具体实施方式
为使本发明更加容易理解,下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
实施例1
单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药的合成
(1)单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸
十二聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺碳酸酯(4mmol)溶于乙酸乙酯(50mL)溶液中,加入赖氨酸(1mmol)和DBU(2mmol),40℃下反应48h,反应结束后,蒸除乙酸乙酯溶液,柱层析纯化得到化合物单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物。1H NMR(400MHz,Chloroform)δ4.55(s,1H),4.20(s,4H),3.63(s,4H),3.53(d,J=15.0Hz,96H),3.40(s,6H),3.18(s,2H),1.81(d,J=12.2Hz,2H),1.50(s,2H),1.25(s,4H).
(2)单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯
单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物(1mmol)溶于乙腈(50mL)溶液中,加入DSC(2mmol),60℃下反应48h,反应结束后,蒸除乙腈溶液,柱层析纯化得到单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯。1H NMR(400MHz,Chloroform)1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.58(s,1H),4.50(s,1H),4.19(s,4H),3.62(s,4H),3.53(d,J=15.0Hz,96H),3.39(s,6H),3.17(s,2H),2.83(s,4H),1.81(d,J=4.2Hz,2H),1.50(s,2H),1.25(s,4H).
(3)单分散十二聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺的合成
单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯(1mmo1)溶于乙酸乙酯(50mL)溶液中,加入马来酰亚胺基乙胺(2mmol)和DBU(1mmol),40℃下反应12h,反应结束后,蒸除乙酸乙酯溶液,柱层析纯化得到化合物单分散十二聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺。1H NMR(400MHz,Chloroform)δ:6.72(s,2H),4.81(s,1H),4.55(s,1H),4.23(d,J=28.8Hz,4H),3.61(d,J=15.0Hz,96H),3.57-3.45(m,10H),3.40(s,6H),3.18(s,2H),2.62(s,4H),1.86(d,J=40.3Hz,2H),1.50(s,2H),1.25(s,4H).
⑷单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药的合成
单分散十二聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺(2mmol)溶于丙酮(50mL)溶液中,加入白介素IL-12(1mmol)和DBU(0.5mmol),60℃下反应24h,反应结束后,蒸除丙酮溶液,透析纯化得到单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药。MALDI-TOF-MS:177684Da
实施例2
单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药的合成
(1)单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸
二十四聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺碳酸酯(4mmol)溶于乙酸乙酯(50mL)溶液中,加入赖氨(1mmol)和N-甲基吗啉(2mmol),40℃下反应48h,反应结束后,蒸除乙酸乙酯溶液,柱层析纯化得到化合物单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物。1HNMR(400MHz,Chloroform)δ4.55(s,1H),4.20(s,4H),3.63(s,4H),3.53(d,J=15.0Hz,192H),3.40(s,6H),3.18(s,2H),1.81(d,J=12.2Hz,2H),1.50(s,2H),1.25(s,4H).
(2)单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯
单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物(1mmol)溶于乙腈(50mL)溶液中,加入DSC(2mmol),60℃下反应48h,反应结束后,蒸除乙腈溶液,柱层析纯化得到单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯。1H NMR(400MHz,Chloroform)1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.58(s,1H),4.50(s,1H),4.19(s,4H),3.62(s,4H),3.53(d,J=15.0Hz,192H),3.39(s,6H),3.17(s,2H),2.83(s,4H),1.81(d,J=4.2Hz,2H),1.50(s,2H),1.25(s,4H).
(3)单分散二十四聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺的合成
单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯(1mmo1)溶于乙酸乙酯(50mL)溶液中,加入马来酰亚胺基乙胺(2mmol)和N-甲基吗啉(1mmol),40℃下反应12h,反应结束后,蒸除乙酸乙酯溶液,柱层析纯化得到化合物单分散二十四聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺。1HNMR(400MHz,Chloroform)δ:6.72(s,2H),4.81(s,1H),4.55(s,1H),4.23(d,J=28.8Hz,4H),3.61(d,J=15.0Hz,192H),3.57-3.45(m,10H),3.40(s,6H),3.18(s,2H),2.62(s,4H),1.86(d,J=40.3Hz,2H),1.50(s,2H),1.25(s,4H).
⑷单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药的合成
单分散二十四聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺(2mmol)溶于二氯乙烷(50mL)溶液中,加入白介素IL-12(1mmol)和N-甲基吗啉(0.5mmol),60℃下反应24h,反应结束后,蒸除二氯乙烷溶液,透析纯化得到单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药。MALDI-TOF-MS:182454Da
实施例3
单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药的合成
(1)单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸
四十八聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺碳酸酯(4mmol)溶于二氧六环(50mL)溶液中,加入赖氨酸(1mmol)和二异丙胺(2mmol),40℃下反应48h,反应结束后,蒸除二氧六环溶液,柱层析纯化得到化合物单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物。1H NMR(400MHz,Chloroform)δ4.55(s,1H),4.20(s,4H),3.63(s,4H),3.53(d,J=15.0Hz,384H),3.40(s,6H),3.18(s,2H),1.81(d,J=12.2Hz,2H),1.50(s,2H),1.25(s,4H).
(2)单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯
单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物(1mmol)溶于乙腈(50mL)溶液中,加入DSC(2mmol),60℃下反应48h,反应结束后,蒸除乙腈溶液,柱层析纯化得到单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯。1H NMR(400MHz,Chloroform)1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.58(s,1H),4.50(s,1H),4.19(s,4H),3.62(s,4H),3.53(d,J=15.0Hz,384H),3.39(s,6H),3.17(s,2H),2.83(s,4H),1.81(d,J=4.2Hz,2H),1.50(s,2H),1.25(s,4H).
(3)单分散四十八聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺的合成
单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯(1mmo1)溶于二氧六环(50mL)溶液中,加入马来酰亚胺基乙胺(2mmol)和二异丙胺(1mmol),40℃下反应12h,反应结束后,蒸除二氧六环溶液,柱层析纯化得到化合物单分散四十八聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺。1H NMR(400MHz,Chloroform)δ:6.72(s,2H),4.81(s,1H),4.55(s,1H),4.23(d,J=28.8Hz,4H),3.61(d,J=15.0Hz,384H),3.57-3.45(m,10H),3.40(s,6H),3.18(s,2H),2.62(s,4H),1.86(d,J=40.3Hz,2H),1.50(s,2H),1.25(s,4H).
⑷单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药的合成
单分散四十八聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺(2mmol)溶于甲苯(50mL)溶液中,加入白介素IL-12(1mmol)和二异丙胺(0.5mmol),60℃下反应24h,反应结束后,蒸除甲苯溶液,透析纯化得到单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药。MALDI-TOF-MS:192454Da
实施例4
细胞毒性研究
使用B16小鼠黑素瘤细胞进行体外单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药的细胞毒性研究
将黑素瘤细胞按2.5x104细胞/ml的浓度种在24孔平板中,并于35℃在含5.5%C02的95%湿度下在50:55Delbecco改进的极限最小培养基(DEM)和含10%小牛血清的F12培养基中生长24小时。然后用含5x10-9M-75x10-9 M浓度的白介素IL-12或单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药的培养基代替化培养基.40小时后,经胰蛋白酶消化使细胞,并用Coulter计数器进行计数.细胞培养基中的DMSO(二甲基亚矾,用于溶解白介素IL-12)和0.05M NaHC03溶液(用于溶解单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药)的最终浓度小于0.01。对照研究表明这一数量的溶剂对细胞生长不产生任何作用.而且,用于产生5X 10-9M至75x10-9M当量白介素IL-12浓度的PG浓度范围对细胞增殖不产生作用.
单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药对小鼠的MCa-4肿瘤的抗肿瘤作用
为了确定单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药对固体乳腺肿瘤的抗肿瘤能力,将MCa-4细胞((5X 10-4细胞)注射在雌性C3Hf/Kam小鼠的右腿肌肉中。当肿瘤长至8mm(约2周)时,给予相当10,20和40mg白介素IL-12/kg体重的单剂量白介素IL-12或单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药.首先将白介素IL-12溶解在与乳浮等体积的无水乙醇中.在15分钟注射时间内,进一步用灭菌生理盆水稀释((1:4体积)这种储备溶液.将单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药溶解在盐水(6mg当量白介素IL-12/ml)中,通过无菌过滤器过滤。对照实验中使用盆水、白介素IL-12载体、用盐水稀释((1:4)的无水乙醇/乳浮((1:1)和盐水中的PEG溶液(600mg吨体重).每天测量肿瘤生长,即测定三个正交肿瘤直径.当肿瘤直径达12mm时,计算肿瘤生长延迟.
剂量为40mg/kg时,单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药和白介素IL-12都能有效延迟肿瘤生长.虽然两者没有统计学上差异,但单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药较白介素IL-12更有效。单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素IL-12前药治疗肿瘤需要12.4天使肿瘤直径达到12mm,而白介素IL-12前药需要6.5天。