CN115894660B - 聚乙二醇衍生物修饰的白介素12及其制备方法和应用 - Google Patents

聚乙二醇衍生物修饰的白介素12及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种聚乙二醇衍生物修饰的白介素12及其制备方法和应用。该聚乙二醇衍生物修饰的白介素12是由聚乙二醇衍生物与白介素12经过修饰反应获得；聚乙二醇衍生物的活性基团包括醛基、酮基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、对硝基苯基、氯甲酸异丁酯基、乙烯基砜基、端炔烃基、卤代基、硫代基和羧基中的一种或多种；白介素12的活性基团包括N末端的α‑氨基、赖氨酸侧链的ε‑氨基和半胱氨酸游离的巯基中的一种或多种。经过聚乙二醇衍生物修饰的白介素12能够平衡IL‑12的药物活性和药物毒性，能够单次使用更大剂量，且能够在体内维持更长时间的有效血药浓度而不会带来严重的毒副作用，有利于治疗的持续性，改善疾病治疗效果。

Description

聚乙二醇衍生物修饰的白介素12及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种聚乙二醇衍生物修饰的白介素12及其制备方法和应用。
背景技术
白介素12(IL-12)作为一种具有广泛生物活性的细胞因子，在免疫调控方面发挥着不可或缺的作用。白介素12可以促使Th0细胞向Th1方向分化成熟，阻止Th0向Th2方向的发展，诱导T细胞和NK细胞生成几种细胞因子：IFN-γ、IFN-α、GM-CSF、M-CSF、IL-13、IL-8、IL-2，并通过这些介质发挥作用，抑制Th2细胞分泌IL-4等，IL-12还可以诱导增强细胞毒性，其诱导作用比IL-2弱，与IFN-γ诱导的作用相当。IL-12与IL-2联合作用时，可观察到NK细胞介导的细胞毒性增强最明显，而这两种因子间是加合作用而非协同作用。对于先天免疫和适应性免疫，IL-12都发挥着重要的调节作用。因此，IL-12在机体抵抗各种细菌，病毒，真菌，寄生虫的感染方面，在抗肿瘤方面都有明显的应用价值。另外，IL-12还对造血细胞有调控作用，IL-12与铁因子(SF)、IL-13及其它造血细胞生长因子协同作用，增加培养液中造血干细胞的存活率与增殖，以及增加早期多能造血干细胞(包括具有骨髓B淋巴系统两性潜能的细胞)集落的数目与大小。因此，IL-12在血象恢复方面也具有很大的积极意义，可以用于放疗，化疗引起的血象异常的副作用的改善，也可以应用于核泄漏事故，核战争导致的急性辐射综合征的预防和治疗。
但是单纯的白介素12本身作为一种蛋白质，在作为药物的应用中也存在很多缺陷，白介素12在体内的半衰期较短，仅有5.3～9.6小时，另外白介素12的系统性用药还会带来较多的副作用，比如：发烧/发冷，疲劳，恶心，呕吐，头痛，特别是在加大IL-12使用量的情况下，副作用提升明显，在以往的临床试验中，给患者连续使用500ng/Kg/天的IL-12，就会引起严重的毒副作用(Effects of Single-Dose Interleukin-12Exposure onInterleukin-12-Associated Toxicity and Interferon-g Production)。IL-12的毒副作用主要与IL-12刺激T细胞或者NK细胞产生的过多的干扰素γ有关，为了应对毒副作用的增加，一般治疗中IL-12的使用量较低。但是，较低剂量的使用IL-12，又会因为IL-12的半衰期太短，需要频繁注射，来维持血药浓度。频繁注射IL-12虽然能够维持血药浓度，但是给患者带来非常大的困扰，而且IL-12在血液中的含量短时间内频繁发生剧烈波动，不利于治疗，注射时间间隔太大会造成治疗不持续，治疗效果变差，注射时间间隔太短，容易产生时间累积毒性。
聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)别名聚氧乙烯醇或聚氧乙烯二醇，系环氧乙烷与单乙二醇(或双乙二醇)在碱性催化剂催化之下聚合而成。因其化学性质稳定，生物安全性好，在医药领域的应用由来已久。聚乙二醇修饰的蛋白或多肽类药物通过多种方式延长药物在体内的血药半衰期，稳定性，抑制免疫原性。
CN1186121A公开了一种构建真核表达载体PEG携带IL-12基因。该方法采用PEG来运载IL-12基因并转染入真核细胞，翻译并表达合成IL-12蛋白，并分泌到细胞外以实现其功效。然而物理运载没有化学键结合牢固和稳定，需要经过的环节较多，药物见效慢，且最终的IL-12的表达量也很难控制，如果表达量太低药效不明显，如果表达量太高，药物副作用增大。除此之外，IL-12本身是一种含有多种氨基酸链的非单分散性的大分子，在机体内代谢半衰期较短，即使表达出IL-12，单纯的IL-12蛋白作为药物应用于治疗中也存在药物的治疗窗口很小、毒副作用很大的缺陷。
CN109438568A公开了一种单分散聚乙二醇单甲醚修饰的白介素IL-12前药的制备方法。该方法具体向单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯中加入白介素12、碱、溶剂，在50℃条件下反应得到单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素12前药；其虽然通过化学键将白介素12与聚乙二醇进行连接，增大了产物分子量，但是所用的聚乙二醇分子量较小，为了达到较好的延长半衰期的效果，此专利使用聚乙二醇对IL-12进行了多位点随机修饰，多位点随机修饰势必会遮蔽更多IL-12的表面，使IL-12得活性下降更多，而且反应在50℃的碱性环境的有机溶剂中进行，对IL-12这种蛋白质极其不友好，很容易造成蛋白变性失活，也会进一步造成IL-12活性的下降，而且随机修饰，产物复杂，在作为药物时存在更大潜在风险。
发明内容
基于现有技术中存在的缺陷，本发明的第一目的在于提供一种聚乙二醇衍生物修饰的白介素12，通过对白介素12结构进行改进降低其在临床应用中的副作用；本发明的第二目的在于提供该聚乙二醇衍生物修饰的白介素12的制备方法，通过控制反应条件和制备条件，获得聚乙二醇衍生物单位点定点修饰的白介素12或多位点可逆修饰的白介素12；本发明的第三目的在于提供该聚乙二醇衍生物修饰的白介素12在制备提高免疫力药物、抗感染药物中的应用；本发明的第四目的在于提供该聚乙二醇衍生物修饰的白介素12在制备预防或治疗血象异常疾病的药物中的应用；本发明的第五目的在于提供该聚乙二醇衍生物修饰的白介素12在制备预防或治疗肿瘤的抗肿瘤药物中的应用；本发明的第六目的在于提供包含有该聚乙二醇衍生物修饰的白介素12的药物制剂。
本发明的技术方案通过以下技术手段得以实现：
一方面，本发明提供一种聚乙二醇衍生物修饰的白介素12，其是由聚乙二醇衍生物与白介素12经过修饰反应获得；其中，由聚乙二醇衍生物的活性基团与白介素12的活性基团参与修饰反应；所述聚乙二醇衍生物的活性基团包括醛基、酮基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、对硝基苯基、氯甲酸异丁酯基、乙烯基砜基、端炔烃基、卤代基、硫代基和羧基中的一种或多种，但不限于此；所述白介素12的活性基团包括N末端的α-氨基、赖氨酸侧链的ε-氨基和半胱氨酸游离的巯基中的一种或多种，但不限于此。
本发明将聚乙二醇衍生物与IL-12通过共价键偶联，获得引入聚乙二醇衍生物修饰的白介素12，使其在保持白介素12原有生物活性的情况下，进一步拥有了更多成为潜在药物产品的优势，包括但不限于分子量和水化半径增大、体内稳定性提高、体内半衰期变长、免疫原性减小、贮存稳定性提高、储存能力、作为液体制剂、冷冻配制品、干燥冻干配制品在若干天后的安全使用等优势。经过聚乙二醇衍生物修饰的白介素12除了能够延长半衰期，还能够平衡IL-12的药物活性和药物毒性。IL-12的毒副作用主要由IL-12刺激T细胞或者NK细胞产生的过量的干扰素γ导致，稍微过量的IL-12便会带来非常大的毒副作用，对于治疗有很大困扰，剂量难以把控，天然的IL-12用于治疗时，只能通过降低单次注射剂量减低毒副作用，但是较低的使用剂量又使得药物治疗效果难以维持，需要频繁低剂量注射维持血药浓度，通过聚乙二醇衍生物修饰的IL-12，可以降低IL-12的毒副作用，平衡药物活性与药物毒性，能够单次使用更大剂量，且能够在体内维持更长时间的有效血药浓度，而不会带来严重的毒副作用，有利于治疗的持续性，改善疾病的治疗效果。
本发明中的白介素12也可以进一步包括白介素12的突变体，单体，聚体，生物活性肽，功能性片段，功能性衍生物，融合蛋白，以及构成白介素12的亚基P40，P35，白介素12的亚基P40，P35的突变体，单体，聚体，生物活性肽，功能性片段，功能性衍生物，融合蛋白等。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，当所述聚乙二醇衍生物的活性基团为醛基或酮基时，进行修饰反应的所述白介素12的活性基团为N末端的α-氨基；
当所述聚乙二醇衍生物的活性基团为马来酰亚胺基、乙烯基砜基、端炔烃基、卤代基或硫代基时，进行修饰反应的所述白介素12的活性基团为半胱氨酸游离的巯基；优选为P40亚基的C252位置的半胱氨酸游离的巯基；
当所述聚乙二醇衍生物的活性基团为琥珀酰亚胺基、氯甲酸异丁酯基、对硝基苯基或羧基时，进行修饰反应的所述白介素12的活性基团为N末端的α-氨基或赖氨酸侧链的ε-氨基。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇衍生物的分子量为5～40KD；优选为10～30KD；更优选为20KD。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇衍生物包括聚乙二醇醛基衍生物、聚乙二醇酮基衍生物、聚乙二醇活性酯衍生物、聚乙二醇羧基衍生物、聚乙二醇含不饱和键衍生物、聚乙二醇卤代烷衍生物、聚乙二醇含硫活性衍生物中的一种或多种；但不限于此。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇醛基衍生物包括聚乙二醇乙醛衍生物、聚乙二醇丙醛衍生物和聚乙二醇丁醛衍生物中的一种或多种；但不限于此。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇丙醛衍生物包括单甲氧基聚乙二醇丙醛和/或两臂聚乙二醇丙醛；但不限于此。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇活性酯衍生物包括聚乙二醇琥珀酰亚胺活性酯衍生物、聚乙二醇对硝基苯活性酯衍生物和聚乙二醇氯甲酸异丁酯活性酯衍生物中的一种或多种；但不限于此。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇琥珀酰亚胺活性酯衍生物包括单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯和/或单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯；但不限于此。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇羧基衍生物包括聚乙二醇乙酸衍生物、聚乙二醇丙酸衍生物、聚乙二醇丁酸衍生物、聚乙二醇戊酸衍生物、聚乙二醇己酸衍生物、聚乙二醇乙二酸衍生物、聚乙二醇丙二酸衍生物、聚乙二醇丁二酸衍生物、聚乙二醇戊二酸衍生物和聚乙二醇己二酸衍生物中的一种或多种；但不限于此。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇羧基衍生物包括单甲氧基聚乙二醇乙酸。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇含不饱和键衍生物包括聚乙二醇乙烯基砜类、聚乙二醇马来酰亚胺类、聚乙二醇端乙炔类中的一种或多种；但不限于此。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇含不饱和键衍生物包括单甲氧基聚乙二醇乙烯基砜、单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺和两臂聚乙二醇马来酰亚胺中的一种或多种；但不限于此。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇卤代烷衍生物包括聚乙二醇碘丙酰胺衍生物、聚乙二醇碘乙酰胺衍生物、聚乙二醇氯丙酰胺衍生物、聚乙二醇氯乙酰胺衍生物、聚乙二醇溴丙酰胺衍生物、聚乙二醇溴乙酰胺衍生物、聚乙二醇氟丙酰胺衍生物和聚乙二醇氟乙酰胺衍生物中的一种或多种；但不限于此。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇卤代烷衍生物包括单甲氧基聚乙二醇碘乙酰胺。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇含硫活性衍生物包括聚乙二醇二硫异吡啶类、聚乙二醇硫代磺酸酯类、和聚乙二醇巯基类中的一种或多种；但不限于此。
上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12中，优选地，所述聚乙二醇含硫活性衍生物包括单甲氧基聚乙二醇二硫异吡啶、单甲氧基聚乙二醇硫代甲磺酸酯和单甲氧基聚乙二醇硫代苯磺酸酯中的一种或多种；但不限于此。
另一方面，本发明还提供上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12的制备方法，其包括如下步骤：
将白介素12溶于溶剂中配制成白介素12溶液；
将聚乙二醇衍生物溶于水中配制成聚乙二醇衍生物水溶液；
将聚乙二醇衍生物水溶液滴入白介素12溶液中进行搅拌反应；
反应结束后进行超滤除杂，然后通过色谱分离纯化得到聚乙二醇衍生物修饰的白介素12。
本发明的制备方法中，通过控制反应条件，能够获得聚乙二醇衍生物单位点定点修饰的IL-12或者多位点可逆修饰的IL-12。单位点修饰的比多位点修饰占用蛋白质更少的表面积，修饰位点更明确，同时采用单个分子量更大的聚乙二醇衍生物，在产物分子量增大明显的情况下可以更好的保留IL-12的生物活性，适当降低的活性还可以更容易与其他药物配伍使用。多位点可逆修饰的IL-12在使用时具有更大的分子量，更长的血药半衰期，PEG可以再次解离下来，恢复IL-12的活性。同时本发明的反应是在低温或者常温下进行，能够更好的保留IL-12的生物活性。具体为：
当聚乙二醇衍生物采用聚乙二醇醛基衍生物，IL-12只有两个亚基，但是同时具有39个赖氨酸侧链氨基，通过控制反应条件，能够实现聚乙二醇醛基衍生物选择性的定点偶联修饰于白介素12的末端α-氨基上，而不是随机修饰白介素12的末端α-氨基或赖氨酸侧链的ε-氨基上；当聚乙二醇衍生物采用聚乙二醇活性酯衍生物和聚乙二醇羧基衍生物时，通过控制反应条件，能够实现聚乙二醇活性酯衍生物或聚乙二醇羧基衍生物选择性定点偶联修饰于白介素12的末端α-氨基上或赖氨酸侧链的ε-氨基上；这种含有酯键的连接基团能够使修饰的白介素12具有可逆修饰的特点，其在使用过程中，能够使聚乙二醇通过水解反应与IL-12再次分离，使IL-12获得更完全的生物活性。将聚乙二醇衍生物采用聚乙二醇含不饱和键衍生物、聚乙二醇卤代烷衍生物或聚乙二醇含硫活性衍生物时，通过控制反应条件，能够实现聚乙二醇含不饱和键衍生物、聚乙二醇卤代烷衍生物或聚乙二醇含硫活性衍生物选择性定点偶联修饰于白介素12的P40亚基的C252位置的半胱氨酸游离的巯基上。
上述的制备方法中，优选地，所述色谱包括离子交换色谱、体积排阻色谱、疏水色谱或反相色谱；但不限于此。
上述的制备方法中，优选地，所述聚乙二醇衍生物与所述白介素12的摩尔比为(5.5～20)：1。
上述的制备方法中，优选地，当所述聚乙二醇衍生物为聚乙二醇醛基衍生物或聚乙二醇酮基衍生物时，所述溶剂包括pH值为4～6.5的酸性缓冲溶液，优选为pH值为5的酸性缓冲溶液，以控制反应条件为酸性环境；搅拌反应的温度为0～40℃，优选为10℃；反应过程中还需要添加还原剂。
上述的制备方法中，优选地，所述酸性缓冲溶液包括MES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液和磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中的一种或多种，但不限于此。
上述的制备方法中，优选地，所述还原剂包括氰基硼氢化钠、硼氢化钠、三乙酰基硼氢化钠、硼烷和二甲基吡啶硼烷中的一种或多种，但不限于此；优选为氰基硼氢化钠。
上述的制备方法中，优选地，所述还原剂与所述白介素12的摩尔比为(30～500)：1。
上述的制备方法中，优选地，当所述聚乙二醇衍生物为聚乙二醇羧基衍生物时，所述聚乙二醇羧基衍生物在于白介素12进行反应前需采用活性缩合剂进行活化。
上述的制备方法中，优选地，所述活性缩合剂包括碳二亚胺类缩合剂、鎓盐类缩合剂和有机磷类缩合剂中的一种或多种；但不限于此。
上述的制备方法中，优选地，所述碳二亚胺类缩合剂包括二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的一种或多种；但不限于此。
上述的制备方法中，优选地，所述鎓盐类缩合剂包括2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、O-(N-琥珀酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、2-(内-5-降冰片烯-2,3-二羧酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐、O-(7-氮杂苯并三氮唑-1基)-二(四氢吡咯基)碳鎓六氟磷酸盐和O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-二吡咯基脲六氟磷酸酯中的一种或多种；但不限于此。
上述的制备方法中，优选地，所述有机磷类缩合剂包括氰基磷酸二乙酯、叠氮基磷酸二苯酯、氯化磷酸二苯酯、叠氮二甲基硫磷、苯并三唑-1-二(三甲氨基)瞵-六氟磷酸酯、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、三苯基磷-多卤代甲烷、三苯基磷-六氯丙酮和三苯基磷-NBS中的一种或多种；但不限于此。
上述的制备方法中，优选地，当所述聚乙二醇衍生物为聚乙二醇活性酯衍生物和/或聚乙二醇含不饱和键衍生物时，所述溶剂包括pH值为7.5～10的碱性缓冲溶液，优选为pH值为8的碱性缓冲溶液，以控制反应条件为碱性环境；搅拌反应的温度为0～40℃，优选为10℃。
上述的制备方法中，优选地，所述碱性缓冲溶液包括MES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、HEPES缓冲液、TEA缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液和Tris-盐酸缓冲液中的一种或多种，但不限于此。
上述的制备方法中，优选地，当所述聚乙二醇衍生物为聚乙二醇羧基衍生物、聚乙二醇卤代烷衍生物或聚乙二醇含硫活性衍生物时，所述溶剂包括pH值为6～8的中性或偏中性缓冲溶液，优选pH值为7的中性缓冲溶液，以控制反应条件为中性或偏中性环境；搅拌反应的温度为0～40℃，优选为10℃。
上述的制备方法中，优选地，中性或偏中性缓冲溶液包括MES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、HEPES缓冲液、TEA缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液和Tris-盐酸缓冲液中的一种或多种；但不限于此。
再一方面，本发明还提供上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12在制备提高免疫力药物、抗感染药物中的应用。
上述的应用中，优选地，所述抗感染包括抗病毒感染疾病、抗细菌感染疾病和抗寄生虫感染疾病中的一种或多种，但不限于此；所述抗病毒感染疾病包括HSV、HIV、肝炎B和肝炎C中的一种或多种，但不限于此；所述抗细菌感染疾病包括肺结核、沙门氏菌病和李斯特氏菌病中的一种或多种，但不限于此；所述抗寄生虫感染疾病包括疟疾、利什曼病和血吸虫病中的一种或多种，但不限于此。
再一方面，本发明还提供上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12在制备预防或治疗血象异常疾病的药物中的应用。
上述的应用中，优选地，所述血象异常疾病包括造血恶性肿瘤引起的血象异常疾病、放射疗法，化学疗法，清髓性疗法导致的血象异常疾病和急性辐射综合征引起的血象异常疾病中的一种或多种；但不限于此。
上述的应用中，优选地，所述造血恶性肿瘤引起的血象异常疾病包括慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、低度非何杰金淋巴瘤、急性髓性白血病、中度淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和何杰金病中的一种或多种；但不限于此
再一方面，本发明还提供上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12在制备预防或治疗肿瘤的抗肿瘤药物中的应用。
上述的应用中，优选地，所述肿瘤包括各类实体瘤和/或非实体瘤。
再一方面，本发明还提供一种药物制剂，其包括有效量的上述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12。
上述的药物制剂中，优选地，所述药物制剂的剂型包括液体制剂和/或冻干制剂；但不限于此。
上述的药物制剂中，优选地，所述药物制剂的给药途径包括注射、口服、外用或多途径联合给药；但不限于此。
上述的药物制剂中，优选地，所述药物制剂的治疗方法包括放射疗法、化疗、清髓疗法、CAR-T疗法、CAR-NK疗法、抗体靶向疗法、溶瘤病毒疗法和基因疫苗疗法中的一种或联合使用；但不限于此。
本发明的有益效果：
本发明将聚乙二醇衍生物与IL-12通过共价键偶联，获得引入聚乙二醇衍生物修饰的白介素12，使其在保持白介素12原有生物活性的情况下，进一步拥有了更多成为潜在药物产品的优势，包括但不限于分子量和水化半径增大、体内稳定性提高、体内半衰期变长、免疫原性减小、贮存稳定性提高、储存能力、作为液体制剂、冷冻配制品、干燥冻干配制品在若干天后的安全使用等优势。经过聚乙二醇衍生物修饰的白介素12能够平衡IL-12的药物活性和药物毒性，与天然的IL-12相比，聚乙二醇衍生物修饰的白介素12能够单次使用更大剂量，且能够维持更长时间的有效血药浓度而不会带来严重的毒副作用，有利于治疗的持续性，改善治疗效果，因此聚乙二醇修饰的白介素12比天然的IL-12具有更大的优势用于抗肿瘤，抗感染，血象恢复等治疗中；与PEG-G-CSF和PEG-IL-2相比，聚乙二醇衍生物修饰的白介素12具有更大的分子量，也就具有更长的半衰期，每次使用，可以维持更长时间的血药浓度，拉长用药间隔，减少患者痛苦，节约时间成本，而且，聚乙二醇衍生物修饰的白介素12不像PEG-G-CSF只有改善血象恢复的作用，也不像PEG-IL-2主要刺激T细胞增殖，诱导细胞毒性的效果，用于抗肿瘤；聚乙二醇衍生物修饰的白介素12有更广泛的应用，不仅可以促进血象恢复，还可以刺激T细胞向Th1方向分化，刺激NK细胞发挥更多自然杀伤毒性，刺激细胞表达一系列的细胞因子，整体提高免疫力，在抗感染，抗肿瘤，血象恢复等方面具有极大应用潜力。本发明聚乙二醇衍生物修饰的白介素12能够广泛应用于放射疗法、化疗、清髓疗法、CAR-T疗法、CAR-NK疗法、抗体靶向疗法、溶瘤病毒疗法和基因疫苗疗法中的一种或联合使用，具有提高免疫力，抗感染，抗肿瘤和血象恢复等效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中mPEG-pALD-20KD-IL-12的UPLC图谱；
图2为本发明实施例1中mPEG-pALD-20KD-IL-12的分子量图谱；
图3为本发明实施例1中mPEG-pALD-20KD-IL-12的电泳图谱；
图4为本发明实施例2中2-arm PEG-CHO-20K-IL-12的UPLC图谱；
图5为本发明实施例3中mPEG-SS-20KD-IL-12的UPLC图谱；
图6为本发明实施例3中mPEG-SS-20KD-IL-12的分子量图谱；
图7为本发明实施例4中mPEG-MAL-20KD-IL-12的UPLC图谱；
图8为本发明实施例4中mPEG-MAL-20KD-IL-12的分子量图谱；
图9为本发明实施例1的mPEG-pALD-20KD-IL-12、实施例4的mPEG-MAL-20KD-IL-12和IL-12的UPLC色谱对比图；
图10为本发明实施例5中2-arm-PEG-MAL-20KD-IL-12的UPLC图谱；
图11为本发明实施例6中mPEG-SC-20KD-IL-12的UPLC图谱；
图12为本发明实施例7中mPEG-SC-5KD-IL-12的UPLC图谱；
图13为本发明实施例15中CD34+细胞进行培养中进行的计数结果图；
图14为本发明实施例15中集落刺激试验中的大型红细胞集落(BFU-E)图；
图15为本发明实施例15中集落刺激试验中的单个红细胞集落(CFU-E)图；
图16为本发明实施例15中集落刺激试验中的粒细胞/巨噬细胞集落(CFU-GM)图；
图17为本发明实施例15中集落刺激试验中的粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞混合集落(CFU-GEMM)图；
图18为本发明实施例15中集落刺激试验的数据汇总图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。以下实施例中的原料组分若无特殊说明，均为本领域常规市售获得。
实施例1：
本实施例提供一种单分散的20KD单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-pALD-20K)修饰的白介素12的合成，具体制备方法如下：
(1)取5mg的白介素12溶于pH值为5.0的0.05M的醋酸/醋酸钠缓冲液中，20℃搅拌溶解配制成终浓度为1.0mg/mL的白介素12溶液。
(2)取14.3mg的分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇丙醛(购自厦门赛诺邦格生物科技有限公司，型号：06020101412)溶于纯水中，配制成单甲氧基聚乙二醇丙醛水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，其中，所述单甲氧基聚乙二醇丙醛与所述白介素12的摩尔比为10:1。
(3)取0.135mg的氰基硼氢化钠(氰基硼氢化钠与白介素12摩尔比为30：1)溶于水中配制成氰基硼氢化钠水溶液，然后将其加入到白介素12溶液中，20℃搅拌反应24h，通过UPLC监控反应，如下表1和图1所示。
表1：
保留时间(min) 面积(μV*s) 高度(μV) 面积％
1 12.801 19562 2065 6.77
2 14.360 192740 12409 66.68
3 15.003 69885 5067 24.18
4 15.385 6856 612 2.37
由表1和图1可以看出：UPLC监控合成的反应情况，停留时间14.360min对应的峰为单修饰产物，即：单分散的20KD单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的白介素12(命名为：mPEG-pALD-20KD-IL-12)，产率达到66.68％。
(4)待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的单分散的20KD单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的白介素12。
本实施例制备方法具体反应流程示意如下：
n取值约为454。
本实施例通过控制上述的反应条件，实现了mPEG-pALD-20KD选择性定点偶联修饰于白介素12的N末端α-氨基上。
采用HLC-8420GPC&LenS3MALS detector对合成的mPEG-pALD-20KD-IL-12进行分子量的检测，实验结果如图2所示。由图2的分子量图谱可以看出，本实施例经过修饰获得的mPEG-pALD-20KD-IL-12分子量经过计算大约为90KD。(计算方法：Mw -1＝KC/RLALS；分子量由上述公式计算得到，其中Mw -1，K是低角度光散射强度与分子量的系数，C是溶液浓度，RLALS是低角度光散射强度)
采用SDS-PAGE检测纯化后的mPEG-pALD-20KD-IL-12的纯度，其电泳图如图3所示，图3中，A1～A9是不同时间收集的纯化梯度洗脱下来的溶液，其中表观分子量133KD左右的为目的单修饰产物mPEG-pALD-20KD-IL-12，A5～A7的产物纯度均在95％以上，A1～A4和A8，A9含有少量。
实施例2：
本实施例提供一种单分散的20KD两臂聚乙二醇丙醛(2-arm PEG-CHO-20K)修饰的白介素12的合成，具体制备方法如下：
(1)取5mg的白介素12溶于pH值为5.0的醋酸缓冲液中，20℃搅拌溶解配制成终浓度为1.0mg/mL的白介素12溶液。
(2)取14.3mg的分子量为20KD的两臂聚乙二醇丙醛(购自厦门赛诺邦格生物科技有限公司，型号：6022108312)溶于纯水中，配制成两臂聚乙二醇丙醛水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，其中，所述两臂聚乙二醇丙醛与所述白介素12的摩尔比为10:1。
(3)取0.135mg的氰基硼氢化钠(氰基硼氢化钠与白介素12摩尔比为30：1)溶于水中配制成氰基硼氢化钠水溶液，然后将其加入到白介素12溶液中，20℃搅拌反应24h，通过UPLC监控反应，如下表2所示和图4所示。
表2：
保留时间(min) 面积(μV*s) 高度(μV) 面积％
1 11.138 425803 41879 23.95
2 12.409 971388 76846 54.64
3 12.940 380739 19275 21.41
由表2和图4可以看出：UPLC监控合成的反应情况，停留时间12.409min对应的峰为单修饰产物，即：两臂聚乙二醇丙醛修饰的白介素12(命名为：2-arm PEG-CHO-20K-IL-12)，产率达到54.64％。
(4)待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的两臂聚乙二醇丙醛修饰的白介素12。
本实施例制备方法具体反应流程示意如下：
n或m值取约为227。
本实施例通过控制上述的反应条件，实现了2-arm PEG-CHO-20K选择性定点偶联修饰于白介素12的N末端α-氨基上。
通过UPLC色谱图可以看出，实施例1和实施例2目标产物具有相同理论分子量，但是停留时间却不同，实施例1停留时间为14.360min，实施例2的停留时间为12.409min，两者相对IL-12的停留时间也不同，实施例2的相对停留时间更小，这是因为实施例2的产物分子是二臂的，表观分子量更大，而采用的色谱柱的填料具有孔径，具有一定的体积排阻色谱的特点，所以表观分子量更大的实施例2的产物柱内的停留时间相对实施例1更短，更早出来。
因此，在相同分子量的情况下，多臂PEG修饰比单臂PEG修饰带来的修饰效果更好，这主要是多臂PEG表观分子量更大，空间位阻更大，同时覆盖的IL-12的面积更小，可以保留更多的IL-12活性。
实施例3：
本实施例提供一种单分散的20KD单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS-20KD)修饰的白介素12的合成，具体制备方法如下：
(1)取5mg的白介素12溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，20℃搅拌溶解配制成终浓度为0.8mg/mL的白介素12溶液。
(2)取7.85mg的分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(购自厦门赛诺邦格生物科技有限公司，型号：06020102512)溶于纯水中，配制成单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，其中，所述单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯与所述白介素12的摩尔比为5.5:1；8℃搅拌反应3h，通过UPLC监控反应，如下表3所示和图5所示。
表3：
保留时间(min) 面积(μV*s) 高度(μV) 面积％
1 12.408 73836 5431 28.29
2 13.987 108000 5332 41.38
3 14.545 60592 3762 23.21
4 14.888 18590 1251 7.12
由表3和图5可以看出：UPLC监控合成的反应情况，停留时间13.987min对应的峰为单修饰产物，即：单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯修饰的白介素12(命名为：mPEG-SS-20KD-IL-12)，产率达到41.38％。
(3)待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯修饰的白介素12。
本实施例制备方法具体反应流程示意如下：
n取值约为454。
本实施例通过控制上述的反应条件，实现了mPEG-SS-20KD选择性定点偶联修饰于白介素12的N末端α-氨基上或赖氨酸侧链的ε-氨基上。采用本实施的聚乙二醇活性酯衍生物修饰的白介素12具有可逆修饰的特点，其在使用过程中，能够使聚乙二醇通过水解反应与IL-12再次分离，使IL-12获得更完全的生物活性。
采用HLC-8420GPC&LenS3MALS detector对合成的mPEG-SS-20KD-IL-12进行分子量的检测，实验结果如图6所示。由图6的分子量图谱可以看出，本实施例经过修饰获得的mPEG-SS-20KD-IL-12分子量经过计算大约为90KD。
实施例4：
本实施例提供一种单分散的20KD单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-MAL-20KD)修饰的白介素12的合成，具体制备方法如下：
(1)取25mg的白介素12溶于pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中，20℃搅拌溶解配制成终浓度为1.0mg/mL的白介素12溶液。
(2)取71mg的分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(购自厦门赛诺邦格生物科技有限公司，型号：06020101912)溶于纯水中，配制成单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，其中，所述单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺与所述白介素12的摩尔比为10:1；20℃搅拌反应24h，通过UPLC监控反应，如下表4所示和图7所示。
表4：
保留时间(min) 面积(μV*s) 高度(μV) 面积％
1 12.770 60303 5361 12.12
2 14.245 361271 23974 72.62
3 15.592 75908 7345 15.26
由表4和图7可以看出：UPLC监控合成的反应情况，停留时间14.245min对应的峰为单修饰产物，即：单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰的白介素12(命名为：mPEG-MAL-20KD-IL-12)，产率达到72.62％。
(3)待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰的白介素12。
本实施例制备方法具体反应流程示意如下：
/>
n取值约为454。
本实施例通过控制上述的反应条件，实现了mPEG-MAL-20KD选择性定点偶联修饰于白介素12的P40亚基的C252位置的半胱氨酸游离的巯基上。
采用HLC-8420GPC&LenS3MALS detector对合成的mPEG-MAL-20KD-IL-12进行分子量的检测，实验结果如图8所示。由图8的分子量图谱可以看出，本实施例经过修饰获得的mPEG-MAL-20KD-IL-12分子量经过计算大约为96KD。
将IL-12、实施例1制备的mPEG-pALD-20KD-IL-12和实施例4制备的mPEG-MAL-20KD-IL-12样品经过巯基乙醇还原之后进行UPLC检查，UPLC色谱图如图9所示。由图9对比可以看出：mPEG-pALD-20KD-IL-12的PEG既有连在IL-12的P35亚基上的也有连在P40亚基上的，大部分是连在P35亚基上；mPEG-MAL-20KD-IL-12的PEG都是连在P40亚基上，又因为P40亚基只有252位置存在一个游离的半胱氨酸，因此证明mPEG-MAL-20KD-IL-12的PEG修饰位点是P40的C252。
实施例5：
本实施例提供一种单分散的20KD分枝单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(2-arm-PEG-MAL-20KD)修饰的白介素12的合成，具体制备方法如下：
(1)取25mg的白介素12溶于pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中，20℃搅拌溶解配制成终浓度为1.0mg/mL的白介素12溶液。
(2)取71mg的分子量为20KD的分枝单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(购自厦门赛诺邦格生物科技有限公司，型号：06022101812)溶于纯水中，配制成分枝单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，其中，所述分枝单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺与所述白介素12的摩尔比为10:1；20℃搅拌反应24h，通过UPLC监控反应，如下表5所示和图10所示。
表5：
保留时间(min) 面积(μV*s) 高度(μV) 面积％
1 11.119 493912 47265 19.81
2 11.705 65360 3768 2.62
3 12.273 1498860 103528 60.11
4 13.530 435542 33879 17.47
由表5和图10可以看出：UPLC监控合成的反应情况，停留时间12.273min对应的峰为单修饰产物，即：分枝单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰的白介素12(命名为：2-arm-PEG-MAL-20KD-IL-12)，产率达到60.11％。
(3)待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的分枝单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰的白介素12。
本实施例制备方法具体反应流程示意如下：
n或m取值约为227。
本实施例通过控制上述的反应条件，实现了2-arm-PEG-MAL-20KD选择性定点偶联修饰于白介素12的P40亚基的C252位置的半胱氨酸游离的巯基上。
通过UPLC色谱图可以看出，实施例4和实施例5目标产物具有相同理论分子量，但是停留时间却不同，实施例4停留时间为14.245min，实施例5的停留时间为12.273min，两者相对IL-12的停留时间也不同，实施例5的相对停留时间更小，这是因为实施例5的产物分子是二臂的，表观分子量更大，而采用的色谱柱的填料具有孔径，具有一定的体积排阻色谱的特点，所以表观分子量更大的实施例5的产物柱内的停留时间相对实施例4更短，更早出来。
因此，在相同分子量的情况下，多臂PEG比单臂PEG带来的修饰效果更好，这主要是多臂PEG表观分子量更大，空间位阻更大，同时覆盖的IL-12的面积更小，可以保留更多的IL-12活性。
实施例6：
本实施例提供一种单分散的20KD单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC-20KD)修饰的白介素12的合成，具体制备方法如下：
(1)取5mg的白介素12溶于pH值为8.0的磷酸盐缓冲液中，8℃搅拌溶解配制成终浓度为1.0mg/mL的白介素12溶液。
(2)取28.5mg的分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(购自厦门赛诺邦格生物科技有限公司，型号：06020102012)溶于纯水中，配制成单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，其中，所述单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与所述白介素12的摩尔比为20:1；8℃搅拌反应4h，通过UPLC监控反应，如下表6所示和图11所示。
表6：
保留时间(min) 面积(μV*s) 高度(μV) 面积％
1 15.788 2248 377 0.98
2 16.255 49666 3428 21.65
3 16.558 177520 7860 77.37
由表6和图11可以看出：UPLC监控合成的反应情况，停留时间16.558min对应的峰为单修饰产物，即：单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯修饰的白介素12(命名为：mPEG-SC-20KD-IL-12)，产率达到77.37％。
(3)待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯修饰的白介素12。
本实施例制备方法具体反应流程示意如下：
n取值约为454。
本实施例通过控制上述的反应条件，实现了mPEG-SC-20KD对白介素12的饱和可逆修饰。选择性定点偶联修饰于白介素12的末端α-氨基上或赖氨酸侧链的ε-氨基上。采用本实施的聚乙二醇活性酯衍生物修饰的白介素12具有可逆修饰的特点，其在使用过程中，能够使聚乙二醇通过水解反应与IL-12再次分离，使IL-12获得更完全的生物活性。
实施例7：
本实施例提供一种单分散的5KD单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC-5KD)修饰的白介素12的合成，具体制备方法如下：
(1)取5mg的白介素12溶于pH值为8.0的磷酸盐缓冲液中，8℃搅拌溶解配制成终浓度为1.0mg/mL的白介素12溶液。
(2)取7.1mg的分子量为5KD的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(购自厦门赛诺邦格生物科技有限公司，型号：06020102006)溶于纯水中，配制成单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，其中，所述单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与所述白介素12的摩尔比为20:1；8℃搅拌反应4h，通过UPLC监控反应，如下表7所示和图12所示。
表7：
保留时间(min) 面积(μV*s) 高度(μV) 面积％
1 13.961 478526 12977 100.00
由表7和图12可以看出：UPLC监控合成的反应情况，停留时间13.961min对应的峰为单修饰产物，即：单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯修饰的白介素12(命名为：mPEG-SC-5KD-IL-12)，产率达到100％。
(3)待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯修饰的白介素12。
本实施例制备方法具体反应流程示意如下：
n取值约为113。
本实施例通过控制上述的反应条件，实现了mPEG-SC-5KD选择性定点偶联修饰于白介素12的末端α-氨基上或赖氨酸侧链的ε-氨基上。采用本实施的聚乙二醇活性酯衍生物修饰的白介素12具有可逆修饰的特点，其在使用过程中，能够使聚乙二醇通过水解反应与IL-12再次分离，使IL-12获得更完全的生物活性。
实施例8：
本实施例提供一种单分散的20KD单甲氧基聚乙二醇乙烯基砜(mPEG-VS-20KD)修饰的白介素12的合成，具体制备方法如下：
(1)取25mg的白介素12溶于pH值为8.0的磷酸盐缓冲液中，8℃搅拌溶解配制成终浓度为1.0mg/mL的白介素12溶液。
(2)取71mg的分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇乙烯基砜(购自厦门赛诺邦格生物科技有限公司，型号：06022105012)溶于纯水中，配制成单甲氧基聚乙二醇乙烯基砜水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，其中，所述单甲氧基聚乙二醇乙烯基砜与所述白介素12的摩尔比为10:1；20℃搅拌反应24h，通过UPLC监控反应。
(3)待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的单甲氧基聚乙二醇乙烯基砜修饰的白介素12(mPEG-VS-20KD-IL-12)。
本实施例制备方法具体反应流程示意如下：
n取值约为454。
实施例9：
本实施例提供一种单分散的20KD单甲氧基聚乙二醇碘乙酰胺(mPEG-IA-20KD)修饰的白介素12的合成，具体制备方法如下：
(1)取25mg的白介素12溶于pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中，20℃搅拌溶解配制成终浓度为1.0mg/mL的白介素12溶液。
(2)取107mg的分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇碘乙酰胺(购自上海拓旸生物科技有限公司，型号：P001019-20000)溶于纯水中，配制成单甲氧基聚乙二醇碘乙酰胺水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，其中，所述单甲氧基聚乙二醇碘乙酰胺与所述白介素12的摩尔比为15:1；20℃搅拌反应24h，通过UPLC监控反应。
(3)待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的单甲氧基聚乙二醇碘乙酰胺修饰的白介素12(mPEG-IA-20KD-IL-12)。
本实施例制备方法具体反应流程示意如下：
n取值约为454。
实施例10：
本实施例提供一种单分散的20KD单甲氧基聚乙二醇二硫异吡啶(mPEG-OPSS-20KD)修饰的白介素12的合成，具体制备方法如下：
(1)取25mg的白介素12溶于pH值为6.0的磷酸盐缓冲液中，20℃搅拌溶解配制成终浓度为1.0mg/mL的白介素12溶液。
(2)取35mg的分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇二硫异吡啶(购自广州碳水科技有限公司，型号：80010121-20000)溶于纯水中，配制成单甲氧基聚乙二醇二硫异吡啶水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，其中，所述单甲氧基聚乙二醇二硫异吡啶与所述白介素12的摩尔比为5:1；20℃搅拌反应24h，通过UPLC监控反应。
(3)待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的单甲氧基聚乙二醇二硫异吡啶修饰的白介素12(mPEG-OPSS-20KD-IL-12)。
本实施例制备方法具体反应流程示意如下：
n取值约为454。
实施例11：
本实施例提供一种单分散的20KD单甲氧基聚乙二醇乙酸(mPEG-AA-20KD)修饰的白介素12的合成，具体制备方法如下：
(1)取10mg的白介素12溶于pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中，20℃搅拌溶解配制成终浓度为1.0mg/mL的白介素12溶液。
(2)取15.7mg的分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇乙酸(购自广州市碳水科技有限公司，型号：80010103-20000)溶于纯水中，配制成单甲氧基聚乙二醇乙酸水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，然后加入4.5mg的缩合剂EDC(EDC与白介素12的摩尔比为200:1)，10℃搅拌反应24h，其中，所述单甲氧基聚乙二醇乙酸与所述白介素12的摩尔比为5.5:1；通过UPLC监控反应。
(3)待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的单甲氧基聚乙二醇乙酸修饰的白介素12(mPEG-AA-20KD-IL-12)。
本实施例制备方法具体反应流程示意如下：
n取值约为454。
实施例12：
通过IFN-γ检测ELISA试剂盒检测mPEG-pALD-20KD-IL-12(实施例1)，mPEG-MAL-20KD-IL-12(实施例4)，mPEG-SS-20KD-IL-12(实施例3)和IL-12对NK-92细胞的刺激产IFN-γ的对照实验，评价mPEG-pALD-20KD-IL-12，mPEG-MAL-20KD-IL-12，mPEG-SS-20KD-IL-12与IL-12的活性差异以及毒性的降低程度。具体方法如下：
(1)取培养的NK-92细胞，并记录代次，显微镜下观察细胞状态，若状态良好，用15ml或50ml无菌离心管收集细胞，600rpm离心5分钟，弃去上清，然后用5ml新鲜完全培养基重悬细胞并计数。
(2)依据细胞计数结果，用新鲜完全培养基，将细胞悬液稀释成2×105cells/ml的细胞悬液，然后将细胞悬液加到96孔板中，每孔100μl。
(3)对样品进行过滤除菌，并用NK-92完全培养基将样品进行梯度稀释，使最终浓度为：1000～0.46U/ml。将稀释后的样品加到已加有100μl细胞悬液的96孔板中，最终培养体系为200μl，最终细胞密度为1×105cells/ml，刺激细胞(24±2)小时。
(4)刺激结束后，1000rpm离心96孔板5分钟，用ELISA Kit中的标准稀释液(1XDilution buffer R)稀释60倍，即用10μl的8道移液器吸取上清5μl加入295μl标准稀释液中，用洗板机高速震荡5分钟。然后取100μl稀释后的上清液加入IFN-γ检测试剂盒的酶标板孔中，并加入生物素化的抗体50μl，混匀，盖上封板膜，室温(18-25℃)孵育120分钟，孵育完后，用洗液洗板四次并拍干。
(5)然后加入100μl链霉亲和素-HRP，室温(18-25℃)孵育20分钟，孵育完后，用洗液洗板四次并拍干。
(6)每孔加入100μl TMB，室温(18-25℃)避光孵育5-30分钟，孔中液体逐渐变成蓝色。室温孵育结束后，每孔中加入100μl Stop solution终止反应，使用SpectraMax M2酶标仪检测450nm处OD值。
结果处理，用GraphPad Prism6软件处理数据，以OD值为纵坐标，以稀释倍数为横坐标，用四参数进行拟合，获得活性曲线、Top值和Bottom值以及R2值，试验标准要求R2值≧0.95。供试品活性按照如下公式计算：
供试品生物学活性
其中，Pr为标准品生物学活性，即WHO IL-12标准品生物学活性＝1×104U/ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效量的稀释倍数。供试品比活性(U/mg)＝供试品效价(U/ml)/供试品浓度(mg/ml)。
实验结果如下表8所示：
表8：
由上述表8实验结果可以看出：与IL-12标准品相比，实施例1所得的产物mPEG-pALD-20KD-IL-12活性下降了8.0倍，实施例4所得产物mPEG-MAL-20KD-IL-12的活性下降了20.3倍，实施例3所得的单修饰产物mPEG-SS-20KD-IL-12活性下降了11.70倍。活性有所下降，意味着产生同样多的IFN-γ，聚乙二醇修饰的白介素12需要比IL-12更大的剂量，反过来说，同样剂量情况下，聚乙二醇修饰的白介素12副作用更低，有利于单次更大剂量的给药，在更长的时间内维持血液内药物浓度稳定，而不会带来较大的副作用。后续的药效学试验所用的聚乙二醇修饰白介素12的剂量，皆是参考实施例8所得的实验结果确定的。
实施例13：
本实施例提供实施例1制备的mPEG-pALD-20KD-IL-12在正常大鼠中的药物作用持续时间的效果的分析实验，通过实施例1制备的mPEG-pALD-20KD-IL-12与IL-12在正常大鼠中的作用持续时间的对照实验，确认长效白介素12的PEG修饰对药物作用持续时间的延长作用。
将八周龄正常大鼠分别再分为对照组(媒介物(vehicle))、给予其中含有mPEG-pALD-20KD-IL-12组、给予其中含有白介素12的组。对每组中的3只大鼠，皮下给予正常大鼠试验物质一次，分别在1、4、8、24、48、和72小时通过其尾静脉采集其全血样品，将全血样品加入每个1.5mL微管中，在室温下以5000rpm离心10分钟，分别分离每种血清并储存在-20℃下。通过ELISA测定将每组血清中含有的聚乙二醇修饰的白介素12或者单纯的白介素12进行定量。ELISA测定以下述的方式进行，将每次收集的血清与抗人白介素12-HRP同时加入包被有白介素12单克隆抗体的平板中，在室温下反应1小时，用TMB试剂显色，并分别在波长450nm下测量其吸光度。
结果表明：与给予其中含有白介素12的组相比，给予其中含有20kDa PEG接头的长效白介素12的组显示AUC增加。
实施例14：
本实施例提供，聚乙二醇衍生物修饰的白介素12用于抗感染的效果实验；IL-12独特的生物学活性，使其可以促进Thl细胞分化成熟，并且能够刺激T细胞和NK细胞，分泌大量IFN-γ，TNF-α、GM-CSF，激活T细胞和NK细胞的杀伤作用。IL-12在机体早期的非特异性免疫和抗原特异性适应性免疫过程中扮演着极其重要的角色。因此，IL-12在抗菌，抗病毒，抗寄生虫等感染方面，有极大的作用。通过聚乙二醇衍生物修饰的白介素12用于抗感染的效果实验；IL-12独特的生物学活性，使其可以促进Thl细胞分化成熟，刺激人外周血单核细胞，对单纯疱疹病毒-I型感染的靶细胞的杀伤来评估PEG修饰的白介素12用于抗感染的效果。详细实验步骤如下：
(1)得到PBMC细胞在RPMI 1640培养基中进行培养10天；
(2)然后以2×106/孔接种到24孔板中，加入不同浓度的实施例4制备的mPEG-MAL-20KD-IL-12(200ng/mL,20pg/mL,0.2pg/mL)同时设置IL-12(10ng/mL,1pg/mL,0.01pg/mL)作为对照和添加等体积缓冲液的作为空白对照，连续培养7天；
(3)同时用RPMI 1640培养基培养L929细胞，L929细胞的标记用5μmol/L CalceinAM 37℃水浴30min进行标记，之后换两次培养基，去除残留的Calcein AM，加入病毒液，继续培养2h，制成靶细胞；
(4)随后收集PBMC，并将其按照1/10(即1×105个靶细胞和1×106个效应细胞)的比例接种到96孔板，在37℃5％CO2培养箱培养24h，同时设置单独培养的靶细胞作为空白对照，并用曲拉通裂解液裂解作为最大杀伤孔，3000r/min离心5min，将上清移入新的孔中。
(5)荧光检测：用荧光测量仪检测上清的荧光值(FI)，激发光为485nm，发射光为538nm。根据检测值评估各种浓度的PEG化白介素12以及IL-12刺激下PBMC对靶细胞杀伤作用的差异，用来说明聚乙二醇修饰白介素12在抗感染方面的作用。
实施例15：
本实施例提供聚乙二醇衍生物修饰的白介素12用于血象恢复的效果实验；在血液学癌症的治疗中多采用清髓疗法，伴随疗法的进展，各种血液细胞均要经过一个下降后逐步恢复的过程。在癌症的治疗中，常规的化学疗法，放射疗法也会导致血液中的各种细胞异常下降，包括中性粒细胞减少，血小板减少，淋巴细胞减少，同时也容易带来严重的副作用，包括血小板减少导致的自发性出血，通常还伴随疲劳并且有时伴随抑郁。白细胞，中性粒细胞，淋巴细胞的减少也会导致人体自身的免疫力下降，容易感染其他并发症。急性辐射综合症，也被称为辐射中毒或辐射病(英文缩写ARS)，发病和症状类型取决于患者的辐射暴露情况。剂量较小的辐射对消化系统产生影响，比如恶心，呕吐，血指数下降的相关症状如感染和出血。大剂量的照射会导致神经系统损伤症状和快速死亡。在ARS的造血亚综合征(subsyndrome)(HSARS)中，大量的有害射线导致的快速的骨髓清除，使得各类血细胞减小。根据受到辐射的剂量不等，一般在2周至2个月的范围内的出现感染，出血等症状，并最终导致死亡。治疗急性辐射综合症的一般方法为输血和抗生素。
IL-12可以刺激造血功能，促进血象恢复。IL-12通过Stat4途径诱导IFN-γ的产生，然后IFN-γ作用于造血干细胞。但是，研究表明，IFN-γ在造血过程中起着双重作用(刺激/抑制作用)。IL-12的毒性与IFN-γ的过量产生有关，这表明IL-12对血液恢复的影响可能与剂量有关：低剂量的IL-12可以促进造血作用，而高剂量的IL-12通过诱导过量的IFN-γ产生和毒性反应来抑制造血功能。
本实施例通过PEG修饰的IL-12，平衡IL-12的药物活性和药物毒性，既可以刺激细胞产生适量的IFN-γ，使其可以应用于血象恢复。CD34+细胞是造血干细胞，我们通过对比使用mPEG-MAL-20K-IL-12，mPEG-pALD-20K-IL-12和IL-12体外刺激CD34+细胞扩增和分化，来评估聚乙二醇修饰的IL-12用于血象恢复的效果。具体实验步骤如下：
(1)配置不同培养基，先在stemline II培养基添加100ng/ml的SCF，20ng/ml的TPO，100ng/ml的Flt-3L作为基础培养基，然后，分出6×10ml培养基分别添加不同浓度的实施例4制备的mPEG-MAL-20KD-IL-12(2ug/ml、200ng/ml、20ng/ml)，实施例1制备的mPEG-pALD-20KD-IL-12(800ng/ml、80ng/ml、8ng/ml)或者不同浓度的IL-12(100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml)；
(2)将1×104个CD34+细胞接种在不同培养基的24孔板中，每种培养基设置三组平行孔，并设置空白对照组。更新培养基的同时更新PEG化的IL-12或者IL-12，连续培养10天。每隔两天，取样并统计细胞数量。
(3)同时进行集落刺激试验，将人造血干细胞集落培养基置于4℃冰箱，过夜解冻，解冻完后将培养基分装至无菌5mL离心管中，每管分装3mL，分别添加不同浓度的实施例4制备的mPEG-MAL-20KD-IL-12(2ug/ml、200ng/ml、20ng/ml)，实施例1制备的mPEG-pALD-20KD-IL-12(800ng/ml、80ng/ml、8ng/ml)或者不同浓度的IL-12(100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml)，并保留一部分不加的培养基作为对照组，分装后置于-20℃保存，避免反复冻融。临用前4℃或常温解冻。
(4)将CD34+细胞用PBS以300g×5min离心洗涤一次，弃上清，用stemline II培养基调整细胞浓度至10倍的接种终浓度。例如，如果要得到每1mL培养基中含有1000个细胞的接种终浓度，则需调整细胞浓度至10000个/mL。根据前期实验摸索的结果，本研究采用的接种终浓度为500个/mL。因此，应将细胞浓度调整至5000个/mL。
(5)将300ul已经调整好浓度的细胞加入含有3mL造血干细胞集落培养基的5mL离心管中(细胞体积：集落培养基体积＝1:10)，立即剧烈振荡使细胞与培养基充分混匀。室温静置5～10min，使气泡充分消散。
(6)将16号无菌注射器针头紧紧套在注射器上，缓慢吸取1.1mL含细胞的培养基至35mm的细胞培养皿中，每个5mL离心管中含有的3.3mL细胞和培养基刚好够接种至3个35mm细胞培养皿中，3个培养皿构成3个平行样。
(7)缓慢倾斜并旋转培养皿，使黏稠的培养基均匀的铺满整个培养皿。
(8)将2个接种了细胞的培养皿放入1个100mm的大培养皿中，另将一个不盖盖子的35mm培养皿也置于100mm大培养皿中，并且在不带盖子的35mm培养皿中加入3mL的无菌水，盖上100mm大培养皿的盖子，置于37℃，5％CO2，湿度>95％的培养箱中培养12天。培养期间注意观察不带盖子的35mm培养皿中水量，注意补水。
(9)培养12天后，利用倒置显微镜对集落进行观察，并分类记录集落类型和数量，比对不同培养基，所产生的集落的数量和类型的差异。
图13为不同浓度的实施例4制备的mPEG-MAL-20KD-IL-12(2ug/ml、200ng/ml、20ng/ml)，实施例1制备的mPEG-pALD-20KD-IL-12(800ng/ml、80ng/ml、8ng/ml)或者不同浓度的IL-12(100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml)刺激下，对CD34+细胞进行培养中进行的计数，可以发现，相比于添加有聚乙二醇修饰IL-12或者IL-12刺激的组，空白对照组的细胞数量在第12天减少趋势明显，说明聚乙二醇修饰IL-12或者IL-12均具有维持CD34+细胞存活更久，减缓凋亡的作用，对于浓度较高的IL-12，对细胞的刺激效果也不好，适当的浓度，如：mPEG-MAL-20KD-IL-12(20ng/mL)和mPEG-pALD-20KD-IL-12(80ng/mL)可以维持细胞存活更久。
图14为集落刺激试验中的大型红细胞集落(BFU-E)。
图15为集落刺激试验中的单个红细胞集落(CFU-E)。
图16为集落刺激试验中的粒细胞/巨噬细胞集落(CFU-GM)。
图17为集落刺激试验中的粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞混合集落(CFU-GEMM)。
图18为集落刺激试验的数据汇总，其中除了添加mPEG-MAL-20K-IL-12(2000ng/mL)组与空白对照组相比，效果较差，其他聚乙二醇修饰的IL-12或者IL-12刺激下CD34+的分化方向与空白对照相比出现明显差异，产生了更多的CFU-GM或者CFU-GEMM类型的细胞集落，其他类型的集落数量差异较小，其中，mPEG-pALD-20K-IL-12组和IL-12组与mPEG-MAL-20K-IL-12组和空白组相比达到了更好的刺激效果，而且mPEG-pALD-20K-IL-12或IL-12的加入量对细胞集落形成也有一定影响，适宜的浓度(mPEG-pALD-20K-IL-12(80ng/mL)或IL-12(10ng/mL))有利于产生更多CFU-GM集落或者CFU-GEMM集落,同时不会影响其他集落的形成，高浓度的IL-12(100ng/mL)将影响BFU-E和CFU-E集落的形成，可能是因为刺激过度，造成CD34+细胞大量向粒细胞/巨噬细胞方向分化,耗尽了干细胞的增殖分化潜力，导致没有足够的细胞往红细胞方向分化。
实施例16：
本实施例提供IL-12刺激经放射性辐射照射后的猕猴动物实验来评估聚乙二醇衍生物修饰的白介素12用于血象恢复的效果。具体实验步骤如下：
此次实验中，猕猴被随机分成三组，同时进行500Rad辐射照射,为了剂量分布均匀，前半份剂量由前向后辐射和后半份剂量由后向前照射。在接受辐射前24小时或接受辐射后30分钟，实验组分别注射mPEG-MAL-20K-IL-12(2ug/Kg)，IL-12(100ng/Kg)，对照组注射PBS缓冲液。每天两次记录临床征兆。每天记录食欲降低(基于食物摄取)和身体活动并且评分如下：1＝轻度；2＝中度；和3＝重度。在给药之前和其后每周两次进行详细的身体检查。在照射之前和第3、10、12、14、16、18、30、45和60天获取体温(耳)。在照射之前和第5、10、12、14、16、18、30、45和60天进行用于外周血计数的血液取样(0.5mL)，观察红细胞，白细胞，血小板的动态变化。在前期，实验组外周血各类细胞的的下降幅度均小于对照组，血小板，红细胞，单核细胞早期恢复显著提高，淋巴细胞，中性粒细胞也有较好的恢复。在后期，注射实施例4制备的mPEG-MAL-20KD-IL-12的实验组与注射IL-12的实验组相比，血小板，红细胞，单核细胞的恢复速度更快，这可能是因为PEG化的IL-12具有更长的体内半衰期，因此能够更长久的发挥作用。实验结果证明，IL-12具有用于应对清髓疗法，放射疗法，化学疗法以及急性放射综合征等情况引起的血象异常情况的预防和治疗，mPEG-MAL-20KD-IL-12由于PEG对IL-12的修饰，使其体内半衰期更长，具有时效更长的治疗效果。
实施例17：
本实施例提供通过聚乙二醇衍生物修饰的白介素12刺激T细胞，对肿瘤细胞的杀伤来评估聚乙二醇衍生物修饰的白介素12用于抗肿瘤的效果。具体实验步骤如下：
(1)得到PBMC细胞在包被有CD3抗体的培养板上，加入RPMI 1640培养基中进行培养收获T细胞；
(2)然后以2×106/孔接种到24孔板中，加入不同浓度的mPEG-MAL-20K-IL-12(2ug/ml、200ng/ml、20ng/ml)同时设置IL-12(10ng/mL，1pg/mL，0.01pg/mL)作为对照和添加等体积缓冲液的作为空白对照，连续培养7天；
(3)同时用RPMI 1640培养基培养各种癌细胞，癌细胞的标记用5μmol/L CalceinAM 37℃水浴30min进行标记，之后换两次培养基，去除残留的Calcein AM；
(4)随后收集PBMC，并将其按照1/10(即1×105个靶细胞和1×106个效应细胞)的比例接种到96孔板，在37℃5％CO2培养箱培养24h，同时设置单独培养的靶细胞作为空白对照，并用曲拉通裂解液裂解作为最大杀伤孔，3000r/min离心5min，将上清移入新的孔中。
(5)荧光检测：用荧光测量仪检测上清的荧光值(FI)，激发光为485nm，发射光为538nm。根据检测值评估各种浓度的PEG化白介素12以及IL-12刺激下PBMC对肿瘤细胞杀伤作用的差异。
实施例18：
本实施例通过小鼠肿瘤模型，评估实施例4制备的mPEG-MAL-20KD-IL-12体内的抗肿瘤效果。将人的造血干细胞(HSC)移植到辐照清髓的M-NSG小鼠体内的构建CD34+人源化小鼠，将pp65-MCF-7癌细胞移植到小鼠中创建癌症模型，用来评估PEG修饰IL-12的体内抗肿瘤活性。每周(IP)给予10只小鼠/组指定剂量的测试物品，实验组分别注射实施例4制备的mPEG-MAL-20KD-IL-12(2ug/Kg)，IL-12(100ng/Kg)，对照组注射PBS缓冲液。在注射之前和注射后的第5、10、12、14、16、18、30天测量肿瘤体积，采血分析淋巴细胞活化/增殖以及血中IFN-γ的含量。统计并分析mPEG-MAL-20K-IL-12和IL-12体内抗肿瘤能力以及副作用的差异。

Claims (9)

1.一种聚乙二醇衍生物修饰的白介素12，其是由聚乙二醇衍生物与白介素12经过修饰反应获得；其中，由聚乙二醇衍生物的活性基团与白介素12的活性基团参与修饰反应；所述聚乙二醇衍生物的活性基团为马来酰亚胺基；进行修饰反应的白介素12的活性基团为P40亚基的C252位置的半胱氨酸游离的巯基；
其中，所述聚乙二醇衍生物为聚乙二醇含不饱和键衍生物；所述聚乙二醇含不饱和键衍生物选自单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺和分枝单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12，其中，所述聚乙二醇衍生物的分子量为20KD。
3.权利要求1或2所述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12的制备方法，其包括如下步骤：
（1）取25mg的白介素12溶于pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中，20℃搅拌溶解配制成终浓度为1.0mg/mL的白介素12溶液；
（2）取71mg的分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺或分枝单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺溶于纯水中，配制成单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺水溶液或分枝单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺水溶液；然后滴入至白介素12溶液中，其中，所述单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺或分枝单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺与所述白介素12的摩尔比为10:1；20℃搅拌反应24h；
（3）待反应结束后，对产物进行纯化，具体为：先采用30KD截流量的超滤管过滤，然后通过离子交换色谱纯化，得到纯化后的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰的白介素12或分枝单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰的白介素12。
4.权利要求1或2所述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12在制备抗感染药物中的应用；
其中，所述抗感染包括抗病毒感染疾病、抗细菌感染疾病和抗寄生虫感染疾病中的一种或多种；所述抗病毒感染疾病包括HSV、HIV、肝炎B和肝炎C中的一种或多种；所述抗细菌感染疾病包括肺结核、沙门氏菌病和李斯特氏菌病中的一种或多种；所述抗寄生虫感染疾病包括疟疾、利什曼病和血吸虫病中的一种或多种。
5.权利要求1或2所述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12在制备预防或治疗血象异常疾病的药物中的应用；
其中，所述血象异常疾病包括：造血恶性肿瘤引起的血象异常疾病，放射疗法、化学疗法或清髓性疗法导致的血象异常疾病，和急性辐射综合征引起的血象异常疾病中的一种或多种；
所述造血恶性肿瘤引起的血象异常疾病包括慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、低度非何杰金淋巴瘤、急性髓性白血病、中度淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和何杰金病中的一种或多种。
6.一种药物制剂，其包括有效量的权利要求1或2所述的聚乙二醇衍生物修饰的白介素12。
7.根据权利要求6所述的药物制剂，其中，所述药物制剂的剂型包括液体制剂和/或冻干制剂。
8.根据权利要求6所述的药物制剂，其中，所述药物制剂的给药途径包括注射、口服、外用或多途径联合给药。
9.根据权利要求6所述的药物制剂，其中，所述药物制剂的使用方法包括与放射疗法、化疗、清髓疗法、CAR-T疗法、CAR-NK疗法、抗体靶向疗法、溶瘤病毒疗法和基因疫苗疗法中的一种或多种联合使用。
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