WO1995023165A1 - Accelerateur de croissance des thrombocytes - Google Patents

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WO1995023165A1
WO1995023165A1 PCT/JP1995/000266 JP9500266W WO9523165A1 WO 1995023165 A1 WO1995023165 A1 WO 1995023165A1 JP 9500266 W JP9500266 W JP 9500266W WO 9523165 A1 WO9523165 A1 WO 9523165A1
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polypeptide
csf
derivative
formula
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PCT/JP1995/000266
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Motoo Yamasaki
Masami Okabe
Toshiyuki Suzawa
Ken Kobayashi
Kumiko Maruyama
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention provides at least one amino group, carboxy group, mercapto group or guanidino group in the molecule of a polypeptide having human granulocyte colony stimulating factor (hereinafter abbreviated as hG-CSF) activity.
  • hG-CSF human granulocyte colony stimulating factor
  • a chemically modified hG-CSF polypeptide obtained by chemical modification with a chemical modifying agent, a platelet growth promoter comprising the polypeptide, a patient with reduced platelets comprising administering an effective amount of the polypeptide
  • the use of said polypeptide for the manufacture of a pharmacological composition effective for the treatment of patients with reduced platelets and a pharmacologically acceptable dosage form together with a pharmacologically acceptable carrier.
  • Substances having a platelet growth promoting action include interleukin 6 [F. Takatsuki et al., Cancer Research, 50, 2885-2890 (1990)], leukemia inhibitory factor [D. Metcalf et al., Blood, 76, 50-56 (1990) )], Stem Cell Factor [P. Hunt et al., Blood, 80, 904-911 (1992)], Macrophage colony stimulating factor (M-CSF; Japanese Patent Publication No. 6-11705) And thrombopoetin [de Sauvage et al., Nature, 369, 533 (1994)] and the like.
  • interleukin 6 F. Takatsuki et al., Cancer Research, 50, 2885-2890 (1990)
  • leukemia inhibitory factor D. Metcalf et al., Blood, 76, 50-56 (1990)
  • Stem Cell Factor P. Hunt et al., Blood, 80, 904-911 (1992)
  • hG-C and SF are one of the polypeptides essential for proliferating and differentiating hematopoietic stem cells and forming various blood cells, and have the effect of mainly promoting the increase of granulocytes, especially neutrophils. It is known to have.
  • Polypeptides obtained by chemically modifying groups in a polypeptide having hG-CSF activity with a chemical modifying agent include at least one amino group in the molecule of the polypeptide having hG-CSF activity in polyethylene glycol.
  • Derivatively modified hG— CSF is known (JP-A-11-sisoowogozosgsz JP-A-5-32559). It is not known that these chemically modified hG-CSFs have the effect of promoting platelet proliferation.
  • the present invention provides a polypeptide in which at least one of an amino, a carboxylic acid group, a mercapto group and a guanidino group in a molecule of a polypeptide having hG-CSF activity is chemically modified, and the polypeptide comprising the polypeptide.
  • a method for treating a patient with decreased platelets comprising administering an effective amount of the polypeptide, and producing a pharmacological composition effective for the treatment of patients with decreased platelets
  • Use of the polypeptide for the preparation of a pharmaceutically acceptable carrier and an effective amount of the polypeptide in a pharmacologically acceptable dosage form together with a pharmacologically acceptable carrier for the treatment of patients with reduced platelets About things.
  • At least one amino group, carboxy group, mercapto group or guanidino group in the molecule of a hG-CSF-active polypeptide is chemically converted to a polyalkylene glycol derivative or a styrene-maleic acid copolymer derivative.
  • Modified polypeptide, platelet growth promoter containing the polypeptide, method for treating a patient with decreased platelet comprising administering an effective amount of the polypeptide, treatment of a patient with decreased platelet Of the polypeptide for the manufacture of a pharmacologically effective pharmaceutical composition and platelets comprising an effective amount of the polypeptide in a pharmacologically acceptable dosage form together with a pharmacologically acceptable carrier And a composition for the treatment of patients with reduced blood pressure.
  • examples of the polyalkylene glycol derivative include a polyethylene glycol derivative, a polypropylene glycol derivative, and a derivative of a polyethylene glycol-polypropylene glycol copolymer.
  • the chemical modifier for at least one of an amino group, a carboxy group, a mercapto group or a guanidino group is described in more detail.
  • R 1 represents an alkyl group or an alkanoyl group
  • M represents —CH 2 CH 2 —, — OCH 2 CH 2 CH 2 — or — (OCH 2 CH 2 ) r- ( ⁇ CH 2 CH 2 CH 2 ) S-
  • n an arbitrarily variable positive integer
  • X represents a single bond
  • ⁇ NH or S
  • R 3 is OH, halogen or one X a — (M a ) na -R 1a
  • Z represents 0, S or NH
  • W represents a carboxy group or a reactive derivative thereof
  • R 4 represents an alkyl group, Ha represents a halogen), p represents an integer of 1 to 6, and m represents 0 or 1.
  • polyalkylene glycol derivative represented by represents a ⁇ , or formula (II)
  • R 5 represents a hydrogen atom or an alkyl group
  • M c , R le and nc represent the same meanings as M, R 1 and n respectively
  • a polyalkylene glycol derivative represented by the following formula:
  • R 5e , ua and va each have the same meaning as R 5 , u and v above, one of Q and R represents a carboxy group, and the other is
  • the alkyl group represented by R 1 , R 4 and R 5 is a linear or branched one having 1 to 18 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, heptyl, Isopuchiru, sec- heptyl, tert- butyl, pentyl, isopentyl, hexyl, cyclohexyl isobutyl, heptyl, Okuchiru, Isookuchiru, decyl, dodecyl, tetradecyl, to Kisadeshiru, Okutadeshiru and the like, represented by R 1
  • the alkanoyl group is a straight-chain or branched one having 1 to 18 carbon atoms, such as formyl, acetyl, propionyl, butyryl, nokrelyl, bivaloyl, pentanoyl, la
  • n, r, s, u, and v are 1 to 1, ⁇ ⁇ ⁇ , especially for ⁇ , 7 to 500, and for r, s, u, and v 1 to 200 is preferred.
  • the molecular weight of the chemical modifying group of the present invention is in the range of 500 to 100,000, preferably in the range of 1,000 to 40,000. is there.
  • any polypeptide having hG-CSF activity can be used, but preferably, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • a polypeptide containing an amino acid sequence of a part of the sequence or an amino acid sequence in which a part of the amino acid is substituted with another amino acid [Nature, 319 ⁇ 415 (1986); -267292, JP-A-63-299, WO 87/0111 32].
  • Table 1 shows specific examples of polypeptides (hG-CSF derivatives) containing an amino acid sequence in which part of the amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been replaced with another amino acid.
  • Chemical modifiers such as polyethylene glycol derivatives, polypropylene glycol derivatives, polyalkylene glycol derivatives such as poly (ethylene glycol) -polypropylene glycol copolymer derivatives, or styrene-maleic acid copolymer derivatives, and amino groups
  • a polypeptide having a carboxy group, a mercapto group or a guanidyl group hG-CSF derivative
  • a known method for example, BIO INDUSTRY_5, 499-505 (1988), JP-A-64-58992, 1 9 9 5 73 etc.
  • an equivalent method can be used o
  • the platelet growth promoting agent containing the chemically modified polypeptide having hG-CSF activity produced by the above-mentioned method include: at least one amino group in hG-CSF; Modified polypeptides obtained by bonding groups represented by the following formula (Ia) are exemplified.
  • R 1 represents an alkyl or alkanoyl group
  • n represents an optionally variable positive integer
  • X represents a single bond
  • ⁇ NH or S
  • R 2a represents
  • R 3a is OH, halogen or 1 X a — (CH 2 CH 20 ) na -R 1a
  • Y a is a single bond, or one Z-(CH 2 ) p- (0) m -CO-
  • the present invention can provide a novel chemically-modified hG-CSF or hG-CSF derivative.
  • novel chemically modified hG-CSF examples include modified polypeptides obtained by bonding a group represented by the following formula (lb) to at least one amino group in hG-CSF. (ib) 0-CO-
  • R 1 represents an alkyl group or an alkanoyl group
  • M is
  • n is an arbitrarily variable positive integer
  • X is a single bond
  • ⁇ NH or S
  • R 3b has the same meaning as R 3a
  • Z represents 0, S or NH
  • p represents an integer of 1 to 6 ⁇ .
  • Chemically modified hG-CSF and chemically modified hG-CSF derivatives include 1 to 5 molecules of polyethylene glycol derivative, polypropylene glycol derivative, polyethylene glycol-polypropylene glycol copolymer derivative, or styrene-maleic acid copolymer derivative. I do. Therefore, the chemically modified hG-CSF and the chemically modified hG-CSF derivative are used as a mixture of 1 to 5 molecule conjugates, or 1 to 5 molecule conjugates are used separately.
  • This chemically modified hG-CSF and chemically modified hG-CSF derivative can be separated by ion-exchange chromatography, gel filtration chromatography, reverse-phase chromatography, or the like used for separation of normal long-chain polypeptides.
  • Various methods such as hydrophobic chromatography and ammonium sulfate fractionation can be applied mutatis mutandis.
  • the degree of chemical modification was determined by following the change in mobility of chemically modified hG-CSF using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Confirmed by
  • the amount of protein in the present invention is measured by the following experimental method.
  • the protein mass is measured by the method of Lowry, O.H., et., Journal 'Ob' Nokological • Chemistry (J. Biol, Chem.), 193 ⁇ 265 (1951)].
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed according to the method of Remli [UKLaemmli: Nature, 227 ⁇ 680 (1970)], and the proteins separated on the gel were stained with Coomassie Priliant Blue. After that, determine the protein content by measuring with a chromatoscanner (CS-930 Shimadzu Corporation).
  • Test Example 1 G-CSF activity of chemically modified hG-CSF and chemically modified hG-CSF derivative and growth promotion effect on mouse leukemia cell NFS60
  • Test example 2 Recovery-stimulating effect on thrombocytopenia in whole body irradiated mice
  • mice 5 male BALB / c mice (10 weeks old) were used per group.
  • male BALBZc mice (6 weeks old) were used.
  • Rx whole body irradiation
  • SPF Pasjin's-Free
  • the chemically modified hG-CSF derivative and the chemically modified hG-CSF derivative shown in Tables 3 to 5 were each dissolved in a physiological saline solution.
  • the chemically modified hG-CSF derivative was used. (Tri form) solution was applied once a day after Rx, or twice a day after Rx and on the 5th day.
  • chemically modified 0 ⁇ 33 derivative solution was subcutaneously administered 2 ml once per mouse once a day after 13 ⁇ 4.
  • mice showed a marked decrease in platelet count, with a low Rx on days 8-9, followed by a gradual increase in platelet count. Did not recover to the same platelet count.
  • mice treated with chemically modified hG-CSF and chemically modified hG-CSF derivatives the decrease in platelet count was suppressed, and a marked increase in platelet count was observed after 8-9 days. By ⁇ 12 days, the platelet count had completely recovered to the same platelet count as before irradiation. Similar effects were observed in the groups administered on the day after Rx and on day 5.
  • Test Example 3 Effect of anticancer drug administration on recovery of thrombocytopenia
  • mice Male BALBZc mice (9 weeks old) were intraperitoneally administered with 10-mg / kg of an anticancer drug 5-fluorouracil (5-FU, manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) to 5 mice per group.
  • the solution of the chemically modified hG-CSF (Tri form) obtained in Reference Example 4 obtained in Reference Example 4 in a physiological saline solution was administered subcutaneously once a day to each mouse at a dose of 5 ⁇ gZ0.2 ml per mouse. Blood was collected from the fundus vein of the mouse over time, and the platelet count was measured using an automatic hemocytometer. Table 6 shows the results. 6 Table
  • the relative value (%) is expressed as follows.
  • mice After male BALB / c mice (8 weeks old) I37 C s radiation source 4 mice per group (RI-4 3 3, Toshiba) was Rx to 1 O Gy per mouse, S PF habitat facilities chestnut - Nrakku Reared within.
  • 2 x 10 6 bone marrow cells non-nylon wool non-adherent cells
  • the chemically modified hG-CSF (Tri-form) obtained in Reference Example 4 was dissolved in a saline solution once per mouse 10 g gZO. 2m 1, 20 g / 0.2 ml or 40 g 0.2 ml subcutaneously. Blood was collected from the fundus vein of the mouse over time, and the platelet count was measured with an automatic hemocytometer. The results are shown in Table 7. Table 7
  • mice All 10 Gy whole body irradiated mice died within 2 weeks with severe thrombocytopenia. No bone marrow cell transplanted mice died, but platelet depletion continued for more than two weeks. In bone marrow transplanted mice to which chemically modified hG-CSF was administered, the effect of promoting platelet recovery was seen after day 11, depending on the dose. Has recovered.
  • Test example 5 Acute toxicity test
  • cytokines low molecular weight platelet growth promoters
  • Other cytokines include interleukin 3, interleukin 6, leukemia inhibitory factor, stem cell factor. Macrophage 'colony stimulating factor, thrombopoietin, and the like.
  • Examples of the low-molecular platelet growth promoter include conagenin, Y25510, 2-pyranone derivatives, FK565, and the like.
  • the chemically modified hG-CSF or chemically modified hG-CSF derivative can be used as it is or in various pharmaceutical forms.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced by uniformly mixing, as an active ingredient, an effective amount of a chemically modified hG-CSF or a chemically modified hG-CSF derivative with a pharmaceutically acceptable carrier. Desirably, these pharmaceutical compositions are in unit dosage form suitable for administration by injection.
  • An injection can be prepared as a liquid preparation using chemically modified hG-CSF or a chemically modified hG-CSF derivative and a carrier comprising distilled water, a salt solution, a glucose solution, or a mixture of a salt solution and a glucose solution. At this time, it is prepared as a solution, a suspending agent or a dispersing agent using an appropriate auxiliary according to a conventional method. Further, the liquid preparation can be freeze-dried to prepare a freeze-dried preparation.
  • the freeze-drying conditions are not particularly limited, but usually freeze at 150 ° C or less for 1 to 5 hours, and shelf temperature—20 ° C to 0 ° C, vacuum at 50 to 150 mTorr, 24 to Dry for 48 hours, then at shelf temperature of 10 to 30 ° C and vacuum of 50 to 100 mTorr for 16 to 24 hours to obtain a freeze-dried product.
  • the platelet growth promoter of the present invention can contain various ordinary pharmaceutical carriers, excipients, diluents, stabilizers, adsorption inhibitors and the like.
  • the dose and frequency of administration of the platelet growth promoter of the present invention are determined according to the dosage form, the age and weight of the patient, the disease to be treated and the condition of the patient. l. Chemically modified hG—C of 511 ⁇ 2, preferably 25-500 ⁇ 8 The SF, or chemically modified h G-CS F derivative-containing steel ⁇ as c administration methods for administering one week question per 1-7 times, intravenous or subcutaneous injection or the like can remain river.
  • the platelet growth promoting agent of the present invention can further be used as a locus or a drop.
  • Injection II having the following composition was prepared by the following method.
  • An injection having the following composition was prepared by the following method.
  • Injection having the following composition was prepared by the following method.
  • 0.7-0M ammonium sulfate was passed through the system at a flow rate of 18 Oml and 3 Oml Zhr in a linear gradient to elute.
  • the target eluted from 0.47M ammonium sulfate to 0.16M.
  • Ammonium sulfate was added to the eluted fraction to a final concentration of 0.7 M, and butyltoyopearl 6.5 M (Tokyo Sodium) filled with 10 mM Tris-HCl buffer-0.7 M ammonium sulfate (pH 7.5) was added.
  • the eluted fraction 20 Om 1 was subjected to ultrafiltration [molecular weight fraction 10,000: YM 10 (manufactured by Amicon)] and concentrated to 6.5 m 1.
  • HG having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 The first threonine of CSF is alanine, the third leucine is threonine, the fourth glycine is tyrosine, the fifth proline is arginine, and the 17th is An hG-CSF derivative (Table 1, compound k) in which cystine was replaced with serine was obtained as follows. Escherichia coli strain W3110 (Escherichia coli ECfBD28 FERM BP-1479) carrying plasmid pCfBD28 containing DNA coding for the above hG-CSF derivative was transformed into LG medium (10 g of bactotryptone, yeast extract 5).
  • LG medium 10 g of bactotryptone, yeast extract 5
  • 3 ⁇ -indoleacrylic acid (3 ⁇ -indoleacrylic acid) acid (hereinafter abbreviated as IAA) was added at 10 g / m 1, and the culture was further continued for 2 to 12 hours.
  • the culture was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to collect the cells, and the cells were washed with 30 mM sodium chloride and 30 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5).
  • the washed cells were suspended in 30 ml of the above buffer solution, and sonicated at 0 for 10 minutes (SONIFIER CELL DISRUPTOR 2 from BRANSON SONIC POWER COMPANY). 00, OUTPUT C0NTR0L2)
  • the sonicated product was centrifuged at 9000 rpm for 30 minutes to obtain a cell residue.
  • the hG-CSF derivative was extracted, purified, solubilized, and regenerated from this cell residue according to the method of Marston et al. [FAO Marston et al .: Bio'Technology 1 (BI0 / TECHN0L0GY), 800 (1984)].
  • the column was passed through at a flow rate of 00 ml and 10 OmlZhr for elution.
  • the desired product was eluted from ammonium sulfate OmM to 25 OmM. Ultrafiltration of 250 ml of eluted fraction
  • a chemically modified hG-CSF derivative (Tri-form) in which three molecules of a polyethylene glycol derivative are bonded to one molecule of hG-CSF, and a polyethylene glycol derivative around 420 to 450 ml
  • a chemically modified hG-CSF derivative (Di-form) with two molecules of carboxylic acid bonded to a chemically modified hG-CSF derivative (Mono) with one molecule of a polyethylene glycol derivative carboxylic acid bonded near 50 Oml to 530 m1 Was eluted, and 2.1 mg (7% yield), 1.5 mg (5% yield) and 1.5 mg (5% yield) were obtained, respectively.
  • the purity of the Mono form, Di form and Tri form was all 90% or more. Reference example 5.
  • reaction solution was centrifuged at 8000 rpm at 4 ° C for 40 minutes, and ammonium sulfate was added to the supernatant 37 Om1 to a final concentration of 0.68 M.
  • Anmoniumu (manufactured by Toso one company) charge has been butyl Toyopearl 650 M in (pH7. 5) (5 cmx 6.
  • the chemically modified hG-CSF polypeptide was eluted at around 200 ml to 380 ml from the beginning of the flow of PBS, and was a mixture of conjugates (Mono to Tetra) of 1 to 4 molecules of polyethylene glycol derivative (Yield) 1 58 mg, yield 78%).
  • ammonium sulfate was passed through a 1 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) system with a linear gradient at a total volume of 240 ml at a flow rate of 40 ml / hr for elution. .
  • the desired product eluted between 0.33M ammonium sulfate and 0.05M.
  • the eluted fraction 90 ml was subjected to ultrafiltration [molecular weight fraction 10,000: YM10 (manufactured by Amicon)] and concentrated to 6 ml.
  • the chemically modified hG-CSF polypeptide is eluted from 1 Om to 120 m1 after starting to flow in PBS and is a mixture of conjugates of 1 to 4 molecules of polyethylene glycol derivative (1 ⁇ 0110 to 10-tra). (Yield 9.5018, Yield 23%).
  • the carboxylic acid (10 g, 1.Ommo 1) and N-hydroxysuccinimide (23 Omg) were dissolved in anhydrous methylene chloride (100 ml), and DCC4 (13 mg) was added in an argon stream under ice cooling, followed by stirring for 30 minutes. . Thereafter, the temperature was returned to room temperature, the mixture was stirred for 1.5 hours, insolubles (DCU) were filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to 40 ml. This was added dropwise to 600 ml of anhydrous getyl ether to form a precipitate. The precipitate was washed with anhydrous getyl ether, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain 7.7 g (0.77 mm 01) of the title compound. Yield 77%).
  • the chemically modified hG-CSF polypeptide was eluted from 11 Oml to about 145 ml after PBS was started to flow, and was a mixture of 1 to 3 molecules of polyethylene glycol derivative (M0n0 to Tri). Yield 7.8 mg, yield 19%).
  • reaction solution was centrifuged at 8000 rpm for 40 minutes at 4 ° C., and ammonium sulfate was added to the supernatant (60 Om1) so that the final concentration was 0.68 M, and 1 OmM Tris-HCl buffer was added. Liquid—0.68 M ammonium sulfate (p
  • the column was eluted at a flow rate of IZhr.
  • the target product was eluted from 0.39 M to 0.20 M ammonium sulfate.
  • the eluted fraction (800 ml) was subjected to ultrafiltration (molecular weight fraction: 10,000: YM10 (manufactured by Amicon)) and concentrated to 100 ml.
  • PB molecular weight fraction: 10,000: YM10 (manufactured by Amicon)
  • the acetone solution was concentrated under reduced pressure, and recrystallized by standing at room temperature to obtain 90 g of a crude product containing about 70 to 80 of the title compound.
  • This was dissolved in 600 ml of distilled water, and after passing through a 2N sodium hydroxide of 1200 ml in advance, 600 ml of anion exchange resin HPA-7 equilibrated with distilled water. 5 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) and eluted with distilled water to collect a fraction containing the title compound as a main component.
  • This was adjusted to pH 1.0 with 1N hydrochloric acid and extracted with black-mouthed form.
  • the dried form phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered off, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain 43.6 g of the highly pure title compound (yield: 43%).
  • 0.7-0M ammonium sulfate was passed through the system with a linear gradient at a flow rate of 300 Om1, 50 OmI Zhr in total to elute.
  • the desired product was eluted from 0.55M ammonium sulfate to 0.08M.
  • Add ammonium sulfate to the eluted fraction to a final concentration of 0.7M, and add 1 OmM Tris-HCl buffer-0.7 M ammonium sulfate (PH7.5) butyltoyopearl 6.5 OM (E. (Manufactured by USSR) (5 cm x 15 cm 300 m 1) at a flow rate of 450 m 1 Zhr.
  • the uneluted portion was eluted with 1 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) (18 Oml) at a flow rate of 60 ml 1 r.
  • the target product was eluted between 0.4 M and 0 M ammonium sulfate.
  • the eluted fraction 210 ml was subjected to ultrafiltration [molecular weight fraction 10,000: YM 10 (manufactured by Amicon)] and concentrated to 30 ml.
  • the concentrate was passed through Sephacryl S-300 [Pharmacia (5 cm ⁇ 51 cm2, 1,000 ml)] filled with PBS at a flow rate of 200 mlZhr, and then passed through the PBS at the same flow rate.
  • hG-CSF derivative (Tri form), in which three molecules of hG-CSF were bonded to three molecules of rubonic acid, a polyethylene glycol derivative, in the vicinity of 285 m1 to 305 m1, was added.
  • reaction solution was concentrated under reduced pressure to 20 ml, and dropped into 300 ml of dried getyl ether 300 ml to cause precipitation.
  • the precipitate was washed with dry getyl ether, the solvent was removed under reduced pressure, recrystallized from dried ethyl acetate, and dried under reduced pressure to obtain 4.6 g (0.46 mmol) of the title compound. Rate 8 1%).
  • Tri-form A chemically modified hG-CSF derivative (Tri-form) in which three molecules of the carboxylic acid were bound was dissolved, and 2. Omg (6.6% yield) of the Tri-form was obtained.
  • a chemically modified polypeptide in which at least one of amino, carboxy, mercapto or guanidino groups in the molecule of the polypeptide having hG-CSF activity is chemically modified.
  • An excellent platelet growth promoting agent containing the polypeptide can be provided.

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Description

明 細 書
血 小 板 増 殖 促 進 剤
技術分野
本発明は、 ヒト顆粒球コロニー刺激因子 （以下、 h G— C S Fと略記する） 活 性を有するポリペプチドの分子中のアミノ基、 カルボキシ基、 メルカプト基また はグァニジノ基の少なくとも 1個の基を化学修飾剤で化学修飾して得られる化学 修飾 h G— C S Fポリペプチドおよび該ポリペプチドを含有してなる血小板増殖 促進剤、 該ポリべプチドの有効量を投与することからなる血小板の減少した患者 の治療方法、 血小板の減少した患者の治療に有効な薬理学的組成物の製造のため の該ポリべプチドの使用および薬理学的に許容される担体と共に薬理的に許容さ れる投与形態にある有効量の該ポリべプチドからなる血小板の減少した患者の治 療のための組成物に関する。
背景技術
血小板増殖促進作用を有する物質としては、 インターロイキン 6 [F. Takatsuki ら、 Cancer Research, 50, 2885-2890 (1990) ] 、 白血病阻害因子 [D. Metcalfら、 Blood, 76, 50-56 (1990) ] 、 幹細胞因子（Stem Cel l Factor) [P. Hunt ら、 Bloo d, 80, 904-911 (1992)] 、 マクロファージコロニー刺激因子 （M— C S F ;特公 平 6— 1 1 7 0 5 ) 、 トロンボポェチン [de Sauvageら、 Nature, 369, 533 (19 94) ] 等が知られている。 また、 低分子の血小板増殖促進作用を有する物質と しては、 コナゲニン 〔日本癌学会総会 #2235 (1992) 〕 、 Y 2 5 5 1 0 〔日本薬 学会第 1 1 3年会 PB13-22 (1993) 〕 、 2 —ピラノン誘導体 〔特開平 5— 2 1 3 7 5 8〕 、 F K 5 6 5 (WO 9 3 / 2 3 0 6 6 ) 等が知られている。
h G— C ,S Fは、 造血幹細胞を増殖 ·分化させ、 種々の血球を形成させる際に 必須なポリペプチドの 1種で、 主として顆粒球、 なかでも好中球の増加を促進す る効果をもつことが知られている。
h G— C S F活性を有するポリぺプチド中の基を化学修飾剤で化学修飾したポ リペプチドとしては、 h G— C S F活性を有するポリぺプチドの分子中の少なく とも 1個のァミノ基をポリエチレングリコール誘導体で修飾した化学修飾 h G— CSFが知られている （特開平 1一 s i s o o wo g ozo s g s z 特開 平 5— 32559) 。 これらの化学修飾 h G— C S F力、 血小板の増殖を促進す る効 ¾を打することは知られていない。
発明の開示
本発明は、 h G— C S F活性を有するポリぺプチドの分子中のァミノ 、 力ル ボキシ基、 メルカプト基またはグァニジノ基の少なくとも 1個の基が化学修飾さ れたポリペプチド、 該ポリペプチドを含有してなる血小板増殖促進剂、 該ポリべ プチドの有効量を投与することからなる血小板の減少した患者の治療方法、 血小 板の減少した患者の治燎に有効な薬理学的組成物の製造のための該ポリぺプチド の使用および薬理学的に許容される担体と共に薬理的に許容される投与形態にあ る有効量の該ポリぺプチドからなる血小板の減少した患者の治療のための組成物 に関する。
詳しくは、 hG— CSF活性を有するボリペプチドの分子中のアミノ基、 カルボ キシ基、 メルカプト基またはグァニジノ基の少なくとも 1個の基が、 ポリアルキ レングリコール誘導体またはスチレンマレイン酸共重合体の誘導体で化学修飾さ れたポリべプチドおよび該ポリべプチドを含有してなる血小板増殖促進剤、 該ボ リベプチドの有効量を投与することからなる血小板の減少した患者の治療方法、 血小板の減少した患者の治療に有効な薬理学的組成物の製造のための該ポリぺプ チドの使用および薬理学的に許容される担体と共に薬理的に許容される投与形態 にある有効量の該ポリべプチドからなる血小板の減少した患者の治療のための組 成物に関する。
ここで、 ポリアルキレングリコール誘導体としてはポリエチレングリコール誘 導体、 ポリプロピレングリコール誘導体、 ポリエチレングリコールーボリプロピ レングリコール共重合体の誘導体等をあげることができる。
アミノ基、 カルボキシ基、 メルカプト基またはグァニジノ基の少なくとも 1個 の基の化学修飾剤をさらに詳しく述べると、 ァミノ基の化学修飾剤が式 （ I)
R1-( )N-X-R2 (ェ） {式中、 R1はアルキル基またはアルカノィル基を表し、 Mは 一〇CH2CH2— 、 — OCH2CH2CH2- または 一 (OCH2CH2)r - (〇CH2CH2CH2)S-
(式中、 rおよび sは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を表す） を 表し、 nは任意に変わりうる正の整数を表し、 Xは単結合、 〇、 NHまたは Sを 表し、 R2は
R3
~ N Y
〔式中、 R3 は OH、 ハロゲンまたは 一 Xa— (Ma)na-R1a
(式中、 Xa、 Me、 Rlaおよび n aはそれぞれ前記 X、 M、 R1および nと同 意義を表す） を表し、 Yはハロゲンまたは
-Z-(CH2)p-(0)m-W
[式中、 Zは 0， Sまたは NHを表し、 Wはカルボキシ基もしくはその反応性誘 導体または、
NH2 +-Har
II .
一 C-OR4
(式中、 R4 はアルキル基を表し、 Ha lはハロゲンを表す） を表し、 pは 1〜 6の整数を表し、 mは 0または 1を表す] を表す〕 、
— (∞)ma-(CH2) -Wa (式中、 および maは前記 Wおよび mと同意義であり、 tは 0〜6の整数を 表す） または
NH2 +.Hala- 一 (〇H2)pa— C一〇R4a
(式中、 Ha l e 、 p aおよび R "はそれぞれ前記 Ha 1、 pおよび R4 と同意 義を表す） を表す } で表されるポリアルキレングリコール誘導体、 または、 式 （ II)
(ID
Figure imgf000006_0001
(式中、 Uおよび Vは同一または異なつて任意に変わりうる正の整数を示し、
R5 は、 水素原子またはアルキル基を表す） で表されるスチレン一マレイン酸共 重合体であり、
力ルボキシ基の化学修飾剤が式（I 11)
Rlb-(Mb)nb~ NH2 (III)
(式中、 Mb 、 Rlbおよび n bはそれぞれ前記 M、 R1 および nと同意義を表す ) で表されるポリアルキレングリコール誘導体であり、
メルカプト基の化学修飾剤が式（IV)
〇
R1C-(MC /nc一 N、 (IV)
(式中、 Mc 、 Rleおよび n cはそれぞれ前記 M、 R1 および nと同意義を表す ) で表されるポリアルキレングリコール誘導体、 または、 式 （V)
Figure imgf000007_0001
〔式中、 R5e、 u aおよび vaはそれぞれ前記 R5 、 uおよび vと同意義を表し Qおよび Rの一方はカルボキシ基を表し、 他方は、
Figure imgf000007_0002
(式中、 p bは前記 pと同意義を表す） を表す〕 で表されるスチレン一マレイン 酸共重合体の誘導体であり、
グァニジノ基の化学修飾剤が式 (VI)
COCHO
[R (Md)nd- (VI)
Figure imgf000007_0003
(式中、 qは 1または 2を、 Md 、 Rldおよび n dはそれぞれ前記 M、 R1 およ び nと同意義を表す） で表されるポリアルキレングリコール誘導体である。
本発明に用いられる化学修飾基に関し、 R1 、 R4 および R5 で示されるアル キル基としては、 炭素数 1から 1 8の直鎖または分岐状のもの、 例えば、 メチル ， ェチル， プロピル， イソプロピル， プチル， イソプチル， s e c—プチル、 t e r t—ブチル， ペンチル， イソペンチル， へキシル， イソへキシル， ヘプチル , ォクチル， イソォクチル， デシル， ドデシル， テトラデシル， へキサデシル， ォクタデシル等があげられ、 R1 で示されるアルカノィル基は炭素数 1から 1 8 の直鎖または分岐状のもの、 例えば、 ホルミル， ァセチル， プロピオニル， プチ リル， ノくレリル， ビバロイル， ペンタノィル， ラウロイル， ミ リストイル， ノ、 °ル ミ トイル， ステアロイル等があげられ、 R3 、 Yおよび Ha 1で示されるハロゲ ンは、 塩素， 臭素， ヨウ素の各原子があげられ、 Wで示されるカルボキシ基の反 応性誘導体としては、 酸クロリ ド、 酸ブロミ ド等の酸ハラィ ド類、 p—ニトロフ ェニルエステル、 N—ォキシコハク酸イミ ド等の活性エステル類、 ^酸モノェチ ルエステル、 炭酸モノイソブチルエステル等との混合酸無水物類等があげられる 。 n, r， s, uおよび vで表される正の整数は、 1〜1， Ο ϋ Οであり、 とり わけ ηについては 7〜5 0 0力く、 r， s, uおよび vについては 1〜 2 0 0が好 ましい。 本発明の化学修飾基の分子量は、 5 0 0〜1 0 0， 0 0 0の範囲内であ り、 好ましくは 1 , 0 0 0〜4 0， 0 0 ϋの範陋內にあるものである。
本発明に使用する h G— C S F活性を有するポリぺプチドとして、 h G— C S F活性を有するポリべプチドならばいずれも用いることができるが、 好ましくは 、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列、 該配列の一部のアミノ酸配列、 または該 配列の一部のァミノ酸が別のァミノ酸で置換されたァミノ酸配列を含むポリぺプ チド 〔Nature， 319^ 415 (1986) 、 特開昭 63- 267292、 特開昭 63— 299、 WO 8 7/0 1 1 3 2〕 をあげることができる。 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 一部のァミノ酸が別のァミノ酸で置換されたァミノ酸配列を含むポリべプチド （ hG-CS F誘導体） の具体例を第 1表に示す。 第 1 表
N末ァミノ酸からの 各種 h G-C S F誘導体における置換ァミノ酸
Figure imgf000008_0001
* ：置換されていないアミノ酸 hG— CSF活性を有するポリべプチドの分子中にはァミノ基、 カルボキシ基 、 メルカプト基およびグァニジノ基が、 それぞれ通常複数存在するが、 hG— C S F活性を有するポリぺプチドの化学修飾を行う場合、 これらの基の少なくとも 1個の基が化学修飾されていればよい。
ポリエチレングリコ一ル誘導体、 ポリプロピレングリコール誘導体あるいはポ リエチレングリコール一ポリプロピレングリコ一ルの共重合体の誘導体等のポリ ァルキレングリコール誘導体またはスチレン—マレイン酸共重合体の誘導体等の 化学修飾剤とアミノ基、 カルボキシ基、 メルカプト基またはグァニジル基を有す るポリペプチド （hG— CSF誘導体） とを反応させることにより、 hG— CS F活性を有するポリぺプチドの化学修飾を行うことができる。
hG— CS F活性を有するポリべプチドの分子中のァミノ基、 カルボキシ基、 メルカプト基またはグァニジノ基とポリエチレングリコール誘導体またはポリプ ロピレングリコール誘導体とを反応させる方法としては、 公知の方法 〔例えば、 特開平 1— 3 1 64 0 0、 Biotech. Lett., R 559-564 (1992)、 BIO/TECHNOLOGY ， 8^ 343-346 (1990) 等〕 あるいはそれに準じた方法を用いることができる。 ポリエチレングリコールーポリプロピレングリコール共重合体の誘導体とを反 応させる方法としては、 公知の方法 〔例えば、 特開昭 5 9 - 5 9 6 2 9. 特開昭 6 0— 1 7 6 5 8 6、 WO 8 9/0 6 54 6、 E P 0 5 3 9 1 6 7A2等〕 ある いはそれに準じた方法を用いることができる。
また、 スチレン一マレイン酸共重合体の誘導体とを反応させる方法としては、 公知の方法 〔例えば、 BIO INDUSTRY_5, 499-505 (1988)、 特開昭 6 4 - 8 5 9 2 2、 特開平 1一 9 9 5 73等〕 あるいはそれに準じた方法を用いることができる o
上記の方法により製造される化学修飾された hG— CSF活性を有するポリぺ プチドを含有してなる血小板増殖促進剤の具体的な例としては、 h G— C S F中 の少なくとも 1個のアミノ基に下記式 （ I a) で表される基を結合してなる修飾 ポリべプチドが例示される。 R1一 (OCH2CH2)n - X - R2a - （ la )
{式中、 R1 はアルキル またはアルカノィル基を表し、 nは任意に変わりうる 正の整数を表し、 Xは単結合、 〇、 NHまたは Sを表し、 R2aは
Figure imgf000010_0001
〔式中 R3aは OH、 ハロゲンまたは 一 Xa— (CH2CH20)na-R1a
(式中 Xa、 Rleおよび n aはそれぞれ前記 X、 R1 および nと同意義を表す） を表し、
Y aは単結合、 または 一 Z - (CH2)p-(0)m-CO -
(式中、 Zは 0, Sまたは NHを表し、 pは 1〜6の整数を表し、 mは 0または 1を表す） を表す〕 または 一（CO)ma— (CH2)t- CO -
(式中、 maは前記 mと同意義を表し、 tは 0〜 6の整数を表す） を表す } 。 式 （I a) の各基の定義において、 アルキル基、 アルカノィル基、 ハロゲンお よび正の整数は、 前記式 （ I) の定義と同じである。
また、 本発明により新規の化学修飾された hG— CSFまたは hG— CSF誘 導体を提供することができる。
新規の化学修飾された h G— C S Fとしては、 h G— C S F中の少なくとも 1 個のアミノ基に下記式 （ l b ) で表される基を結合してなる修飾ポリペプチドが 例示される。 (ib)
Figure imgf000011_0001
0-CO -
{式中、 R1 はアルキル基またはアルカノィル基を表し、 Mは
— OCH2CH2- 、 一OCH2CH2CH2 - または 一 (OCH2CH2)r - (OCH2CH2CH2)s -
(式中、 rおよび sは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を表す） を 表し、 nは任意に変わりうる正の整数を表し、 Xは単結合、 ◦、 NHまたは Sを 表し、 R3bは R3aと同意義を表し、 Zは 0， Sまたは NHを表し、 pは 1〜6の 整数を表す } 。
化学修飾 hG— CSFおよび化学修飾 h G— C S F誘導体にはポリエチレング リコール誘導体、 ポリプロピレングリコール誘導体、 ポリエチレングリコール一 ポリプロピレングリコール共重合体の誘導体またはスチレン一マレイン酸共重合 体の誘導体が 1〜5分子結合する。 したがって、 本化学修飾 hG— CSFならび に本化学修飾 hG— CSF誘導体は 1〜5分子結合体の混合物で用いるか、 ある いは 1〜 5分子結合体をそれぞれ分離して用いる。 本化学修飾 h G— C S Fなら びに化学修飾 h G-CS F誘導体の分離には、 通常の長鎖ポリぺプチド等の分離 に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィー、 逆 相クロマトグラフィー、 疎水クロマトグラフィ一等の各種クロマトグラフィー、 硫安分画等の方法を準用することができる。
化学修飾の程度は遊離基の減少量をドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルァ ミ ドゲル電気泳動法を用いて、 化学修飾 hG— CSFの移動度の変化を追うこと により確認される。
本発明における蛋白質量の測定は、 以下に記載する実験方法によって測定する 実験方法 1
口一リーの方法 〔Lowry， O.H.， et .，ジャーナル 'ォブ 'ノくィォロジカル •ケミストリ一 （J. Biol, Chem. ), 193^ 265 (1951) 〕 により蛋白質量の測定 を行う。
実験方法 2
レムリの方法 〔U.K.Laemmli ： ネイチヤー（Nature), 227^ 680 (1970) 〕 によ り SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を行い、 該ゲル上に分離された蛋白 質をクマシ一プリリアントブルーで染色した後、 クロマトスキャナー （CS— 9 3 0 島津製作所） で測定することにより蛋白質量を求める。
次に、 化学修飾 h G-C S Fおよび化学修飾 h G-CS F誘導体の薬理活性に ついて試験例で説明する。
試験例 1. 化学修飾 h G― C S Fおよび化学修飾 h G-CS F誘導体の G— C S F活性およびマウス白血病細胞 NFS 6 0に対する増殖促進作用
後述する参考例 4、 6、 8、 9、 1 2、 1 5、 1 7、 1 9、 20および実施例 4で得られた化学修飾 G— C S Fおよび化学修飾 h G - C S F誘導体のマウス骨 髄細胞に対する G— CSF活性を、 岡部らの方法 [M.0kabe al., Blood, 75, 1788 (1990)]に従って測定した。 また、 NFS 6 0細胞 [K.Holmes ら、 Pro Nat 1. Acad. Sci. USA, 82, 6687 (1985)]に対する増殖促進活性を、 浅野らの方法 〔薬 理と治療、 19， 2767 (1991) 〕 に従って測定した。 その結果を第 2表に示した。
2 表
*2
1分子 hG-CSF
h G-CSF *1
化学修飾 増殖促進活性 （％)
への修飾化合物
(誘導体） 化合物 の結合分子数 骨髄細胞 NFS60細胞 参考例 3 な し 0 100 100
参考例 3 18 21
4 1 5 配列番号 1 4 19 参考例 3 4 12 配列番号 1 1 3 17 参考例 3 1 3 33
ク 1 4 1 1 ク 参考例 1 3 24
2 40 ク 1 61 ク 実施例 4 3 17 々 2 24
1 53
*1：使用した hG-CSFまたは hG-CSF誘導.体の凼来を表示
*2：参考例 3で取得した hG-CSF誘導体の活性を 100とし
たときの相対値 （％) で示した。 試験例 2. 放射線全身照射マウスの血小板減少に対する回復促進効果
第 3表および第 4表に示した試験においては、 雄性 BALB/cマウス （1 0 週令） 1群 5匹を用い、 第 5表に示した試験においては、 雄性 BALBZcマウ ス （ 6週令） 1群 4匹を用い、 これらマウスに 137C s放射線源 （R I— 433 , 東芝製） をマウス当たり 3 Gyを全身放射線照射 （以下、 Rxと略記する） し た後、 スぺシフアイ ド 'パソジヱン 'フリー （SPF) 飼育環境施設のクリーン ラック内で飼育した。 飲料水および餌は自由摂取させた。 無処理対照群として、 放射線を照射しないマウスを同様にして飼育した。
第 3表〜第 5表に示した化学修飾 hG— CSFおよび化学修飾 h G - C S F誘 導体をそれぞれ生理食塩水溶液に溶解し、 第 3表で示した試験においては、 化学 修飾 h G— C S F誘導体 (Tri体）溶液を R xの翌日に 1回、 または R xの翌日と 5日目に 2回、 第 4表および第 5表に示した試験においては、 化学修飾 hG— C 3 ?または化学修飾 0—じ3 ?誘導体溶液を1¾ の翌日に 1回、 マウス 1匹当 たり 1回 2 m l皮下に投与した。
経時的にマウス眼底^脈より採血し、 自動血球計数器 ( C C - 1 8 0 A, 束亚 医用電子製） で血小板数を測定した。 結果を第 3表〜第 5表に示した。 第 3 表 歸 1 *2
化学修飾 hG-CSF 平均血小板数 （％)
ί線
誘導体 の投与 0 11 13 20
日後 投与せず 100 95.7 37.7 53.5 59.5 80.6
1日目に投与 100 94.5 54.0 109.8 100.3 94.8
1、 5曰目に投与 100 100.1 40.2 118.6 101.3 105.1
*1 ：参考例 4の化学修飾 h G-C S F誘導体 (Tri体）
*2 ：全身放射線無処理対照群の平均血小板数の値
を 1 0 0とした時の相対値 （％) で示した。 第 4 表 投与化学修飾 平均血小板数 （96) *
hG-CSF (誘導体） 放射線 0 6 8 9 10 11
照射 12日後 投与せず 100 88.9 36.2 42.1 51.2 67.6 74.2 参考例 8 100 101 41.1 63.2 98.5 126 133 参考例 9 100 103 41.0 66.3 98.9 142 159 参考例 1 1 100 84.1 34.5 51.6 81.3 112 130 参考例 1 2 100 93.1 42.4 66.1 92.7 145 140
*：全身放射 ·線無処理対照群の平均血小板数の値
を 1 0 0とした時の相対値 （％) で示した。 第 5 表 投与化学修飾 平均血小板数 （％)*
hG-CSF (誘導体） 放射線 0 6 8 10 11
照射 12日後 投与せず 100 58.9 26.6 35.1 38.3 45.1 参考例 1 9 100 55.1 30.5 62.7 98.5 103.6 参考例 20 100 52.4 29.1 61.3 84.6 105.1
*：全身放射線無処理対照群の平均血小板数の値
を 1 00とした時の相対値 （％) で示した。
3 Gyの全身放射線照射マウスは著明な血小板数の減少がみられ、 Rxの 8〜 9日目で最低値となり、 その後、 徐々に血小板数は増加してきたが、 試験期間中 に放射線処理前と同じ血小板数にまで回復することはなかった。 しかし、 化学修 飾 hG— CSFおよび化学修飾 h G - C S F誘導体を投与したマウスでは、 血小 板数の減少が抑制され、 8〜9日目以降に著しい血小板数の増加が認められ、 1 1〜1 2日目には、 放射線処理前と同じ血小板数にまで完全に回復した。 Rxの の翌日と 5日目に投与した群でも同様の効果が認められた。
試験例 3. 抗癌剤投与による血小板減少に対する回復促進効果
雄性 BALBZcマウス （9週令） 1群 5匹に、 抗癌剤 5—フルォロウラシル (5 -FU, 協和醱酵工業社製） を 1 0 Omg/kg腹腔内に投与した。 5— F U投与翌日に参考例 4で得られた化学修飾 hG - CSF (Tr i体） を生理食塩 水溶液に溶解したものをマウス 1匹当たり 1回 5〃gZ0. 2m lを皮下に投与 した。 経時的にマウス眼底静脈より採血し、 自動血球計数器で血小板数を測定し た。 その結果を第 6表に示した。 6 表
*2
化学修飾 hG-CSF 平均血小板数 （％)
誘導体 の投与 5^FU 0
投与せず 100 31.2 27.1 39.1 60.4
1日目に投与 100 42.3 43.6 68.3 103.7
*1 ：参考例 4の化学修飾 h G-C S F誘導体 (Tri体）
*2 ： 5 -FU非投与群の平均血小板数の値を 1 00
とした時の相対値 （％) で示した。
5— FU投与群では、 投与 4日目より血小板数の減少がみられ、 5日目に最低 値となり、 9日目に投与前の数に回復した。 化学修飾 hG— CSF投与群では、 血小板の減少が抑制され、 6日目以降明確な回復促進効果が認められた。 7日目 曰 には、 投与前の血小板数にまで完全に回復した。 後 試験例 4. 骨髄移植時の血小板減少に対する回復促進効果
雄性 BALB/cマウス （ 8週令） 1群 4匹に I37C s放射線源 （R I— 4 3 3, 東芝製） をマウス当たり 1 O Gyを Rxした後、 S PF飼育環境施設のクリ —ンラック内で飼育した。 放射線照射翌日に同系のマウスの骨髄細胞 （ナイロン ウール非付着細胞） の 2 x 1 06 個を放射線マウスの静脈内に移植した。 約 2時 間経過後に、 参考例 4で得られた化学修飾 hG - CS F (Tr i体） を生理食塩 水溶液に溶解したものをマウス 1匹当たり 1回 1 0〃 gZO. 2m 1、 2 0 g /0. 2m 1または 4 0 gノ 0. 2 m 1皮下に投与した。 経時的にマウス眼底 静脈より採血し、 自動血球計数器で血小板数を測定した。 その結果を第 7表に示 した。 第 7 表
*フ
化 -CSF 平均血小板数 (%)
髄移ォ iff
Figure imgf000017_0001
放射線 n
の投与量 g) 照射 0 7 11 12 13
15日後 移植せず 0 100 7.1 11.3 3.2 7.1 死亡 移植 0 100 6.3 15.8 29.1 52.3 75.8 移植 40 100 6.6 21.4 42.0 81.5 118.7 移植 20 100 6.9 23.9 46.6 86.1 117.6 移植 10 100 7.9 17.6 43.8 79.8 108.7
*1 ：参考例 4の化学修飾 h G-C S F誘導体 (Tri体)
*2 ：全身放射線無処现対照群の平均血小板数の値
を 1 00とした時の相対値 （％) で示した。
1 0 Gyの全身放射線照射マウスは、 重篤な血小板減少とともに 2週間以内に 全例死亡した。 骨髄細胞の移植を受けたマウスは、 死亡例は無かったが、 血小板 の低下が 2週間以上続いた。 化学修飾 h G - C S Fを投与した骨髄移植マウスで は、 用量に依存して、 1 1日目以降に血小板の回復促進効果がみられ、 1 5曰目 には、 放射線処理以前の血小板数以上に回復した。
試験例 5. 急性毒性試験
5〜i 0週令の BALB/c系雄マウスを 1群 4匹用い、 参考例 4で得られた 化学修飾 h G— C S F (T r i体） を 1匹あたり 25〃 g単回投与した。 あるい は 1匹あたり 2 O /zgを投与した後、 投与後 1、 5、 9日目に 20 gずつ計 4 回投与したが、 ともに症状変化は全くなく、 死亡例も認められなかった。 以上、 試験例で示したように、 化学修飾 hG - CSFおよび化学修飾 hG— C SF誘導体は、 放射線照射、 癌化学療法または骨髄移植時等にみられる重篤な血 小板減少症に対して、 血小板の明らかな回復促進効果を示し、 血小板増殖促進剤 として有用である。
また、 化学修飾 hG— CSFまたは化学修飾 hG— CSF誘導体とともに、 他 のサイトカインゃ低分子血小板増殖促進剤を用いることもできる。 他のサイトカ インとしては、 インターロイキン 3、 インタ一ロイキン 6、 白血病阻害因子、 幹 細胞因子 （Stem Cell Factor). マクロファージ 'コロニー刺激因子、 トロンボ ポェチン等があげられる。 低分子血小板増殖促進剤としては、 コナゲニン、 Y 2 5 5 1 0、 2—ピラノン誘導体、 FK 5 6 5等があげられる。
化学修飾 h G -CS Fまたは化学修飾 h G-CS F誘導体は、 そのままあるい は各種の製薬形態で使用することができる。 本発明の製薬組成物は活性成分とし て、 有効な量の化学修飾 h G— C S Fまたは化学修飾 h G - C S F誘導体を薬理 上許容される担体と均一に混合して製造することができる。 これらの製薬組成物 は、 注射による投与に対して適する単位服用形態にあることが望ましい。
注射剤は、 化学修飾 h G— C S Fまたは化学修飾 h G— C S F誘導体と蒸留水 、 塩溶液、 グルコース溶液または塩水とグルコース溶液の混合物から成る担体と を用いて液剤として調製することができる。 この際、 常法に従い、 適当な助剤を 用いて、 溶液、 懸濁剤または分散剤として調製される。 また、 当該液剤を凍結乾 燥し、 凍結乾燥剤として調製することもできる。 凍結乾燥の条件はとくに限定し ないが、 通常は一 5 0°C以下で 1〜5時間凍結し、 棚温— 20 °C〜0°C、 真空度 5 0〜 1 5 0 mTorr で 24〜 4 8時間乾燥し、 ついで棚温 1 0〜 3 0 °C、 真空度 5 0〜1 0 0 mTorr で 1 6〜24時間乾燥し、 凍結乾燥品を得る。
なお、 本発明の血小板増殖促進剤は、 通常の各種製薬担体、 賦形剤、 希釈剤、 安定化剤あるいは吸着防止剤などを含むことができる。
本発明の血小板増殖促進剤の投与量および投与回数は、 投与形態、 患者の年齢 、 体重、 対象となる疾患および患者の病状にあわせて決められるが、 通常、 成人 —人当り 1 5〃g 〜l . 51½、 好ましくは25〜5 0 0〃8 の化学修飾 hG— C S Fまたは化学修飾 h G-CS F誘導体含有製剂を 1週問当り 1〜 7回投与する c 投与方法としては、 静脈注射または皮下注射等が川いられる。 本発明の血小板増 殖促進剂は、 更に、 座剂、 点^薬としても川いることができる。
以下に実施例および参考例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1. 注射剤
下記方法により、 次の組成からなる注射剂を調製した。
参考例 4で得られた化学修飾 hG— CSF誘導体 (Tri体） 1 Omgを PBS溶 液 8 Omlに溶解し、 ポリソルベート 80 (和光純薬社製） を 2mg、 ヒト血清 アルブミン （シグマ社製） 1 0 Omgおよび D—マンニトール 1. 5 gを加え、 P B Sで容量を 1 00m lにあわせた。 得られた溶液を 0. 22 /mのディスポ —ザブル製メンブランフィルターを用いて無菌濾過後、 ガラスバイアルに 2m 1 ずつ無菌的に充填して、 注射剤 （ 1バイアルあたり o θ活 o o性成分 0. 2mgを含有す る） を得た。 処方 <fc ^修鼬 G- CSF ^(Tri体） 0.2 mg
ポリソノ 一ト 80
ヒトfil?青アルブミン
N
Figure imgf000019_0001
a細 4 ' 127
2.0 ml 実施例 2. 注射剤
下記方法により、 次の組成からなる注射剤を調製した。
参考例 4で得られた化学修飾 hG - CSF誘導体 (Tri体） 5 Omgを PBS溶 液 8 Omlに溶解し、 ポリソルベート 80 (和光純薬社製） を 2 mgおよび D— マンニトール 1. 5 gを加え、 PBSで容量を 1 0 Om 1にあわせた。 得られた 溶液を 0. 22 mのディスポ一ザブル製メンブランフィル夕一を用いて無菌濾 過後、 ガラスバイアルに 2m 1ずつ無菌的に充塡して、 注射剤 （ 1バイアルあた り活性成分 1. Omgを含有する） を得た。 処方 標纖 G- CSiH灘 (Tri体） 1.0 mg
ポリソルベート 80 0.04mg
D—マンニ 1、一ル 30 mg
NaCl 16 mg
KC1 0.4 mg
KH2P04 0.4 mg
Na2HP04 ·12½ 5.8 mg
2.0 ml 実施例 3. 注射剤
4
下記方法により、 次の組成からなる注射剤を調製 ο ο 8336した。
参考例 4で得られた化学修飾 hG - CSF誘導体 (Tri体） 1 Omgを PBS溶 液 8 Omlに溶解し、 ポリソルベート 80 (和光純薬社製） を 2mg、 ヒト血清 アルブミン （シグマ社製） 1 0 Omgおよび D—マンニトール 1. 5 gを加え、 リン酸で pHを約 5に調整した後、 注射用蒸留水で容量を 1 0 Omlにあわせた 。 得られた溶液を 0. 22 zmのデイスポーザブル製メンブランフィルターを用 いて無菌濾過後、 ガラスバイアルに 2mlずつ無菌的に充塡して、 注射剤 （1バ ィアルあたり活性成分 0. 2mgを含有する） を得た。 処方 難 G- CSF ^本 (Tri体） 0.2 mg
ポリソルベート 80
ヒト アルブミン
D—マンニ 1、一ル
Figure imgf000020_0001
NaCl
C1
Figure imgf000020_0002
Na2HP04 - 127j<ii
リン酸
2.0 ml 実施例 4.
参考例 3で得られた hG— CS F誘導体 3 1. 5mgを含む 5 OmMリン酸緩 衝液 （pH 7. 3) 3 5m lを、 5 %水酸化ナトリウムで p H 8. 7に調整し、 氷冷下で参考例 1 8で得られた 2 , 4—ビス （◦—メ トキシポリエチレングリコ ール） 一 6— ( 1—ァミノプロピルォキシカルボニルォキシ一 4 ' —ニトロフエ ニル） 一 s—トリアジン 5. O gを添加し、 4 °Cで 7日間反応させた。 該反応液 に最終濃度 0. 7Mとなるように硫酸アンモニゥ厶を添加し、 1 0mMトリス塩 酸緩衝液一 0. 7M硫酸アンモニゥ厶 （pH7. 5) で充されたブチルトヨパー ル 6 5 0 M (東ソ一社製） （2. 5 cmx 6. l cm= 3 0m l ) に、 3 0m l rの流速で通塔した。 次いで 1 OmMトリス塩酸緩衝液一 0. 7 M硫酸アン モニゥ厶 （pH7. 5) 9 Om lを 3 Om l Zhrの流速で通塔して洗浄後、 1 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH 7. 5) 系に、 直線勾配で 0. 7〜0M硫酸アン モニゥムを総量 1 8 Om l、 3 Om l Zh rの流速で通塔し、 溶出を行った。 目 的物は、 硫酸アンモニゥム 0. 4 7Mから 0. 1 6 Mで溶出された。 溶出画分に 最終濃度 0. 7Mとなるように硫酸アンモニゥムを添加し、 1 0mMトリス塩酸 緩衝液— 0. 7M硫酸アンモニゥム （pH7. 5) で充されたブチルトヨパール 6 5 0 M (東ソ一社製） （2. 5 cmx i 2 cm= 6 0m l ) に、 S Om l Zh rの流速で通塔した。 次いで 1 OmMトリス塩酸緩衝液一 0. 7 M硫酸アンモニ ゥ厶 （pH 7. 5) 1 8 Om 1を 6 Om 1 Zh rの流速で通塔して洗浄後、 1 0 mMトリス塩酸緩衝液 （pH 7. 5) 系に、 直線勾配で 0. 7〜0M硫酸アンモ 二ゥムを総量 6 0 0 ml、 6 Om 1 Zh rの流速で通塔し、 溶出を行った。 目的 物は、 硫酸アンモニカム 0. 3
Figure imgf000021_0001
0. 1 1 Mで溶出された。 溶出画分 20 Om 1を限外濾過 〔分子量分画 1万： YM 1 0 (アミコン社製） 〕 し、 6. 5m 1 まで濃縮した。 該濃縮液を P B Sで充されたセファクリル S— 3 0 0 (フアル マシア社製） （2. 5 cmx 4 5 cm= 22 Om 1 ) に 4 4m 1 Zh rの流速で 通塔した後、 同流速で PBSを通塔した。
PBSを流し始め、 9 2 m 1〜 1 0 0 m 1近辺に、 h G— C S F 1分子に対し ポリエチレングリコール誘導体の力ルボン酸が 3分子結合した化学修飾 h G— C S F誘導体 （T r i体） 力、、 1 0 Om 1 ~ 1 04m 1近辺に、 ポリエチレングリ コール誘導体のカルボン酸が 2分子結合した化学修飾 hG— CSF誘導体 （D i 体） 力、 1 1 6 m 1 ~ 1 20m l近辺に、 ポリエチレングリコール誘導体のカル ボン酸が 1分子結合した化学修飾 hG— CSF誘導体 （Mon o体） が溶出され 、 それぞれを 1. Omg (収率 3. 0 %) . 1. 4mg (収率 4. 4 %) 、 1. 1 mg (収率 3. 6 %) 取得した。
尚、 化学修飾 hG— CSF誘導体の純度および Mono体、 D i体および Tr i体における h G— C S F誘導体 1分子へのポリエチレングリコール誘導体の結 合分子数は S D S—ポリアクリルァミ ドゲル電気泳動により確認した。
以後の参考例においても、 化学修飾 hG - CS F誘導体の純度およびポリェチ レングリコール誘導体の結合分子数は SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 により確認した。
参考例 1.
6一クロル一 2, 4—ビス （〇一メ トキシポリェチレングリコール） 一 s—ト リアジンの製造
1 0 gの無水炭酸ナトリゥムを含む 1 00mlの無水トルエンに平均分子量 4 000のモノメ トキシポリエチレングリコール （日本油脂社製） 20 gを溶解し 、 1 1 0°Cで 30分間加熱した後、 塩化シァヌル 50 Omgを加え、 1 1 0 °Cで 24時間加熱した。 反応残留物を瀘去し、 石油エーテル 300 m lを加えて、 沈 澱を生じさせ、 該沈澱を数回石油エーテルで洗浄し、 標記塩化物を 1 0 g取得し た （収率 50%)。
参考例 2.
6 - ( 3—カルボキシプロピルァミノ） 一 2， 4一ビス （0—メ トキシポリェ チレングリコール） 一 s—トリアジンの N—ヒドロキシサクシンィミ ドエステル の製造
参考例 1で得られた塩化物 50 Omgを無水テトラヒドロフラン 9mlに溶解 した。 一方、 ァ—ァミノ酪酸 1 0mg、 トリェチルァミン 28 1 を無水ジメチ ルアミ ド lmlに溶解した液に上記溶液を添加後、 室温下 1 6時間攪拌した。 次
2 0
. 訂正されぇ (細! 19¾ いで、 減圧乾固の後、 塩化メチレン 30 m 1、 1 0 mMリン酸緩衝液 （p H 1 0 ) 1 5m 1を加え分配した。 上層を 2N塩酸で pH 1にした後、 塩化メチレン 3 Om lを加え、 再び分配した。 下層を分画し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 濾 別し、 減圧濃縮を行い、 標記カルボン酸を 1 5 Omg取得した （収率 30 %) 。 該カルボン酸 1 5 Omgと N—ヒドロキシサクシンイミ ド 3 mgを無水塩化メ チレン 1 m 1に溶解し、 氷冷下 N, N' —ジシクロへキシルカルポジイミ ド （D CO 6mgを添加後、 室温下 1 2時間攪拌した。 生じたジシクロへキシルウレ ァ （DCU) を濾別し、 濾液にェチルエーテルを加えて、 沈澱を生じさせた。 該 沈澱を濾別後、 減圧乾燥し、 標記エステルを 1 0 Omg取得した （収率 61%) c 参考例 3.
配列番号 1に示したァミノ酸配列を有する hG— CSFの 1番目のスレオニン をァラニンに、 3番目のロイシンをスレオニンに、 4番目のグリシンをチロシン に、 5番目のプロリンをアルギニンに、 1 7番目のシスチンをセリンにそれぞれ 置換した hG— CSF誘導体 （第 1表、 化合物 k) を以下のようにして得た。 上記の hG— CSF誘導体をコ一ドする DN Aを含むプラスミ ド pC f BD2 8を保有する大腸菌 W3110 株 (Escherichia coli ECfBD28 FERM BP- 1479) を L G培地 〔バクトトリプトン 1 0 g, 酵母エキス 5 g, 塩化ナトリゥム 5 g, グルコース 1 gを水 1 リッ トルに溶かし、 N a OHで pHを 7. 0とする 〕 で 37°C、 1 8時間培養し、 この培養液 5mlを 25 g/m 1のトリプトフ アンと 50 gZm lのアンピシリンを含む MCG培地 （Na2HP 04 0. 6 %, KH2P 04 0. 3 %, 塩化ナトリウム 0. 5%， カザミノ酸 0. 5%， M gS04 lmM， ビタミン B! 4 g/m 1 , pH 7. 2) 1 00mlに接種し 、 30°Cで 4〜8時間培養後、 トリブトファンの誘導物質である 3 ーインドー ルァクリル酸 （ 3 ^-indoleacrylic acid, 以下 I A Aと略す） を 1 0 g/m 1加え、 さらに 2〜1 2時間培養を続けた。 培養液を 8000 r pm、 1 0分間 遠心して集菌し、 30mM 塩化ナトリウム、 30mM トリス■塩酸緩衝液 （ pH 7. 5) で洗浄した。 洗浄菌体を上記緩衝液 30m lに懸濁し、 0でで 1 0 分間超音波破砕 (BRANSON SONIC POWER COMPANY社 SONIFIER CELL DISRUPTOR 2 00, OUTPUT C0NTR0L2) した。 該超音波破砕物を 9000 r pmで 30分間遠心 分離して菌体残渣を得た。 この菌体残渣からマーストンらの方法 〔F.A.O. Marst onら：バイオ 'テクノロジ一 （BI0/TECHN0L0GY) , ， 800 (1984)〕 に準じ hG -CS F誘導体を抽出■精製 ·可溶化 ·再生した。
参考例 4.
参考例 3で得られた hG— CSF誘導体 30 Omgを含む 5 OmMリン酸緩衝 液 （pH7. 2) 1 00m 1に、 参考例 2で得られた活性エステル 80 Omgを 添加し、 4 °Cで 24時間反応させた。 1 OmMトリス塩酸緩衝液— 0. 7 M硫酸 アンモニゥム （pH 8. 0) 1 00mlを加えた後、 1 OmMトリス塩酸緩衝液 — 0. 35M硫酸アンモニゥム （pH 8. 0) で充たされたブチルトヨパール 6
50M (東ソ一製） （2. 2cmx26cm) に 1 0 OmlZhrの流速で通塔した c 次いで 1 OmMトリス塩酸緩衝液— 0. 35M硫酸アンモニゥム （pH 8. 0
) 1 00m 1を 1 00m 1 Zh rの流速で通塔して洗浄後、 1 0 mMトリス塩酸 緩衝液 （pH8. 0) 系に直線勾配で 0. 35〜0M硫酸アンモニゥムを総量 4
00ml、 1 0 OmlZhrの流速で通塔し、 溶出を行った。 目的物は、 硫酸ァ ンモニゥム OmMから 25 OmMで溶出された。 溶出画分 250 mlを限外濾過
〔分子量分画 1万： YM1 0 (アミコン社製） 〕 し、 1 0mlまで濃縮した。 該 濃縮液を、 1 OmMリン酸緩衝液—生理食塩水 （pH 7. 2) (PBS) で充た されたセファクリル S— 200 (フアルマシア製）（5. 6cmx 40 cm) に 1 60 m lZh rの流速で通塔後、 同流速で P B Sを通塔した。 PBSを流し始め、 3
6 Oml〜 40 Oml近辺に、 hG— CSF 1分子に対しポリエチレングリコー ル誘導体のカルボン酸が 3分子結合した化学修飾 hG— CSF誘導体 （Tr i体 ) が、 420ml〜 450ml近辺に、 ポリエチレングリコール誘導体のカルボ ン酸が 2分子結合した化学修飾 hG— CSF誘導体 （D i体） が、 50 Oml〜 530 m 1近辺に、 ポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が 1分子結合し た化学修飾 hG— CSF誘導体 （Mono体） が溶出され、 それぞれを 2. 1 m g (収率 7%) 、 1. 5mg (収率 5%) 、 1. 5mg (収率 5%) 取得した。 Mo n o体、 D i体および T r i体の純度はいずれも 90 %以上であった。 参考例 5.
カルボキシルメチルモノメ トキシポリェチレングリコールの N—ヒドロキシス クシンイミ ドエステルの製造
充分脱水した平均分子量 5000のカルボキシルメチルモノメ トキシポリェチ レングリコール （日本油脂社製） 4 g ( 0. 8mmo 1 ) 、 N—ヒドロキシスク シンィミ ド （HONSu) 1 84mgを無水塩化メチレン 40 m 1に溶解後、 氷 冷下アルゴン気流中 DCC 33 Omgを加え， 30分間攪拌した。 その後、 室 温に戻し、 1. 5時間攪拌後、 不溶物 （DC U) を濾別し濾液を 1 6mlまで減 圧濃縮した。 これを無水ジェチルエーテル 240 m 1に滴下して沈殿を生成させ 、 沈殿を無水ジェチルエーテルで洗浄後、 減圧下溶媒を除去し、 標記化合物を 2 . 8 g (0. 56mmo 1 ) 取得した （収率 70%) 。
参考例 6.
参考例 3で得られた hG— CSF誘導体 202. 5 mgを含む 5 OmMリン酸 緩衝液 （PH 7. 3 ) 225 mlを、 5 %水酸化ナトリウムで p H 8. 1に調整 し、 氷冷下で参考例 5で得られたカルボキシルメチルモノメ トキシポリエチレン グリコールの N—ヒドロキシスクシンイミ ドエステル 1. 1 gを添加し、 4でで 6時間反応させた。 その後、 26. 7mgのトリス （ヒドロキシメチル） ァミノ メタンを含む水溶液 0. 5 m 1を加え、 反応液とした。 反応液を 8000 r pm 、 4 °Cで 40分間遠心分離し、 その上清 37 Om 1に最終濃度 0. 68Mとなる ように硫酸アンモニゥムを添加し、 1 OmMトリス塩酸緩衝液— 0. 68M硫酸 アンモニゥム （pH7. 5) で充されたブチルトヨパール 650 M (東ソ一社製 ) (5 cmx 6. 6 cm= 1 30ml) に、 1 30 m 1 Zh rの流速で通塔した c 次いで 1 OmMトリス塩酸緩衝液— 0. 68M硫酸アンモニゥム （pH 7. 5 ) 390mlを 1 30m l Zhrの流速で通塔して洗浄後、 1 0 mMトリス塩酸 緩衝液 （pH7. 5 ) 390mlを 1 30 m 1 Zh rの流速で通塔し、 溶出を行 つた。 目的物は、 35m 1から 8 Om 1で溶出された。 溶出画分 45m 1を限外 濾過 〔分子量分画 1万： YM1 0 (アミコン社製） 〕 し、 30m lまで濃縮した 。 該濃縮液を、 PBSで充されたセフアクリル S— 200 (フアルマシア社製） (5 cmx 5 1 c m= 1 000 m l ) に 200m l rの流速で通塔した後、 同流速で PBSを通塔した。 化学修飾 hG— CSFポリペプチドは、 PBSを流 し始めて 200m lから 380m lあたりに溶出され、 ポリエチレングリコール 誘導体 1から 4分子の結合体 （Mo n o体〜 T e t r a体） の混合物であった （ 収量 1 58mg、 収率 78%) 。
参考例 7.
カルボキシルメチルモノメ トキシポリエチレングリコールの N—ヒドロキシス クシンイミ ドエステルの製造
充分脱水した平均分子量 1 0000のカルボキシルメチルモノメ トキシポリエ チレングリコール （日本油脂社製） 1 2 g ( 1. 2mm 01 ) 、 HONS υ 2 76 mgを無水塩化メチレン 1 20mlに溶解後、 氷冷下アルゴン気流中 D C C
495 mgを加え、 30分間撹拌した。 その後、 室温に戻し 1. 5時間撹拌し 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液を 48mlまで減圧濃縮した。 これを無水ジェ チルエーテル 720 mlに滴下して沈殿を生じさせ、 沈殿を無水ジェチルェ一テ ルで洗浄後、 減圧下で溶媒を除去し、 標記化合物を 1 0. 0 g ( 1. 0 mm 01 ) 取得した （収率 83%) 。
参考例 8.
配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する G— CSF 40. 8mgを含む 5 OmMリン酸緩衝液 （pH 7. 3) 30 m 1を、 5 %水酸化ナトリウムで p H 8 . 3に調整し氷冷下で参考例 7で得られたカルボキシルメチルモノメ トキシポリ エチレングリコールの N—ヒドロキシスクシンィミ ドエステル 326 mgを添加 し、 4 °Cで 6時間反応させた。 その後、 3. 9mgのトリス （ヒドロキシメチル ) ァミノメタンを含む水溶液 0. 1mlを加え、 反応液とした。 反応液に硫酸ァ ンモニゥムをその濃度が最終的に 0. 7Mとなるように添加し、 1 OmMトリス 塩酸緩衝液— 0. 7M硫酸アンモニゥム （pH7. 5) で充されたブチルトヨパ —ル 650 M (東ソ一社製） （2. 5 cmx 8. l cm=40ml ) に、 40m IZh rの流速で通塔した。 次いで 1 OmMトリス塩酸緩衝液— 0. 7M硫酸ァ ンモニゥ厶 （pH7. 5) 1 20mlを 40ml/hrの流速で通塔して洗浄後 後、 1 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH7. 5) 系に、 直線勾配で 0. 7〜 0 M硫 酸アンモニゥ厶を総量 240m l、 40m 1 /h rの流速で通塔し、 溶出を行つ た。 目的物は、 硫酸アンモニゥム 0. 33Mから 0. 05Mで溶出された。 溶出 画分 90 m 1を限外濾過 〔分子量分画 1万： YM 1 0 (アミコン社製） 〕 し、 6 mlまで濃縮した。 該濃縮液を PBSで充されたセフアクリル S— 300 (ファ ルマシア社製） （2. 5 cmx 45 cm= 22 Om 1 ) に 44m 1 rの流速 で通塔した後、 同流速で PBSを通塔した。 化学修飾 hG— CSFポリペプチド は、 PBSを流し始めて 6 Om 1から 1 02m 1あたりに溶出され、 ポリエチレ ングリコール誘導体 1から 4分子の結合体 （1^0110体〜丁6 t r a体） の混合 物であった （収量 9. 5018、 収率23%) 。
参考例 9.
参考例 3で得られた hG— CSF誘導体 304. 2 mgを含む 5 OmMリン酸 緩衝液 （pH 7. 3 ) 338 mlを、 5 %水酸化ナトリウムで p H 8. 1に調整 し氷冷下で参考例 7で得られたカルボキシルメチルモノメトキシポリエチレング リコールの N—ヒ ドロキシスクシンイミ ドエステル 4. 8 gを添加し、 4°Cで 6 時間反応させた。 その後、 58. 1 mgのトリス （ヒドロキシメチル） アミノメ タンを含む水溶液 0. 5 m 1を加え、 反応液とした。 反応液を 8000 r pm、 4 °Cで 40分間遠心分離し、 その上清に最終濃度 0. 68Mとなるように硫酸ァ ンモニゥムを添加し、 1 OmMトリス塩酸緩衝液一 0. 68 M硫酸アンモニゥム (pH 8. 0) で充されたブチルトヨパール 65 OM (東ソ一社製） （5 cmx 7. l cm= 1 40ml) に、 1 40 m 1 rの流速で通塔した。 次いで 1 0 mMトリス塩酸緩衝液一 0. 68M硫酸アンモニゥ厶 （pH 8. 0 ) 420 ml を 1 4 OmlZhrの流速で通塔して洗浄後、 1 0 mMトリス塩酸緩衝液 （pH 8. 0) 42 Om lを 1 40 m 1 Zh rの流速で通塔し、 溶出を行った。 目的物 は、 82mlから 1 84m lで溶出された。 溶出画分 1 02 m 1を、 PBSで充 されたセフアクリル S— 300 (フアルマシア社製） （1 0 cmx 50 cm=3 900 m l) に 780 m 1 rの流速で通塔した後、 同流速で PBSを通塔し た。 化学修飾 hG— CSFポリペプチドは PBSを流し始めて 1 60 Omlから 2070 m 1あたりに溶出され、 ポリエチレングリコール誘導体 1力、ら 4分子の 結合体 （Mono体〜 T e t r a体） の混合物であつた （収量 21 6 m g 収率 71 %) 。
参考例 1 0.
6— （ 3—カルボキシプロピルァミノ） 一 2， 4一ビス （0—メ トキシポリエ チレングリコール） 一 s—トリアジンの N-ヒドロキシスクシンィミ ドエステルの
7—ァミノ酪酸 4 1 2mg (4. Ommo l) を 0. 1Mホウ酸緩衝液 （pH 1 0 ) 300 m lに溶解し、 氷冷下 6—クロル一 2, 4—ビス （0—メ トキシポ リエチレングリコール） 一 s—トリアジン 20 g ( 2 mm 01 ) (生化学工業社 製） を加えて、 4 °Cで一昼夜撹拌した。 さらに室温で 6時間撹拌した後、 1N塩 酸で pHlに調整し、 クロ口ホルム抽出を行った。 クロ口ホルム相を無水硫酸ナ トリウムで乾燥し、 乾燥後濾別した。 減圧下で溶媒を除去し、 生じた固形物に乾 燥したアセトンを添加し、 溶解させた。 該アセトン溶液を減圧濃縮し、 室温に放 置することにより標記カルボン酸を再結晶化させ、 該結晶を 1 5. 8 g (1. 6 mm o 1 )取得した。
該カルボン酸 1 0 g ( 1. Ommo 1 ) と N—ヒドロキシスクシンイミ ド 23 Omgを無水塩化メチレン 1 00m lに溶解し、 氷冷下アルゴン気流中 D C C 4 1 3mgを加え、 30分撹拌した。 その後、 室温に戻し 1. 5時間撹拌し不溶 物 （DCU) を濾別し、 濾液を 40mlまで減圧濃縮した。 これを無水ジェチル エーテル 600 m lに滴下して沈殿を生成させ、 沈殿を無水ジェチルェ一テルで 洗浄後、 減圧下で溶媒を除去し標記化合物を 7. 7 g (0. 77 mm 01 )取得 した （収率 77%) 。
参考例 1 1.
配列番号 1で表されるのアミノ酸配列を有する hG— CSF 40. 8mgを含 む 5 OmMリン酸緩衝液 （pH 7. 3) 30 m 1を、 5%水酸化ナトリウムで p H 7. 2に調整し、 氷冷下で参考例 1 0で得られた 6— （3—カルボキシプロピ ルァミノ） 一 2， 4—ビス （ 0—メ トキシポリエチレングリコール） 一 s—トリ ァジンの N-ヒ ドロキシスクシンイミ ドエステル 326 mgを添加し、 4°Cで 48 時間反応させた。 その後、 3. 9 mgのトリス （ヒド口キシメチル） アミノメ夕 ンを含む水溶液 0. 1 m 1を加え、 反応液とした。 反応液に最終濃度 0. 7Mと なるように硫酸アンモニゥ厶を添加し、 1 OmMトリス塩酸緩衝液— 0. 7M硫 酸アンモニゥム （pH7. 5 ) で充されたブチルトヨパール 65.0 M (東ソ一社 製） （2. 5 cmx 8. 1 cm= 4 Om 1 ) に、 4 Om 1 Zh rの流速で通塔し た。 次いで 1 OmlV [トリス塩酸緩衝液— 0. 7M硫酸アンモニゥム （pH7. 5 ) 1 2 Om 1を 4 Om 1 Zh rの流速で通塔して洗浄後、 1 0 mMトリス塩酸緩 衝液 （pH7. 5) 系に、 直線勾配で 0. 7〜0M硫酸アンモニゥ厶を総量 24 Om K 4 Oml Zhrの流速で通塔し、 溶出を行った。 目的物は、 硫酸アンモ ニゥム 0. 351^から0. 07Mで溶出された。 溶出画分 9 Om 1を限外濾過 〔 分子量分画 1万： YM1 0 (アミコン社製） 〕 し、 6m lまで濃縮した。 該濃縮 液を P B Sで充されたセフアクリル S— 300 (フアルマシア社製） （2. 5 c mx47 cm= 230ml) に 46mlZh rの流速で通塔した後、 同流速で P BSを通塔した。 化学修飾 hG— CSFポリペプチドは PBSを流し始めて 1 1 Omlから 1 45mlあたりに溶出され、 ポリエチレングリコール誘導体 1から 3分子の結合体 （M 0 n 0体〜 T r i体） の混合物であつた （収量 7. 8 m g、 収率 1 9%) 。
参考例 1 2.
参考例 3で得られた hG— CSF誘導体 54 Omgを含む 5 OmMリン酸緩衝 液 （pH7. 3) 600mlを、 5 %水酸化ナトリウムで p H 7. 2に調整し氷 冷下で参考例 1 0で得られた 6— ( 3—カルボキシプロピルァミノ） 一 2， 4一 ビス （〇ーメ トキシポリエチレングリコール） 一 s—トリアジンの N-ヒドロキシ スクシンイミ ドエステル 8. 7 gを添加し 4 °Cで 48時間反応させた。 その後、 1 05mgのトリス （ヒドロキシメチル） ァミノメタンを含む水溶液 0. 5ml を加え、 反応液とした。 反応液を 8000 r pm, 40分間、 4 °Cで遠心分離し 、 その上清 60 Om 1に硫酸アンモニゥムをその濃度が最終的に 0. 68Mとな るように添加し、 1 OmMトリス塩酸緩衝液— 0. 68 M硫酸アンモニゥム （p
~~ ί — H 7. 5 ) で充されたブチルトヨパール 650 M (東ソ一社製） （5 cmx l 8 cm= 350ml) に 350mlZh rの流速で通塔した。 次いで 1 OmMトリ ス塩酸緩衝液— 0. 68 M硫酸アンモニゥム （pH 7. 5 ) 700mlを 350 m 1 Zh rの流速で通塔して洗浄後、 1 0 mMトリス塩酸緩衝液 （ p H 7. 5) 系に直線勾配で 0. 68〜0M硫酸アンモニゥムを総量 2800m 1、 350m
IZh rの流速で通塔し、 溶出を行った。 目的物は、 硫酸アンモニゥム 0. 39 Mから 0. 20Mで溶出された。 溶出画分 800 m 1を限外濾過 〔分子量分画 1 万： YM1 0 (アミコン社製） 〕 し、 1 00mlまで濃縮した。 該濃縮液を PB
Sで充されたセファクリル S— 300 (フアルマシア社製） （ 1 0 cmx 50 c m=3900m l) に 780ml/h rの流速で通塔した後、 同流速で P B Sを 通塔した。 化学修飾 hG— CSFポリべプチドは PBSを流し始めて 1 750 m
1から 225 Om 1あたりに溶出され、 ポリエチレングリコール誘導体 1から 3 分子の結合体 （1^011 0体〜丁 i体） の混合物であった （収量 303 mg、 収 率 56
参考例 1 3.
6 - ( 3—カルボキシプロピルァミノ） 一 2， 4一ビス （0—メ トキシポリエ チレングリコール） 一 s—トリアジンの製造
充分乾燥した平均分子量 1 2000のモノメ トキシポリエチレングリコール （ 日本油脂社製） 1 00 g (8. 33mmo 1 ) 、 酸化亜鉛 （和光純薬工業社製） 9. 3 g、 モレキュラーシーブス （タイプ 4 A) (和光純薬工業社製） 83. 5 gを乾燥ベンゼンに溶解し、 アルゴン気流中室温で一昼夜放置した。 その後、 モ レキユラ一シーブスを除去し、 再び新しいモレキュラーシーブス 42 gを加え、 同様に一昼夜放置した。 次に、 モレキュラーシ一ブスを除去し、 蒸留装置を用い てアルゴン気流中 80°Cで蒸留し、 初留 5 Om 1を除去した。 さらにモレキユラ ーシーブス （タイプ 4 A) を 1 00 g程度詰め込んだソックスレー抽出装置 （固 相用） を用いて、 アルゴン気流中 80°Cで一昼夜脱水還留を行った。 反応液を冷 却後、 736 mg (4. Ommo 1 ) の塩化シァヌルを加え、 5日間同様にして 脱水還留を行った。 この際使用した塩化シァヌルは、 乾燥したジェチルエーテル より再結晶したものを用いた。 その後、 室温で冷却し乾燥ベンゼン 3 0 Om 1を 加え、 3 6 0 0 r pmで 1 0分間遠心分離し、 不溶物を除去した。 上清を 3 0 0 m 1まで減圧濃縮し、 乾燥したジェチルエーテル 3 0 0 0 m l中に滴下し沈殿を 生成させた。 該沈殿を回収し、 乾燥ジェチルエーテルで洗浄後、 減圧下で溶媒を 除去し、 乾燥沈殿物を取得した。
該乾燥沈殿物 1 0 0 gを、 ァーァミノ酪酸 1. 24 g ( 1 2. Ommo l ) を 0. 1 Mホウ酸緩衝液 （pH 1 0 ) 1 0 0 0 m 1に溶解した溶液に、 氷冷下で添 加し、 4°Cで一昼夜撹拌した。 さらに室温で 6時間撹拌した後、 1 N塩酸で pH 1. 0に調整し、 クロ口ホルムで抽出した。 クロ口ホルム相を無水硫酸ナトリウ ムで乾燥後、 濾別し、 減圧下で溶媒を除去した。 生じた白色固体に乾燥アセトン を添加し溶解させた。 該アセトン溶液を減圧濃縮し、 室温に放置することにより 再結晶化させ、 標記化合物を約 70〜8 0 含む粗精製物 9 0 gを得た。 これを 、 6 0 0 0 m lの蒸留水に溶解し、 あらかじめ 2N水酸化ナトリウム 1 2 0 0 0 m 1を通塔後、 蒸留水で平衡化した 6 0 00 m lの陰イオン交換樹脂 H P A - 7 5 (三菱化学社製） に通塔し、 蒸留水で溶出して標記化合物を主成分に含有する 画分を回収した。 これを 1 N塩酸で pH l . 0に調整し、 クロ口ホルム抽出を行 つた。 クロ口ホルム相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 濾別し、 減圧下で溶媒を 除去し、 高純度の標記化合物を 4 3. 6 g取得した （収率 4 3%)。
参考例 1 4.
6 - ( 3—カルボキシプロピルァミノ） 一 2, 4—ビス （0—メ トキシポリエ チレングリコール） 一 s—トリアジンの N—ヒドロキシスクシンィミ ドエステル の製造
参考例 1 3の方法に準じ合成し、 充分乾燥させた 6— （3—カルボキシプロピ ルァミノ） 一 2， 4一ビス （ 0—メ トキシポリエチレングリコール） 一 s—トリ ァジン 25 g ( 1. Ommo l ) と N—ヒドロキシスクシンイミ ド 24 Omgを 無水塩化メチレン 4 0 Om 1に溶解し、 氷冷下アルゴン気流中 DCC 4 3 1 m gを加え、 3 0分撹拌した。 その後、 室温に戻し 1. 5時間撹拌し、 不溶物 （D CU) を濾別し、 濾液を 1 6 Om lまで減圧濃縮した。 これを無水ジェチルェ一 テル 24 0 Om 1に滴下して沈殿を生じさせ、 該沈殿を無水ジェチルエーテルで 洗浄後、 減圧下で溶媒を除去し標記化合物を 2 1. 4 g (0. 8 9 mm o 1 ) 取 得した （収率 8 9 %)。
参考例 1 5.
参考例 3で得られた hG— CSF誘導体 5 0 4 mgを含む 5 OmMリン酸緩衝 液 （pH7. 3) 5 6 Om lを、 5 %水酸化ナトリウムで p H 7. 3に調整し、 氷冷下で参考例 1 4で得られた 6— （3—カルボキシプロピルァミノ） — 2， 4 -ビス （〇一メ トキシポリエチレングリコール） 一 s—トリアジンの N—ヒドロ キシスクシンイミ ドエステル 22. 4 gを添加し、 4 °Cで 4 8時間反応させた。 その後、 1 1 3mgのトリス （ヒドロキシメチル） アミノメタンを含む水溶液 0 . 5m 1を加え、 反応液とした。 反応液に最終濃度 0. 7Mとなるように硫酸ァ ンモニゥムを添加し、 1 OmMトリス塩酸緩衝液一 0. 7M硫酸アンモニゥム （ pH 7. 5) で充されたブチルトヨパール 6 5 OM (東ソ一社製） （5 cmx 2 5 cm= 5 0 Om 1 ) に、 5 0 Om 1 rの流速で通塔した。 次いで 1 0 mM トリス塩酸緩衝液— 0. 7M硫酸アンモニゥム （pH 7. 5 ) 1 5 0 0 m lを 5 0 Om l Zh rの流速で通塔して洗浄後、 1 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH7. 5) 系に、 直線勾配で 0. 7〜0M硫酸アンモニゥムを総量 30 0 Om 1、 5 0 Om l Zh rの流速で通塔し、 溶出を行った。 目的物は、 硫酸アンモニゥム 0. 5 5Mから 0. 0 8 Mで溶出された。 溶出画分に最終濃度 0. 7Mとなるように 硫酸アンモニゥムを添加し、 1 OmMトリス塩酸緩衝液— 0. 7M硫酸アンモニ ゥム （PH7. 5) で充されたブチルトヨパール 6 5 OM (東ソ一社製） （5 c mx 1 5 c m= 3 0 0 m 1 ) に、 4 5 0 m 1 Zh rの流速で通塔した。 次いで 1 0 mlV [トリス塩酸緩衝液一 0. 7M硫酸アンモニゥ厶 （pH 7. 5 ) 1 5 0 0 m 1を 4 5 Om 1 rの流速で通塔して洗浄後、 1 OmMトリス塩酸緩衝液 （p H 7. 5 ) 9 0 0m lを 4 5 0 m 1 Zh rの流速で通塔し、 溶出を行った。 目的 物は、 6 7m 1力、ら 1 32m 1で溶出された。 溶出画分 1 0 0 m 1を、 PBSで 充されたセフアデックス G— 25 (フアルマシア社製） （5 cmx 5 0 cm= l 0 0 0 m l ) に S O Om l Zh rの流速で通塔した。 次いで、 同流速で P B Sを 通塔した。 化学修飾 hG— C S Fポリべプチドは P B Sを流し始めて 35 0 m l から 5 0 0 m 1あたりに溶出され、 ポリエチレングリコール誘導体 1から 4分子 の結合体 （Mo n o体〜 T e t r a体） の混合物であった （収量 2 8 2 mg、 収 率 5 6 %) 。
参考例 1 6.
4一二トロフヱニルォキシカルボ二ルー （◦—メ トキシポリエチレングリコー ル） の製造
充分乾燥した平均分子量 1 0 0 0 0のメ トキシポリエチレングリコール 5. 5 g (0. 5 5mmo 1 ) (日本油脂社製） を 27. 5 m 1の乾燥塩化メチレンに 溶解し、 0. 1 5 3m 1のトリエチルァミン、 222mgの 4一二トロフエニル クロ口ホルメイトを加え、 アルゴン気流中、 室温で 4時間攪拌した。 この間、 ト リエチルァミンで pHを 7. 5〜8. 5に保った。 反応液を 20m 1まで減圧濃 縮し、 3 0 0 m 1の乾燥ジェチルエーテル中に滴下して沈殿を生じさせた。 該沈 殿を乾燥ジェチルエーテルで洗浄し、 減圧下で溶媒を除去した。 該沈殿を乾燥し た酢酸ェチルより再結晶化させ、 減圧乾燥して標記化合物を 4. 8 g (0. 4 8 mmo 1 ) 取得した （収率 8 Ί %) 。
参考例 1 7.
参考例 3で得られた hG— CSF誘導体 4 0. 5mgを含む 5 OmMリン酸緩 衝液 （PH7. 3) 4 5m lを、 5 %水酸化ナトリウムで p H 8. 7に調整し、 氷冷下で参考例 1 6で得られた 4一二トロフエニルォキシカルボ二ルー （0—メ トキシポリエチレングリコール） 4. 3 gを添加し、 4°Cで 3日間反応させ、 反 応液とした。 反応液に最終濃度 0. 7Mとなるように硫酸アン乇ニゥムを添加し 、 1 OmMトリス塩酸緩衝液一 0. 7M硫酸アンモニゥム （pH 7. 5) で充さ れたブチルトヨパール 6 5 0 M (東ソ一社製） （2. 5 cmx 1 2 cm= 6 0m 1 ) に、 6 0m 1 Zh rの流速で通塔した。 次いで 1 OmMトリス塩酸緩衝液一 0. 7M硫酸アンモニゥム （pH7. 5) 1 8 Om 1を 6 Om 1 Zh rの流速で 通塔して洗浄後、 1 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH 7. 5) 系に、 直線勾配で 0 • 7〜01V [硫酸アンモニゥムを総量 3 6 Om 1、 6 0 m 1 /h rの流速で通塔し 、 溶出を行った。 次いで 1 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH 7. 5 ) 1 8 Om lを 60m 1 rの流速で未溶出部分の溶出を行った。 目的物は、 硫酸アンモニゥ ム 0. 4 Mから 0 Mで溶出された。 溶出画分 2 1 0mlを限外濾過 〔分子量分画 1万： YM 1 0 (アミコン社製） 〕 し、 30mlまで濃縮した。 該濃縮液を PB Sで充されたセファクリル S— 300 〔フアルマシア社製 （5 cmx 5 1 cm二 1 000ml) 〕 に 200mlZh rの流速で通塔した後、 同流速で PB Sを通 塔した。
PBSを流し始め、 285 m 1〜305 m 1近辺に、 hG— CSF 1分子に対 しポリエチレングリコール誘導体の力ルボン酸が 3分子結合した化学修飾 h G— C S F誘導体 （T r i体） が、 325 m 1〜345 m 1近辺に、 ポリエチレング リコール誘導体のカルボン酸が 2分子結合した化学修飾 h G -CS F誘導体 （D i体） が、 365 m 1〜385 m 1近辺に、 ポリエチレングリコール誘導体の力 ルボン酸が 1分子結合した化学修飾 hG— CSF誘導体 （Mo no体） が溶出さ れ、 それぞれを 6. 2mg (収率 1 0. 9%) 、 6. 8mg (収率 1 1. 9%)
、 5. Omg (収率 8. 8%) 取得した。
参考例 1 8.
6— （ 1—ァミノプロピルォキシカルボニルォキシー 4 ' 一二トロフエニル） — 2， 4一ビス （0—メ トキシポリエチレングリコール） 一 s—トリアジンの製 造 ，
1 2 Omg ( 1. 6mmo 1 ) の 3—アミノー 1—プロパノ一ルを 0. 1 Mホ ゥ酸緩衝液 （pH 1 0 ) 200 mlに溶解し氷冷下 8 g (0. 8mmo 1 ) の 6 —クロル一 2, 4—ビス （0—メ トキシポリエチレングリコール） 一 s—トリア ジン （生化学工業社製） を加え、 4 °Cで一昼夜攪拌した。 反応液を 2 N塩酸で p HI. 0に調整し、 クロ口ホルムで抽出した。 クロ口ホルム相を 2 N塩酸で 2回 洗浄した後、 無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 濾過した。 減圧下で溶媒を除去し、 生じた固形物に乾燥アセトンを添加し、 溶解させた。 該アセトン溶液を減圧濃縮 し、 室温に放置することによりアルコール体を再結晶化させ、 該結晶を 5. 5 g 取得した。 （収率 69%) 次に充分乾燥した該アルコール体 5. 3 g ( 0. 5 3 mm 0 1 ) を乾燥塩化メ チレン 2 6. 5m 1 に溶解後 0. 1 4 7m 1のトリエチルァミ ンを加え、 さらに 2 1 4 m g ( 1. 0 6 mm o 1 ) の 4一二トロフヱニルクロロホルメートを加え 、 4 °Cで 4時間攪拌した。 その後、 反応液を 2 0m 1 に減圧濃縮し、 3 0 0 m l の乾燥ジェチルエーテル 3 0 0 m 1 に滴下して沈殿を生じさせた。 この沈殿を乾 燥ジェチルエーテルで洗浄し、 減圧下で溶媒を除去後、 乾燥した酢酸ェチルより 再結晶し、 減 乾燥により標記化合物を 4. 6 g ( 0. 4 6mmo l ) 取得した (収率 8 1 %) 。
参考例 1 9.
参考例 3で得られた hG - C S F誘導体 2 9. 2 5 mgを含む 5 OmMリン酸 緩衝液 （pH 7. 5) 6. 5m 1 に、 氷冷下で活性化ポリエチレングリコール試 薬 M— S CM— 2 0 0 0 0 (Shearwater Polymer社製） 2 8 7 mgを添加し、 4 °Cで 6時間反応させた後、 5 0mgZm lのトリス （ヒ ドロキシメチル） ァミノ メタン水溶液 3 5 fi 1を加え、 反応液とした。 該反応液を PBSで充されたセフ アク リル S— 3 0 0 (フアルマシア社製） （2. 5 cmx 4 5 cm= 2 2 0m l ) に 4 4m 1 Zh rの流速で通塔した後、 同流速で P B Sを通塔した。
PBSを流し始め、 9 6m 1〜 1 0 4m 1近辺に、 ポリエチレングリコール誘 導体のカルボン酸が 2分子結合した化学修飾 hG— CSF誘導体 （D i体） が溶 出され、 該 D i体を 3. 8mg (収率 1 3. 0 %) 取得した。
参考例 2 0.
参考例 3で得られた hG— CSF誘導体 2 8. 8mgを含む 5 OmMリン酸緩 衝液 （PH 7. 5) 6. 7m 1に、 氷冷下で活性化ポリエチレングリコール試薬 M-S S PA- 2 0 0 0 0 (Shearwater Polymer社製） 9 8 mgを添加し、 4 °C で 2 4時間反応させた後、 4 Omg/m 1のトリス （ヒ ドロキシメチル） ァミノ メタン水溶液 3 0 1を加え、 反応液とした。 該反応液を P BSで充されたセフ アク リル S— 3 0 0 (フアルマシア社製） （2. 5 cmX 4 5 cm= 2 2 0m l ) に 4 4m l Zh rの流速で通塔した後、 同流速で P B Sを通塔した。
P B Sを流し始め、 7 8 m 1〜9 8m 1近辺に、 ポリエチレングリコール誘導 体のカルボン酸が 3分子結合した化学修飾 hG— CSF誘導体 （Tr i体） が溶 出され、 該 Tr i体を 2. Omg (収率 6. 6%) 取得した。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 h G— C S F活性を有するポリべプチドの分子中のァミノ基、 カルボキシ基、 メルカプト基またはグァニジノ基の少なく とも 1個の基が化学修 飾された化学修飾ポリべプチドおよび該ポリべプチドを含有する優れた血小板増 殖促進剤を提供することができる。
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Claims

請 求 の 範 囲
1 . ヒト颗粒球コロニー刺激囚子活性を有するポリぺプチドの分子屮のァミノ 基、 カルボキシ基、 メルカプト基またはグァニジノ茈の少なくとも 1個の ¾が化 学修飾剤で化学修飾されたポリべプチドを含有してなる血小板増殖促進剤。
2 . ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが配列番号 1で表 されるアミノ酸配列、 該配列の一部のアミノ酸配列、 または該配列の一部のアミ ノ酸が別のァミノ酸で置換されたァミノ酸配列を含むポリべプチドである請求項 1記載のポリべプチド。
3 . アミノ基、 カルボキシ基、 メルカプト基またはグァニジノ基の化学修飾剤 がポリアルキレングリコール誘導体またはスチレン一マレイン酸共重合体である 請求項 1または請求項 2記載のポリべプチドを含有してなる血小板増殖促進剤。
4 . ポリアルキレングリコ一ル誘導体がポリエチレングリコール誘導体、 ポリ プロピレングリコール誘導体またはポリェチレングリコール—ポリプロピレング リコール共重合体の誘導体である請求項 3記載のポリべプチドを含有してなる血 小板増殖促進剤。
5 . ァミノ基の化学修飾剤が、 式 （ I )
R1— (M)n - X - R2 ( I ) {式中、 R 1はアルキル基またはアルカノィル基を表し、 Mは 一〇CH2CH2— 、 一 OCH2CH2CH2— または
一 (OCH2CH2)r一 (OCH2CH2CH2)s
(式中、 rおよび sは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を表す） を 表し、 nは任意に変わりうる正の整数を表し、 Xは単結合、 0, N Hまたは Sを 表し、 R 2は
Figure imgf000040_0001
〔式中、 R3 は 0H、 ハロゲンまたは 一 Xa— (Ma)na - R1a
(式中、 Xa、 M\ Rlaおよび n aはそれぞれ前記 X、 M、 R1および nと同 意義を表す） を表し、 Yはハロゲンまたは
-Z-(CH2)p-(0)m-W
[式中、 Zは〇， Sまたは NHを表し、 Wはカルボキシ基もしくはその反応性誘 導体または、
Figure imgf000040_0002
(式中、 R4 はアルキル基を表し、 Ha 1はハロゲンを表す） を表し、 pは 1〜 6の整数を表し、 mは 0または 1を表す] を表す、
Figure imgf000040_0003
(式中、 Waおよび maはそれぞれ前記 Wおよび mと同意義であり、 tは 0〜6 の整数を表す） または
Figure imgf000040_0004
(式中、 Ha l e、 p aおよび R "はそれぞれ前記 Ha 1、 pおよび R4と同意 義を表す） を表す } で表されるポリアルキレングリコール誘導体、 または、 式 （ I) (ID
Figure imgf000041_0001
(式中、 uおよび vは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を示し、 R 5 は、 水素原子またはアルキル基を表す） で表されるスチレン—マレイン酸共重 合体の誘導体である請求項 3記載のポリぺプチドを含有してなる血小板増殖促進 剤。
6. カルボキシ基の化学修飾剤が式 （
R1b-(M ■Db)\nb-一 NH2 (III)
(式中、 Mb 、 Rlbおよび nbはそれぞれ前記 M、 R1 および nと同意義を表す ) で表されるポリアルキレングリコール誘導体である請求項 3記載のポリぺプチ ドを含有してなる血小板増殖促進剤。
7. メルカプト基の化学修飾剤が式（IV)
R1し— (IV)
Figure imgf000041_0002
(式中、 Me 、 Rleおよび n cはそれぞれ前記 M、 R1 および nと同意義を表す ) で表されるポリアルキレングリコール誘導体、 または式 （V)
Figure imgf000041_0003
〔式中、 R5a、 u aおよび v aはそれぞれ前記 R5 、 uおよび vと同意義を表し Qおよび Rの一方はカルボキシ基を表し、 他方は、
Figure imgf000042_0001
(式中、 pbは前記 pと同意義を表す） を表す〕 で表されるスチレン一マレイン 酸共重合体の誘導体である請求項 3記載のポリぺプチドを含有してなる血小板増 殖促進剤。
8. グァニジノ基の化学修飾剤が式 (VI)
Figure imgf000042_0002
(式中、 qは 1または 2を、 Md 、 Rldおよび n dはそれぞれ前記 M、 R1 およ び nと同意義を表す） で表されるポリアルキレングリコール誘導体である請求項 3記載のポリぺプチドを含有してなる血小板増殖促進剤。
9. ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドの分子中の少なく とも 1個のアミノ基に下記式 （ I a)で表される基を結合してなる修飾ポリぺブ チドを含有してなる血小板増殖促進剤。
R1— (OCH2CH2)n - X - R2a - (la)
{式中、 R1 はアルキル基またはアルカノィル基を表し、 nは任意に変わりうる 正の整数を表し、 Xは単結合、 0, NHまたは Sを表し、 R2eは
R3a
~ ( N
Yd一
〔式中、 R3 i〇H、 ハロゲンまたは 一 Xa— (Ma)na - R1a
(式中、 Xa、 Rlaおよび n aはそれぞれ前記 X、 R1 および nと同意義を表す ) を表し、 Yaは単結合、 または
-Z-(CH2)p-(0)m-CO-
(式中、 Zは 0, Sまたは NHを表し、 pは 1〜6の整数を表し、 m.は 0または 1を表す） を表す〕 または 一 (CO)ma-(CH2)rCO-
(式中、 maは前記 mと同意義であり、 tは 0〜6の整数を表す） を表す } 。
1 0. 請求の範囲 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8または 9記載のポリペプチド の有効量を投与することからなる血小板の減少した患者の治療方法。
1 1. 血小板の減少した患者の治療に有効な薬理学的組成物の製造のための請求 の範囲 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8または 9記載のポリペプチドの使用。
1 2. 血小板の減少した患者の治療のための請求の範囲 1、 2、 3、 4、 5、 6 、 7、 8または 9記載のポリペプチドの使用。
1 3. 薬理学的に許容される担体と共に薬理的に許容される投与形態にある、 有 効量の請求の範囲 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8または 9記載のポリペプチド からなる血小板の減少した患者の治療のための組成物。
1 4. ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドの分子中の少な くとも 1個のアミノ基に下記式 （ l b)
Figure imgf000043_0001
{式中、 R1 はアルキル基またはアルカノィル基を表し、 Mは 一 OCH2CH2— 、 — OCH2CH2CH2- または ― (OCH2CH2)r - (OCH2CH2CH2)s -
(式中、 rおよび sは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を表す） を 表し、 nは任意に変わりうる正の整数を表し、 Xは単結合、 .〇， NHまたは Sを 表し、 R3bは R3aと同意義を表し、 Zは 0， Sまたは NHを表し、 pは 1〜6の 整数を表す } で表される基を結合してなる修飾ポリ
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