CN1097058C - 血小板生成促进剂 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种多肽，其中在一个具有人粒性白细胞集落刺激因子活性的多肽分子中，至少有氨基、羧基、巯基、或胍基之一被一种化学修饰剂所修饰，本发明还涉及到一种含有该种多肽的血小板生成促进剂，一种包括给予病人用一个有效剂量的该种多肽来治疗血小板数量减少的病人的方法，以及将该种多肽用于生产治疗血小板数量减少的病人有用的药物成分，还涉及到一个治疗血小板数量减少的病人的药物组方，此组方由一个此种多肽的有效剂量，以及药剂学合适的剂型，与药物可接受的载体共同组成。

Description

血小板生成促进剂
本发明涉及的工业领域
本发明涉及一种经化学修饰的人粒性白细胞集落刺激因子多肽，该多肽是对一个具有人粒性白细胞集落刺激因子(以后被简称为hG-CSF)活性的多肽分子，通过对其至少氨基、羧基、巯基、或胍基之一进行化学修饰而产生的，本发明还涉及到一种含有这种多肽的血小板生成促进剂，一种包括对病人给予有效剂量的该种多肽来治疗血小板数量减少的病人的方法，将这种多肽用于生产治疗血小板数量减少的病人有用的药物组合物的应用，以及作为用于治疗血小板数量减少的病人的组合物，此组合物是由一个有效剂量的该种多肽，以一种药用剂型及药用载体共同组成。
技术背景
白介素6[F.Takatsuki et al.，癌症研究，50，2885-2890(1990)]，白血病抑制因子[D.Metcalf et al.，血液，76，50-56(1990)]，干细胞因子[P.Hunt et al.，血液，80，904-911(1992)]巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF；日本公开的审查专利申请No.11705/94)和促血小板生成素[de Sauvage et al.，自然，369，533(1994)]都是通常所说的可以促进血小板生成的物质。而Conagenin[日本癌症协会#2235(1992)]，Y25510[日本医药学会113届年会，PB13-22(1993)]，2-吡喃酮衍生物[日本公开的未审查专利申请No.213758/93]，和FK 565(WO 93/23066)等都被认为是可能促进血小板生成的低分子量物质。
据认为，hG-CSF是一种对造血干细胞的生长和分化，从而导致各种类型血细胞形成至关重要的多肽，并且hG-CSF还对绝大多数粒性白细胞，特别是嗜中性白细胞，具有生长促进作用。
作为一种显示hG-CSF活性的被修饰的多肽，其中的一些基团已被一种化学修饰剂进行了化学修饰，已经知道一种经化学修饰的hG-CSF，它是通过用一个聚乙二醇衍生物修饰具有hG-CSF活性的多肽的至少一个氨基而得到的(日本公开的未审查专利申请No.316400/89，WO 90/06952，日本公开的未审查专利申请No.32559/92)。还不知道这些经化学修饰的hG-CSF多肽是否具有血小板生成促进作用。
发明公开
本发明是关于一种经化学修饰的多肽，在这种具有hG-CSF活性的多肽分子中，至少有一个氨基、羧基、巯基或胍基被化学修饰，本发明还涉及到一种含有该多肽的血小板生成促进剂，一种通过给予病人有效剂量的该种多肽，来治疗血小板数量减少的病人的方法，将该种多肽用于治疗血小板数量减少的病人的药物组合物的应用，以及用于治疗血小板数量减少的病人的组合物，此组合物是由一个有效剂量的该种多肽以一种药用剂型，与药用载体共同组成。
更具体地说，本发明是关于一种经化学修饰的多肽，在这种具有hG-CSF活性的多肽分子中，至少有氨基、羧基、巯基、或胍基之一受到了聚二醇衍生物或苯乙烯马来酸共聚物的化学修饰，本发明还涉及到一种含有该多肽的血小板生成促进剂，一种通过给于病人有效剂量的该种多肽来治疗血小板数量减少的病人的方法，将该种多肽用于生产治疗血小板数量减少的病人的药物组合物的应用，以及作为治疗血小板数量减少的病人的组合物，此组合物是由一个有效剂量的该种多肽以一种药用剂型，与药用载体共同组成。
聚二醇衍生物包括，例如聚乙二醇衍生物，聚丙烯衍生物和聚乙烯-聚丙烯共聚体衍生物。
关于用于化学修饰至少一个氨基、羧基、巯基和胍基的试剂，具体到氨基化学修饰剂包括，例如具有式(I)的聚二醇衍生物：
              R1-(M)n-X-R2                  (I)其中R1代表一个烷基或烷酰基，M代表式：-OCH2CH2-，-OCH2CH2CH2-或-(OCH2CH2)r-(OCH2CH2)s-，其中r和s是任何可变的正整数值，它们可以相同或不同；n可以是任何可变的正整数值；X代表一个单键，O，NH或S；而R2代表如下式其中R3代表OH，卤素或如下式：
        -Xa-(Ma)na-R1a其中Xa、Ma、R1a和na分别与上述X、M、R1和n有相同的含义，而Y代表卤素或如下式：
        -Z-(CH2)p-(O)m-W其中Z代表O、S或NH；W代表一个羧基，及其活性衍生物，或如下式：
Figure C9519271700101
其中R4代表一个烷基；Hal代表卤素，p可以是一个1到6的整数；m可以是数值0或1，
        -(CO)ma-(CH2)t-Wa其中Wa和ma分别与上述W和m具有同样的含义；t可以是一个0到6的整数，或者是
Figure C9519271700102
其中Hala，pa和R4a分别与上述Hal、p和R4具有相同的含义，氨基化学修饰剂还包括具有如下式(II)的苯乙烯-马来酸共聚物(II)：其中u和v可以是任何可变的正整数值，它们可以相同或不同；R5代表一个氢原子或者一个烷基。羧基化学修饰剂包括，例如具有如下式(III)的聚二醇衍生物：
         R1b-(Mb)nb-NH2                          (III)其中Mb、R1b和nb分别与上述M。R1和n的含义相同，巯基化学修饰剂是具有如下式(IV)的聚二醇衍生物：
Figure C9519271700111
其中Mc、R1c和nc分别与上述M、R1和n有相同的含义，巯基化学修饰剂还可以是具有如下式(V)的苯乙烯-马来酸：
Figure C9519271700112
其中R5a、ua和va分别与上述的R5、u和v具有相同的含义，Q和R中的一个代表羧基，而另一个代表如下式：
Figure C9519271700113
其中pb与上述的p有相同的含义。胍基化学修饰剂包括，例如具有如下式(VI)的聚二醇衍生物：
Figure C9519271700114
其中q可以是数值1或2，而Md、R1d和nd分别与上述的M、R1和n有相同的含义。
在用于本发明的化学修饰基中，以R1、R4和R5代表的烷基包括，例如，具有从1个到18个碳原子的线性或分枝基团，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基、庚基、辛基、异辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基和十八烷基；以R1代表的烷酰基包括例如，具有从1个到18个碳原子的线性或分枝基团，如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、三甲基乙酰基、戊酰基、十二烷酰基、十四烷酰基、十六烷酰基和十八烷酰基；以R3、Y和Hal代表的卤素包括例如，氯原子、溴原子和碘原子；以W代表的羧基活性衍生物包括例如，酰卤化物如酰氯、酰溴，包括活性酯类如对硝基苯基酯和氮-羟基琥珀酰亚胺，还有包括单乙基酯碳酸盐和单异丁基碳酸盐在内的混合酐类。符号n、r、s、u和v代表1到1000的正整数值，优选地，n为7到500，而r、s、u和v中的每一个都在1到200之间。化学修饰基团的分子量可分布在从500到100,000的范围内，而优选地是在从1000到40,000的范围内。
任何具有hG-CSF活性的肽都可能用于构成本发明的具有hG-CSF活性的多肽，而优选地是含有SEQ ID NO：1氨基酸序列的多肽，该序列的一部分，或者是其中的一部分氨基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列[自然，319，415(1986)，日本公开的未审查专利申请No.267292/88，日本公开的未审查专利申请No.299/88，和WO 87/01132]都可被利用，一些具体的多肽被展示在表1中，这些多肽都含有其中一部分被其它氨基酸(hG-CSF衍生物)取代的氨基酸序列。
                                表1
距氨基酸N-末端的位置(hG-CSF ofSEQ ID NO：1                            hG-CSF衍生物中被取代的氨基酸
a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l)
  第1(Thr) * Val Cys Tyr Arg * Asn Ile Ser * Ala *
  第3(Leu) Glu Ile Ile Ile Thr Thr Glu Thr Thr * Thr *
  第4(Gly) Lys Arg Arg Arg Are Arg Arg Arg Arg Arg Tyr *
  第5(Pro) Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser * Arg *
  第17(Cys) Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
*：未被取代的氨基酸
在通常存在一个以上氨基、羧基、巯基和胍基的，具有hG-CSF活性的肽分子中，仅需这些基团中的一个就足以进行化学修饰。
具有hG-CSF活性的肽可以通过用下列化学试剂与含有氨基、羧基、巯基或胍基的多肽(hG-CSF衍生物)的反应来进行化学修饰，包括：聚二醇衍生物(如聚乙二醇衍生物，聚丙烯丁醇衍生物和聚乙二醇-聚丙烯二醇共聚体衍生物)和苯乙烯-马来酸共聚体衍生物。
常规的方法[例如，日本公开的未审查专利申请No.316400/89，生物技术通讯，14，559-564(1992)，生物/技术，8，343-346(1990)]或者其中基础上的改进方法，可用于使含有氨基、羧基、巯基或胍基的多肽与聚乙二醇衍生物或聚丙二醇衍生物发生化学反应。
常规的方法[例如，日本公开的未审查专利申请No.59629/84，日本公开的未审查专利申请No.176586/85，WO 89/06546，EP 0539167A2]或者其中基础上的改进方法，可用于使这种多肽与聚乙醇-聚丙二醇共聚体的衍生物发生化学反应。
常规的方法[例如，生物工业5，499-505(1988)，日本公开的未审查专利申请No.85922/89，日本公开的未审查专利申请No.99573/89]或者其中基础上的改进方法，可用于使这种多肽与苯乙烯-马来酸共聚体衍生物发生化学反应。
作为化学修饰的具有hG-CSF活性肽的一个例子，经修饰的肽可通过使hG-CSF的至少一个氨基与下述式(Ia)中所描述的基团相结合而得到：
        R1-(OCH2CH2)n-X-R2a-            (Ia)其中R1代表一个烷基或烷酰基，n可以是任何可变正整数值；X代表一个单键，O，NH或S；R2a代表如下式：
Figure C9519271700131
其中R3a代表OH，卤素或者如下式：
        -Xa-(CH2CH2O)na-R1a其中Xa、R1a和na分别与上述X、R1和n相同，Ya代表一个单键或如下式：
        -Z-(CH2)p-(O)m-CO其中Z代表O、S或NH；p可以是1到6的一个整数；m可以是数值0或1，
        -(CO)ma-(CH2)t-CO-其中ma与上述m相同，t可以是0到6的一个整数。
在式(Ia)的每个基团中，烷基、烷酰基、卤素和正整数值都被规定与前述式(I)中的这些基团相类似。
此外，本发明可提供一种新型的经化学修饰的hG-CSF或hG-CSF衍生物。
作为新型的化学修饰的hG-CSF其经修饰的肽可通过使至少一个氨基与下述式(Ib)中所描述的基团相结合而得到：
Figure C9519271700141
其中R1代表一个烷基或一个烷酰基；M代表下列式：-OCH2CH2-、-OCH2CH2CH2-或-(OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s-其中r和s可以是任何可变正整数，二者可以相同或不同，n可以是任何可变正整数；X代表一个单键，O、NH或S，R3b与R3a相同，Z代表O、S或NH，而p可以是一个从1到6的整数。
有1到5个聚乙二醇衍生物，聚丙二醇衍生物，聚乙二醇-聚丙二醇共聚体衍生物，或者苯乙烯-马来酸共聚体衍生物分子与化学修饰的hG-CSF或化学修饰的hG-CSF衍生物相结合。因此，这种化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物，是以1到5个分子组合物的混合物形式，或每种分离部分的组合物的形式被使用的。各种层析技术(如离子交换层析技术，凝胶过滤层析技术，反相层析技术和疏水层析技术)和硫酸铵分级分离技术都可用于这种化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物的分离纯化，这些技术通常是用于分离纯化长链多肽等成分的。
化学修饰的程度可通过将游离基(free group)的减少来确证，而游离基的减少可借助十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，通过检测化学修饰的hG-CSF的迁移率来测定。
在本发明中，蛋白质测定是通过下面的实验方法进行的。
    实验方法1
在本发明中，用Lowry等人的方法测定蛋白质浓度[Lowry，O.H.etal.，生物化学杂志.，193，265(1951)]。
    实验方法2
按照Laemmli的方法进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳[U.K.Laemmli：自然，227，680(1970)]，将在上述凝胶上分离的蛋白质用考马斯亮兰染色之后，用色谱扫描仪(CS-930，Shimadzu公司)测定蛋白质浓度。
下面的实施例可用来阐明化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物的药理学活性。
    实验实施例1
化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物的G-CSF活性和对白血病细胞，NFS-60细胞的促进作用。
在下述参考实施例4、6、8、12、15、17、19、20和实施例4中得到的化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物对小鼠骨髓细胞的活性，可按照Okabe等人的方法来测定[M.Okabe等，血液，75，1788(1990)]。此外，对抗NSF-60细胞[K.Holmes et al.美国自然科学协会进展，82，6687(1985)]的生长促进活性，可按照Asano等人的方法测定[Asano等，日本药物治疗19，2767(1991)]结果在表2中说明。
                              表2
HG-CSF*1(衍生物) 化学修饰的化合物 与一分子hG-CSF结合的被修饰化合物分子数目     产生的促进活性(％)*2
  骨髓细胞   NFS60细胞
参考实施例3 未作     0     100     100
参考实施例3 参考实施例4     3     18     21
参考实施例3 参考实施例6     1-4     15
SEQ ID NO：1 参考实施例8     1-4     19
参考实施例3 参考实施例9     1-4     12
SEQ ID NO：1 参考实施例11     1-3     17
参考实施例3 参考实施例12     1-3     33
参考实施例3 参考实施例15     1-4     11
参考实施例3 参考实施例17     3     24
参考实施例3 参考实施例17     2     40
参考实施例3 参考实施例17     1     61
参考实施例3 实施例4     3     17
参考实施例3 实施例4     2     24
参考实施例3 实施例4     1     53
*1：所用hG-CSF或hG-CSF衍生物的来源
*2：以实施例中产生的hG-CSF衍生物的活性作为100％时的相
    对活性(％)
实验实施例2
对恢复受整体放射性照射的小鼠血小板减少的促进作用。
在表3和表4描述的研究中，用了5只雄性BALB/c小白鼠(10周龄)，在表5所描述的研究中用了4只雄性BALB/c小白鼠(6周龄)。用放射源137铯(RI-433，东芝公司)对每只小鼠用3GY整体照射(以后被简称为Rx)后，将这些小白鼠在特制的无病原体环境中饲养在干净的笼子内。可以任意饮水和吃食。以未受照射的小鼠作未处理对照并在同样条件下饲养。
先将表3到表5中列举的化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物分别溶解在生理盐水中，以每只小鼠5μg/0.2ml的单一剂量作皮下给药，其中在表3列举的研究中，是以一个化学修饰的hG-CSF衍生物(三型)溶液，在对小鼠作Rx处理后的当天给药一次，或者在作Rx处理后的当天和第5天给药二次，在表4和表5列举的研究中，是在作Rx处理后的当天，以化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物给药一次。
为观察结果，从小鼠眼底静脉采血，用一台自动细胞计数仪(cc-180A，TOA医学电子有限公司)作血小板计数测定。结果见表3至表5。
                                表3
  以化学修饰的hG-CSF衍生物给药                            平均血小板计数(％)*2
                              照射后的天数
    0     5     9    11   13   20
不给药     100     95.7     37.7    53.5   59.5   80.6
照射后的第一天给药     100     94.5     54.0    109.8   100.3   94.8
照射后的第1天和第5天给药     100     100.1     40.2    118.6   101.3  105.1
*1：参考实施例4的化学修饰的hG-CSF衍生物(三型)
*2：以非照射对照组的计数作为100时的相对平均血小板计数(％)
                                     表4
给予化学修饰的hG-CSF(衍生物)                       平均血小板计数(％)*
                          照射后的天数
  0  6   8   9   10 11 12
不给药   100  88.9   36.2   42.1   51.2 67.6 74.2
参考实施例8   100  101   41.1   63.2   98.5 126 133
参考实施例9   100  103   41.0   66.3   98.9 142 159
参考实施例11   100  84.1   34.5   51.6   81.3 112 130
参考实施例12   100  93.1   42.4   66.1   92.7 145 140
*：以非照射对照组的计数作为100时的相对平均血小板计数(％)
                      表5
  给予的化学修饰的hG-CSF(衍生物)                          平均血小板计数(％)*
                            照射后的天数
    0     6     8     10     11   12
  不给药     100     58.9     26.6     35.1     38.3   45.1
  参考实施例19     100     55.1     30.5     62.7     98.5   103.6
  参考实施例20     100     52.4     29.1     61.3     84.6   105.1
*：以非照射对照组的计数作为100时的相对平均血小板计数(％)
受到3GY整体照射组的小白鼠，血小板数量显著减少，在Rx处理后的第8天到第9天达到最低值，此后逐渐增加，但整个实验过程中血小板数量没有恢复到照射处理前的水平。然而，给予化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物的小白鼠，其血小板数量减少受到了抑制，在照射处理后的第8天到第9天，血小板数量明显增加了，在照射处理后的第11天到第12天，血小板数量已完全恢复到其照射处理前的水平。在作Rx处理后的当天和第5天给予该药剂的试验组小鼠也看到相似的效果。
    实验实施例3
对恢复抗癌药物治疗引起的血小板减少的促进作用。
用一个抗肿瘤药5-氟尿嘧啶(5-FU，协和发酵工业公司)以100mg/kg的剂量对5只雄性BALB/c小白鼠(9周龄)腹膜内给药，在5-FU给药后的当天，将在参考实施例4中得到的化学修饰的hG-CSF(三型)溶解于生理盐水中，以每只小鼠5μg/0.2ml的单一剂量作皮下给药。从小鼠眼底静脉采血，用自动细胞计数仪作血小板计数测定，结果见表6。
                          表6
  给予的化学修饰的hG-CSF(衍生物)*1     平均血小板计数(％)*2
    给予5-FU后的天数
    0     4     5     6     7
  不给药     100     31.2     27.1     39.1     60.4
  照射后的第1天给药     100     42.3     43.6     68.3     103.7
*1：参考实施例4的化学修饰的hG-CSF衍生物(三型)
*2：以非照射对照组的计数作为100时的相对平均血小板计数(％)
5-FU给药组从给药后的第4天开始血小板数量减少，在第5天达到最低值，而后第9天恢复到给药前的水平。在给予化学修饰的hG-CSF组中，其血小板数量减少受到抑制，在第6天后，可见到对血小板数量恢复的明显促进作用。给药后第7天血小板计数恢复到给药前的水平。
    实验实施例4
对恢复骨髓移植引起的血小板减少的促进作用
4只雄性BALB/c小白鼠(8周龄)在接受137铯放射源的10GY Rx处理后，饲养在特制的无病源体(SPF)环境的干净鼠笼内。在受照射处理后的当天，以相同品系的2×106个骨髓细胞(无附着的尼龙纤毛)对小鼠作移植手术。2小时后，将参考实施例4中得到的化学修饰的hG-CSF(三型)溶解于生理盐水中，以每只小鼠10μg/0.2ml，20μg/0.2ml或40μg/0.2ml的剂量作一次皮下给药。从小鼠眼底静脉采血，用自动细胞计数仪进行血小板计数测定。结果见表7。
                        表7
   骨髓移植 化学修饰的hG-CSF衍生物剂量*1(μg)                        平均血小板计数(％)*
                          照射后的天数
  0     7   11   12   13   15
    未移植     0   100     7.1   11.3   3.2   7.1   死亡
    移植     0   100     6.3   15.8   29.1   52.3   75.8
    移植     40   100     6.6   21.4   42.0   81.5   118.7
    移植     20   100     6.9   23.9   46.6   86.1   117.6
    移植     10   100     7.9   17.6   43.8   79.8   108.7
*1：参考实施例4的化学修饰的hG-CSF衍生物(三型)
*2：以未受照射的对照组作100时的相对平均血小板计数(％)
所有接受了10GY整体放射性照射处理的小鼠都表现出严重的血小板数量减少，并在二周内死亡。作骨髓细胞移植的小鼠没有死亡，其血小板计数减少持续超过2周。给予化学修饰的hG-CSF的骨髓移植小鼠，在第11天显示出对血小板计数恢复的剂量依赖式的促进作用，在照射处理后的第15天，恢复甚至超过照射前的水平。
    实验实施例5
急性毒性试验
对4只5到10周龄的雄性BALB/c小鼠，以每只小鼠25μg的单一剂量的参考实施例4中得到的化学修饰的hG-CSF(三型)给药。在另一组实验中，以20μg剂量给药后的第1天，第5天和第9天再各给予20μg。在两组实验中观察小鼠的死亡率，发现小鼠的健康状况未发生任何改变，没有小鼠死亡。
正如在实验实施例中所述，化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物，对由于放射性照射，癌症化学治疗，或者骨髓移植引起的严重的血小板数量减少的再恢复显示出明显的促进作用，从而表明它作为血小板生成促进剂的用途。
除了这种化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物之外，其它的胞质分裂因子(Cytokines)或低分子血小板生成促进剂也可能被利用。其它的细胞因子有：白介素3，白介素6，白血病抑制因子，干细胞因子，  巨噬细胞集落刺激因子，促血小板生成素等。作为低分子血小板生成促进剂，有Conagenin，Y25510，2-吡喃酮衍生物，FK565等。
这种化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物可以单独使用或者以各种剂型使用。本发明的药物组合物可以通过使作为活性成分的有效剂量的化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物与一个药用载体，均匀地混合而制备。优选地这些药物组合物是适合于通过注射给药的剂型。
用这种化学修饰的hG-CSF或化学修饰的hG-CSF衍生物和载体如蒸馏水、盐溶液、葡萄糖溶液，或盐溶液和葡萄糖溶液的混合物，可以制成可注射的制剂。在制备过程中，按照常规的方法，使用适合的辅剂，可以将这种制剂制备成溶液，悬浮液或散剂。此外，通过将该制剂冷冻干燥，可以制备成冷冻干燥制剂。尽管冷冻干燥的条件不是特别严格，但该制剂通常应在-50°以下冷冻1到5小时，再在从-20℃到0℃的支架温度下，以及50到150mTorr真空度下干燥24到48小时，接着在10℃到30℃的支架温度下，以及50到100mTorr真空度下继续干燥16到24小时，最后得到冷冻干燥制剂。
本发明的血小板生成促进剂可以含有各种通常的药用载体，主药成分，稀释剂，稳定剂，或吸附抑制剂。
虽然给药的剂量和给药次数取决于剂型、病人的年龄、体重、主观病症和病情，但对于一个成年人，通常可给予15μg到1.5mg，最好是25μg到500μg的化学修饰的hG-CSF或化学修饰的hG-CSF衍生物，每周给药1到7次。采用途径是静脉或皮下注射给药。此外，本发明的血小板生成促进剂还可以用作栓剂或滴鼻剂。
通过下列实施例本发明将被进一步阐述。实现本发明的最佳模式
实施例1    注射液
按下述方法可以制备由下列成分组成的注射液。
将参考实施例4中得到的化学修饰的hG-CSF衍生物10mg溶于80ml PBS液中，加入2mg吐温80(Wako纯化学有限公司)100mg人血清白蛋白(西格玛有限公司)，以及1.5g D-甘露醇，然后用PBS调到100ml体积。用0.22μm孔径的一次性滤膜过滤除菌，在无菌条件下，按每2ml滤液分装于玻璃小药瓶中，即可得到注射液(每瓶含0.2mg活性成分)。
                             配方表化学修饰的hG-CSF衍生物(三型)                          0.2mg吐温80                                                0.04mg人血清白蛋白                                          2.0mgD-甘露糖醇                                            30mgNaCl                                                  16mgKCl                                                   0.4mgKH2PO4                                             0.4mgNa2HPO4·12H2O                                    5.8mg
                                                  2.0ml
实施例2    注射液
按下述方法可以制备由下列成分组成的注射液。
将参考实施例4中得到的化学修饰的hG-CSF衍生物50mg溶于80ml PBS液中，再加入2mg吐温80(Wako纯化学工业有限公司)1.5g D-甘露醇，然后用PBS调到100ml体积。再用0.22μm孔径的一次性滤膜过滤除菌之后，在无菌条件下，按每2ml滤液分装于玻璃小药瓶中，即可得到注射液(每瓶含活性成分1.0mg)。
                        配方表化学修饰的hG-CSF衍生物(三型)                          1.0mg吐温80                                                0.04mgD-甘露醇                                              30mgNaCl                                                  16mgKCl                                                   0.4mgKH2PO4                                             0.4mgNa2HPO4·12H2O                                    5.8mg
                                                  2.0ml实施例3    注射液
按下述方法可以制备由下列成分组成的注射液。
将参考实施例4中得到的化学修饰的hG-CSF衍生物10mg溶于80ml PBS液中，再加入2mg吐温80(Wako纯化学工业有限公司)100mg人血清白蛋白(西格玛有限公司)，以及1.5g D-甘露醇，然后用磷酸调节到大约pH5，用注射用蒸馏水调到100ml体积。用0.22μm孔径的一次性滤膜过滤除菌，在无菌条件下，按每2ml滤液分装于玻璃小药瓶中，即可得到注射液(每瓶含活性成分0.2mg)。
                          配方表化学修饰的hG-CSF衍生物(三型)                         0.2mg吐温80                                               0.04mg人血清白蛋白                                         2.0mgD-甘露醇                                             30mgNaCl                                                 12.8mgKCl                                                  0.32mgKH2PO4                                            0.32mgNa2HPO4·12H2O                                   4.64mg磷酸                                                 q.s.
                                                 2.0ml
实施例4
将由参考实施例3得到的hG-CSF衍生物31.5g溶于35ml 50mM磷酸盐缓冲液中(pH7.3)，并以5g NaOH调节至pH8.7，加入5.0g 2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-6-(1-氨基丙基碳酰氧基-4’-硝基苯)-S-三嗪，在4℃下持续反应7天。向该反应液中加入硫酸铵，使其终浓度为0.7M，然后加样到丁基-Toyopearl 650M(Tosoh公司)层析柱(2.5cm×6.1cm＝30ml)上，该柱预先用含有0.7M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡，流速30ml/小时。然后用90ml含有0.7M硫酸铵10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，以30ml/小时的流速洗柱，然后以一个在10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中配制的硫酸铵浓度从0.7M到0M逐渐降低的线性梯度液进行洗脱，洗脱液总量为180ml，流速为30ml/小时。目标物在硫酸铵浓度为0.47M和0.16M之间被洗脱出来。
将硫酸铵加到洗出液组分中，使其最后浓度为0.7M，将样品加到丁基-Toyopear 650M(Tosoh Corporaion)层析柱上(2.5cm×12cm＝60ml)，该柱预先用含有0.7M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡，流速为60ml/小时。然后用180ml含有0.7M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，以60ml/小时的流速洗柱，然后以一个在10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中配制的硫酸铵浓度从0.7M到0M逐渐降低线性梯度液进行洗脱，洗脱液总量为600ml，流速为60ml/小时。目标物在硫酸铵浓度为0.38M和0.11M之间被洗脱出来。将200ml的洗脱液组分进行超滤[截止Mr或标定的分子量极限10000∶YM10(Amicon有限公司)]并浓缩至6.5ml。再将该浓缩液样品加到Sephacryl S-300(Pharmacia Co.，Ltd.)柱(2.5cm×45cm＝220ml)，该柱先用PBS平衡，流速为44ml/小时，然后使PBS以相同的流速继续通过。起始PBS流出后为三型化学修饰的hG-CSF衍生物(其中有3分子聚乙二醇羧酸与1分子hG-CSF相结合)在92ml至100ml之间被洗脱出来，二型化学修饰的hG-CSF衍生物(其中有2分子被结合聚乙二醇羧酸)在100ml至104ml之间被洗脱出来，一型化学修饰的hG-CSF衍生物(其中有1分子被结合的聚乙二醇羧酸)在116ml至120ml之间被洗脱出来，得量分别是1.0mg(产率3.0％)，1.4mg(产率4.4％)，和1.1mg(产率3.6％)。
在一型、二型和三型hG-CSF衍生物中，与1分子hG-CSF衍生物结合的聚乙二醇衍生物的分子数目，可以借助SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来确证。
如在下述参考实施例中所示，结合的聚乙二醇衍生物的分子数目和化学修饰的hG-CSF衍生物的纯度，也可以用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定。
    参考实施例1
6-氯-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪的制备
将平均分子量为4000的甲氧基聚乙二醇(日本油脂有限公司)20g溶解于含有10g无水碳酸钠的100ml无水甲苯中，110℃加热30分钟，然后加入500g氰尿酰氯，再于110℃下加热24小时。除去残留物后，加入300ml石油醚使之产生沉淀物，生成的沉淀用石油醚洗几次，最后得到10g目标氯化物(产率50％)。
    参考实施例2
6-(3-羧丙氨基)-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪-N-羟基丁二酸亚胺酯的制备
将上述参考实施例1中得到的氯化物500mg溶于9ml无水四氢呋喃中。另一方面，先将10mg γ-氨基丁酸和28μl三乙胺溶于1ml无水N，N-二甲基甲酰胺中，然后将上面的溶液加入其中，在室温下搅拌16小时。真空干燥后，加入30ml二氯甲烷和15ml 10mM磷酸盐缓冲液(pH10)进行分配抽提。将上层溶液相2N盐酸调节至pH1，再加入30ml二氯甲烷，进行再一次分配抽提。将下层溶液相进行分馏处理，先用无水硫酸钠干燥，然后在减压下过滤，浓缩，得到150mg目标羧酸(产率30％)。
将150mg该羧酸和3mg N-羟基丁二酸亚胺溶于1ml无水二氯甲烷中，外用冰浴冷却，加入6mg N，N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)后，在室温下搅拌12小时。将生成的二环己基脲(DCU)在减压下过滤，干燥，得到100mg目标酯(产率67％)。
    参考实施例3
含有SEQ ID NO：1氨基酸序列的hG-CSF衍生物(表1化合物K)，在SEQ ID NO：1序列中，其第1个氨基酸，苏氨酸被丙氨酸取代，第3个氨基酸，亮氨酸被苏氨酸取代，第4个氨基酸，甘氨酸被酪氨酸取代，第5个氨基酸，脯氨酸被精氨酸取代，第17个氨基酸，半胱氨酸被丝氨酸取代，该hG-CSF衍生物可按下述方法得到：
用具有质粒pCfBD28的大肠杆菌E.coli W3110A品系(EscherichiaColi ECfBD28 FERM BP-1479)来生产hG-CSF衍生物，该质粒含有编码此hG-CSF衍生物的DNA，将这种大肠杆菌在LG培养基[10gBacto-胰蛋白胨，5g酵母浸出物，5g NaCl，1g葡萄糖，溶于1000ml水中，用NaOH调节至pH7.0]中，在37℃下培养18小时，然后取5ml培养物接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的100ml MCG培养基中(0.6％Na2HPO4、0.3％ KH2PO4、0.5％ NaCl、0.5％酪蛋白水解物(casamino acid)，1mM MgSO4、4μg/ml维生素B1、pH7.2)，于30℃培养4到8小时，然后加入色氨酸衍生物，10μg/ml 3β-吲哚丙烯酸(以后简称为IAA)，进一步继续培养2到12小时。将培养物以转速8000rpm离心10分钟，收集细胞，用30mM NaCl和30mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)洗细胞。将洗过的细胞悬浮于30ml同种缓冲液中，于0℃超声破碎处理(BRANSON声能公司发声细胞破碎器200，输出控制2)10分钟。将该超声破碎碎片以转速9000rpm离心30分钟，得到细胞碎片沉淀。按照Marston等人的方法[F.A.O.Marston et al.，生物/技术，2，800(1984)]，hG-CSF衍生物可以从此细胞碎片沉淀中抽提出来，并可进行纯化，溶液化，并可重复进行。
    参考实施例4
将由参考实施例2得到的活性酯800mg，加到含有由参考实施例3得到的hG-CSF衍生物300mg的100ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，在4℃下反应24小时。向反应物中加入100ml含有0.7M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，将此反应混合物样品加到丁基-Toyopearl 650M(Tosoh公司)柱(2.2cm×26cm)上，该柱预先用含有0.35M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡，流速为100ml/小时。先用含有0.35M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)100ml，以100ml/小时的流速洗柱，然后用以一个在10mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中配制的硫酸铵浓度从0.35M到0M逐渐降低的线性梯度液进行洗脱，洗脱液总量为400ml，流速为100ml/小时。所需物在硫酸铵浓度0mM至250mM之间被洗脱出来。将250ml洗出液组分进行超滤[截止分子量比率(Mr)或标定的分子量极限10000∶YM10(Amicon Co.Ltd.)]，并浓缩至10ml。再将该浓缩样品加到SephacrylS-200(法玛西亚有限公司)柱(5.6cm×40cm)上，流速为160ml/小时，然后PBS以相同的流速继续通过。
起始PBS通过后，三型化学修饰的hG-CSF衍生物(其中有3分子聚乙二醇羧酸与1分子hG-CSF相结合)在大约360ml至大约400ml之间被洗脱出来，二型化学修饰的hG-CSF衍生物(其中有2分子被结合的聚乙二醇羧酸)在大约420ml至大约450ml之间被洗脱出来，一型化学修饰的hG-CSF衍生物(其中有1分子被结合的聚乙二醇羧酸)在大约500ml至大约530ml之间被洗脱出来，含量分别是2.1mg(产率7％)，1.5mg(产率5％)，和1.5mg(产率5％)。一型、二型和三型的纯度水平都超过90％。
    参考实施例5
羧甲基单甲氧基聚乙二醇的N-羟基丁二酸亚胺酯的制备
将平均分子量为5000的，已充分脱水的羧甲基单甲氧基聚乙二醇(日本油脂有限公司)4g(0.8mmol)和N-羟基丁二酸亚胺(HONSu)184mg溶于40ml无水二氯甲烷中，置于冰浴上，氩气流中加入300mgDCC，搅拌30分钟。随后，待回到室温下，再搅拌1.5小时后，将不溶解的物质(DCU)滤出，滤液在减压下浓缩至16ml。将此浓缩液滴加到240ml无水二乙醚中，即生成沉淀物，用无水二乙醚洗沉淀物，然后在减压下去除溶剂，得到2.8g目标化合物(0.56mmol)(产率7％)。
    参考实施例6
将含有由参考实施例3得到的hG-CSF衍生物202.5mg的225ml50mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)，用5％NaOH调节至pH8.1，再将由参考实施例5得到的羧甲基单甲氧基聚乙二醇的N-羟基丁二酸亚胺酯1.1g加到含hG-CSF的溶液中，在4℃下反应6小时。随后，加入含有26.7mg三(羟甲基)-氨基甲烷的0.5ml水溶液，得到反应液，并以转速8000rpm，在4℃下离心40分钟，将硫酸铵加入上清液370ml中，使最终浓度为0.68M，再将此溶液样品加到丁基-Toyopearl 650M(Tosoh公司)柱(5cm×6.6cm＝130ml)上，流速为130ml/小时。
先用含有0.68M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)390ml洗柱，流速为130ml/小时，然后再用390ml 10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)进行洗脱，流速为130ml/小时。所需物在35ml至80ml之间被洗脱出来，将45ml洗出液组分进行超滤[截止分子量比率(Mr)或标定的分子量极限10000∶YM10]，并浓缩至30ml。再将该浓缩液样品加到Sephacryl S-200(法玛西亚有限公司)柱(5cm×51cm＝1000ml)上，先用PBS平衡，流速为200ml/小时，然后PBS以相同的流速继续通过。化学修饰的hG-CSF多肽，在PBS通过之后，在约200ml至约380ml之间被洗脱出来，是一个由1到4个聚乙二醇分子组合的混合物(一型到四型，总量158mg，产率78％)。
    参考实施例7
羧甲基单甲氧基聚乙二醇的N-羟基丁二酸亚胺酯的制备
将平均分子量为10000的，已充分脱水的羧甲基单甲氧基聚乙二醇(日本油脂有限公司)12g(1.2mmol)和276mg HONSu溶解于120ml无水二氯甲烷中，置于冰浴上，于氩气流中加入495mg DCC，搅拌30分钟。随后回复到室温下，再搅拌1.5小时后，不溶性物质(DCU)可过滤分出，滤液在减压下浓缩至48ml。将此浓缩液滴加到720ml无水二乙醚中，使产生沉淀，用无水二乙醚洗沉淀物后，减压下去除溶剂，得到10.0g目标化合物(1.0mmol)(产率83％)。
    参考实施例8
将40.8mg含有SEQ ID NO：1氨基酸序列的hG-CSF溶于30ml50mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)中，用5％NaOH调节至pH8.3，置于冰浴上，将此溶液加到由参考实施例7得到的羧甲基单甲氧基聚乙二醇的N-羟基丁二酸亚胺酯326mg中，反应在4℃下进行6小时。随后加入0.1ml含有3.9mg三(羟甲基)氨基甲烷的水溶液，得到反应液，向此反应液内加入硫酸铵，使终浓度为0.7M，然后加样上丁基-Toyopearl650M(Tosoh公司)柱(2.5cm×8.1cm＝40ml)，流速40ml/小时。
先用含有0.7M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)120ml洗柱，流速为40ml/小时，然后用一个在10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中配制的，硫酸铵浓度从0.7M到0M逐渐降低的线性梯度液进行洗脱，洗脱液总量为240ml，流速为40ml/小时。所需物在硫酸铵浓度0.33M至0.05M之间被洗脱出来。将90ml洗出液组分进行超过滤[截止分子量比率(Mr)或标定的分子量极限10000∶YM10(AmiconCo.Ltd.)]并浓缩至6ml。再将该浓缩液加样上Sephacryl S-300(法玛西亚有限公司)柱(2.5cm×45cm＝220ml)该柱先用PBS平衡，流速44ml/小时，然后使PBS以相同的流速继续通过。起始PBS流出后，化学修饰的hG-CSF多肽在大约60ml至102ml之间被洗脱出来，是一个1到4个聚乙二醇分子组合的混合物(一型到四型，总量9.5mg，产率23％)。
    参考实施例9
将由参考实施例3得到的hG-CSF衍生物304.2mg溶于338ml50mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)中，并用5％NaOH调节至pH8.1置于冰上，再将由参考实施例7得到的羧甲基单甲氧基聚乙二醇的N-羟基丁二酸亚胺酯4.8g加到该含hG-CSF的溶液中，在4℃下反应6小时。随后加入0.5ml含有58.1mg三(羟甲基)氨基甲烷的水溶液，得到反应液，向此反应液以转速8000rpm，在4℃下离心40分钟，将硫酸铵加入上清液中，使终浓度为0.68M，再将此液加样上丁基-Toyopearl650M(Tosoh公司)柱(5cm×7.1cm＝140ml)，先用含0.68M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡，流速140ml/小时。
用含有0.68M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)420ml洗柱，流速140ml/小时，然后用420ml 10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行洗脱，流速为140ml/小时。目的物在82ml至184ml之间被洗脱出来。将洗出液组分102ml加样上Sephacryl S-300(法玛西亚有限公司)柱(10cm×50cm＝3900ml)，先用PBS平衡，流速780ml/小时，然后使PBS以相同流速通过。起始PBS流出后，化学修饰的hG-CSF多肽在大约1600ml至2070ml之间被洗脱出来，是一个由1到4个聚乙二醇分子组合的混合物(一型到四型，总量216mg，产率71％)。
    参考实施例10
6-(3-羧丙氨基)-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪的N-羟基丁二酸亚胺酯的制备
将412mg(4.0mmol)γ-氨基丁酸溶于300ml 0.1M硼酸盐缓冲液中(pH10)，置于冰浴上，加入20g(2mmol)6-氯-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪(SEIKAGAKU公司)，4℃下搅拌过夜。再将此混合物在室温下搅拌6小时，用1N HCl将此溶液调节至pH1，再用氯仿抽提。氯仿层用无水硫酸钠干燥，干燥后用过滤法分出液体，在减压下去除溶剂，将生成的固体物加到干燥的丙酮中，使其溶解。在减压下将该丙酮溶液浓缩，放置在室温中，重结晶出目标羧酸，得到结晶15.8g(1.6mm0l)。
将该种羧酸10g(1.0mmol)和N-羟基丁二酸亚胺230mg溶解于无水二氯甲烷中，置于冰浴上，在氩气流中，加入413mg DCC，搅拌10分钟。接着，在室温下再搅拌1.5小时之后，将不溶解的物质(DCU)过滤出，并将滤液在减压下浓缩至40ml。将此浓缩液滴加到600ml无水二乙醚中，产生沉淀，用无水二乙醚洗沉淀后，减压去除溶剂，得到7.7g(0.77mmol)目标化合物(产率77％)。
    参考实施例11
将包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的hG-CSF 40.8mg溶于30ml50mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)中，用5％NaOH调节至pH7.2，置于冰浴上，加入由参考实施例10得到的6-(3-羧丙氨基)-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪的N-羟基丁二酸亚胺酯326mg，在4℃下反应48小时。随后，通过加入0.1ml三(羟甲基)氨基甲烷3.9mg的水溶液，得到反应液，向此反应液内加入硫酸铵，使其终浓度为0.7M，并加样上丁基-Toyopearl 650M(Tosoh公司)柱(2.5cm×8.1cm＝40ml)，流速为40ml/小时。
先用含有0.7M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)120ml，以40ml/小时的流速洗柱，然后以一个10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中配制的，硫酸铵浓度从0.7M到0M逐渐降低的线性梯度液洗脱，洗脱液总量240ml，流速40ml/小时。目标物在硫酸铵浓度0.35M至0.07M之间被洗脱出来。将90ml洗出液组分进行超过滤[截止分子量比率(Mr)或标定分子量极限10000∶YM10(Amicon有限公司)]并浓缩至6ml。再将该浓缩液加样上Sephacryl S-300(法玛西亚有限公司)柱(2.5cm×47cm＝230ml)，先用PBS平衡，流速46ml/小时，然后使PBS以同样的流速通过。起始PBS流出后，化学修饰的hG-CSF多肽在大约在110ml至145ml之间被洗脱出来，它是一个1到3个聚乙二醇分子组合的混合物(一型到三型，总量7.8mg，产率19％)。
    参考实施例12
将由参考实施例3得到的hG-CSF衍生物540mg溶于600ml50mM磷酸盐缓冲液中(pH7.3)，用5％NaOH调节至pH7.2置于冰浴上，加入参考实施例10得到的6-(3-羧丙氨基)-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪的N-羟基丁二酸亚胺酯8.7g，在4℃下反应48小时。
随后，通过加入0.5ml 105mg三(羟甲基)氨基甲烷的水溶液，获得反应液，将此反应液在4℃，以转速8000rpm离心40分钟，在600ml上清液中加入硫酸铵，使其终浓度为0.68M，再将此溶液加样上丁基-Toyopearl 650M(Tosoh公司)柱(5cm×18cm＝350ml)，该柱先用含有0.68M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡，流速350ml/小时。
用含有0.68M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)700ml以350ml/小时的流速洗柱后，再用在10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中配制的硫酸铵浓度从0.68M至0M逐渐降低的线性梯度液进行洗脱，洗脱液总量2800ml，流速350ml/小时。目标物在硫酸铵浓度0.39M至0.20M之间被洗脱出来。将800ml洗出液组分进行超过滤[截止分子量比率(Mr)10000∶YM10(Amicon有限公司)]并浓缩至100ml。再将该浓缩液加样上Sephacryl S-300(法玛西亚有限公司)柱(10cm×50cm＝3900ml)，先用PBS平衡，流速780ml/小时，然后使PBS以同样的流速通过。起始PBS流出后，化学修饰的hG-CSF多肽在大约在1750ml至2250ml之间被洗脱出，它是一个1到3个聚乙二醇分子组合的混合物(一型到三型，总量303mg，产率56％)。
    参考实施例13
6-(3-羧丙氨基)-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪的制备
将100g(8.33mmol)充分脱水的，平均分子量为12000的单甲氧基聚乙二醇(日本油脂有限公司)9.3g氧化锌(Wako纯化学工业有限公司)，83.5g分子筛(4A型)(Wako纯化学工业有限公司)溶于经干燥处理的苯中，在室温下，置于氩气流中过夜。随后除去其中的分子筛，而重新加入42g分子筛，将此溶液在同上条件下放置过夜。接着再除去其中的分子筛，将此溶液用一蒸馏装置，在氩气流中，在80℃下蒸馏，除去最初的50ml蒸馏液。然后用一个装有100g分子筛(4A型)的Soxhlet抽提器(用于土壤的)，将此溶液，在氩气流中，通过80℃回流加热过夜而进一步脱水。冷却后，向此反应液中加入36mg(4.0mmol)氰尿酰氯，并按上述同样条件通过回流加热脱水处理5天。其中使用的氰尿酰氯是用无水二乙醚重结晶过的。随后，反应液在室温下冷却，加入300ml无水的苯，将此溶液以转速3600rpm离心10分钟，弃去不溶解的物质。上清液在减压下浓缩至300ml，并被滴加到3000ml无水的二乙醚中形成沉淀。收集沉淀，用无水的二乙醚洗，然后减压去除溶剂，得到干燥的沉淀物。
在1000ml 0.1M硼酸盐缓冲液(pH10)中加入24g(12.0mmol)γ-氨基丁酸使溶解，然后置于冰浴上，将上述干燥的沉淀物100g加到此1000ml缓冲液中，在4℃下搅拌过夜。然后于室温下再搅拌6小时，将溶液用1N HCl调节至pH1.0，再用氯仿抽提。用无水硫酸钠干燥此氯仿相，并用过滤法分离，在减压下除去溶剂。将干燥的丙酮加到生成的白色固体物中，并使此固体溶解。丙酮溶液在减压下浓缩，在室温下放置，使其重结晶，得到90g粗制产品，其中含有约70％到80％目的化合物。将此粗制品溶于6000ml蒸馏水中，然后加样上阴离子交换树酯HPA-75(三菱化学公司)柱，先通过12000ml 2N氢化钠后再用蒸馏水平衡，通过用蒸馏水洗脱，收集含有主要成分的目标化合物的组分。将得到的溶液用1N HCl调节至pH1.0，然后用氯仿抽提。氯仿相用无水硫酸钠干燥，并用过滤法分离，减压下除去溶剂，得到43.6g高度纯化的目标化合物(产率43％)。
    参考实施例14
6-(3-羧丙氨基)-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪的N-羟基丁二酸亚胺酯的制备
将按照参考实施例1 3的方法合成的，并充分干燥的6-(3-羧丙氨基)-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪25g和N-羟基丁二酸亚胺240mg溶于400ml无水二氯甲烷中，置于冰浴上，于氩气流中，加入431mg DCC，搅拌30分钟。随后，回复到室温下，继续搅拌1.5小时，滤出不溶解的物质(DCU)，将滤液在减压下浓缩至160ml。将此浓缩液滴加到2400ml无水二乙醚中使产生沉淀，用无水二乙醚洗该沉淀后，减压下除去溶剂，得到21.4g(0.89mmol)目的化合物(产率89％)。
    参考实施例15
将含有由参考实施例3得到的hG-CSF衍生物504mg的560ml50mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)，用5％NaOH调节至pH7.3，置于冰浴上，加入由参考实施例14得到的6-(3-羧丙氨基)-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪的N-羟基丁二酸亚胺酯22.4g，在4℃下反应48小时。然后将通过加入0.5ml三(羟甲基)-氨基甲烷113mg的水溶液而得到反应液中加入硫酸铵，使其终浓度为0.7M，并加样上丁基-Toyopearl 650M(Tosoh公司)柱(5cm×25cm＝500ml)，该柱先用含0.7M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡，流速500ml/小时。先用含0.7M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)1500ml洗柱，流速500ml/小时，然后以在10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中配制的硫酸铵浓度从0.7M到0M逐渐降低的线性梯度液进行洗脱，洗脱液总量3000ml，流速500ml/小时。目标物在硫酸铵浓度0.55M至0.08M之间被洗脱出来。再向此洗出液组分中加入硫酸铵，使其终浓度为0.7M，并加样上丁基-Toyopearl 650M(Tosoh公司)柱(5cm×15cm＝300ml)，该柱先用含0.7M硫酸铵的10mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡，流速450ml/小时。用含有0.7M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)1500ml，以450ml/小时的流速洗柱后，用900ml 10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，以450ml/小时的流速进行洗脱。目的物在67ml至132ml之间被洗脱出来。将100ml洗出液组分加样上Sephadex G-25(法玛西亚有限公司)柱(5cm×50cm＝1000ml)，该柱先用PBS平衡，流速300ml/小时，然后，PBS以同样的流速通过。在起始PBS流出之后，化学修饰的hG-CSF多肽在大约3 50ml至500ml之间被洗脱出来，得到1到4个聚乙二醇分子组合的混合物(一型到四型，总量382mg，产率56％)。
    参考实施例16
4-硝基苯氧代羰基(邻-甲氧基聚乙二醇)的制备
将5.5g充分脱水的，平均分子量为10000的甲氧基聚乙二醇(日本油脂有限公司)(0.55mmol)溶解于27.5ml无水的二氯甲烷中，加入0.153ml三乙胺和222mg 4-硝基苯氯甲酸酯，在室温下，于氩气流中搅拌4小时。在搅拌过程中，通入加入三乙胺，使pH保持在7.5至8.5之间。在减压下将此反应液浓缩到20ml，然后滴加到300ml干燥的乙醚中，使之产生沉淀。用乙酸乙酯将该沉淀重结晶，通过减压干燥，得到4.8g目的化合物(0.48mmol)(产率87％)。
    参考实施例17
将含有由参考实施例3得到的hG-CSF衍生物40.5mg的45ml50mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)，用5％NaOH调节至pH8.7，置于冰浴上，加入由参考实施例16得到的4-硝基苯氧代羰基-(邻-甲氧基聚乙二醇)4.3g，在4℃下使它们反应3天，得到反应液。向此反应液内加入硫酸铵，使其终浓度为0.7M，将此反应液加样上丁基-Toyopearl650M(Tosoh公司)柱(2.5cm×12cm＝60ml)，该柱先用含有0.7M硫酸铵的10mM  Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡，流速60ml/小时。用180ml含有0.7M硫酸铵的10mM Tris-HCl缓冲液，以60ml/小时的流速洗柱后，以一个在10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中配制的，硫酸铵浓度从0.7M至0M逐渐降低的线性梯度液进行洗脱，洗脱液总量360ml，流速60ml/小时。
随后，对剩余未被洗脱出的部分用180ml 10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)再洗脱。目的物在上述硫酸铵0.4M至0M的浓度中被洗脱出来。将洗出液组分210ml进行超滤[截止分子量比率(Mr)10000∶YM10(Amicon有限公司)]并浓缩至30ml。将该浓缩液加样上Sephacryl S-300(法玛西亚有限公司)柱(5cm×51cm＝1000ml)，先用PBS，以200ml/小时的流速平衡，然后使PBS以同样的流速通过。
在起始PBS流出后，(三型)化学修饰的hG-CSF衍生物(其中有3分子聚乙二醇羧酸与1分子hG-CSF结合)在大约285ml至305ml之间被洗脱出来，(二型)化学修饰的hG-CSF衍生物(其中有2分子聚乙二醇羧酸与之结合)在大约325ml至345ml之间被洗脱出来，(一型)化学修饰的hG-CSF衍生物(其中有1分子聚乙二醇羧酸与之结合)在大约365ml至385ml之间被洗脱出来，得量分别6.2mg(产率10.9％)，6.8mg(产率11.9％)，和5.0mg(产率8.8％)。
    参考实施例18
6-(1-氨丙氧羰基氧-4’-硝基苯)-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪的制备
将120mg(1.6mmol)3-氨基-1-丙醇溶于200ml 0.1M硼酸盐缓冲液(pH10)中，置于冰浴上，加入8g(0.8mmol)6-氯-2，4-双(邻-甲氧基聚乙二醇)-S-三嗪(SEIKAGAKU公司)，在4℃下搅拌过夜。用2N HCl将此反应液调节至pH1.0，再用氯仿抽提，氯仿相先用2N HCl洗2次，然后用无水硫酸钠干燥后过滤。减压下除去溶剂，将生成的固体加入无水丙酮，使固体溶解，将该丙酮溶液在减压下浓缩，置于室温下，聚乙二醇衍生物被重结晶出来，得到结晶物5.5g，(产率69％)。
接着，将经充分干燥的聚乙二醇衍生物溶于26.5ml无水二氯甲烷中，加入0.147ml三乙胺，再加入214mg(1.06mmol)4-硝基苯氯甲酸酯，于4℃下搅拌4小时。然后将此反应液在减压下浓缩至20ml，再滴加到300ml无水二乙醚中，使之产生沉淀物，用无水二乙醚洗沉淀物，减压下除去溶剂后，再用无水乙酸乙酯重结晶，在减压下使之干燥，得到4.6g(0.46mmol)目的化合物(产率87％)。
    参考实施例19
将含有由参考实施例3得到的hG-CSF衍生物29.5mg的6.5ml50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)，加入287mg活化的聚乙二醇M-SCM-20000(Shearwater聚合物公司)，反应在4℃下进行6小时，然后再加入35μl 50mg/ml的三(羟甲基)-氨基甲烷，得到反应液。将该反应液加样上Sephacryl S-300(法玛西亚有限公司)柱(2.5cm×45cm＝220ml)，先用PBS，以44ml/小时的流速平衡，然后使PBS以同样的流速通过。
起始PBS流出后，(二型)化学修饰的hG-CSF多肽(其中有2分子聚乙二醇羧酸被结合)在大约96ml至104ml之间被洗脱出来，得到3.8mg二型多肽(产率13.0％)。
    参考实施例20
将含有由参考实施例3得到的hG-CSF衍生物28.8mg的6.7ml50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)，加入98mg活化的聚乙二醇M-SSPA-20000(Shearwater聚合物公司)，反应在4℃下进行24小时，然后再加入30μl 40mg/ml的三(羟甲基)氨基甲烷，得到反应液。将该反应液加样上Sephacryl S-300(法玛西亚有限公司)柱(2.5cm×45cm＝220ml)，先用PBS，以44ml/小时流速平衡，然后使PBS以同样的流速通过。
起始PBS流出后，(三型)化学修饰的hG-CSF多肽(其中有3分子聚乙二醇羧酸被结合)在大约78ml至98ml之间被洗脱出，得到该三型多肽2.0mg(产率6.6％)。
产业利用
本发明可以提供一种化学修饰的多肽，其中在具有hG-CSF活性的一个多肽分子中，至少有一个氨基、羧基、巯基和胍基被化学修饰，本发明还可以提供一种含有该修饰多肽极好的血小板生成促进剂。
                         序列表
SEQ ID NO：1
序列长度：174个氨基酸
序列类型：氨基酸
链股数：单股
链形状：直链
分子类型：蛋白质
序列描述：Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1               5                   10                  15Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
            20                  25                  30Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
        35                  40                  45Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
    50                  55                  60Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
65                  70                  75Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile80                  85                  90                  95Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
            100                 105                 110Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
        115                 120                 125Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
    130                 135                 140Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145                 150                 155Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro160                 165                 170

Claims (14)

1.化学修饰的多肽在制备用于治疗血小板数量减少的病人的药物组合物中的应用，所述多肽具有人粒性白细胞集落刺激因子活性，包含SEQ ID No：1的氨基酸序列，该氨基酸序列的一部分或该序列的部分氨基酸被其它氨基酸替代的氨基酸序列，多肽分子中的至少一个选自氨基、羧基、巯基或胍基的基团被化学修饰剂化学修饰，所述化学修饰剂是聚二醇衍生物或苯乙烯-马来酸共聚体。
2.根据权利要求1所述的应用，其中聚二醇衍生物是聚乙二醇衍生物、聚丙二醇衍生物或聚乙二醇-聚丙二醇共聚体的衍生物。
3.根据权利要求1所述的应用，其中聚二醇衍生物具有下式：
    R1-(M)n-X-R2                       (I)
其中R1代表烷基或烷酰基，M代表式：-OCH2CH2-，-OCH2CH2CH2-或-(OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s-，其中r和s是任意可变的正整数，它们可以相同或不同；n是任意可变的正整数；X代表单键、O、NH或S；R2代表下式
Figure C9519271700021
其中R3代表OH、卤素或下式：
           -Xa-(Ma)na-R1a
其中Xa、Ma、R1a和na分别与上述X、M、R1和n相同，而Y代表卤素或下式：
           -Z-(CH2)p-(O)m-W
其中Z代表O、S或NH；W代表羧基，其活性衍生物，或下式：
Figure C9519271700022
其中R4代表烷基；Hal代表卤素，p是1到6的整数；m是数值0或1，或
              -(CO)ma-(CH2)t-Wa，
其中Wa和ma分别与上述W和m相同，t是从0到6的整数，或其中Hala，pa和R4a分别与上述Hal、p和R4相同，苯乙烯-马来酸共聚体的衍生物具有式(II)：
其中u和v是任意可变的正整数，它们可以相同或不同；R5代表氢原子或烷基。
4.根据权利要求1所述的应用，其中聚二醇衍生物具有式(III)：
            R1b-(Mb)nb-NH2                (III)
其中Mb、R1b和nb分别与上述M、R1和n相同。
5.根据权利要求1所述的应用，其中聚二醇衍生物具有式(IV)：
Figure C9519271700033
其中Mc、R1c和nc分别与上述M、R1和n相同，具有式(V)的苯乙烯-马来酸共聚体(V)：
Figure C9519271700041
其中R5a、ua和va分别与上述的R5、u和v相同，Q和R中的一个代表羧基，而另一个代表下式：
Figure C9519271700042
其中pb同上述p。
6.根据权利要求1所述的应用，其中聚二醇衍生物具有式(VI)：
Figure C9519271700043
其中q是数值1或2，而Md、R1d和nd分别与上述M、R1和n相同。
7.血小板生成促进剂在制备药物中的应用，所述血小板生成促进剂含有化学修饰的多肽，所述多肽具有人粒性白细胞集落刺激因子活性，包含SEQ ID No：1的氨基酸序列，该氨基酸序列的一部分或该序列的部分氨基酸被其它氨基酸替代的氨基酸序列，在所述多肽分子中，至少有一个氨基与下述式(Ia)表示的基团结合：
                R1-(OCH2CH2)n-X-R2a-                (Ia)
其中R1代表烷基或烷酰基，n是任意可变的正整数；X代表单键、O、NH或S；而R2a代表下式：
Figure C9519271700051
其中R3a代表OH，卤素或下式：
            -Xa-(Ma)na-R1a
其中Xa、R1a和na分别与上述X、R1和n相同，Ma代表下式：
-OCH2CH2-、-OCH2CH2CH2-或-(OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s-，
其中，r和s是任意可变的正整数，可以相同或不同，而Ya代表单键或下式：
             -Z-(CH2)p-(O)m-CO-
其中Z代表O、S或NH；p是从1到6的整数；m是数值0或1，或下式
             -(CO)ma-(CH2)t-CO-
其中ma与上述m相同，t是从0到6的整数。
8.一种用于治疗血小板数目降低的患者的组合物，其在药用剂量形式中含有在权利要求1、2、3、4、5、6或7中应用的化学修饰的多肽以及药用载体。
9.一种化学修饰的多肽，所述多肽具有人粒性白细胞集落刺激因子活性，包含SEQ ID No：1的氨基酸序列，该氨基酸序列的一部分或该序列的部分氨基酸被其它氨基酸替代的氨基酸序列，所述多肽中至少一个氨基被式(Ib)基团所取代：
其中R1代表烷基或烷酰基；M代表下式：-OCH2CH2-、-OCH2CH2CH2-或-(OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s-其中r和s是任意可变的正整数，它们可以相同或不同，n是任意可变的正整数；X代表单键、O、NH或S；R3b代表OH、卤素，或下式
                 -Xa-(Ma)na-R1a
其中Xa、Ma、R1a和na分别与所述X、M、R1和n相同；Z代表O、S或NH；p是从1到6的整数。
10.一种血小板生成促进剂，它含有化学修饰的多肽，所述多肽具有人粒性白细胞集落刺激因子活性，包含SEQ ID No：1的氨基酸序列，该氨基酸序列的一部分或该序列的部分氨基酸被其它氨基酸替代的氨基酸序列，所述多肽分子中的至少一个选自羧基、巯基和胍基中的基团被化学修饰剂化学修饰，所述化学修饰剂是聚二醇衍生物或苯乙烯-马来酸共聚体。
11.根据权利要求10的血小板生成促进剂，其中聚二醇衍生物是聚乙二醇衍生物、聚丙二醇衍生物或聚乙二醇-聚丙二醇共聚体的衍生物。
12.根据权利要求10的血小板生成促进剂，其中聚二醇衍生物具有式(III)：
         R1b-(Mb)nb-NH2                  (III)其中Mb、R1b和nb分别与上述M、R1和n相同。
13.根据权利要求10的血小板生成促进剂，其中聚二醇衍生物具有式(IV)：
Figure C9519271700061
其中Mc、R1c和nc分别与上述M、R1和n相同，具有式(V)的苯乙烯-马来酸共聚体(V)：
Figure C9519271700071
其中R5a、ua和va分别与上述的R5、u和v相同，Q和R中的一个代表羧基，而另一个代表下式：
其中pb同上述p。
14.根据权利要求10的血小板生成促进剂，其中聚二醇衍生物具有式(VI)：
其中q是数值1或2，而Md、R1d和nd分别与上述M、R1和n相同。
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