KR20170047004A - 폴리에틸렌글라이콜의 유도체로 페길화된 exendin-4를 유효성분으로 포함하는 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리에틸렌글라이콜의 유도체로 페길화된 exendin-4를 유효성분으로 포함하는 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 티올(thiol)기가 삼중가지형 구조를 갖는 폴리에틸렌글라이콜(PEG)의 유도체로 페길화(PEGylation)된 시스테인 아미노산이 C-말단에 도입된 exendin-4를 유효성분으로 포함하는 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 조성물은 염증 조절 효과가 뛰어나므로, 혈관 염증성 질환의 치료제를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

폴리에틸렌글라이콜의 유도체로 페길화된 exendin-4를 유효성분으로 포함하는 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for preventing or treating vascular inflammatory diseases comprising exendin-4 analogues PEGylated with polyethylene glycol derivatives}

본 발명은 폴리에틸렌글라이콜의 유도체로 페길화된 exendin-4를 유효성분으로 포함하는 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 티올(thiol)기가 삼중가지형 구조를 갖는 폴리에틸렌글라이콜(PEG)의 유도체로 페길화(PEGylation)된 시스테인 아미노산이 C-말단에 도입된 exendin-4를 유효성분으로 포함하는 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

패혈증은 결핵, 박테리아 감염 등 비교적 흔한 감염성 질환의 합병증으로 발병하며, 중환자실 환자 사망의 가장 주요한 원인이기도 하다. 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrom, SIRS)과 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크와 복합장기부전(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)은 임상적 증후로 연결되어 있다(Russell JA, N Engl J Med, 355:1699-1713, 2006; Andreu Ballester JC et al., Infect Control Hosp Epidemiol, 29:630-634, 2008; Angus DC et al., Crit Care Med , 29:S109-S116, 2001). 패혈증과 패혈성 쇼크 치료제로는 일라이 릴리사의 시그리스(Xigris)가 2001년에 미국 식품의약국(FDA)에서, 2002년에는 유럽 의약품청(EMA)에서 각각 허가받았으나, 패혈성 쇼크 임상 실험에서 28일간 패혈증 치사율을 개선시키는 효과가 없는 것으로 확인되었고, 또 다른 부작용으로 인하여 제약시장에서 판매가 중단되었다(Thachil J et al., Br J Haematol, 157:493-494, 2012). 현재까지 패혈증을 예방하거나 치료할 수 있는 약제는 전무한 실정이다.

엑센딘-4(exendin-4, EX4)는 미국 독도마뱀(Gila monster lizard)의 타액에서 발견된 글루카곤 유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1) 수용체의 작용제(agonist)이다. EX4는 소장의 L 세포에서 분비되는 장 인크레틴(incretin) 호르몬인 GLP-1과 53% 아미노산 서열 동일성(identity)을 나타낸다. GLP-1와 유사하게 EX4도 GLP-1 수용체에 작용하여 혈당에 의한 인슐린 분비를 유도하고 췌장 β세포의 사멸을 억제함으로써 혈당 수준을 효과적으로 조절한다. EX4의 합성 형태인 Exenatide(Byetta)이 제2형 당뇨병 치료제로 시판되고 있으나, 체내 혈중 반감기가 1.5~4 시간에 불과하여 치료 효과가 제한적이고, 하루에 두 번 주사해야 하는 불편함이 있다.

EX4의 약물동태학적 특성을 개선하기 위한 약물 전달 기술이 개발되어 왔다. 최근에는 일주일에 1회 복용하는 EX4의 생분해성 폴리락티드-글리코라이드(poly (D, L-lactide-co-glycolide)) 중합체 미립구(Bydureon^TM)가 상용화되었는데, 복잡한 미립구 제조 과정, 불규칙적인 약물 방출, 상대적으로 큰 미립구 입자 크기로 인하여 주사시 통증이 동반되며, 체내 면역 반응을 유발할 가능성이 커서 임상에 적용하는데 우려되는 점이 많다. 한편, EX4는 주로 신장에서 분해되고 제거되는 것으로 알려져 있는데, EX4의 혈장 반감기를 늘리고 체내 안정성을 개선하기 위한 방법으로 폴리에틸렌글라이콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 분자를 이용한 생결합(bioconjugation) 방법이 시도되었다. PEGylation은 단백질 반감기를 연장하고, 면역 유발 반응을 감소시키며, 체액에서의 안전성을 증진시키는 효과가 있어서 단백질 치료제의 효능을 개선하기 위하여 단백질에 변형을 가하는 방법으로 사용되어 왔다.

본 발명자들은 EX4의 다양한 PEGylation 유도체를 제조하고, 패혈증이나 패혈성 쇼크와 같은 중증 혈관 염증성 질환 치료제로의 개발 가능성을 알아보았다.

이에 본 발명자들은 삼중가지형 구조를 갖는 폴리에틸렌글라이콜로 페길화(PEGylated)된 exendin-4에 뛰어난 항염증 효과가 있으며, 야생형 exendin-4와 비교하여 그 효과가 현저한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은

티올(thiol)기가 삼중가지형 구조를 갖는 폴리에틸렌글라이콜(PEG)의 유도체로 페길화(PEGylation)된 시스테인 아미노산이 C-말단에 도입된 exendin-4를 유효성분으로 포함하는 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

티올(thiol)기가 삼중가지형 구조를 갖는 폴리에틸렌글라이콜(PEG)의 유도체로 페길화(PEGylation)된 시스테인 아미노산이 C-말단에 도입된 exendin-4를 유효성분으로 포함하는 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 티올(thiol)기가 삼중가지형 구조를 갖는 폴리에틸렌글라이콜(PEG)의 유도체로 페길화(PEGylation)된 시스테인 아미노산이 C-말단에 도입된 exendin-4를 유효성분으로 포함하는 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 exendin-4(EX4)의 C-말단에 시스테인(cysteine, Cys) 아미노산을 도입하고, C-말단의 시스테인에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 유도체를 연결하여 다양한 exendin-4의 PEG 유도체(PEGylated EX4)를 제조하고, 패혈증의 동물 모델에서 항염증과 패혈증 치료 효과를 확인하였다. 야생형 EX4 또는 PEGylated EX4는 모두 전신성 염증 반응으로 인한 조직과 기관의 손상과 치사율을 감소시키는 효과가 있었는데, 이중 삼중가지형 PEG를 갖는 EX4 유도체가 가장 뛰어난 염증 조절 효과를 갖는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명자들은 패혈증이나 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)과 같은 중증 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있는 삼중가지형 PEG를 갖는 EX4 유도체를 포함하는 조성물을 본 명세서에서 처음으로 공개한다.

본 발명에서 ‘exendin-4(EX4)'는 미국 독도마뱀(Gila monster)인 헬로더마 서스펙텀(Heloderma suspectum)의 타액에서 처음 발견된, 인간의 GLP-1과 유사한 생물학적 활성을 나타내는 39개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 호르몬이다. EX4는 GLP-1 수용체를 활성화하여 혈당 대사와 인슐린 분비를 조절하는 작용을 하며, 인공적으로 합성된 펩티드 형태인 exenatide가 Byetta, Bydureon 등의 브랜드 이름으로 제2형 당뇨병 치료제로 개발되었다.

본 발명자들은 EX4의 C-말단 위치에 PEG을 결합시키기 위하여, PEG가 결합할 수 있는 자유 티올기(free thiol group, -SH)를 갖는 Cys 아미노산을 C-말단에 도입한 EX4 유도체를 사용하였다. C-말단에 Cys가 도입된 총 40개의 아미노산으로 이루어진 EX4의 서열은 서열번호 1로 표시된 바와 같다. C-말단에 Cys가 도입된 EX4는 당업계에서 통상적으로 사용되는 펩티드 합성 방법에 의하여 합성될 수도 있고, Cys가 도입된 EX4의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 제작하여 적절한 숙주세포에서 발현시켜 수득하는 유전공학적 방법에 의하여 제작될 수도 있다.

본 발명의 목적상 exendin-4를 PEGylation하기 위한 폴리에틸렌글라이콜(PEG)의 유도체는 삼중가지형 구조를 가지며, 삼중가지의 어느 한 말단에는 티올기와 결합할 수 있는 작용기를 갖고, 삼중가지의 다른 두 말단은 메톡시기를 갖는 것이 바람직하다.

상기 삼중가지형이란 알파벳의 대문자 Y와 같은 모양으로 세 개의 가지가 연결된 구조를 의미한다. 따라서 본 발명에 따른 바람직한 삼중가지형 PEG의 유도체의 구조는 세 개의 가지 부분을 구성하게 되는 세 개의 선형(linear)의 PEG 유도체가 Y자 형태로 연결되어 있는 것으로서, 어느 한 선형 PEG 가지에서 다른 두 개의 선형 PEG와 결합하고 있지 않은 말단은 티올기와 결합할 수 있는 작용기를 가지며, 삼중가지를 구성하는 나머지 두 개의 선형 PEG 가지에서 다른 선형 PEG와 결합하고 있지 않은 각각의 말단은 메톡시기를 갖는 것이다. 상기 삼중가지형 폴리에틸렌글라이콜의 유도체는 어느 한 말단의 티올기와 결합할 수 있는 작용기를 통해 EX4의 C-말단에 도입된 Cys의 티올기와 결합하여 본 발명에 따른 PEGylated EX4를 형성하게 된다.

상기 작용기는 티올기와 결합할 수 있고, PEG의 구조나 EX4의 효능에 영향을 미치지 않는 것이라면 제한없이 선택하여 이용할 수 있으나, 바람직하게는 숙신이미딜프로피오네이트(succinimidyl propionate), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 프로피온알데히드(propionaldehyde) 또는 말레이미드(maleimide)일 수 있으며, 가장 바람직한 작용기는 말레이미드일 수 있다. 또한 상기 작용기는 그 자체로 삼중가지형 PEG의 어느 한 말단에 직접 연결되는 형태일 수도 있고, PEG의 구조를 변경시키지 않는 범위에서 선형 링커에 연결되어 있는 형태일 수도 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 말레이미드 작용기는 -(CH₂)₃-NHCO-CH₂CH₂-말레이미드일 수 있으며, 이 경우 말레이미드는 -(CH₂)₃-NHCO-CH₂CH₂-의 구조를 갖는 링커로 PEG에 연결되게 된다.

본 발명에서 사용할 수 있는 삼중가지형의 PEG 유도체는 구체적으로는 메톡시폴리에틸렌글라이콜 숙신이미딜프로피오네이트, 메톡시폴리에틸렌글라이콜 N-히드록시숙신이미드, 메톡시폴리에틸렌글라이콜 프로피온알데히드 및 메톡시폴리에렌글라이콜 말레이미드로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 삼중가지형 폴리에틸렌글라이콜의 유도체는 보다 구체적으로는 하기 <화학식 1>의 구조를 갖는 것일 수 있다. 화학식 1에서 m과 n은 임의의 정수이고, 작용기는 앞에서 서술한 바와 같다.

<화학식 1>

또한 본 발명에 따른 삼중가지형 폴리에틸렌글라이콜의 유도체는 분자량이 40kDa 이상 100kDa 이하인 것이 바람직하며, 가장 바람직한 분자량은 50kDa일 수 있다. 본 발명에 따른 삼중가지형 폴리에틸렌글라이콜의 유도체가 50kDa일 때 상기 <화학식 1>에서 m은 200 내지 250의 범위에 속하는 정수이고, n은 550 내지 600의 범위에 속하는 정수이다.

본 발명자들은 구체적인 실시예에서 분자량이 50kDa인 삼중가지형의 모노메톡시 PEG-말레이미드(monomethoxy trimeric PEG maleimide)와 C-말단에 Cys가 도입된 EX4를 1:1.5의 몰비로 혼합하여 pH 6인 인산염완충용액(PBS)에 용해시키고, 상온에서 1시간 동안 PEGylation 반응을 진행한 후, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피(cation exchange column chromatography)로 분리하고 말디-토프 질량 분석(MALDI-TOF mass spectrometry)를 이용하여 분자량을 확인하였다. EX4의 삼중가지형 PEG 유도체와 효능을 비교하기 위한 선형 구조의 PEG(분자량 2kDa, 5kDa, 20kDa) 유도체도 동일한 방법으로 제조되었다. 보다 구체적인 PEGylated EX4의 제조 방법은 실시예에 서술된 바와 같다. PEGylated EX4 유도체들은 야생형 EX4(WT-EX4)와 비교하여 혈액 내 안정성이 증가하여 체내 잔류시간도 모두 증가한 것으로 나타났다.

본 발명자들은 다른 실시예에서 마우스에 맹장 결찰과 천자(cecal ligation and puncture, CLP) 수술을 실시하여 전신 염증인 패혈증을 유발하고, 야생형 EX4와 PEGylated EX4의 항염증 효과를 알아보았다. CLP 수술한 마우스에서는 대조군 마우스와 비교하여 에반스 블루 염료를 이용하여 측정한 혈관 투과성과 복강 내 백혈구(leukocyte) 숫자로 측정한 백혈구 침윤과 이동 현상이 현저하게 증가하였으며, 상기 염증 반응은 야생형 EX4(WT-EX4) 또는 PEGylated EX4를 주입함으로써 감소하였다. 특히 삼중가지형 PEG를 갖는 EX-4(EX-50K)는 WT-EX4나 선형(linear) PEG를 갖는 EX4(EX4-2K, EX4-5K, EX4-20K)와 비교하여 혈관 투과성을 감소시키고, 면역세포 활성화를 억제하는데 가장 현저한 효과가 있는 것으로 확인하였다.

한편 EX4-2K, EX4-5K, EX4-20K는 WT-EX4와 비교하여 체내 반감기가 2.9 내지 4.1배로 현저하게 증가했음에도 불구하고, 혈관 투과성과 백혈구 이동을 억제하는데 있어서는 WT-EX4와 효과가 유사하거나 오히려 감소하는 것으로 나타났다. 이는 EX4의 체내 안정성 또는 체내 체류 시간은, 염증으로 유발된 혈관 손상(혈관 투과성 증가)과 면역 세포의 활성화(백혈구의 이동)를 감소시키는 항염증 효과와 분명하게 비례하지는 않음을 시사한다. 따라서 PEGylated EX4 유도체의 항염증 효과는실험을 통해 다각적으로 확인해야 함을 알 수 있다.

또한 상기 삼중가지형 EX4-50K는 CLP로 유발된 폐의 염증 반응을 조절하는데서도 가장 뛰어난 효과를 나타내었다. 삼중가지형 EX4-50K를 주입한 마우스의 폐는 면역세포의 폐조직으로의 침윤, 폐 부종, 폐 조직 구조의 손상 정도에 있어서 염증을 유발하지 않은 대조군(Sham)과 비슷한 수준의 상태인 것으로 관찰되었다.

삼중가지형 EX4-50K가 염증으로 인한 조직과 기관의 손상을 완화하는 효과는 CLP 수술한 마우스의 혈청에서 측정한 ALT, AST 등 간 지수, 크레아티닌, BUN 등 신장 지수, LDH 등 조직 손상 지수, 그리고 각종 사이토카인/키모카인의 수준이 크게 감소한 것으로도 확인할 수 있었다. 나아가 전신 염증 또는 패혈증으로 인한 생존률도 WT-EX4나 선형 PEG 유도체와 비교하여 삼중가지형 EX-50K에 의해 크게 향상되었다.

본 발명에서 ‘혈관 염증성 질환’은 박테리아와 같은 외부 병원체의 감염, 조직 손상 등 다양한 원인에 의하여 혈관벽에 염증이 발생하는 질환을 의미한다. 염증이 발생한 혈관의 위치와 범위, 염증의 확산 정도에 따라 차이가 있으나, 중증의 혈관 염증성 질환에서는 혈관 투과성이 증가하여 체내 순환하는 체액의 양이 감소하고, 혈관의 내피세포 간 면역세포의 이동과 침윤 현상이 일어나며, 결과적으로 혈관이 좁아지거나 파괴되어 조직이나 장기의 혈액 순환이 원활하게 이루어지지 않게 된다. 혈액 순환 부족과 염증의 확산으로 복합장기부전이 발생하며, 치사에까지 이를 수 있다.

상기 혈관 염증성 질환은 바람직하게는 패혈증, 패혈성 쇼크, 전신성 염증 반응 증후군, 맥관염, 혈관염 및 가와사키병으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 목적상 용어 ‘예방’은 본 발명의 조성물의 투여로 혈관 염증성 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, ‘치료’는 혈관 염증성 질환의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다.

본 발명에 따른 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있으며, 바람직하게는 혈관내 투여할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여 경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성 성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성인 것을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

본 발명의 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 본 발명의 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강흡입제의 형태로 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야하며 박테리아, 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 ‘경피투여’는 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입투여제의 경우, 본 발명에 따른 조성물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다양하게 제형화될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 혈관 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 티올(thiol)기가 삼중가지형 구조를 갖는 폴리에틸렌글라이콜(PEG)의 유도체로 페길화(PEGylation)된 시스테인 아미노산이 C-말단에 도입된 exendin-4를 유효성분으로 포함하는 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 야생형 exendin-4보다 현저하게 향상된 항염증 효과를 나타내며, 전신성 염증으로 유발되는 혈관의 투과성, 면역세포의 침윤, 그리고 조직과 기관의 손상을 완화하고 지연시키는 작용을 한다. 따라서 본 발명의 조성물은 패혈증과 같은 중증 혈관 염증성 질환의 치료제를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 CLP 패혈증 동물 모델에서 야생형 EX4(WT-EX4)와 PEGylated EX4가 혈관 투과성에 미치는 영향을 확인하기 위한 에반스 블루 염료 누출(Evans blue dye leakage) 실험 결과를 나타낸다. *는 PBS를 주입한 CLP 대조군(PBS)과 비교하여 p<0.05인 것을 나타내고, #는 WT-EX4를 주입한 CLP 실험군(WT-EX4)과 비교하여 p<0.05인 것을 나타낸다.
도 2는 CLP 패혈증 동물 모델에서 WT-EX4와 PEGylated EX4가 백혈구 이동(leukocyte migration)에 미치는 영향을 알아보기 위한 복강내 백혈구 수치 측정 결과를 나타낸다. *는 PBS를 주입한 CLP 대조군(PBS)과 비교하여 p<0.05인 것을 나타내고, #는 WT-EX4를 주입한 CLP 실험군과 비교하여 p<0.05인 것을 나타낸다.
도 3은 CLP 패혈증 동물 모델에서 WT-EX4와 PEGylated EX4가 폐에서 일어나는 염증 반응에 미치는 영향을 알아보기 위한 H&E 염색한 폐 조직 사진과 폐 조직의 조직병리학적 점수(histopathological score)를 나타낸다. *는 CLP 대조군(CLP)과 비교하여 p<0.05인 것을 나타내고, #는 WT-EX4를 주입한 CLP 실험군(CLP + WT-EX4)과 비교하여 p<0.05인 것을 나타낸다.
도 4는 CLP 패혈증 동물 모델에서 WT-EX4와 PEGylated EX4가 내부 기관 손상, 사이토카인과 키모카인 생성에 미치는 영향을 나타낸다. 도 4의 A는 간 손상 정도를 나타내는 AST와 ALT 지수, 도 4의 B는 신장 손상 정도를 나타내는 크레아티닌(creatinine), 도 4의 C는 신장 손상 정도를 나타내는 BUN, 도 4의 D는 조직 손상 정도를 나타내는 LDH, 도 4의 E는 IL-1β, IL-6, IL-10 수준, 도 4의 F는 TNF-α 수준, 도 4의 G는 MCP-1 수준을 나타낸다. +는 CLP 실험군(CLP)과 비교하여 p<0.05인 것을 나타내고, #는 WT-EX4를 주입한 CLP 실험군(CLP + WT-EX4)과 비교하여 p<0.05인 것을 나타낸다.
도 5는 CLP 패혈증 동물 모델에서 WT-EX4와 PEGylated EX4가 패혈증 생존률(survival rate)에 미치는 영향을 나타내는 생존률 그래프를 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험 방법>

EX4 의 PEG 유도체 제작

C-말단에 Cys가 도입된 분자량 4290.7Da의 EX4-Cys(아미노산 서열 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC, 서열번호 1)는 CS Bio(Menlo Park)에서 구입하였다. 분자량 2kDa, 5kDa, 20kDa인 선형(linear type) monomethoxy PEG-maleimide(각각 PEG-2K-MAL, PEG-5K-MAL, PEG-20K-MAL)와 분자량이 50kDa인 삼중가지형(trimeric) PEG-MAL(tPEG-50K-MAL, 제품번호 SUNBRIGHT GL3-400MA100U)는 NOF사(Japan)에서 구입하였다.

EX4-Cys의 C-말단 Cys의 자유 티올기(free thiol group)에 상기 PEG-MAL과 tPEG-50K-MAL을 이용하여 위치특이적 PEGylation 반응을 실시하였다. 간략하게, 각각의 PEG-MAL 또는 tPEG-50K-MAL를 용해시킨 50mM 인산염완충용액(phosphate buffer, pH 6.0) 200uL을 100uL의 EX4-Cys 용액(10mg/ml, deionized water)에 PEG-MAL 또는 tPEG-50K-MAL와 EX4-Cys가 1:1.5의 몰비가 되도록 혼합하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. PEGylated EX4 유도체를 분리하기 위하여, 반응 혼합물은 equilibrium buffer A(20mM acetate buffer, pH 4.0)에 10배 희석하고, 0.8mL/min의 유속의 equilibrium buffer A로 평형 상태를 미리 유지시킨 TSKgel SP 5PW 양이온 교환 칼럼(cation-exchange column, 75×7.5mm id, 10μm, Tosoh Bioscience, Japan)에 통과시켰다. 8분간 세척하고, 40분간 0%부터 100%의 elution buffer(1M NaCl의 버퍼 A) 선형 농도 구배로 PEGylated EX4를 용리하였고(elution), 280nm에서 UV 흡광도를 측정하였다. PEGylated EX4에 해당하는 분획은 말디-토프 질량 분석( matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)으로 확인하여 수득하였다. 확인된 PEGylated EX4 유도체는 Amicon centrifugal filter(분자량 컷-오프 3 또는 10kDa, Millipore, USA)로 약 1mg/ml의 농도로 농축하고, 0.2μm 막(membrane) 필터로 여과하여 -70℃에서 보관하였다. 단백질 농도는 microBCA assay(Pierce, USA)로 측정하였다.

상기 제조된 PEGylated EX4 유도체의 분자량은 Bruker Daltonics Microflex MALDI-TOF mass spectrometer(Germany)와 337nm 질소 레이저를 이용하여 확인하였다. 질량 분석 결과는 20kV 가속 전압의 선형 양이온 모드에서 얻었다. 매트릭스 용액(matrix solution)으로는 0.1% trifluoroacetic acid(TFA)를 포함하는 acetonitrile:water(50:50, v:v)에 포화된 시나피닉산(sinapinic acid) 용액을 이용하였다. 각각의 분석시료는 매트릭스 용액과 1:1(분석시료:매트릭스, v:v)의 비율로 혼합하고, 1uL의 분석시료-매트릭스 용액을 샘플 플레이트에 발라 공기 중에 건조시켰다.

EX4 와 PEGylated EX4 의 형광 표지

야생형 EX4(WT-EX4) 또는 PEGylated EX4는 FNG-675 NHS ester로 형광표지하였다. 각각의 EX4는 PBS(1.5mL)에 10μM의 농도로 용해시키고, FNG-675 ester는 DMSO(0.2mL)에 30uM의 농도롤 용해시키고, 1:4의 몰비가 되도록 혼합하여 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 산물은 0.2μM 필터 유닛을 이용하여 여과하고, 반응하지 않은 형광 염료는 2mM의 소디움 아자이드(sodium azide)를 포함하는 PD midiTrap^TM G-25(GE Healthcare, UK)을 이용하여 제거하였다. 상기 과정을 통해 각각의 EX4 분자당 약 2.8개의 형광 염료가 결합한 나노파티클(nanoparticle)을 3.62μM의 농도로 수득하였다.

동물 실험

실험에 사용한 마우스는 C57BL/6 수컷(6-7주령, 체중 27g)으로, Orient bio(Korea)에서 구입하여 12시간 동안 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 동물들은 12:12시간 명암 주기로 온도(20-25℃)와 습도(40-45%)가 조절되는 폴리카보네이트 케이지에서 5마리씩 통상적인 설치류 펠렛 식이로 사육하였고, 물도 무제한(ad libitum) 제공하였다. 실험에 사용한 동물은 모두 경북대학교에서 발행한 실험 동물 관리와 사용에 관한 지침(IRB No.; KNU2012-13)에 따라 다루었다.

맹장 결찰과 천자 모델

패혈증의 동물 모델로 맹장 결찰과 천자(cecal ligaton and puncture, CLP)를 실시하였다. 패혈증을 유도하기 위하여 수컷 마우스들은 처음에는 공기체임버(breathing chamber)에서, 이후에는 안면 마스크를 이용하여 2% isoflurane (Forane, JW pharmaceutical, Korea)을 포함하는 산소를 소형 설치류 기체 마취 기계(small rodent gas anesthesia machine, RC2, Vetequip, USA)로 공급하여 마취하였다. 마우스들은 수술하는 동안 자발적으로 호흡하였다. 마취된 마우스는 2cm 길이로 중앙선을 절개하여 맹장과 인접한 소장을 노출시키고, 맹장 말단(cecal tip)부터 5.0mm 위치에서 3.0-silk suture로 단단하게 묶고, 22게이지 주사 바늘로 한번 천공하였다. 천공된 부분으로부터 소량의 배설물이 빠져나오도록 부드럽게 압박하고, 복강 내 원래대로 위치하도록 하였다. 개복 부위는 4.0-silk로 봉합하였다. 허위 수술 대조군(sham control) 동물들은 맹장은 복강 외부로 노출만 시키되, 묶거나 천공하지 않고 복강 내로 다시 넣어주었다. 상기 프로토콜은 본 실험 전에 경북대학교 동물 관리 위원회에서 허가받은 것이다(IRB No. KNU 2012-13).

체내 혈관 투과성과 총 백혈구 이동 분석

CLP 수술한 마우스들은 12시간 또는 12시간 및 50시간 후에 WT-EX4 또는 PEGylated EX4(nanoparticle, 100nM)를 정맥으로 주입하였다. 6시간 후 1% 에반스 블루(Evans blue) 염료를 포함하는 식염수를 정맥으로 주입하고, 30분 후 마우스를 희생하고 5mL의 식염수로 복강을 세척한 복강삼출액을 수득하여 200×g로 10분간 원심분리하였다. 상층액의 흡광도를 650nm에서 측정하였다. 혈관 투과성은 에반스 블루 염료의 표준 곡선(standard curve)에 따라, 복강 내로 유출된 염료(μg/mouse)로 표시하였다.

총 백혈구 이동 정도를 알아보기 위하여 CLP 수술한 마우스들은 각각 CLP 수술 6시간 후 실험 조건에 따라 WT-EX4 또는 PEGylated EX4를 정맥으로 주입하고, 복강을 5mL의 식염수로 세척하여 복강삼출액을 수득하였다. 복강삼출액 20μL를 380uL의 Turk's 용액(0.01% 크리스탈 바이올렛을 포함하는 3% 아세트산)과 혼합한 뒤 광학 현미경을 이용하여 백혈구의 수를 측정하였다. 결과는 복강 당 호중구×10⁶로 표시하였다.

폐의 조직학적 분석

CLP 수술을 한 C57BL/6 수컷 마우스들은 수술 6시간 후 WT-EX4 또는 PEGylated EX4(30nM, 251ng/mouse)를 정맥주사하고(그룹당 마우스 5마리), CLP 수술 96시간 후에 희생시켰다. 마우스 폐의 형태상의 변화를 분석하기 위하여, 각각의 마우스에서 수득한 폐 샘플을 PBS(pH 7.4)로 3번 세척하여 혈액을 제거하고, 4% 포름알데하이드(Junsei, Japan)를 포함하는 PBS(pH 7.4)로 4℃에서 20시간 동안 고정하였다. 고정된 샘플은 에탄올 농도 구배를 이용하여 탈수하고, 파라핀에 내장하여 4um 두께의 조직 절편으로 슬라이드에 취하였다. 조직 절편 슬라이드는 60℃ 오븐에서 파라핀을 제거하고, 재수화하고 헤마톡실린(Sigma)으로 염색하였다. 과염색을 없애기 위하여 슬라이드는 0.5% acid alcohol에 빠르게 세 번 담갔다가 에오신(Sigma)으로 염색하였다. 에탄올 농도 구배와 자일린(xylene)으로 세척하고 커버슬립으로 덮었다. 제작된 폐 조직 표본은 폐 조직, 조직 부종과 면역세포 침윤 정도를 평가하기 위하여 실험 조건을 알지 못하는 블라인드 상태로 광학 현미경을 이용하여 분석하였다. 조직학적 분석 결과는 Grade 1은 정상적인 조직 형태; Grade 2는 최소한의 호중구 백혈구 침윤 상태; Grade 3은 중간 정도의 호중구 백혈구 침윤 상태, 혈관 주위 부종 형성(perivascualr edema formation), 폐 조직 구조의 부분적 손상; Grade 4에서 5는 호중구 백혈구의 집중적인 침윤 상태, 농양 형성, 폐 조직 구조의 전체적인 손상을 나타내는 5개의 등급(Grade)으로 나누어 표시하였다.

임상 화학지수( clinical chemistry )와 사이토카인 수준 측정

임상 화학지수와 사이토카인은 상기 폐의 조직학적 분석을 위하여 CLP 수술한 마우스의 혈청을 이용하였다. CLP 수술 72시간 후 혈액을 수득하여 혈청을 분리하였다. 조직과 기관 손상 정도를 나타내는 아스파르트산 트랜스아미나제(aspartate transaminase, AST), 알라닌 트랜스아미나제(alanine transaminase, ALT), blood urea nitrogen(BUN), 크레아티닌(creatinine), 락트산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 등의 임상 화학적 지수를 생화학 반응 키트(biochemical kit, Mybiosource)를 이용하여 수득한 각 실험군 마우스(군당 5마리)의 혈청에서 측정하였다. IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1, TNF-α 등의 사이토카인/케모카인의 농도는 시판되는 ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여 제조자가 제공한 프로토콜에 따라 측정하였다. 각 반응의 수치는 ELISA plate reader(Tecan, Austria GmbH, Austria)를 이용하여 측정하였다.

통계 처리

모든 실험은 독립적으로 최소한 세 번 이상 실시하였다. 데이터는 평균+표준오차(means+SEM)로 나타내었다. 실험 그룹 간 차이의 통계적 유의성은 윈도우즈용 SPSS 버전 16.0(SPSS, Chicago, IL)을 이용하여 판단하였다. 통계적 타당성은 one-way analysis of variance(ANOVA)와 Tukey's post test를 이용하여 결정하였다. 0.05 미만인 P 수치를 통계적으로 유의한 것으로 하였다. CLP로 유발된 패혈증의 생존률 분석은 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석을 이용하여 실시하였다.

< 실시예 1>

EX4 의 PEG 유도체 제조와 혈중 체류 시간 측정

EX4의 EX4에 C-말단에 자유 티올기(free thiol group)을 갖는 시스테인을 도입하고(EX4-Cys), 시스테인의 티올기에 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 결합시킨 다양한 EX4의 C-말단 PEG 유도체(PEGylated EX4)를 제조하고, 체액에서의 화학적 안정성을 알아보았다.

PEGylated EX4를 제조하기 위하여 EX4-Cys를 말레이미드로 활성화된 분자량 2, 5, 20kDa의 선형 PEG(linear PEG) 또는 분자량 50kDa의 삼중가지형 PEG(trimeric PEG 또는 tPEG, 이하 삼중가지형 PEG로 지칭)와 반응시켜 선형 PEG 유도체(EX4-2K, EX4-5K, EX4-20K)와 삼중가지형 PEG 유도체(EX4-50K)를 제조하고, 양이온 교환 크로마토그래피로 분리하고 말디-토프 분석으로 분자량을 확인하였다. 상기 제조한 PEGylated EX4와 야생형 EX4(WT-EX4)는 각각 맹장의 결찰과 천자(CLP) 수술로 패혈증을 일으킨 마우스에 주입하고, 시간에 따라 마우스의 혈액을 수득하고 혈청을 분리하여 혈청 중의 EX4의 수준을 측정하였다. EX4의 수준은 amylin사의 exendin의 two-site sandwich assay(최고 감지 농도 15pM)를 이용하여 측정하였다. 시간에 따른 EX4의 농도의 반대수 플롯(semilog plot)을 회귀분석하여 분해 속도 상수를 계산하여 WT-EX4와 PEGylated E4의 체내 반감기(half-life)를 도출하였다.

제조된 EX4-2K, EX4-5K, EX4-20K 그리고 EX4-50K의 분자량은 각각 m/z 6457, 9200, 25996과 57675으로 측정되어, EX4와 각각의 말레이미드로 활성화된 PEG 한 분자의 결합으로부터 예상되는 분자량과 잘 부합하는 것을 확인하였다.

또한 패혈증의 마우스 모델의 혈액에서 측정한 체액에서의 EX4의 수준을 분석하여 WT-EX4와 PEGylated EX4의 분해 속도(degradation rate)는 모두 대략 1차 반응속도를 따르는 것을 확인하였다. 한편 WT-EX4와 비교하여 PEGylated EX4의 반감기는 모두 증가하였으며, 구체적으로 WT-EX4의 반감기는 16.9시간인데 반하여 EX4-2K는 49.2시간, EX4-5K는 62.8시간, EX4-20K는 69.7시간, 그리고 EX4-50K는 234.2시간인 것으로 측정되었다.

< 실시예 2>

패혈증에서 EX4 와 PEGylated EX4 가 혈관 장벽기능에 미치는 영향

<2-1> 혈관 투과성 측정

WT-EX4와 PEGylated EX4가 패혈증의 마우스 모델에서 염증 반응으로 손상된 혈관 기능에 미치는 영향을 알아보았다. 중증의 혈관 염증 반응에서는 과다한 염증성 사이토카인과 키모카인의 영향으로 혈관이 회복불가한 정도로 손상되어 체액의 과다한 손실을 야기할 수 있으며, 이 같은 병리학적 변화로 인해 조직 내 체액 순환 부족, 장기 부전과 사망에까지 진행될 수도 있다.

패혈증을 유발하기 위하여 마우스에 CLP 수술을 실시하고, 실험 조건에 따라 WT-EX4, EX4의 선형 PEG 유도체(EX-2K, EX-5K, EX-20K) 또는 삼중가지형 PEG 유도체(EX4-50K)를 정맥으로 주입하였다. 6시간 뒤 에반스 블루 염료를 정맥으로 주입하고, 염료가 혈관에서 복강으로 유출된 정도로 측정하여 혈관 투과성을 확인하였다.

도 1에서 나타나듯이, CLP 수술 뒤 PBS를 주입한 대조군(PBS)은 허위시술 대조군(Sham)과 비교하여 복강으로 유출된 염료의 양이 크게 증가하여 염증 반응으로 인하여 혈관 투과성이 크게 증가하였으나, CLP 수술 후 WT-EX4 또는 PEGylated EX4를 주입한 마우스에서는 복강으로 유출된 염료의 양이 크게 감소하였다. 한편 EX4의 선형 PEG 유도체인 EX4-2K, EX4-5K, EX4-20K는 WT-EX4와 비교하여 염료 유출 감소 정도가 비슷하였으나, 삼중가지형 PEG 유도체인 EX4-50K는 복강 내에서 검출된 염료의 양이 가장 현저하게 감소하였다. 즉, EX4-50K는 염증으로 유발되는 혈관 손상과 혈관 투과성의 증가를 개선하는데 WT-EX4 보다 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다.

<2-2> 백혈구의 내피세포 간 이동 정도 측정

WT-EX4와 PEGylated EX4가 패혈증의 마우스 모델에서 염증으로 유발되는 백혈구(leukocyte)의 혈관 내피세포 간 이동(transendothelial migration)에 미치는 영향을 알아보았다. 혈액 속에서 순환하는 백혈구들이 혈관 내피세포 사이를 통과하여 이동하고 혈관을 이탈하는 것은 혈관 염증 질환의 병리를 가속시키는 핵심적인 단계이다.

마우스에 패혈증을 유발하기 위한 CLP(cecal ligation and puncture) 수술을 하고, 실험 조건에 따라 WT-EX4 또는 PEGylated EX4를 정맥으로 주입하였다. 6시간 뒤 각각의 마우스에서 복강삼출액을 수득하고 Truk 용액으로 염색한 후 백혈구의 수를 측정하였다.

도 2에서 나타나듯이, CLP 수술 뒤 PBS를 주입한 대조군(PBS)은 허위시술 대조군(Sham)과 비교하여 복강으로 이동한 백혈구의 수가 크게 증가하였으나, WT-EX4 또는 PEGylated EX4를 주입한 마우스에서는 복강 내 백혈구 수치가 감소하였다. 한편 EX4의 선형 PEG 유도체인 EX4-2K, EX4-5K, EX4-20K를 주입한 마우스에서는 WT-EX4를 주입한 마우스와 비교하여 유사하거나 오히려 높은 복강 내 백혈구 수치를 나타내었으나, 삼중가지형 EX4-50K를 주입한 마우스에서는 WT-EX4과 비교하여 복강 내 백혈구의 수치가 현저하게 감소한 것으로 관찰되었다. 즉, 삼중가지형 EX4-50K는 염증으로 유발되는 혈관 내피세포 간 백혈구의 이동을 억제하는데 WT-EX4보다 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다.

이상의 실험 결과는 WT-EX4와 PEGylated EX4가 패혈증으로 유발되는 혈관 투과성의 증가와 혈관 내피세포 간 백혈구의 이동을 억제하는 효과가 있으며, 특히 EX4의 삼중가지형 PEG가 가장 뛰어난 효과를 갖는 것을 보여준다. 또한 <실시예 1>에서 측정한 EX4-2K, EX4-5K, EX4-20K의 반감기는 각각 WT-EX4 반감기의 2.9배, 3.7배와 4.1배로 현저하게 증가했음에도 불구하고, 혈관 투과성과 백혈구 이동을 억제하는데 있어서는 WT-EX4와 효과가 유사하거나 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 EX4의 체내 안정성 또는 혈액 내 체류 시간과 염증으로 유발되는 혈관의 손상(혈관 투과성 증가)과 면역 세포의 활성화(백혈구의 이동)의 억제 효과는 분명한 정상관의 관계에 있는 것은 아니라는 것을 보여준다.

< 실시예 3>

패혈증에서 WT - EX4 와 PEGylated EX4 - PEG 가 폐의 염증 반응에 미치는 영향

WT-EX4와 PEGylated EX4가 패혈증의 마우스 모델에서 내장 기관, 특히 폐의 염증 반응에 미치는 영향을 알아보았다.

마우스에 CLP 수술을 하고, 6시간 후 실험 조건에 따라 WT-EX4, 선형 EX4-20K와 삼중가지형 EX4-50K를 정맥으로 주입하였다(그룹당 마우스 5마리). CLP 수술 96시간 후에 수득하여 H&E 염색한 폐의 조직 표본을 관찰하여 폐 조직 구조, 조직 부종, 면역세포 침윤 정도에 따라 1부터 5까지 조직병리학 지수(histopathological scores)를 부여하였다(등급이 높을수록 염증이 심화된 상태를 나타냄; Grade 1, 정상적인 조직 형태; Grade 2, 최소한의 호중구 백혈구 침윤 상태; Grade 3, 중간 정도의 호중구 백혈구 침윤 상태, 혈관 주위 부종 형성(perivascualr edema formation), 폐 조직 구조의 부분적 손상; Grade 4~5, 호중구 백혈구의 집중적인 침윤 상태, 농양 형성, 폐 조직 구조의 전체적인 손상).

도 3에서 나타나듯이, CLP 실험군(CLP)의 폐에서는 조직 부종이 나타나고, 폐 간질(interstitium)과 폐포 공간(alveolar space)이 염증성 세포로 과다하게 침윤되어 있으며, 조직 구조 역시 심각하게 손상되었으나, WT-EX4 또는 PEGylated EX4를 주입한 마우스의 폐에서는 염증 반응이 감소된 경향을 나타내었다. 특히 삼중가지형 EX4-50K를 주입한 마우스(CLP + EX4-50K)의 폐는 허위시술 대조군(Sham)과 거의 유사한 정도로 정상적인 폐의 구조를 가지고 있었다. 각 실험군의 폐 조직의 염증 정도를 나타내는 조직병리학 지수에서도 CLP 실험군(CLP)이 가장 높았으며, WT-EX4(CLP + WT-EX4)와 EX4-20K(CLP + EX4-20K)를 주입한 실험군에서는 유사한 정도로 조직병리학 지수가 감소하였고, 특히 EX4-50K를 주입한 실험군(CLP + EX4-50K)에서는 Sham과 비슷한 가장 낮은 조직 병리학 지수를 나타내어 EX4-50K의 항염증 효과가 가장 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4>

패혈증에서 WT - EX4 와 PEGylated EX4 가 조직과 기관 손상에 미치는 영향

WT-EX4와 PEGylated EX4가 패혈증의 마우스 모델에서 과도한 염증으로 인한 조직과 기관의 손상에 미치는 영향을 알아보았다. 패혈증의 전신 염증 반응은 흔히 복합장기부전(multiple organ failure)를 유발하는데, 간과 신장이 대표적으로 염증에 의해 손상되는 기관이다.

<실시예 3>의 각 실험군의 마우스에서 혈청을 수득하여 조직과 기관 손상 정도를 나타내는 AST, ALT, BUN, 크레아티닌(creatinine), LDH 등의 임상화학지수와 IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1, TNF-α 등의 사이토카인/케모카인의 수준을 측정하였다.

도 4에서 나타나듯이, CLP 실험군(CLP)에서는 Sham과 비교하여 간의 손상을 나타내는 ALT와 AST(도 4의 A), 그리고 신장의 손상을 나타내는 크레아티닌(creatinine, 도 4의 B)과 BUN 지수(도 4의 C), 일반적인 조직 손상의 지표인 LDH(도 4의 D)가 모두 큰 폭으로 증가하여 패혈증 모델에서 간과 신장 등의 기관과 조직이 손상되고 있음을 나타내었다. 한편 WT-EX4 또는 PEGylated EX4를 주입한 마우스에서는 기관과 조직 손상의 지표가 감소하여, 기관/조직을 염증으로부터 보호 효과가 있음을 알 수 있었다. EX4의 선형 PEG 유도체인 EX4-20K(CLP + EX4-20K)는 WT-EX4(CLP + WT-EX4)와 비슷한 정도의 기관/조직 보호 효과를 나타내었으나, 삼중가지형 PEG 유도체인 EX-50K(CLP + EX4-50K)는 CLP 수술로 증가한 ALT, AST, creatinine, BUN, LDH를 모두 가장 큰 폭으로 감소시켰다.

또한 CLP 실험군(CLP)에서는 Sham과 비교하여 IL-1β, IL-6, IL-10(도 4의 E), TNF-α(도 4의 F), MCP-1(도 4의 G) 등의 사이토카인/케모카인 수준이 크게 증가하여 염증 반응이 과다하게 진행되고 있음을 확인하였다. 이같은 사이토카인/케모카인의 수준도 WT-EX4 또는 PEGylated EX4를 주입한 마우스에서 감소하는 경향을 나타내었으며, 특히 EX4의 삼중가지형 PEG 유도체의 효과가 가장 뛰어난 것으로 관찰되었다.

이상의 실험 결과는 EX4의 삼중가지형 PEG 유도체인 EX-50K가 패혈증에서 효과적으로 과다한 염증 반응을 조절하고, 염증으로 유발되는 조직과 기관의 손상을 완화시키는 작용을 하며, 특히 WT-EX4와 비교하여 현저하게 향상된 항염증 효과를 갖는 것을 보여준다.

< 실시예 5>

WT - EX4 와 PEGylated EX4 가 패혈증 생존률에 미치는 영향

WT-EX4와 PEGylated EX4가 혈증의 마우스 모델에서 패혈증으로 인한 치사율에 미치는 영향을 알아보았다.

마우스에 CLP 수술을 하고, 12시간 후 실험 조건에 따라 WT-EX4, 선형 EX4-20K와 삼중가지형 EX4-50K를 각각 1회 주입하였다(418.3ng/마우스, 그룹당 60마리). 시간에 따른 마우스 생존률을 관찰하고 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법으로 분석하였다.

도 5에서 나타나듯이, CLP 수술한 마우스는 CLP 수술 30시간 후부터 생존률이 급격히 감소하였으나, WT-EX4 또는 PEGylated EX4를 주입한 마우스는 CLP 실험군과 비교하여 생존률이 증가하였다. 선형 EX4-20K와 WT-EX4의 효과는 유사하였으나, 삼중가지형 EX4-50K는 WT-EX4나 EX4-20K와 비교하여 생존률이 약 30% 이상 더욱 향상시켜 가장 뛰어난 효과를 갖는 것으로 나타났다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 exendin-4의 삼중가지형 폴리에틸렌글라이콜 유도체는 야생형 exendin-4 보다 뛰어난 항염증 효과를 나타내며, 이를 이요하여 패혈증, 패혈성 쇼크, 전신염증반응증후군, 혈관염 등 혈관 염증성 질환의 효과지속적인 치료제를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Compositions for preventing or treating vascular inflammatory diseases comprising exendin-4 analogues PEGylated with polyethylene glycol derivatives <130> NP15-0112 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exendin-4 analogue containing C-terminal cycteine <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Cys 35 40

Claims (7)

1. 티올(thiol)기가 삼중가지형 구조를 갖는 폴리에틸렌글라이콜(PEG)의 유도체로 페길화(PEGylation)된 시스테인 아미노산이 C-말단에 도입된 exendin-4를 유효성분으로 포함하는 혈관 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 혈관 염증성 질환은 패혈증, 패혈성 쇼크, 전신성 염증 반응 증후군, 맥관염, 혈관염 및 가와사키병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글라이콜의 유도체는 폴리에틸렌글라이콜 삼중가지의 어느 한 말단에 티올기와 결합할 수 있는 작용기를 갖고, 삼중가지의 다른 두 말단은 메톡시기를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글라이콜의 유도체는 화학식 1의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물;
   <화학식 1>
   

   

   
   
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 작용기는 숙신이미딜프로피오네이트, N-히드록시숙신이미드, 프로피온알데히드 및 말레이미드로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제3항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글라이콜의 유도체는 메톡시폴리에틸렌글라이콜 숙신이미딜프로피오네이트, 메톡시폴리에틸렌글라이콜 N-히드록시숙신이미드,메톡시폴리에틸렌글라이콜 프로피온알데히드 및 메톡시폴리에틸렌글라이콜 말레이미드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제3항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글라이콜의 유도체는 분자량이 40kDa 이상 100kDa 이하인 것을 특징으로 하는 조성물.
   

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