KR100403688B1 - 혈소판증식촉진제및이를포함하는약제학적조성물 - Google Patents

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마사미 오카베
도시유키 스자와
겐 고바야시
구미코 마루야마
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교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
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Description

혈소판 증식 촉진제 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
인터루킨 6[참조: F. Takatsuki et al., Cancer Research 50, 2885-2890 (1990)], 백혈병 억제 인자[참조: D. Metcalf et al., Blood, 76, 50-56 (1990)], 간 세포 인자[참조: P. Hunt et al., Blood, 80, 904-911 (1992)], 대식구 콜로니 자극 인자(M-CSF: 일본국 특허공보 제11705/94호) 및 트롬보포이에틴(thrombopoietin)[참조: de Sauvage et al., Nature, 369, 533 (1994)]이 혈소판 증식을 촉진시킬 수 있는 물질로서 공지되어 있다. 더구나, 코나게닌(conagenin)[참조: Japanese Cancer Association # 2235 (1992)], Y 25510[참조: The 113rd annual meeting of Pharmaceutical Society of Japan, PB13-22 (1993)], 2-피라논 유도체[참조: 일본국 특허공개공보(미심사) 제213758/93호] 및 FK 565(WO 93/23066)은 혈소판 증식을 촉진시킬 수 있는 저분자량 물질로서 공지되어 있다.
hG-CSF가 각종 유형의 혈구 생성을 유도하는 조혈성 간 세포 성장과 분화에 필수적인 폴리펩타이드 중 하나이고 대부분의 과립구 및 특히 호중구에 대해 성장 촉진 효과를 발휘한다는 것은 공지되어 있다.
특정 그룹들이 화학적 변형제에 의해 화학적으로 변형되고 hG-CSF 활성을 나타내는 변형된 폴리펩타이드로는, hG-CSF 활성을 나타내는 폴리펩타이드내 하나 이상의 아미노 그룹을 폴리에틸렌 글리콜 유도체로 변형시킴으로써 수득한 화학적으로 변형된 hG-CSF가 공지되어 있다[참조: 일본국 특허공개공보(미심사) 제316400/89호, WO 90/06952, 일본국 특허공개공보(미심사) 제32559/92호]. 이들 화학적으로 변형된 hG-CSF 폴리펩타이드가 혈소판 증식 촉진 효과를 발휘한다는 것은 공지된 바가 없다.
본 발명은 사람 과립구 콜로니 자극 인자(hG-CSF로 후술됨) 활성을 지닌 폴리펩타이드 분자내의 아미노, 카복실, 머캅토 및 구아니디노 그룹 중의 하나 이상의 그룹을 화학적으로 변형시켜 제조한 hG-CSF 폴리펩타이드; 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 혈소판 증식 촉진제; 혈소판 수가 감소된 환자에게 유효량의 당해 폴리펩타이드를 투여함을 포함하여 상기 환자를 치료하는 방법; 혈소판 수가 감소된 환자의 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 당해 폴리펩타이드의 용도; 및 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 유효량의 당해 폴리펩타이드를 약제학적으로 허용되는 투여 형태로 포함하는, 혈소판 수가 감소된 환자를 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 hG-CSF 활성을 지닌 폴리펩타이드 분자내의 아미노, 카복실, 머캅토 및 구아니디노 그룹 중의 하나 이상의 그룹을 화학적으로 변형시킨 폴리펩타이드; 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 혈소판 증식 촉진제; 혈소판 수가 감소된 환자에게 유효량의 당해 폴리펩타이드를 투여함을 포함하여, 상기 환자를 치료하는방법; 혈소판 수가 감소된 환자의 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 당해 폴리펩타이드의 용도; 및 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 유효량의 당해 폴리펩타이드를 약제학적으로 허용되는 투여 형태로 포함하는, 혈소판 수가 감소된 환자를 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
더욱 특정하게는, 본 발명은 hG-CSF 활성을 지닌 폴리펩타이드 분자내의 아미노, 카복실, 머캅토 및 구아니디노 그룹 중의 하나 이상의 그룹을 폴리알킬렌 글리콜 유도체 또는 스티렌-말레산 공중합체에 의해 화학적으로 변형시킨 폴리펩타이드; 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 혈소판 증식 촉진제; 혈소판 수가 감소된 환자에게 유효량의 당해 폴리펩타이드를 투여함을 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법; 혈소판 수가 감소된 환자의 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 당해 폴리펩타이드의 용도; 및 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 유효량의 당해 폴리펩타이드를 약제학적으로 허용되는 투여 형태로 포함하는, 혈소판 수가 감소된 환자를 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
폴리알킬렌 글리콜 유도체로는, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 폴리프로필렌, 유도체 및 폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체 유도체가 있다.
아미노, 카복실, 머캅토 및 구아니디노 그룹 중의 하나 이상을 화학적으로 변형시키기 위한 제제를 보다 구체적으로 언급해보면, 아미노 그룹-화학적 변형제로는, 예를 들면, 다음 화학식 1의 폴리알킬렌 글리콜 유도체 및 다음 화학식 2의 스티렌-말레산 공중합체가 있다:
상기식에서,
R1은 알킬 또는 알카노일 그룹이고;
M은 화학식 -OCH2CH2-, -OCH2CH2CH2-, 또는 -(OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s-(여기서, r 및 s는 동일하거나 상이한 양의 정수이다)이며;
n은 양의 정수이고;
X는 단일 결합, O, NH 또는 S이며;
R2는 화학식{상기식에서, R3은 OH, 할로겐 또는 화학식 -Xa-(Ma)na-R1a[여기서, Xa, Ma, R1a및 na는 상기 언급된 X, M, R1및 n과 각각 동일한 의미를 지닌다]이고,
Y는 할로겐 또는 화학식 -Z-(CH2)p-(O)m-W[여기서, Z는 O, S 또는 NH이고, W는 카복실 그룹, 이의 반응성 유도체 또는 화학식(여기서, R4는 알킬 그룹이고, Hal은 할로겐이다)이며, p는 1 내지 6의 정수이고, m은 0 또는 1이다]}. -(CO)ma-(CH2)t-Wa[여기서, Wa및 ma는 상기 언급된 W 및 m과 각각 동일한 의미를 나타내며, t는 0 내지 6의 정수이다] 또는[여기서, Hala, pa 및 R4a는 상기 언급된 Hal, p 및 R4와 각각 동일한 의미를 나타낸다]이고;
u 및 v는 동일하거나 상이한 양의 정수이며;
R5는 수소 원자 또는 알킬 그룹이다.
카복실 그룹-화학적 변형제로는, 예를 들면, 다음 화학식 3의 폴리알킬렌 글리콜 유도체가 있다.
상기식에서,
Mb, R1b및 nb는 상기 언급된 M, R1및 n과 각각 동일한 의미를 나타낸다. 머캅토 그룹-화학적 변형제는 다음 화학식 4의 폴리알킬렌 글리콜 유도체 및 화학식 5의 스티렌-말레산 공중합체이다.
상기식에서,
Mc, R1c및 nc는 상기 언급된 M, R1및 n과 각각 동일한 의미를 나타내고;
R5a, ua 및 va는 상기 언급된 R5, u 및 v와 각각 동일한 의미를 나타내며;
Q 및 R중 하나는 카복실 그룹을 나타내고 다른 하나는 화학식
[여기서, pb는 상기 언급된 p와 동일한 의미를 나타낸다]을 나타낸다.
구아니디노 그룹-화학적 변형제로는, 예를 들면, 다음 화학식 6의 폴리알킬렌 글리콜 유도체가 있다:
상기식에서,
q는 1 또는 2의 수이고;
Md, R1d및 nd는 상기 언급된 M, R1및 n과 각각 동일한 의미를 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같은 화학적 변형제에서, R1, R4및 R5로 나타낸 알킬 그룹으로는, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 2급 부틸, 3급 부틸, 펜틸, 이소펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 옥틸, 이소옥틸, 데실, 도데실, 테트라데실, 헥사데실 및 옥타데실 등의 탄소수 1 내지 18의 직쇄 또는 측쇄 그룹이 있으며; R1로 나타낸 알카노일 그룹으로는, 예를 들면, 포밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 발레릴, 피발로일, 펜타노일, 라우로일, 미리스토일, 팔미토일 및 스테아로일 등의 탄소수 1 내지 18의 직쇄 또는 측쇄 그룹이 있고; R3, Y 및 Hal로 나타낸 할로겐으로는, 예를 들면, 입소, 브롬 및 요오드 원자가 있으며; W로 나타낸 카복실 그룹의 활성 유도체로는, 예를 들면, 산 클로라이드 및 산 브로마이드 등이 산 할라이드, p-니트로페닐 에스테르 및 N-옥시석신이미드 등의 활성에스테르, 및 모노에틸에스테르 카보네이트 및 모노이소부틸 카보네이트를 포함하는 혼합 무수물이 있다. 부호 n, r, s, u 및 v는 1 내지 1000의 양의 정수를 나타내며, 바람직하게는 n은 7 내지 500이고, r, s, u 및 v는 각각 1 내지 200이다. 화학적 변형제 그룹의 분자량은 500 내지 100,000, 바람직하게는 1,000 내지 40,000의 범위 이다.
본 발명의 hG-CSF 활성을 지닌 폴리펩타이드로는, hG-CSF 활성을 지니는 어떠한 펩타이드도 사용될 수 있으며, 바람직하게는 서열확인번호 1의 아미노산 서열, 이러한 서열의 일부, 또는 이러한 서열의 아미노산 일부가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열[참조: Nature, 319, 415 (1986), 일본국 특허공개공보(미심사) 제267292/88호 및 제299/88호, 및 WO87/01132]을 포함하는 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 서열 일부가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(hG-CSF)의 한 양태가 표 1에 예시되어 있다:
일반적으로, 아미노, 카복실, 머캅토 및 구아니디노 그룹 각각이 하나 이상 존재하는, hG-CSF 활성을 지닌 펩타이드 분자내에서는, 이들 그룹 중 하나가 화학적으로 변형되면 충분하다.
hG-CSF 활성을 지닌 펩타이드는, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 폴리프로필렌 글리콜 유도체 및 폴리에틸렌 글리콜-폴리프로필렌 글리콜 공중합체 유도체 등의 폴리알킬렌 글리콜 유도체, 및 스티렌-말레산 공중합체 유도체를 포함하는 화학적 제제를 아미노, 카복실 또는 구아니디노 그룹을 포함하는 폴리펩타이드(hG-CSF 유도체)와 반응시킴으로써 화학적으로 변형시킬 수 있다.
아미노, 카복실, 머캅토 또는 구아니디노 그룹을 포함하는 폴리펩타이드를 폴리에틸렌 글리콜 유도체 또는 폴리프로필렌 글리콜 유도체와 반응시키기 위한 방법으로서, 예를 들면, 일본국 특허공개공보(미심사) 제316400/89호 및 문헌[참조: Biotech, Lett., 14, 559-564 (1992), BIO/TECHNOLOGY, 8, 343-346 (1990)]에 기술된 통상적인 방법 또는 이의 변형법이 사용될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜-프로프로필렌 글리콜 공중합체 유도체와의 반응을 위한 방법으로는, 예를 들면, 일본국 특허공개공보(미심사) 제59629/84호 및 제176586/85호, WO 89/06546 및 EP 0539167A2에 기술된 통상적인 방법 또는 이의 변형법이 사용될 수 있다.
스티렌-말레산 공중합체 유도체와의 반응을 위한 방법으로는, 예를 들어, 문헌[참조: BIO INDUSTRY 2, 499-505 (1988), 및 일본국 특허공개공보 (미심사) 제85922/89호 및 제99573/89호에 기재된 통상적인 방법 또는 이의 변형법이 사용될 수 있다.
hG-CSF 활성을 지닌 화학적으로 변형된 펩타이드의 한 예로는, hG-CSF의 하나 이상의 아미노 그룹을 다음 화학식 1a의 그룹과 결합시킴으로써 수득한 변형된 펩타이드가 있다:
[화학식 1a]
상기식에서,
R1은 알킬 또는 알카노일 그룹이고,
n은 양의 정수이며,
X는 단일 결합, O, NH 또는 S이고,
R2a는 화학식
{상기식에서, R3a는 OH, 할로겐 또는 화학식 -Xa-(CH2CH2O)na-R1a[여기서, Xa, R1a및 na는 상기 X, R1및 n과 각각 동일하다]이고, Ya는 단일 결합 또는 화학식 -Z-(CH2)p-(O)m-CO-[여기서, Z는 O, S 또는 NH이고 p는 1 내지 6의 정수이며 m은 0 또는 1이다]이다} 또는 -(CO)ma-(CH2)t-CO-[여기서, ma는 상기 m과 동일하고 t는 0 내지 6의 정수이다]이다.
화학식 1a의 각 그룹에서, 알킬 그룹, 알카노일 그룹, 할로겐 및 양수는 상기 화학식 1에서의 정의와 유사하게 정의된다.
또한, 신규의 화학적으로 변형된 hG-CSF 또는 화학적으로 변형된 hS-CSF 유도체가 본 발명에 의해 제공될 수 있다.
신규의 화학적으로 변형된 hG-CSF로는, 하나 이상의 아미노 그룹과 다음 화학식 1b의 그룹을 결합시킴으로써 수득한 변형된 펩타이드가 있다:
상기식에서,
R1은 알킬 또는 알카노일 그룹이고,
M은 화학식 -OCH2CH2-, -OCH2CH2CH2또는 -(OCH2CH2),-(OCH2CH2CH2)s-(여기서, r 및 s는 동일하거나 상이한 양의 정수이다)을 나타내고,
n은 양의 정수이며,
X는 단일 결합, O, NH 또는 S이고,
R3b는 R3a와 동일하며,
Z는 O, S 또는 NH이고,
p는 1 내지 6의 정수이다.
폴리에틸렌 글리콜 유도체, 폴리프로필렌 글리콜 유도체, 폴리에틸렌 글리콜-폴리프로필렌 글리콜 공중합체 유도체 또는 스티렌-말레산 공중합체 유도체1 내지 5 분자가 화학적으로 변형된 hG-CSF 또는 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체와 결합한다. 결과적으로, 화학적으로 변형된 hG-CSF 및 화학적으로 변형된 hS-CSF 유도체는 1 내지 5개의 분자 결합체의 혼합물 또는 각각 분리된 결합체 형태로 사용된다. 화학적으로 변형된 hG-CSF 및 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체의 분리에 있어서, 장쇄 폴리펩타이드 등의 분리에 통상적으로 사용되는, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피와 같은 각종 크로마토그래피와 암모늄 설페이트 분리 공정을 적용할 수 있다.
화학적 변형 정도는 유리 그룹의 감소로 확인되며, 이는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 화학적으로 변형된 hG-CSF의 이동도를 모니터함으로써 측정되는, 유리 그룹의 감소에 의해 확인된다.
본 발명에서의 단백질 분석은 다음 실험방법으로 수행했다.
실험방법 1
본 발명에서는, 단백질 농도를 로우리(Lowry) 등의 방법[참조: Lowry, O. H. et al., J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)]으로 측정했다.
실험방법 2
램리(Laemmli)의 방법[참조: U. K. Laemmli: Nature, 227, 680 (1970)]에 따라서, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하고 이러한 겔 상에 분리된 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 후, 크로마토스캐너(CS-930, Shimadzu Corporation)를 사용하여 단백질 농도를 측정했다.
다음 실험 실시예는 화학적으로 변형된 hG-CSF와 화학적으로 변형된 hG-CSF유도체의 약리학적 활성을 나타내기 위한 것이다.
실험 실시예 1
화학적으로 변형된 hG-CSF와 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체의 백혈병 세포인 NSF-60 세포인 대한 G-CSF 활성 및 촉진 효과
다음 참조 실시예 4, 6, 8, 12, 15, 17, 19 및 20과 실시예 4에서 수득한 화학적으로 변형된 hG-CSF와 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체의 마우스 골수세포에 대한 활성은 오카베(Okabe) 등의 방법[참조: M. Okabe et al., Blood, 75, 1788 (1990)]에 따라서 측정했다. 또한, NSF-60 세포[참조: K. Holmes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6687 (1985)]에 대한 증식 촉진 활성은 아사노(Asano) 등의 방법[참조: Asano et al., Jpn. Pharmacol. Ther. 19, 2767 (1991)]에 따라서 측정했다. 그 결과가 표 2에 나타나 있다.
실험 실시예 2
방사선이 전신에 조사된 마우스에서의 감소된 혈소판 회복에 대한 촉진 효과
표 3 및 4에 나타낸 연구에서는 5마리의 숫컷 BALB/c 마우스(10주령)를 사용하고 표 5에 나타낸 연구에서는 4마리의 숫컷 BALB/c 마우스(6주령)를 사용했다. 마우스 1마리당137Cs 방사능 공급원(RI-433, Toshiba Corporation)으로부터 3Gy를 전신 방사선 조사(Rx로서 후술됨)한 후, 이들 마우스를 특정의 병원균이 없는 (SPF: Specilic Pathogen Free) 사육 환경 시설의 청결한 우리속에서 사육했다. 물과 사료는 원하는 즉시 이용될 수 있게끔 했다. 처리하지 않은 대조군으로는 조사되지 않은 마우스를 유사하게 사육했다.
표 3 내지 5에 열거된 화학적으로 변형된 hG-CSF와 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체를 생리식염수에 각각 용해시키고, 마우스 1마리당 5㎍/0.2ml의 단일 투여랑으로 피하 투여하였는데, 이때 표 3에 나타낸 연구에서는, 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(트리-타입) 용액을 Rx한 다음날에 1회 투여하거나 또는 Rx한 다음날과 5일째 되는 날에 2회 투여하였으며, 표 4 및 5에 나타낸 연구에서는, Rx한 다음날에 1회 투여하였다.
혈액을 쥐의 안저(eyeground) 정맥으로부터 순차적으로 수거하고 자동 혈구 계수기(CC-180A, TOA MEDICAL ELECTRONICS Co., Ltd.)를 사용하여 혈소판 수를 측정했다. 결과는 다음 표 3 내지 5에 나타나 있다.
*1: 참조 실시예 4의 화학적으로 변형된 hG-SSF 유도체(트리-타입)
*2: 전신 방사선 조사되지 않은 대조 그룹의 수를 100으로 했을때의 상대적인 평균 혈소판 수(%)
*: 전신 방사선 조사되지 않은 대조 그룹의 수를 100으로 했을때의 상대적인 평균 혈소판 수(%)
*: 전신 방사선 조사되지 않은 대조 그룹의 수를 100으로 했을때의 상대적인 평균 혈소판 수(%)
3Gy의 전신 방사선 조사를 받은 마우스 그룹에서는 혈소판 수가 현격히 감소되었으며, Rx의 8일째 되는 날과 9일째 되는 날에 최소에 달했으며 이어서 점차적으로 증가되었으나, 당해 연구 내내, 혈소판 수는 결코 조사하기 전의 수준으로 회복되지는 못하였다. 그러나, 화차적으로 변형된 hG-CSF와 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체가 투여된 마우스에서는, 혈소판 수의 감소가 억제되었으며, 조사한지 8일쩨 되는 날과 9일째 되는 날에 혈소판 수가 현격히 증가하였으며, 조사한지 11일째 되는 날과 12일째 되는 날에는 조사하기 전의 혈소판 수를 완전히 회복하였다. 유사한 효과가 또한, 당해 제제를 Rx한 다음날과 5일째 되는 날에 투여한 그룹에서도 나타났다.
실험 실시예 3
항암제 투여하에서의 혈소판 감소에 대한 회복 촉진 효과
항종양제인 5-플루오로우라실(5-Fu, Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)을100mg/kg이 용량으로 5마리의 숫컷 BALB/c 마우스(9주령)에게 복강내 투여했다. 5-FU 투여 다음날에, 참조 실시예 4에서 수득한 화학적으로 변형된 hG-CSF(트리-타입)를 생리식염수에 용해시키고 마우스 1마리당 5㎍/0.2ml의 단일 용량으로 피하 투여했다. 혈액을 쥐의 안저 정맥으로부터 순차적으로 수집하고 자동 혈구 계수기를 사용하여 혈소판 수를 측정했다. 그 결과가 표 6에 나타나 있다.
*1: 참조 실시예 4의 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(트리-타입)
*2: 전신 방사선 조사되지 않은 대조 그룹의 수를 100으로 했을때의 상대적인 평균 혈소판 수(%)
5-FU 투여 그룹에서는 투여한지 4일째 되는 날부터 혈소판 수가 감소되었으며, 5일째 되는 날에 최저에 달했으며, 9일째 되는 날에 이의 투여 이전의 수준으로 회복되었다. 화학적으로 변형된 hG-CSF 그룹에서는 혈소판 감소가 억제되었으며 6일째 되는 날 이후부터는 회복이 명백히 촉진됨을 알 수 있었다. 투여한지 7일 후, 혈소판 수가 투여 이전의 수준으로 회복되었다.
실험 실시예 4
골수 이식시의 혈소판 감소에 대한 회복 촉진 효과
137Cs 방사능 공급원(RI-433, Toshiba Corporation)으로부터의 10Gy를 Rx한 후, 4마리의 BALB/c 마우스(8주령)를 SPF 사육 환경 시설의 청결한 우리 속에서 사육했다. 방사선 조사 다음날, 이들 마우스에 동계 마우스의 2x106개의 골수 세포(나일론 울 비부착 세포)를 이식했다. 2시간 후, 참조 실시예 4에서 수득한 화학적으로 변형된 hG-CSF(트리-타입)를 생리식염수에 용해시키고 마우스 1마리당 10㎍/0.2ml, 20㎍/0.2ml, 또는 40㎍/0.2ml의 단일 용량으로 피하 투여했다. 혈액을 쥐의 안저 정맥으로부터 순차적으로 수집하고 자동 혈구 계수기를 사용하여 혈소판 수를 측정했다. 결과는 표 7에 나타나 있다.
*1: 참조 실시예 4의 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(트리-타입)
*2: 전신 방사선 조사되지 않은 대조 그룹의 수를 100으로 했을때의 상대적인 평균 혈소판 수(%)
10Gy의 전신 방사선 조사를 받은 모든 마우스의 혈소판 수가 심각하게 감소되었으며, 2주 이내에 사망하였다. 골수 세포가 이식된 마우스는 사망하지는 않았지만, 혈소판 수의 감소가 2주 이상 지속되었다. 화학적으로 변형된 hG-CSF가 투여된. 골수 이식된 마우스는 11일째 되는 날 이후부터는 용량-의존성 방식으로 혈소판 수의 회복에 대한 촉진 효과를 나타내었으며 조사한지 15일째 되는 날에는 방사선 조사 이전의 수준 이상으로 혈소판 수가 회복되었다.
실험 실시예 5
급성 독성 시험
5 내지 10주령의 4마리의 BALB/c 마우스에게 참조 실시예 4에서 수득한 화학적으로 변형된 hG-CSF(트리-타입)를 마우스 1마리당 25㎍의 단일 용량으로 공급했다. 또 다른 시험에서는, 20㎍의 용량을 투여한 후, 투여 1일째, 5일째 및 9일째 되는 날에 각각 20㎍을 추가로 투여했다. 양 시험에서, 사망율을 조사한 결과 마우스가 건강한 조건하에서 어떠한 변화도 나타내지 않았으며 사망한 마우스가 없다는 사실이 관측되었다.
실험 실시예에 기재된 바와 같이, 과학적으로 변형된 hG-CSF와 화학적으로 변형된 hC-CSF 유도체는 방사선 조사, 암에 대한 화학 치료 요법 또는 골수 이식에 의해 야기된 심각한 혈소판 수 감소로부터 혈소판 수 회복을 명백히 촉진시키는 효과를 발휘하므로, 이는 당해 hG-CSF 또는 hG-CSF 유도체의 혈소판 증식 촉진제로서의 유용성을 나타내 준다.
화학적으로 변형된 hG-CSF와 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체 이외에, 기타 사이토킨 또는 저분자량 혈소판 증식 촉진제가 사용될 수 있다. 기타 사이토킨으로는, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 백혈병 억제 인자, 간(stem) 세포 인자, 대식구 콜로니 자극 인자, 트롬보포이에틴 등이 있다. 저분자량 혈소판 증식 촉진제로는, 코나게닌, Y25510, 2-피라논 유도체, FK 565등이 있다.
화학적으로 변형된 hG-CSF와 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체는 단독으로 사용되거나 각종 투여 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 활성 성분으로서의 화학적으로 변형된 hG-CSF와 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체의 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와 균질하게 혼합함으로써 제조될 수 있다. 바람직하게는, 이들 약제학적 조성물은 주사 투여용으로 적합한 투여 형태이다.
주사용 제제는 화학적으로 변형된 hG-CSF 또는 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체 및 담체, 예를 들면 증류수, 염 용액, 글루코즈 용액 또는 염 용액과 글루코즈 용액의 혼합물을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 제제에서는, 통상적인 방법에 따라서, 적합한 보조제를 사용하여 용제, 현탁제 또는 분산제의 형태로 제제를 제조할 수 있다. 더우기, 동결건조된 제제는 상기 제제를 동결건조시킴으로써 제조될 수 있다. 동결건조 조건이 특정하게 제한되지는 않지만, 통상적으로, 상기 제제를 -50℃ 미만에서 1 내지 5시간 동안 냉동시키고 -20℃ 내지 0℃의 저장 온도 및 50 내지 150mTorr의 진공하에 24시간 내지 48시간 동안 건조시킨 다음, 이어서 10 내지 30℃의 저장 온도 및 50 내지 100mTorr의 진공하에 16시간 내지 24시간 동안 건조시켜 동결건조된 제제를 수득한다.
본 발명에 따른 혈소판 증식 촉진제로는 각종 통상의 약제학적 담체, 치료약 주성분, 희석제, 안정화제 또는 흡착 억제제가 포함될 수 있다.
투여량과 투여 횟수는 통상적으로, 성인에 있어서, 투여 형태, 환자의 연령, 체중, 대상 질병 및 환자의 상태에 따라서 결정되지만, 화학적으로 번형된hG-CSF 또는 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체 15㎍ 내지 1.5mg, 바람직하게는 25 내지 500㎍을 1주당 1 내지 7회 투여한다. 투여 경로로는, 정맥내 또는 피하 주사가 사용된다. 본 발명에 따른 혈소판 증식 촉진제는 또한, 좌제 또는 비내 점적제로서 사용된다.
본 발명은 다음 실시예를 통하여 추가로 예시된다.
실시예 1 주사제
다음 조성으로 이루어진 주사제를 다음에 기술된 방법으로 제조했다.
참조 실시예 4에서 수득한 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체 10mg을 PBS 용액 80ml에 용해시키고, 폴리솔베이트 80(Wallo Pure Chemical Industries, Ltd.) 2mg, 사람 힐청 알부민(Sigma, Ltd.) 100mg 및 D-만니톨 1.5g을 가한 다음, PBS를 사용하여 100ml의 용량으로 조정했다. 공극 크기가 0.22μm인 1회용 막여과기를 통하여 무균적으로 여과한 후, 생성된 용액 각 2ml를 유리 바이알에 무균적으로 가하여 주사제(바이알당 활성 성분을 0.2mg함유)를 수득했다.
처방
실시예 2 주사제
다음 조성으로 이루어진 주사제를 다운에 기술된 방법으로 제조했다.
참조 실시예 4에서 수득한 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체 50mg을 PBS 용액 80ml에 용해시키고, 폴리솔베이트 80(Wallo Pure Chemical Industries, Ltd.) 2mg, 및 D-만니톨 1.5g을 가한 다음, PBS를 사용하여 100ml의 용량으로 조정했다. 공극 크기가 0.22μm인 1회용 막여과기를 통하여 무균성 여과한 후, 생성된 용액 각 2ml를 유리 바이알에 무균적으로 가하여 주사제(바이알당 활성 성분을 1.0mg 함유)를 수득했다.
처방
실시예 3 주사제
다음 조성으로 이루어진 주사제를 다음에 기술된 방법으로 제조했다.
참조 실시예 4에서 수득한 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체 10mg을 PBS 용액 80ml에 용해시키고, 폴리솔베이트 80(Wallo Pure Chemical Industries, Ltd.) 2mg, 사람 힐청 알부민(Sigma, Ltd.) 100mg 및 D-만니톨 1.5g을 가한 다음, PBS를 사용하여 pH 약 5로 조정하고 주사용 증류수로 용량을 100ml로 만들었다. 공극 크기가 0.22μm인 1회용 막여과기를 통하여 무균성 여과한 후, 생성된 용액 각 2ml를 유리 바이알에 무균적으로 가하여 주사제(바이알당 활성 성분을 0.2mg 함유)를 수득했다.
처방
[실시예 4]
참조 실시예 3에서 수득한 hG-CSF 유도체를 31.5mg 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 7.3) 35ml를 5% 수산화나트륨으로 pH 8.7로 조정하고, 2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-(1-아미노프로필옥시카보닐옥시-4'-니트로페닐)-s-트리아진 5.0g을 가한 다음, 반응을 4℃에서 7일간 수행했다. 상기 반응 용액에, 황산암모늄을 0.7M의 최종 농도로 가한 다음, 0.7M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형시킨 부틸-도요펄 65OM(Tosoh Corporation)의 컬럼(2.5cm x 6.1cm = 30ml)상에 30ml/hr의 유속으로 로딩했다. 0.7M 황산암모늄을 함유하는 100mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 90ml을 30ml/hr의 유속으로 가하여 상기 컬럼을 세척한 후, 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 계에서 황산암모늄 농도의 직선 구배를 0.7에서 0 M로 감소시키면서 총 180ml의 용적으로 30ml/hr의 유속하에 용출을 수행했다. 목적하는 물질은 0.47M 내지 0.16M의 황산암모늄 농도에서 용출되었다.
황산암모늄을 0.7M의 최종 농도로 상기 용출된 분획에 가하고, 0.7M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형시킨 부틸-도요펄 650M(Tosoh Corporation)의 컬럼(2.5cm x 12cm = 60ml)상에 60ml/hr의 유속으로 로딩했다. 0.7M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 180ml를 60ml/hr의 유속으로 가하여 상기 컬럼을 세척한 후, 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 계에서 황산암모늄 농도의 직선 구배를 0.7에서 0 M로 감소시키면서 총 600ml의 용적으로 60ml/hr의 유속하에 용출을 수행했다. 목적하는 물질은 0.38M 내지 0.11M의 황산암모늄 농도에서 용출되었다. 용출된 분획 200ml를 한외여과시키고 [컷오프(cutoff) Mr 또는 공칭 분자량 한계치 10,000:YM10(Amicon Co., Ltd.)] 6.5ml로 농축시켰다. 이와 같이 농축된 용액을 44ml/hr의 유속으로, PBS로 평형시킨 세파그릴 S-300(Pharmacia Co., Ltd.) 컬럼(2 5cm x 45cm = 220ml)상에 로딩한 다음, PBS를 동일한 유속으로 통과시켰다.
PBS의 개시후, 폴리에틸렌 글리콜의 자복실산 3분자가 hG-CSF 1분자와 결합된 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(트리-타입)는 92ml 내지 100ml에서 용출되었고, 폴리에틸렌 글리콜의 카복실산 2분자가 hG-CSF 1분자와 결합된 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(디-타입)는 100ml 내지 104ml에서 용출되었고, 폴리에틸렌 글리콜의 카복실산 1분자가 hG-CSF 1분자와 결합된 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(모노-타입)는 116ml 내지 120ml에서 용출되어, 각각 1.0mg(수율 3.0%),1.4mg(수율 4.4%) 및 1.1mg(수율 3.6%)이 수득되었다.
모노-타입, 디-타입 및 트리-타입에서 hG-CSF 유도체 1분자와 결합하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 분자수를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 확인하였다.
또한, 다음 참조 실시예에서는, 결합하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 분자수와 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체의 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 확인하였다.
참조 실시예 1
6-클로로-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-s-트리아진의 제조
평균 분자량이 4,000인 메톡시폴리에틸렌 글리콜(Nippon Oil and Fats Co., Ltd.) 20g을, 무수 탄산나트륨 10g을 함유하는 무수 톨루엔 100ml에 용해시키고 110℃에서 30분간 가열한 다음, 시아누릭 클로라이드 500mg을 가하고 110℃에서 24시간 동안 가열했다. 잔류 물질을 제거하고 석유 에테르 300ml를 침전을 위해 가하고, 이러한 침전물을 석유 에테르로 수회 세척하여 목적하는 클로라이드를 10g 수득했다(수율 50%).
참조 실시예 2
6-(3-카복시프로필아미노)-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-s-트리아진의 N-하이드록시석신이미드 에스테르의 제조
참조 실시예 1에서 수득한 클로라이드 500mg을 무수 테트라하이드로푸란 9ml에 용해시켰다. 또 다른 한편, 상기 용액을, γ-아미노 부티르산 10mg과 트리에틸아민 28㎕를 무수 N,N-디메틸포름아미드 1ml에 용해시킨 용액에 가한 다음, 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 감압하에 건조시킨 후, 메틸렌 클로라이드 30ml와 10mM 인산염 완충액(pH 10) 15ml를 가하여 분배했다. 이의 상부 상을 2N 염산으로 pH 1로 조정한 다음, 메틸렌 클로라이드 30ml를 가하고 다시 분배시켰다. 하부 상을 분획시키고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과시키고, 감압하에 농축시켜 목적하는 카복실산을 150mg 수득했다(수율 30%).
상기 카본산 150mg과 N-하이드록시석신이미드 3mg을 무수 메틸렌 클로라이드 1ml에 용해시키고 빙상의 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 6mg을 가한 후, 실온에서 12시간 동안 교반시켰다 생성된 디사이클로헥실우레아(DCU)를 여과하고, 감압하에 건조시켜 목적하는 에스테르를 100mg 수득했다(수율 67%).
참조 실시예 3
서열확인번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 hG-CSF의 1번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환되고, 3번째 아미노산인 류신이 트레오닌으로 치환되고, 4번째 아미노산인 글리신이 티로신으로 치환되고, 5번째 아미노산이 프롤린이 아르기닌으로 치환되고, 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 각각 치환된 hG-CSF 유도체(표 1, 화합물 k)를 다음과 같이 수득했다:
당해 hG-CSF 유도체를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pCfBD28를 지니는 이. 콜라이 W3110 str A[Escherichia coli ECfBD28 FERM BP-1479]를 LG 배지[박코-트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 5g 및 글루코즈 1g을 물 1,000ml에 용해시킨 다음, NaOH로 pH 7.0으로 조정시킴]에서 37℃하에 18시간 동안 배양하고,배양물 5ml를, 앰피실린 50㎍/ml를 함유하는 MCG 배지(0.6% Na2HPO4, 0.3% KH2PO4, 0.5% 염화나트륨, 0.5% 카사미노산, 1mm MgSO4, 4㎍/ml 비타민 B1, pH 7.2)내로 30℃하에 4 내지 8시간 동안 접종한 다음, 트립토판 유도체인 3β-인돌아크릴산(IAA로서 후술됨) 10㎍/ml를 가하고 추가로 2 내지 12시간 동안 배양을 지속시켰다. 배양물을 8,000rpm으로 10분 동안 원심분리시키고, 세포를 수집한 다음, 30mM염화나트륨과 30mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 세척했다. 세척시킨 세포를 상기 완충액 30ml에 현탁시키고 0℃에서 10분간 초음파 처리했다(BRANSON SONIC POWER COMPANY SONIFIER CELL DISRUPTOR 200, OUTPUT CONTROL 2). 이와 같이 초음파 처리된 파쇄물을 9,000rpm으로 30분간 원심분리시켜 세포의 펠렛을 수득했다. 이 펠렛으로부터, 문헌[참조: F.A.O. Marston et al. : BIO/TECHNOLOGY, 2, 8000(1984)]의 방법에 따라서, hG-CSF 유도체를 추출하고, 정제시키고, 용해시킨 다음, 재폴딩시켰다.
참조 실시예 4
참조 실시예 3에서 수득된 hG-CSF 유도체 300mg을 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 7.2) 100ml에, 참조 실시예 2에서 수득된 활성 에스테르 800mg을 가하고, 반응을 4℃에서 24시간 동안 수행했다. 0.7M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0) 100ml를 첨가한 후, 반응 혼합물을, 0.35M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)으로 평형시킨 부틸-도요펄 650M(Tosoh Corporation)의 컬럼(2.2cm x 26cm)상에 100ml/hr의 유속으로 가했다. 0.35M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0) 100ml를 100ml/hr의 유속으로 가하여 상기 컬럼을 세척한 후, 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0) 계에서 황산암모늄 농도 직선 구배를 0.35M에서 0 M로 감소시키면서 총 400ml 용량으로 100ml/hr의 유속하에 용출을 수행했다. 목적하는 물질은 0mM 내지 250mM의 황산암모늄 농도에서 용출되었다. 용출된 분획 250ml를 한외여과시키고[컷오프 Mr 또는 공칭 분자량 한계치 10,000 : YM10(Amicon Co., Ltd.)] 10ml로 농축시켰다. 이와 같이 농축시킨 용액을 세파크릴 S-200(Pharmacia Co., Ltd.)의 컬럼(5.6cm x 40cm)상에 160ml/hr의 유속으로 가한 다음, PBS를 동일한 유속으로 통과시켰다.
PBS를 통과시킨 후, 폴리에틸렌 글리콜의 카복실산 3분자가 hG-CSF 1분자와 결합된 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(트리-타입)는 약 360ml 내지 약 400ml에서 용출되었고, 폴리에틸렌 글리콜의 카복실산 2분자가 결합된 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(디-타입)는 약 420ml 내지 약 450ml에서 용출되었으며, 폴리에틸렌 글리콜의 카복실산 1분자가 결합된 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(모노-타입)는 약 500ml 내지 약 530ml에서 용출되어, 각각 2.1mg(수율 7%), 1.5mg(수율 5%) 및 1.5mg(수율 5%)이 수득되었다. 모노-타입, 디-타입 및 트리-타입의 순도는 모두 90% 이상이다.
참조 실시예 5
카복실 메틸 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜의 N-하이드록시석신이미드 에스테르의 제조
평균 분자량이 5,000이고 충분하게 탈수된 카복실 메틸 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(Nippon Oil and Fats Co,, Ltd.) 4g(0.8mmol) 및 N-하이드록시석신이미드(HONSu) 184mg을 무수 메틸렌 클로라이드 40ml에 용해시키고 DCC 300mg을 빙냉하, 아르곤 스트림중에 가한 다음, 30분간 교반시켰다. 연속적으로, 실온으로 만들어 1.5시간 동안 교반시킨 후, 불용성 물질(DCU)을 여과시키고, 여액을 감압하에 16ml로 농축시켰다. 생성된 용액을 무수 디에틸 에테르 240ml에 적가하여 침전물을 생성시키고, 이러한 침전물을 무수 디에틸 에테르로 세척한 후, 용매를 감압하에 제거하여 목적 화합물 2.8g(0.56mmol)을 수득했다(수율 70%).
참조 실시예 6
참조 실시예 3에서 추측한 hG-CSF 유도체 202.5mg을 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 7.3) 225ml를 5% 수산화나트륨을 사용하여 pH 8.1로 조정하고, 참조 실시예 5에서 수득한 카복실 메틸 모노메톡시콜리에틸렌 글리콜의 N-하이드록시석신이미드 에스테르 1.1g을 상기 hG-CSF 함유 용액에 가한 다음, 반응을 4℃에서 6시간 동안 수행했다. 이어서, 트리스(하이드록시메틸)-아미노 메탄 26.7mg을 함유하는 수용액 0.5ml를 첨가함으로써 반응 용액을 수득했다, 반응 용액을 8,000rpm하, 4℃에서 40분간 원심분리시키고, 황산암모늄을 0.68M의 최종 농도로 상층액 370ml에 가하고, 이 용액을 부틸-도요펄 650M(Tosoh Corporation)의 컬럼(5cm x 6.6cm = 130ml)상에 130ml/hr의 유속으로 가했다.
0.68M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 390ml을 130ml/hr의 유속으로 가하여 상기 컬럼을 세척한 후, 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 390ml를 130ml/hr의 유속으로 가하여 용출을 수행했다. 목적 물질은 35ml 내지 80ml에서 용출되었다. 용출된 분획 45ml를 한외여과시키고[컷오프 Mr 또는 공칭 분자량 한계치 10,000 : YM10] 30ml로 농축시켰다. 상기 농축된 용액을, PBS로 평형시킨 세파크릴 S-200(Pharmacia Co., Ltd.)의 컬럼(5cm x 51cm = 1000ml)상에 200ml/hr의 유속으로 가한 다음, PBS를 동일한 유속으로 통과시켰다. PBS 통과후, 화학적으로 변형된 hG-CSF 폴리펩타이드는 약 200ml 내지 약 380ml에서 용출되었는데, 이는 폴리에틸렌 글리콜 1 내지 4분자(모노-타입 내지 테트라-타입) 결합체의 혼합물이다(총중량 : 158mg, 수율 : 78%).
참조 실시예 7
카복실 메틸 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜의 N-하이드록시석신이미드 에스테르의 제조
평균 분자량이 10,000이고 충분하게 탈수된 카복실 메틸 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(Nippon Oil and Fats Co., Ltd.) 12g(1.2mmol)과 HONSu 276mg을 무수 메틸렌 클로라이드 120ml에 용해시키고 DCC 495mg을 빙냉하, 아르곤 스트림중에 가한 다음, 30분간 교반시켰다. 이어서, 실온으로 만들어 1.5시간 동안 교반시킨후, 불용성 물질(DCU)을 여과시킨 다음, 여액을 감압하에 48ml로 농축시켰다. 생성 용액을 무수 디에틸 에테르 720ml에 적가하여 침전물을 생성시키고, 이 침전물을 무수 디에틸 에테르로 세척한 후, 용매를 감압하에 제거하여 목적 화합물(1.0mmol) 10.0g을 수득했다(수율 83%).
참조 실시예 8
서열확인번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 hG-CSF 40.8mg을 함유하는 50mM인산염 완충액(pH 7.3) 30ml를 5% 수산화나트륨으로 pH 8.3으로 조정하고, 빙냉하에, 참조 실시예 7에서 수득한 카복실 메틸 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜의 N-하이드록시석신이미드 에스테르 326mg에 가하고, 반응을 4℃에서 6시간 동안 수행했다. 이어서, 트리스-(하이드록시메틸) 아미노 메탄 3.9mg의 수용액 0.1ml를 첨가하여 반응 용액을 수득했다. 이 반응 용액에 황산암모늄을 0.7M의 최종 농도로 가한 다음, 부틸 도요펄 650M(Tosoh Corporation)의 컬럼(2.5cm x 8.1cm = 40ml)상에 40ml/hr의 유속으로 가했다.
0.7M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 120ml을 40ml/hr의 유속으로 가하여 상기 컬럼을 세척한 후, 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 계에서 황산암모늄 농도의 직선 구배를 0.7에서 0 M로 감소시키면서 총 240ml의 용량으로 40ml/hr의 유속하에 용출을 수행했다. 목적 물질은 0.33M 내지 0.05M의 황산암모늄 농도에서 용출되었다. 용출된 분획 90ml를 한외여과시키고[컷오프 Mr 또는 공칭 분자량 한계 10,000 : YM10(Amicon Co., Ltd.)] 6ml로 농축시켰다. 이와 같이 농축된 용액을, PBS로 평형시킨 세파크릴 S-300(Pharmacia Co., Ltd.)의 컬럼(2.5cm x 45cm = 220ml)상에 44ml/hr의 유속으로 가한 다음, PBS를 동일 유속하에 통과시켰다, PBS 통과 후, 화학적으로 변형된 hG-CSF 폴리펩타이드는 약 60ml 내지 약 102ml에서 용출되었는데, 이는 폴리에틸렌 글리콜 1 내지 4 분자(모노-타입 내지 테트라-타입) 결합체의 혼합물이다(총 중량 9.5mg, 수율 23%).
참조 실시예 9
참조 실시예 3에서 수득한 hG-CSF 유도체 304.2mg을 함유하는 50M 인산염 완충액(pH 7.3) 338ml를 5% 수산화나트륨으로 pH 8.1로 조정하고, 빙냉하에, 참조 실시예 7에서 수득한 카복실 메틸 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜의 N-하이드록시석신이미드 에스테르 4.8g을 hG-CSF 함유 용액에 가하고, 반응을 4℃에서 6시간 동안 수행했다. 이어서, 트리스-(하이드록시메틸)아미노 메탄 58.1mg을 함유하는 수용액 0.5ml를 첨가하여 반응 용액을 수득했다. 이 반응 용액을 8,000rpm으로 4℃하에 40분간 원심분리시키고, 황산암모늄을 0.68M의 최종 농도로 상층액에 가한 다음, 0.68M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스 HCl 완충액(pH 8.0)으로 평형시킨 부틸 도요펄 650M(Tosoh Corporation)의 컬럼(5cm x 7.1cm = 140ml)상에 140ml/hr의 유속으로 가했다.
0.68M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0) 420ml를 140ml/hr의 유속으로 가하여 상기 컬럼을 세척한 후, 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0) 420ml로 140ml/hr의 유속하에 용출을 수행했다. 목적 물질은 82ml 내지 184ml에서 용출되었다. 용출된 분획 102ml를 PBS로 평형시킨 세파크릴 S-300(Pharmacia Co., Ltd.)의 컬럼(10cm x 50cm = 3,900ml)상에 780ml/hr의 유속으로 가한 다음, PBS를 동일 유속하에 통과시켰다. PBS 통과 후, 화학적으로 변형된 hG-CSF 폴리펩타이드는 약 1,600ml 내지 약 2,070ml에서 용출되었는데, 이는 폴리에틸렌 글리콜 1 내지 4 분자(모노-타입 내지 테트라-타입) 결합체의 혼합물이다(총 중량 216mg, 수율 71%).
참조 실시예 10
6-(3-카복시프로필아미노)-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-s-트리아진의 N-하이드록시석신이미드 에스테르의 제조
γ-아미노 부티르산 412mg(4.0mmol)을 0.1M 붕산염 완충액(pH 10) 300ml에 용해시키고, 6-클로로-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-s-트리아진(SEIKAGAKU CORPORATION) 20g(2mmol)을 빙냉하에 가하고 4℃에서 밤새 교반시켰다. 이 혼합물을 실온에서 6시간 더 교반시킨 후, 용액을 1N 염산으로 pH 1로 조정한 다음, 클로로포름을 사용하여 추출했다. 클로로포름 상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 건조된 후에는 여과시켜 분리했다. 용매를 감압하에 제거하고 생성된 고체를 무수 아세톤에 가한 다음, 용해시켰다. 이러한 아세톤 용액을 감압하에 농축시키고 목적하는 카복실산을 실온에 둠으로써 재결정화시켜, 결정 15.8g(1.6mmol)을 수득했다.
상기 카복실산 10g(1.0mmol)과 N-하이드록시석신이미드 230mg을 무수 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 DCC 413mg에 빙냉하에 아르곤 스트림중에 가한 다음, 30분간 교반시켰다. 이어서, 실온으로 만든 후, 1.5시간 동안 교반시키고, 불용성 물질(DCU)을 여과시킨 다음, 여액을 감압하에 40ml로 농축시켰다. 생성 용액을 부수 디에틸 에테르 600ml에 적가하여 침전물을 생성시키고, 이 침전물을 무수 디에틸 에테르로 세척한 후, 용매를 감압하에 제거하여 목적하는 화합물 7.7g(0.77mmol)을 수득했다(수율 77%).
참조 실시예 11
서열확인번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 hG-CSF 40.8mg을 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 7.3) 30ml를 5% 수산화나트륨으로 pH 7.2로 조정하고, 참조 실시예 10에서 수득한 6-(3-카복시프로필아미노)-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌글리콜)-s-트리아진의 N-하이드록시석신이미드 에스테르 326mg을 빙냉하에 가하고, 반응을 4℃에서 48시간 동안 수행했다. 이어서, 트리스-(하이드록시메틸)아미노메탄 3.9mg의 수용액 0.1를 첨가하여 반응 용액을 수득했다. 이 반응 용액에 황산암모늄을 0.7M의 최종 농도로 가한 다음, 부틸-도요펄 650M(Tosoh Corporation)의 컬럼(2.5cm x 8.1cm = 40ml)상에 40ml/hr의 유속으로 가했다.
0.7M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 120ml를 40ml/hr의 유속으로 가하여 상기 컬럼을 세척한 후, 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 계에서 황산암모늄 농도의 직선 구배를 0.7 내지 0 M로 감소시키면서 총 240ml의 용량으로 40ml/hr의 유속하에 용출을 수행했다. 목적 물질은 0.35M 내지 0.07M의 황산암모늄 농도에서 용출되었다. 용출된 분획 90ml를 한외여과시키고[컷오프 Mr 또는 공칭분자량 한계 10,000 : YM10(Amicon Co., Ltd.)] 6ml로 농축시켰다. 이와 같이 농축된 용액을, PBS로 평형시킨 세파크릴 S-300(Pharmacia Co., Ltd.)의 컬럼(2.5cm x 47cm = 230ml)상에 46ml/hr의 유속으로 가한 다음, PBS를 동일유속하에 통과시켰다. PBS 통과 후, 화학적으로 변형된 hG-CSF 폴립펩타이드는 약 110ml 내지 약 145ml에서 용출되었는데, 이는 폴리에틸렌 글리콜 1 내지 3분자(모노-타입 내지 트리-타입) 결합체의 혼합물이다(총 중량 7.8mg, 수율 19%).
참조 실시예 12
참조 실시예 3에서 수득한 hG-CSF 유도체 540mg을 함유하는 50mM 인산염완충액(pH 7.3) 600ml를 5% 수산화나트륨으로 pH 7.2로 조정하고, 참조 실시예 10에서 수득한 6-(3-카복시프로필아미노)-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌글리콜)-s-트리아진의 N-하이드록시석신이미드 에스테르 8.7g을 빙냉하에 가하고, 반응을 4℃에서 48시간 동안 수행했다.
이어서, 트리스-(하이드록시메틸)아미노 메탄 105mg의 수용액 0.5ml를 첨가하여 반응 용액을 수득한다. 이 반응 용액을 8,000rpm으로 4℃하에 40분간 원심분리시키고, 황산암모늄을 0.68M의 최종 농도로 상층액 600ml에 가한 다음, 이 용액을, 0.68M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형시킨 부틸 도요펄 650M(Tosoh Corporation)의 컬럼(5cm x 18cm = 350ml)상에 350ml/hr의 유속으로 가했다.
0.68M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 700ml를 350ml/hr의 유속으로 가하여 상기 컬럼을 세척한 후, 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 계에서 황산암모늄 농도의 직선 구배를 0.68에서 0 M로 감소시키면서 총 2800ml의 용량으로 350ml/hr의 유속하에 용출을 수행했다. 목적 물질은 0.39M 내지 0.20M의 황산암모늄 농도에서 용출되었다. 용출된 분획 800ml를 한외여과시키고[컷오프 Mr 10,000 : YM10(Amicon Co., Ltd.)] 100ml로 농축시킨다. 이와 같이 농축된 용액을, PBS로 평형시킨 세파크릴 S-300 (Pharmacia Co., Ltd.)의 컬럼(10cm x 50cm = 3900ml)상에 780ml/hr의 유속으로 가한 다음, PBS를 동일유속하에 통과시켰다. PBS 통과 후, 화학적으로 변형된 hG-CSF VHF리펩타이드는 약 1750ml 내지 약 2250ml에서 용출되었는데, 이는 폴리에틸렌 글리콜 1 내지 3 분자(모노-타입 내지 트리-타입) 결합체의 혼합물이다(총 중량 303mg, 수율 56%).
참조 실시예 13
6-(3-카복시프로필아미노)-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-s-트리아진의 제조
평균 분자량이 12,000이고 충분하게 탈수시킨 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(Nippon Oil and Fats Co., Ltd.) 100g(8.33mmol), 산화 아연(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 9.3g, 및 분자체(타입 4A)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 83.5g을 건조된 벤젠에 용해시키고 아르곤 스트림하 실온에서 밤새 방치시켰다. 이어서, 분자체를 제거하고 분자체 42g을 새롭게 가하고, 이 용액을 유사하게 밤새 방치시켰다. 이어서, 분자체를 제거한 다음, 증류기를 사용하여 아르곤 스트림하 80℃에서 증류시키고, 제1 증류물 50ml를 제거했다. 또한, 분자체(타입 4A) 100g이 부가된 속실릿트 추출기(Soxhlet extractor)(토양용)를 사용하여, 용액을 아르곤 스트림하 80℃에서 밤새 환류시키면서 탈수시켰다. 냉각시킨 후, 시아누릭 클로라이드 36mg(4.0mmol)을 반응 용액에 가하고 5일간 환류시키면서 유사하게 탈수시켰다. 건조된 디에틸 에테르에 의해 재결정화시킨 시아누릭 클로라이드를 이 경우에 사용했다. 연속적으로, 용액을 실온에서 냉각시키고, 건조된 벤젠 300ml를 이 용액에 가하고, 이를 3,600rpm으로 10분간 원심분리시킨 다음, 불용성 물질을 제거했다. 상층액을 감압하에 300ml로 농축시키고 건조된 디에틸 에테르 3,000ml에 적가하여 침전물을 생성시켰다. 이 침전물을 수집하고 건조된 디에틸 에테르를 세척한 다음, 용매를 감압하에 제거하여 건조된 침전물을 수득했다.
이러한 건조된 침전물 100g을 빙냉하에, 0.1M 붕산염 완충 용액(pH 10) 1,000ml에 가하고(이때, γ -아미노 부티르산 24g(12.0mmol)이 상기 완충액1,000ml에 용해된다) 4℃에서 밤새 교반시켰다. 실온에서 6시간 더 교반시킨 후, 용액을 1N 염산으로 pH 1.0으로 조정한 다음, 클로로포름으로 추출시켰다. 클로로포름 상을 무수 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과시켜 분리하고, 용매를 감압하에 제거했다. 건조된 아세톤을 생성된 백색 고체에 가하고 이 고체를 용해시켰다. 상기 아세톤 용액을 감압하에 농축시키고 이를 실온에 둠으로써 재결정화시켜 표적 화합물을 약 70 내지 80% 함유하는 조생성물을 90g 수득했다. 이 생성물을 증류수 6,000ml에 용해시키고, 2N 수소화나트륨 12,000ml를 미리 통과시킨 후 증류수로 평형시킨 음이온 교환 수지 HPA-75 (Mitsublshi Chemical Corporation)의 컬럼상에 가하고, 주성분으로서 당해 화합물을 함유하는 분획을 증류수로 용출시켜 수집했다, 수득한 용액을 1N 염산으로 pH 1.0으로 조정한 다음, 클로로포름으로 추출했다. 클로로포름 상을 추수 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과시켜 분리하고, 용매를 감압하에 제거하여 고도로 정제된 목적 화합물 43.6g을 수득했다(수율 43%).
참조 실시예 14
6-(3-카복시프로필아미노)-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-s-트리아진의 N-하이드록시석신이미드 에스테르의 제조
참조 실시예 13의 방법에 따라서 합성하여 충분히 건조시킨 6-(3-카복시프로필아미노)-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-s-트리아진 25g과 N-하이드록시 석신이미드 240mg을 무수 메틸렌 클로라이드 400ml에 용해시키고 DCC 431mg에 빙냉하에 아르곤 스트림중에 가한 다음, 30분간 교반시켰다. 이어서, 실온으로 만든 다음, 1.5시간 동안 교반시키고, 불용성 물질(DCU)을 여과시키고, 여액을 감압하에160ml로 농축시켰다. 생성 용액을 무수 디에틸 에테르 2,400ml에 적가하여 침전물을 생성시키고, 상기 침전물을 무수 디에틸 에테르로 세척한 후, 용매를 감압하에 제거하여 목적 화합물을 214g(0.89mmol) 수득했다(수율 89%).
참조 실시예 15
참조 실시예 3에서 수득한 hG-CSF 유도체 504mg을 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 7.3) 560ml를 5% 수산화나트륨으로 pH 7.3으로 조정하고, 참조 실시에 14에서 수득한 6-(3-카복시프로필아미노)-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-s-트리아진의 N-하이드록시석신이미드 에스테르 22.4g을 빙냉하에 가하고, 반응을 4℃에서 48시간 동안 수행했다. 이어서, 트리스-(하이드록시메틸) 아미노 메탄 113mg의 수용액 0.5ml를 첨가하여 반응 용액을 수득했다. 이 반응 용액에 황산암모늄을 0.7M이 최종 농도로 가한 다음, 이 용액을 0.7M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)로 평형시킨 부틸 도요펄 650M(Tosoh Corporation)의 컬럼(5cm x 25cm = 500ml)상에 500ml/hr의 유속으로 가했다. 0.7M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 1,500ml를 500ml/hr의 유속으로 가하여 컬럼을 세척한 후, 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 계에서 황산암모늄 농도의 직선 구배를 0.7M에서 0M로 감소시키면서 총 3,000ml의 용량으로 500ml/hr의 유속하에 용출을 수행했다. 목적 물질은 0.55M 내지 0.08M의 황산암모늄 농도에서 용출되었다. 황산암모늄을 0.7M의 최종 농도로 용출된 분획에 가하고, 0.7M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형시킨 부틸-도요펄 650M(Tosoh Corporation)의 컬럼(5cm x 15cm = 300ml)상에 450ml/hr의 유속으로 가했다. 0.7M황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 1,500ml를 450ml/hr의 유속으로 가하여 상기 컬럼을 세척한 후, 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 900ml를 450ml/hr의 유속으로 가하여 용출을 수행했다. 목적하는 물질은 67ml 내지 122ml에서 용출되었다. 용출된 분획 100ml를, PBS로 평형시킨 세파덱스 G-25(Pharmacia Co., Ltd.)의 컬럼(5cm x 50cm = 1000ml)상에 300ml/hr의 유속으로 가했다. 이어서, PBS를 동일한 유속으로 통과시켰다. PBS 통과후, 화학적으로 변형된 hC-SSF 폴리펩타이드가 약 350ml 내지 약 500ml에서 용출되었는데, 이는 폴리에틸렌 글리콜 1 내지 4 분자(모노-타입 내지 테트라-타입) 결합체의 혼합물이다(총 중량 282mg, 수율 56%).
참조 실시예 16
4-니트로페닐옥시카보닐(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)의 제조
평균 분자량이 10,000이고 충분히 탈수시킨 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(Nippon Oil and Fats Co., Ltd.) 5,5g(0.55mmol)을 무수 에틸렌 클로라이드 27.5ml에 용해시키고, 트리에틸아민 0.153ml와 4-니트로페닐 클로로포르메이트 222mg을 가한 다음, 아르곤 스트림하 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. 교반 동안, 트리에틸아민을 가하여 pH를 7.5 내지 8.5로 유지시켰다. 반응 용액을 감압하에 20ml로 농축시키고 무수 디에틸에테르 300ml에 적가하여 침전물을 생성시켰다. 이 침전물을 에틸 아세테이트로 재결정화시키고, 감압하에 건조시켜 표적 화합물 4.8g(0.48mmol)(수율 87%)을 수득했다.
참조 실시예 17
참조 실시예 3에서 수득한 hG-CSF 유도체 40.5mg을 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 7.3) 45ml를 5% 수산화나트륨으로 pH 8.7로 조정하고, 참조 실시예 16에서 수득한 4-니트로페닐옥시카보닐(o-메톡시폭리에틸렌 글리콜) 4.3g을 빙냉하에 가하고 이들을 4℃에서 3일 동안 반응시켜 반응 용액을 수득했다. 이 반응 용액에 황산암모늄을 0.7M의 최종 농도로 가한 다음, 0.7M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형시킨 부틸 도요펄 650M(Tosoh Corporation)의 컬럼(2.5cm x 12cm = 60ml)상에 60ml/hr의 유속으로 가했다. 0.7M 황산암모늄을 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 180ml를 60ml/hr의 유속으로 가하여 상기 컬럼을 세척한 후, 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 계에서 황산암모늄 농도의 직선 구배를 0.7M에서 0M로 감소시키면서 총 360ml의 용량으로 60ml/hr의 유속하에 용출을 수행했다.
이어서, 용출되지 않은 잔여 부분을 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)180ml로 통과시켜 용출시켰다. 목적 물질은 0.4M 내지 0M의 황산암모늄 농도에서 용출되었다. 용출된 분획 210ml를 한외여과시키고[컷오프 분자량 10,000:YM10(Amicon Co., Ltd.)] 30ml로 농축시켰다. 이와 같이 농축된 용액을, PBS로 평형시킨 세파크릴 S-300(Pharmacia Co., Ltd.)의 컬럼(5cm × 51cm = 1,000ml)상에 200ml/hr의 유속으로 가한 다음, PBS를 동일 유속하에 통과시켰다.
PBS 개시 후, 폴리에틸렌 글리콜의 카복실산 3 분자가 hG-CSF 1 분자와 결합된 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(트리-타입)는 약 285ml 내지 약 305ml에서 용출되었고, 폴리에틸렌 글리콜의 카복실산 2 분자가 결합된 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(디-타입)는 약 325ml 내지 약 345ml에서 용출되었으며, 폴리에틸렌 글리콜의 카복실산 1 분자가 결합된 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(모노-타입)는 약 365 내지 약 385ml에서 용출되어, 각각 6.2mg (수율 10.9%), 6.8mg(수율 11.9%) 및 5.0mg(수율 8.8%)이 수득되었다.
참조 실시예 18
6-(1-아미노프로필옥시카보닐옥시-4'-니트로페닐)-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-s-트리아진의 제조
3-아미노-1-프로판을 120mg(1.6mmol)을 0.1M 붕산염 완충액(pH 10) 200ml에 용해시키고 6-클로로-2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-s-트리아진(SElKAGAKU CORPORATION) 8g(0.8mmol)을 빙냉하에 가하고 4℃에서 밤새 교반시켰다. 반응 용액을 2N 염산으로 pH 1.0으로 조정한 다음, 클로로포름으로 추출했다. 2N 염산으로 2회 세척한 후, 클로로포름상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과 시켰다. 용매를 감압하에 제거하고 건조된 아세톤을 생성된 고체에 가한 다음, 이 고체를 용해시켰다. 이러한 아세톤 용액을 감압하에 농축시키고 폴리에틸렌 글리콜 유도체를 실온에 둠으로써 재결정화시켜 결정성 물질 5.5g을 수득했다(수율 69%).
이어서, 충분하게 건조시킨 상기 폴리에틸렌 글리콜 유도체 5.3g(0.53mmol)을 무수 메틸렌 클로라이드 26.5ml에 용해시키고 트리에틸아민 0.147ml를 가하고 추가로 4-니트로페닐 클로로포르메이트 214mg(1.06mmol)을 가한 다음, 4℃에서 4시간 동안 교반시켰다. 이어서, 반응 용액을 감압하에 20ml로 농축시키고 무수 디에틸 에테르 300ml에 적가하여 침전물을 생성시켰다. 이 침전물을 무수 디에틸 에테르로 세척하고, 용매를 감압하에 제거한 다음, 무수 에틸 아세테이트로 재결정화시키고 이를 감압하에 건조시킴으로써 목적 화합물 4.6g(0.46mmol)을 수득했다(수율 87%).
참조 실시예 19
활성화 폴리에틸렌 글리콜 M-SCM-20,000(Shearwater Polymer, Inc.) 287mg을 참조 실시예 3에서 수득한 hG-CSF 유도체 29.25mg을 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 7.5) 6.5ml에 가하고 반응을 4℃에서 6시간 동안 수행한 다음, 트리스(하이드록시메틸)아미노 메탄 50mg/ml 35㎕를 가하여 반응 용액을 수득했다. 이러한 반응 용액을 PBS로 평형시킨 세파크릴 S-300 (Pharmacia Co., Ltd.)의 컬럼(2.5cm × 45cm = 220ml)상에 44ml/hr의 유속으로 가한 다음, 동일한 유속으로 PBS를 통과시켰다.
PBS 개시 후, 폴리에틸렌 글리콜의 카복실산 2 분자가 결합된 화학적으로 변형된 hG-CSF 유도체(디-타입)는 약 96ml 내지 약 104ml에서 용출되어 상기 디-타입 3.8mg이 수득되었다(수율 13.0%).
참조 실시예 20
활성화 폴리에틸렌 글리콜 M-SSPA-20,000(Shearwater Polymer Inc.) 98mg을 참조 실시예 3에서 수득한 hG-CSF 유도체 28.8mg을 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 7.5) 6.7ml에 가하고 반응을 4℃에서 24시간 동안 수행한 다음, 40mg/ml의 트리스(하이드록시메틸) 아미노 메탄 30㎕을 가하여 반응 용액을 수득했다. 이러한 반응 용액을 PBS로 평형시킨 세파크릴 S-300(Pharmacia Co., Ltd.)의컬럼(2.5cm x 45cm = 220ml)상에 44ml/hr의 유속으로 가한 다음, PBS를 동일한 유속으로 통과시켰다.
PBS 개시 후, 폴리에틸렌 글리콜의 카복실산 3 분자가 결합된 화학적으로 변형된 hG-CSF 폴리펩타이드(트리-타입)는 약 78 내지 약 98ml에서 용출되어 상기 트리-타입 2.0mg이 수득되었다(수율 6.6%).
본 발명은 hG-CSF를 갖는 폴리펩타이드 분자내의 아미노, 카복실, 머캅토 및 구아니디노 그룹 중의 하나 이상의 그룹이 화학적으로 변형된 폴리펩타이드 및 이러한 변형된 폴리펩타이드를 포함하는 우수한 혈소판 증식 촉진 인자를 제공할 수 있다.

Claims (3)

  1. 사람 과립구 콜로니 자극 활성을 갖고 서열확인번호 1의 아미노산 서열 또는 서열확인번호 1에서 1번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환 되고, 3번째 아미노산인 류신이 트레오닌으로 치환되고, 4번째 아미노산인 글리신이 티로신으로 치환되고, 5번째 아미노산인 프롤린이 아르기닌으로 치환되고, 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 각각 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 분자내의 아미노 그룹중 하나 이상이 다음 화학식 1'의 폴리에틸렌 글리콜 유도체에 의해 화학적으로 변형된, 혈소판 증식 촉진제로서 사용하기 위한 화학적으로 변형된 폴리펩타이드.
    화학식 1'
    상기식에서,
    R1은 알킬 또는 알카노일 그룹이고;
    n은 양의 정수이고;
    X는 단일 결합, O, NH 또는 S이며;
    R2는 화학식{여기서, R3는 OH, 할로겐 또는 화학식 -Xa-(OCH2CH2)na-R1a[여기서, Xa, R1a및 na는 상기 X, R1및 n과 각각 동일하다]이고, Y는 할로겐 또는 화학식 -Z-(CH2)P-(O)m-W[여기서, Z는 O, S 또는 NH이고, W는 카복실 그룹의 반응성 유도체이며, p는 1 내지 6의 정수이고, m은 0 또는 1이다]}, 또는 화학식 -(CO)ma-(CH2)t-Wa[여기서, Wa및 ma는 상기 W 및 m과 각각 동일하고, t는 0 내지 6의 정수이다]이다.
  2. 사람 과립구 콜로니 자극 활성을 갖고 서열확인번호 1의 아미노산 서열 또는 서열확인번호 1에서 1번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환 되고, 3번째 아미노산인 류신이 트레오닌으로 치환되고, 4번째 아미노산인 글리신이 티로신으로 치환되고, 5번째 아미노산인 프롤린이 아르기닌으로 치환되고, 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 각각 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 분자내의 아미노 그룹중 하나 이상이 다음 화학식 1a의 그룹과 결합된, 혈소판 증식 촉진제로서 사용한기 위한 화학적으로 변형된 폴리펩타이드.
    화학식 1a
    상기식에서,
    R1은 알킬 또는 알카노일 그룹이고;
    n은 양의 정수이며;
    X는 단일 결합, O, NH 또는 S이고;
    R2a는 화학식{여기서, R3a는 OH, 할로겐 또는 화학식 -Xa-(OCH2CH2)na-R1a[여기서, Xa, R1a및 na는 상기 X, R1및 n과 각각 동일하다]이고, Ya는 단일 결합 또는 화학식 -Z-(CH2)p-(O)m-CO-[여기서, Z는 O, S 또는 NH이고, p는 1 내지 6의 정수이며, m은 0 또는 1이다]이다}, 또는 -(CO)ma-(CH2)t-CO-[여기서, ma는 상기 m과 동일하고, t는 0 내지 6의 정수이다]이다.
  3. 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 제1항 또는 제2항에 따른 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 약제학적으로 허용되는 투여 형태로 포함하는, 혈소판 수가 감소된 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
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