药新药研究指南》的要求，对鸦胆子油乳注射液的性状、油酸薄层鉴别、三油酸甘油脂薄层鉴别、各项检查指标进行考察，结果见表13-1、表13-2、表13-3、表13-4：
表13-1实施例2所得鸦胆子油乳注射液稳定性试验报告
Figure C20031010832900321
表13-2实施例3所得鸦胆子油乳注射液稳定性试验报告
Figure C20031010832900331
表13-3实施例4所得鸦胆子油乳注射液稳定性试验报告
表13-4实施例5所得鸦胆子油乳注射液稳定性试验报告
结果表明，在室温的条件下，本发明方法制备的产品在第0、1、2、3月后鸦胆子油乳注射液的各项指标均符合要求。

Claims (10)

1.一种鸦胆子油乳注射液的制备方法，其特征在于所述的鸦胆子油乳注射液每100ml乳剂中含有鸦胆子油5～20g、药用可接受的乳化剂0.75～2.5g、及与人体等渗剂量药用可接受的等渗剂，余量为水，并包括以下制备步骤：
a.油相制备：取处方量的鸦胆子油及乳化剂，加热、搅拌使完全混匀，通氮消泡，保温在65℃～95℃；
b.水相制备：另取处方量的等渗剂加足量的注射用水，加热至油相的相同温度，注入均质机内，升压至5000～7000psi，使水相均匀混合；
c.将油相慢慢加入水相，制成初乳，进行均质，至粒径达到50～300nm，制成体系稳定的乳剂；
d.将c步骤生成的乳剂灌封、灭菌。
2.如权利要求1所述的鸦胆子油乳注射液的制备方法，其特征在于所述鸦胆子油乳注射液所用的药用可接受的乳化剂可选用下式之一：①卵磷脂、②大豆磷脂、③大豆卵磷脂、④聚甘油棕榈酸。
3.如权利要求1所述的鸦胆子油乳注射液的制备方法，其特征在于所述鸦胆子油乳注射液所用的药用可接受的等渗剂可选用下式之一：①药用甘油、②山梨醇、③木糖醇。
4.如权利要求1所述的鸦胆子油乳注射液的制备方法，其特征在于所述鸦胆子油乳注射液所用的药用可接受的乳化剂为卵磷脂，所述药用可接受的等渗剂为药用甘油。
5.如权利要求1～4之一所述的鸦胆子油乳注射液的制备方法，其特征在于所述的步骤a中的油相的温度保温在70℃。
6.如权利要求5所述的鸦胆子油乳注射液的制备方法，其特征在于所述的步骤c中的均质反复进行6～9次至粒径达到100～300nm，制成体系稳定的乳剂。
7.如权利要求6所述的鸦胆子油乳注射液的制备方法，其特征在于所述鸦胆子油乳注射液每100ml乳剂中含有鸦胆子油5～20g、作为乳化剂的卵磷脂0.75～2.5g、作为等渗剂的药用甘油2.0～5.0g，并包括以下步骤：
a油相制备：取处方量的鸦胆子油及卵磷脂，加热、搅拌使完全混匀，通氮气消泡，保温在70℃；
b水相制备：另取处方量的药用甘油加足量的注射用水，加热至油相的相同温度，注入均质机内，升压至5000～7000psi，使水相均匀混合；
c将油相慢慢加入水相，制成初乳，进行均质，反复均质6～9次，至粒径达到100～300nm，制成体系稳定的乳剂；
d将c步骤生成的乳剂充氮、灌封、灭菌。
8.如权利要求7所述的鸦胆子油乳注射液的制备方法，其特征在于所述鸦胆子油乳注射液每100ml乳剂中含有鸦胆子油10g、作为乳化剂的卵磷脂1.2g、作为等渗剂的药用甘油2.25g。
9.如权利要求7所述的鸦胆子油乳注射液的制备方法，其特征在于所述鸦胆子油按如下步骤制备：
(1)粉碎：选适量鸦胆子果实粉碎成粗粉；
(2)石油醚萃取：按每公斤鸦胆子粗粉加6～9升石油醚的比例加入石油醚，在密闭容器中浸泡8～10小时，过滤，收集滤液；
(3)粗油制备：蒸馏步骤(2)所得滤液，加热回收石油醚，直到无液滴流出为止，得墨绿色鸦胆子粗油；
(4)精制：将步骤(3)所得墨绿色鸦胆子粗油加热至70℃～95℃，按每升粗油加0.01～0.1公斤活性炭的比例加入经干燥的活性炭，搅拌充分后减压抽提得黄色粗油，将得到的黄色粗油加热至70℃～95℃，按每升黄色粗油加入0.03～0.12公斤高岭土的比例加入经干燥的高岭土，搅拌充分后减压抽提得鸦胆子油精品；
(5)纯化：将上步得到的鸦胆子油精品在100～115℃条件下减压通氮0.5～2小时，得鸦胆子油。
10.如权利要求8所述的鸦胆子油乳注射液的制备方法，其特征在于所述鸦胆子油按如下步骤制备：
(1)粉碎：选适量鸦胆子果实粉碎成粗粉；
(2)石油醚萃取：按每公斤鸦胆子粗粉加8升石油醚的比例加入石油醚，在密闭容器中浸泡8～10小时，过滤，收集滤液；
(3)粗油制备：蒸馏步骤(2)所得滤液，加热回收石油醚，直到无液滴流出为止，得墨绿色鸦胆子粗油；
(4)精制：将步骤(3)所得墨绿色鸦胆子粗油加热至80℃～85℃，按每升粗油加0.03～0.05公斤活性炭的比例加入经干燥的活性炭，搅拌充分后减压抽提得黄色粗油，将得到的黄色粗油加热至80℃～85℃，按每升黄色粗油加入0.05～0.08公斤高岭土的比例加入经干燥的高岭土，搅拌充分后减压抽提得鸦胆子油精品；
(5)纯化：将上步得到的鸦胆子油精品在115℃条件下700mmHg减压通氮1小时，得鸦胆子油。
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