EA045369B1 - Рекомбинантный гипосиалилированный эритропоэтин человека, его способы получения и применения при расстройствах нервной системы - Google Patents
Рекомбинантный гипосиалилированный эритропоэтин человека, его способы получения и применения при расстройствах нервной системы Download PDFInfo
- Publication number
- EA045369B1 EA045369B1 EA202290636 EA045369B1 EA 045369 B1 EA045369 B1 EA 045369B1 EA 202290636 EA202290636 EA 202290636 EA 045369 B1 EA045369 B1 EA 045369B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rhepo
- hyposialylated
- group
- glycans
- treated
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 9
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 3
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 claims description 3
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 claims description 3
- 239000012925 reference material Substances 0.000 claims description 3
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims 5
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 claims 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 claims 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 claims 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 68
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 68
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 17
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 17
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 17
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 17
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 16
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 16
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 12
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 9
- DWPVVZZGGGCRRM-UHFFFAOYSA-N (4-methoxyphenyl)-(4-methylpiperazin-1-yl)methanone Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(=O)N1CCN(C)CC1 DWPVVZZGGGCRRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 8
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 6
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 5
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 3
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 2
- KFEUJDWYNGMDBV-UHFFFAOYSA-N (N-Acetyl)-glucosamin-4-beta-galaktosid Natural products OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 KFEUJDWYNGMDBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)C(N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 2
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 2
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 241000023813 Isia Species 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- KFEUJDWYNGMDBV-LODBTCKLSA-N N-acetyllactosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 KFEUJDWYNGMDBV-LODBTCKLSA-N 0.000 description 2
- HESSGHHCXGBPAJ-UHFFFAOYSA-N N-acetyllactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HESSGHHCXGBPAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010050081 Neonatal hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 101100037618 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ant-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 2
- -1 Quaternary Ammonium Anion Chemical class 0.000 description 2
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000003981 capillary liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000007745 plasma electrolytic oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 2
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010048964 Carotid artery occlusion Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101100333654 Homo sapiens EPO gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N L-homocitrulline Chemical compound NC(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000012996 alamarblue reagent Substances 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000021235 carbamoylation Effects 0.000 description 1
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009886 enzymatic interesterification Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000011556 gerbil model Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000000208 hepatic perisinusoidal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003140 lateral ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- OETHQSJEHLVLGH-UHFFFAOYSA-N metformin hydrochloride Chemical compound Cl.CN(C)C(=N)N=C(N)N OETHQSJEHLVLGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к областям биотехнологии и медицины, в частности к получению фармацевтической композиции рекомбинантного эритропоэтина человека с паттерном гликозилирования, который придает ему свойства, которые позволяют использовать его при расстройствах нервной системы.
Уровень техники
Эритропоэтин (ЕРО) представляет собой гликопротеиновый гормон, образованный 166 аминокислотами, который имеет молекулярную массу 30,4 кДа (Lanfranco, F. and Strasburger, С. J. (2016) Sports Endocrinology 47: 115-27). ЕРО естественным образом продуцируется в перисинусоидальных клетках печени у эмбриона и в перинатальный период, а во взрослом возрасте главным образом в интерстициальных фибробластах почек. Этот гормон стимулирует продуцирование эритроцитов в костном мозге и играет важную роль в реакции мозга на повреждение нейронов (Siren L. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (7): 4044-9. ЕРО представляет собой сильно гликозилированную молекулу, и ее углеводная часть составляет 40% ее молекулярной массы. Этот белок содержит четыре сложных цепочки олигосахаридов, связанных с полипептидной цепочкой, три из них соединениями N-типа и одна соединением О-типа, расположение которых было хорошо описано разными авторами Elliott, S. et al. (2004) The Journal of Biological Chemistry, 279(16): 16854-16862; Watson et al. (1994) Glycobiology 4(2): 227-237. Олигосахариды с соединением N-типа могут содержать разное число терминальных остатков сиаловой кислоты и являются важными для секреции, молекулярной стабильности, рецепторного связывания и активности in vivo (Egrie, J. and Browne, J. (2001) Br. J. Cancer, 84(1): 3-10; Goldwasser et al. (1974) J. Biol. Chem 249: 42024206).
С девяностых годов последнего столетия и до настоящего времени было накоплено большое число доказательств нейрозащитных свойств рекомбинантного ЕРО человека (rhEPO). В 1998 г. Sakanara и коллеги в модели глобальной ишемии у песчанок показали, что после окклюзии общей сонной артерии подача rhEPO через боковые желудочки приводила к снижению ишемического повреждения гиппокампальных нейронов в области СА1 (Sakanara, M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 4635-4640).
Цитопротекторное действие ЕРО на центральную нервную систему было показано Maiese и коллегами в 2004 г. и позднее Viviani и коллегами в 2005 г. (Maiese, K. et al. (2004) Trends in Pharmacological Sciences 25 (11): 577-83; Viviani, D. et al. (2005) Journal of Neurochemistry 93 (2): 257-268). Несмотря на всю информацию, накопленную в неклинических исследованиях касательно гематопоэтического ЕРО, достигнутые результаты не было воспроизведены в клинической среде из-за осложнений, связанных с его длительным использованием, которые возникают у пациентов.
У взрослых экспрессия рецептора ЕРО в нервной системе главным образом обнаруживается в нейронах, астроцитах и микроглии, тогда как астроциты продуцируют ЕРО, это гипосиаллилированный ЕРО (Nagai, A. et al. (2001) Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 60 (4): 317-319).
Значительное число исследователей предпринимали попытку модификации rhEPO для получения лекарственного средства, которое имеет такие же нейропротективные свойства, но без осложнений, вызываемых гематопоэтическим действием. ЕРО, называемый AsialoEPO (US 2004/0122216), который получают посредством общего ферментативного десиалилирования rhEPO, имеет желаемые свойства, указанные выше, этот вид ЕРО имеет высокую аффинность к рецептору rhEPO, но ограниченное протективное действие из-за очень короткого срока полужизни в плазме. Другой пример модификации эритропоэтина состоит в превращении лизина в гомоцитруллин путем карбамилирования белка, которое дает карбамилированный ЕРО, называемый СЕРО (Leist, M., Ghezzi, P., Grasso, G., et al. (2004) 305 (5681): 239242). Хотя оба ЕРО не показали гематопоэтического действия, в клинических испытаниях, проводимых с СЕРО, даже если не наблюдалось никаких неблагоприятных эффектов, нейропротективная эффективность не была показана.
Патентная заявка WO 2007/009404 заявляет различные назальные составы ЕРО с низким содержанием сиаловой кислоты, позднее названные NeuroEPO в публикации ее авторов (Garcia, JC and Sosa, I. (2009), The Scientific World Journal, 9: 970-981). Этот rhEPO получается путем процесса ферментации полой волоконной мембраны и ионообменной хроматографии при очистке для отделения наиболее кислых изоформ (тех, которые имеют большее содержание сиаловой кислоты относительно тех, у которых меньшее содержание сиаловой кислоты). Указанный NeuroEPO имеет профиль из 13 изоформ, из которых он делит 9 с гематопоэтическим rhEPO, называемым EPOCIM®.
Впервые авторы настоящего изобретения описали процесс получения в баке-смесителе (ST), объединенном со стадией очистки, проводимой посредством хроматографии, используя монолитную колонку в качестве анионообменника с четвертичным аммонийным лигандом Q, способным повышать экспрессию гипосиалилированных изоформ rhEPO без дополнительных химических и генетических модификаций. Эти изоформы имеют профиль изоэлектрической точки в диапазоне рН от 4,25 до 5,85 и третичную структуру, связанную с гликозилированием, отличным от такового в NeuroEPO, что дает им большую эффективность в механизмах нейрозащиты и нейровосстановления как in vitro, так и in vivo.
Краткое описание изобретения
В одном варианте осуществления объектом настоящего изобретения является фармацевтическая
- 1 045369 композиция, содержащая в качестве действующего средства rhEPO с профилем изоформ, изоэлектрическая точка которых находится в диапазоне от 4,25 до 5,85. Указанный rhEPO имеет микрогетерогенность фукозилированных N-гликанов, образованных би-, три- и тетраантенарными структурами, которые имеют моно- и бисиалилированные остатки сиаловой кислоты, которые составляют 40-60% всех гликанов, трисиалилированные остатки, которые составляют 40-43%, и тетрасиалилированные остатки, которые представляют 10-13%, а также фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
В частности, сайт О-гликозилирования в серине 126 имеет 3 сиалоформы, которые имеют 0-2 остатка сиаловой кислоты, причем моносиалилированная структура является наиболее распространенной и составляет 78-82% всех гликанов, тогда как асиалированные структуры составляют 6-10% всех гликанов. Сайт N-гликозилирования аспарагина 83 содержит фукозилированные биантенарные структуры с 1 и 2 остатками сиаловой кислоты, где указанные структуры составляют 8-12% всех гликанов, фукозилированные триантенарные структуры с 1, 2 и 3 остатками сиаловой кислоты, где эти структуры составляют 17-21% всех гликанов, фукозилированные тетраантенарные структуры, которые имеют 1-4 остатка сиаловой кислоты, где эти структуры составляют 27-31% всех гликанов, и фукозилированные тетраантенарные структуры с N-ацетиллактозамином 1 и 2 типа, которые имеют 1-4 остатка сиаловой кислоты, эти структуры составляют 38-42% всех гликанов.
Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества для фармацевтической композиции, заявленной в настоящем изобретении, включают, помимо прочего, биоадгезивные полимеры, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза, и стабилизаторы белка, такие как L-триптофан, L-лейцин, гидрохлорид L-аргинина и гидрохлорид L-гистидина.
Вышеописанная структура изоформ rhEPO, которые являются частью фармацевтических композиций объекта настоящего изобретения, придает им большую эффективность в механизмах нейрозащиты и нейровосстановления как in vitro, так и in vivo.
В другом варианте осуществления объект настоящего изобретения представляет собой способ получения немодифицированного rhEPO, где процесс ферментации происходит в ST в режиме перфузии в диапазоне температуры 34±2°С, с безбелковой культуральной средой и с диапазоном рН от 7,2 до 7,3, эта среда дополняется глутамином до получения конечной концентрации глутамина в диапазоне 8-12 ммоль/л. Этот способ также включает процесс очистки, который имеет хроматографический этап, на котором монолитную колонку используют как анионообменник с четвертичным аммонийным лигандом Q, причем равновесный буфер является раствором 20 ммоль/л трис в 10 ммоль/л HCl, рН которого находится в диапазоне от 7,9 до 8,10, с диапазоном проводимости 1,35-1,65 мСм/см, и который использует 50 ммоль/л буфер для элюирования на основе ацетата натрия с рН от 4,3 до 4,5 и проводимостью от 2 до 3,5 мСм/см. При помощи способа, описанного в настоящей заявке, можно получить фармацевтическую композицию с увеличенным количеством изоформ с низким содержанием сиаловой кислоты, которые имеют третичную структуру, связанную с гликозилированием, отличным от такового для NeuroEPO, что придает им большую эффективность в механизмах нейрозищиты и нейровосстановления как in vitro, так и in vivo.
Также объектом настоящего изобретения является применение фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для лечения деменции, инсульта, болезни Паркинсона, атаксии, черепно-мозговой травмы, глаукомы, аутизма, гипоксии новорожденных, рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза и неврологического повреждения, вызываемого травмой, отравлением или облучением. В частности, описан способ лечения этой фармацевтической композицией субъекта, нуждающегося в этом, где введение указанной композиции проводят от одного до трех раз в неделю периодами от 6 до 12 месяцев в диапазоне введения от 0,1 до 4 мг в объеме 1 мл.
Подробное описание изобретения Фармацевтические композиции
Объект настоящего изобретения rhEPO отличается тем, что он имеет профиль изоэлектрической точки от 4,25 до 5,85 и вторичную и третичную структуру белка, не связанную с гликозилированием подобно rhEPO, сохраняя такую же третичную структуру, связанную с гликозилированием с сайтом Огликозилирования в серине 126 и тремя сайтами N-гликозилирования в аспарагине 24, 38 и 83. Углеводный состав rhEPO, описанного в настоящем документе, отличает его от других rhEPO. Микрогетерогенность фукозилированных N-гликанов состоит из би-, три- и тетраантенарных структур, которые имеют моно- и бисиалилированные остатки сиаловой кислоты в диапазоне 40-60% всех углеводов, предпочтительно в диапазоне 43-50%, трисиалилированные остатки в диапазоне 40-43% и тетрасиалилированные остатки в диапазоне 10-13% всех углеводов. В частности, сайт О-гликозилирования в серине 126 имеет 3 сиалоформы, которые имеют от 0 до 2 остатков сиаловой кислоты, моносиалилированная структура является наиболее распространенной и составляет 78-82% всех гликанов, а асиалилированные структуры составляют 6-10% всех гликанов.
Сайт N-гликозилирования аспарагина 83 содержит фукозилированные биантенарные структуры с 1 и 2 остатками сиаловой кислоты, где указанные
- 2 045369 структуры составляют 8-12% всех гликанов, фукозилированные триантенарные структуры с 1, 2 и 3 остатками сиаловой кислоты, где эти структуры составляют 17-21% всех гликанов, фукозилированные тетраантенарные структуры, которые имеют 1-4 остатка сиаловой кислоты, где эти структуры составляют 27-31% всех гликанов, и фукозилированные тетраантенарные структуры с N-ацетиллактозамином 1 и 2 типа, которые имеют 1-4 остатка сиаловой кислоты, где эти структуры находятся в диапазоне 38-42% относительно всех гликанов.
Термины гипосиалилированный rhEPO, EPO, HS или основные изоформы используются взаимозаменяемо в настоящем изобретении для ссылки на фармацевтические композиции с характеристиками, описанными выше, также в общем называемые NeuroEPO plus.
Фармацевтические композиции объекта настоящего изобретения имеют в качестве активного ингредиента гипосиалилированные изоформы rhEPO. Эти гипосиалилированные изоформы получаются путем процесса, описанного в настоящем документе, который не предполагает химической и/или генетической модификации rhEPO для получения указанных изоформ. Изоформы rhEPO, которые являются частью действующего вещества указанных фармацевтических композиций, имеют третичную структуру, связанную с гликозилированием, отличным от такового для NeuroEPO, что придает им большую эффективность в механизмах нейрозищиты и нейровосстановления как in vitro, так и in vivo. Фармацевтические композиции объекта настоящего изобретения вводят путем назального или офтальмологического путей введения, и они находятся в форме водных растворов, готовые лекарственные формы которых представляют назальные капли, назальные спреи или глазные капли. Указанные фармацевтические составы содержат гипосиалилированный rhEPO в качестве активного ингредиента и необязательно фармацевтически подходящие вспомогательные вещества и/или стабилизаторы.
Фармацевтически подходящие вспомогательные вещества и/или стабилизаторы являются нетоксичными для субъектов, которые их принимают, в используемых дозах и концентрациях и могут содержать биоадгезивные полимеры, такие как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза и метилцеллюлоза; стабилизаторы белков, такие как L-триптофан, L-лейцин, гидрохлорид L-аргинина и/или гидрохлорид L-гистидина и его соли.
Терапевтическое применение и способы лечения
Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, пригодные для лечения расстройств нервной системы, таких как: цереброваскулярные, психиатрические и нейродегенеративные заболевания. В частности, указанные заболевания могут представлять собой: деменцию, инсульт, болезнь Паркинсона, атаксию, черепно-мозговую травму, глаукому, аутизм, гипоксию новорожденных, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз и неврологическое повреждение, вызываемое травмой, отравлением или облучением. Настоящее изобретение также обеспечивает способ, включающий введение гипосиалилированного rhEPO субъекту, нуждающемуся в таком лечении, один-три раза в неделю периодами в 6-12 месяцев. Указанное введение будет проводиться интраназально (и/н), медленно, путем инстилляции лекарственного средства в слизистую. Доза введения находится в диапазоне 0,1-4 мг, предпочтительно 0,5-1 мг. Максимальный объем введения на дозу составляет 1; 0,5 мл на ноздрю для общей суточной дозы 3 мл. Указанный объем можно распределять на меньшие объемы с интервалами по времени 5-15 мин между каждым введением, предпочтительно каждые 15 мин.
Способ получения гипосиалилированных изоформ rhEPO
Способ, заявленный в настоящем изобретении, состоит из различных этапов и использует клеточные линии, описанные ниже.
Клеточные линии
Клеточные линии, которые можно использовать для выполнения способа объекта настоящего изобретения, являются такими же, как указано для получения rhEPO.
Среди линий наиболее используемыми являются: СНО, COS, BHK, Namalwa, HeLa,
Нер3В, HepG2, предпочтительно для настоящего изобретения используется линия СНО.
Процесс ферментации
Процесс ферментации настоящего изобретения проводят, используя технологию ST. Этот процесс состоит из нескольких этапов, первый содержит размораживание ампулы из рабочего банка клеток до достижения комнатной температуры (18-24°С).
Затем проводят этап размножения, на котором клетки масштабируют до концентрации клеток и жизнеспособности клеток, которая обеспечивает надлежащее инокулирование инокулятора с целью увеличения биомассы.
Как только достигалась плотность клеток > 1x106 клеток/мл, ферментацию начинали с различными режимами работы. Эти режимы могут быть периодическим культивированием, непрерывным культивированием с удержанием биомассы или без него.
Для получения гипосиалилированных изоформ на этом этапе ферментации следует обеспечивать температуру в диапазоне 34±2°С и рН в диапазоне 6,8±0,4.
- 3 045369
Клетки должны расти в безбелковой культуральной среде до получения конечной концентрации глутамина в диапазоне 8-12 ммоль/л.
Процесс очистки
Процесс очистки гипосиалилированного rhEPO включает следующие хроматографические этапы.
Во-первых, проводят псевдоаффинную хроматографию в окрашенном лиганде.
Целью этого этапа является захват rhEPO и частичное удаление основных загрязняющих веществ, присутствующих в супернатанте (SN). Затем гельфильтрационную хроматографию проводят для замены буфера белка на буфер раствора введения для следующего хроматографического этапа.
Затем проводят псевдоаффинную хроматографию хелатами металлов. Этот этап направлен на захват rhEPO и полное исключение фракции загрязняющих веществ, которые не были удалены на предыдущем этапе процесса. Гельфильтрационную хроматографию проводят снова для замены буфера на буфер для раствора введения следующего хроматографического этапа.
В качестве важной стадии процесса получения проводят анионнообменную хроматографию с лигандом четвертичного аммония Q. На этом хроматографическом этапе используют монолитные колонки. Целями этой хроматографии являются отделение гипосиалилированных (биологически активных) изоформ от кислотных, удержание ДНК и концентрирование продукта.
Все это гарантирует, что получаются гипосиалилированные изоформы без загрязнения или смешивания с кислотными изоформами.
Наконец, гельфильтрационную хроматографию проводят снова с целью замены буфера и обеспечения элюирования белка в виде активного сырого материала.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Профиль изоформ:
А) Определение доли изоформ;
В) SN, образованный в культурах при оцениваемых условиях температуры и рН;
фиг. 2 - доля гипосиалилированных изоформ в культурах при оцениваемых условиях температуры и рН;
фиг. 3 - доля гипосиалилированных изоформ в каждой культуре при условиях, оцениваемых в полупромышленном масштабе;
фиг. 4 - относительная интенсивность менее кислотных изоформ в SN;
фиг. 5 - влияние рН и проводимости подвижной фазы на статическую поглощающую способность в четвертичном аммонийном лиганде Q изоформ rhEPO: (А) гипосиалилированные (основные), (В) кислотные;
фиг. 6 - кривые проскока:
А) Хроматографическая матрица Q SFF,
В) Монолитная колонка CIM QA;
фиг. 7 - влияние рН буфера для элюирования на рабочие характеристики основных и кислотных изоформ;
фиг. 8 - распределение гипосиалилированных изоформ rhEPO в производственном масштабе;
фиг. 9 - изучение N-гликанов гипосиалилированного rhEPO путем жидкостной хроматографии с цвиттер-ионным гидрофильным взаимодействием, совмещенной с масс-спектрометрией;
фиг. 10 - электроферограмма извлеченных ионов (EIE) гликоформ гликопептида O126 гипосиалилированного rhEPO, наблюдаемая при ферментативном расщеплении с: а) трипсином и нейраминидазой и b)трипсином;
фиг. 11 - EIE наблюдаемых гликоформ гликопептида N83, полученных при ферментативном расщеплении с трипсином и нейраминидазой;
фиг. 12 - EIE наблюдаемых гликоформ гликопептида N83 гипосиалилированного rhEPO, полученных при ферментации с: а) трипсином и нейраминидазой и b) трипсином;
фиг. 13 - профиль выживаемости клеток культуры астроцитов через 24 и 48 ч после повреждения клеток 8% диметилсульфоксидом (DMSO) и последующей обработкой гипосиалилированным rhEPO;
фиг. 14 - график Каплана-Мейера, выживаемость в течение 7 дней наблюдения;
фиг. 15 - неврологический статус животных через 24 ч после инфаркта;
фиг. 16 - эффект применения различных изоформ rhEPO на количество ретикулоцитов в нормоцитемической мышиной модели.
Настоящее изобретение также дополнено следующими примерами и фигурами.
Однако эти примеры не подразумеваются как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Влияние рН и температуры на профиль изоформ rhEPO в лабораторном масштабе
Из клеточной линии СНО, трансфицированной геном ЕРО человека, получали банк семенных клеток, который приспосабливали к росту в суспензии в безбелковой среде. Полное приспосабливание к этой культуральной среде получали через 37 поколений, представляющих 25 дней культивирования.
Для оценки рабочих характеристик клеточной линии в присутствии различных условий рН и температуры проводили план эксперимента, где объединяли обе переменные. Экспериментальные условия
- 4 045369 показаны в табл. 1. рН культуры контролировали добавлением 0,5 моль/л гидроксида натрия. Таблица 1. Экспериментальные условия для оценки влияния переменных рН и температуры на профиль изоформ rhEPO
| Исходная концентрация клеток | 0,3 Х1О6 |
| (клетки/мл) | |
| Выживаемость клеток (%) | >90 |
| Время культивирования (дни) | 7 |
| Температура инкубации (°C) | 35 |
| 37 | |
| Рабочий объем (мл) | 300 |
| 7,2 | |
| pH | 7,3 |
| 7,5 |
Профиль изоформ rhEPO, соответствующий образцам SN, полученным в культурах при различных оцениваемых условиях, определяли изоэлектрическим фокусированием. Использовали смесь амфолинов с диапазоном рН от 2 до 5 и от 3 до 10, внутренний эталонный материал EPOCIM® использовали как контроль.
Процент интенсивности каждой изоформы в образцах анализировали денситометрией, используя программу Gene Tools. Изоформы со значениями рН в диапазоне от 2,80 до 4,25 определяли как кислотные изоформы, а со значением рН в диапазоне от 4,25 до 6,55 - как основные изоформы (фиг. 1А).
Фиг. 1В показывает, что на профиль изоформ сильно влияла температура.
Несмотря на рН, когда образцы SN, соответствующие каждому условию, сравнивали при температуре 37°С с контролем наблюдали 7 кислотных изоформ. С другой стороны, при 35°С наблюдалась потеря кислотных изоформ, что было более выраженным при условиях с рН 7,2 и 7,3.
Фиг. 2 показывает, что при условиях рН 7,2 и 7,3 и температуре 35°С все полученные изоформы (100%) были основными изоформами.
Пример 2. Влияние рН и температуры на профиль изоформ rhEPO в полупромышленном масштабе
Влияние наилучших культуральных условий, полученных в лабораторном масштабе (температура 35°С, рН 7,2 и 7,3), оценивали в более контролируемой и подходящей среде для клеточной культуры. Из банка семенных клеток, описанного в примере 1, разрабатывали четыре цикла ферментации, используя биореактор типа ST (Infors-AGCH 4103, Боттминген) с эффективным объемом 3,5 л. Рабочие условия показаны в табл. 2. Исходная выживаемость клеток была больше чем 90% при всех оцениваемых условиях.
Таблица 2. Рабочие условия, соответствующие каждому циклу ферментирования
| Параметры | Условие 1 | Условие 2 | Условие 3 | Условие 4 |
| Исходный Xv (клеток/мл) | 0,5х106 | 1,7бх106 | 1,08х106 | 2,31х106 |
| Рабочая температура (°C) | 37 | 35 | 35 | 37 |
| pH | 7,41 | 7,2 | 7,3 | - |
| Рабочий объем (л) | 1,5 | 3 | 3 | 3 |
| Общее время культивирования (дни) | 5 | 7 | 7 | 7 |
| Поток воздуха (мл/мин) | 15 | 15 | 15 | 15 |
| Скорость вращения импеллера (об/мин) | 150 | 150 | 150 | 150 |
| Степень разбавления (vvd) | - | о,з | о,з | о,з |
Образцы отбирали в конце каждой ферментации и профиль изоформ образцов SN, образованных в культурах для оцениваемых условий в биореакторе, определяли посредством техники изоэлектрического фокусирования. Как только получали эти профили, использовали программу Gene Tools и начиная с изображения, соответствующего гелю изоэлектрического фокусирования, определяли интенсивность каждой полосы, присутствующей в геле, и оценивали долю гипосиалилированных изоформ для каждого условия.
Как можно увидеть на фиг. 3 в условиях культивирования 2 и 3 (35°С, рН 7,2-7,3), доля гипосиали- 5 045369 лированных изоформ была выше, чем при условиях 1 и 4. Эти результаты подтверждают обнаружения, полученные на лабораторном уровне, а именно, что путем модификации рабочих условий до рН 7,2-7,3 и температуры 35°С, профиль изоформ rhEPO изменяется, причем большая интенсивность достигается при значениях рН от 4,25 до 5,85.
Пример 3. Путем увеличения концентрации глютамина в культуральной среде происходит содействие экспрессии основных изоформ rhEPO
Для оценки, имело ли повышение концентрации глютамина в культуральной среде влияние на увеличение гипосиалилированных изоформ, оценивали рабочие характеристики клеточной линии СНО, продуцирующей rhEPO. Использовали банк семенных клеток, который подвергали действию различных концентраций глутамина в культуральной среде, и приспособление к культуральной среде проводили в течение 15 дней. Оценка начиналась с исходной концентрации клеток 0,5x106 клеток/мл в конечном объеме 300 мл культуральной среды, используя вращающиеся бутылки, которые выдерживали в инкубаторах при 37°С со скоростью встряхивания 600 об/мин. Конечные концентрации глутамина в культуральной среде составляли 8, 12 и 16 ммоль/л, и культуральную среду с 6 ммоль/л глутамина использовали как контроль.
Относительную интенсивность гипосиалилированных изоформ в SN культур оценивали по денситометрии через семь дней обработки различными концентрациями глутамина.
Фиг. 4 показывает, что с каждым из трех оцененных вариантов большие доли гипосиалилированных изоформ получали относительно контроля, таким образом подтверждая, что с повышением концентрации глутамина в культуральной среде получение гипосиалилированных изоформ в SN является предпочтительным. Наибольшее значение этих изоформ наблюдали с 8 ммоль/л глутамина (87%).
Пример 4. Влияние рН и проводимости на адсорбцию кислотных и основных изоформ в сильном четвертичном аммонийном анионообменнике Q в лабораторном масштабе
С целью определения условий рН и проводимости, которые благоприятствуют наибольшей адсорбции кислотных изоформ в сильном четвертичном аммонийном анионообменнике Q оценивали следующие буферные растворы: 20 ммоль/л фосфата натрия (безводный двухосновный и одноосновный дигидрат) и 20 ммоль/л трис с 10 ммоль/л HCl. Буферные растворы изучали при различных значениях рН и проводимости, рН от 6 до 8 и проводимость от 1,5 до 5 мСм/см.
Наибольшая адсорбция кислотных изоформ для обменника наблюдалась с условиями рН 6 и проводимостью 1,50 мСм/см. С другой стороны, адсорбция гипосиалилированных (основных) изоформ максимизируется при рН 8 и проводимости 1,50 мСм/см. Результаты показаны на фиг. 5.
Пример 5. Сильная анионная матрица Q, которая использует технологию монолитной колонки, имеет лучшие рабочие характеристики в отношении емкости к отдельным изоформам rhEPO по сравнению с той, что использует обычную технологию хроматографических гелей в лабораторном масштабе
Динамическую адсорбционную способность (Q) каждой технологии при изучении рассчитывали с двумя кривыми проскока, используя два из линейных расходов, рекомендуемых изготовителем каждой технологии - 100 см/ч и 600 см/ч для технологии хроматографических гелей (Q SFF) и 156 и 624 см/ч для монолитной колонки (CIM QA). Равновесный раствор, используемый для экспериментов с обычной технологией и для технологии монолитной колонки, представлял буфер трис-HCL с рН 8 и проводимостью 1,5 мСм/см согласно результатам, полученным в примере 4.
Образец rhEPO применяли к колонкам и на выходе из них образцы отбирали в различное время. Концентрацию белков (С) в каждом образце определяли спектрофотометрией. С известными значениями С в каждом из образцов рассчитывали долю неадсорбированного белка С/Со. Загрузку, которая является массой белка, внесенного в колонку, на единицу объема геля, данную в мг rhEPO/мл матрицы Q, рассчитывали для каждого времени.
На фиг. 6 значения С/Со относительно динамической адсорбционной способности представлены графически на кривых проскока, что позволяет узнать Q геля на долю неадсорбированного белка С/С0=0,1 при определенных расходах. Фиг. 6А показывает кривую проскока, полученную с обычной технологией хроматографических гелей, где самый низкий расход был таковым с самой высокой динамической способностью. Фиг. 6В показывает, что монолитная колонка имеет очень похожую динамическую адсорбционную способность с двумя протестированными линейными расходами, поэтому она может работать при более высоких расходах, не испытывая вариаций в динамической адсорбционной способности матрицы.
Табл. 3 показывает значения Q, полученные с различными выполненными измерениями.
Таблица 3. Значения Q, полученные с каждым из расходов, изученных в колонках Q SFF и CIM QA
| Колонка | Поток воздуха (см/ч) | Q (rhEPO/мл геля) |
| QSFF | 100 | 7,82 |
- 6 045369
| 600 | 5,58 | |
| CIM QA | 156 | 8,25 |
| 624 | 7,79 |
При сравнении результатов исследований Q, проводимых в сильных анионообменниках в набивке фильтра и технологии монолитной колонки, наблюдали, что обе технологии имеют подобный Q при самой низкой исследованной линейной скорости. Однако при самой высокой линейной скорости монолитная колонка имеет динамическую адсорбционную способность в 1,40 раза больше, чем у традиционной оцененной хроматографической матрицы. Таким образом, можно сделать вывод, что монолитная колонка обеспечивает увеличение рабочего потока процесса без влияния на емкость обработки массы rhEPO, которую необходимо очищать.
Пример 6. Путем снижения рН оказывается содействие элюированию гипосиалилированных изоформ rhEPO в монолитной колонке в лабораторном масштабе
Проводили экспериментальные тесты, используя колонки Q SFF и CIM QA. Равновесный раствор, используемый для обеих технологий, представлял собой буфер трис-HCl при рН 8 и проводимости 1,5 мСм/см согласно примеру 4. Рабочая линейная скорость колонки Q SFF составляла 600 см/ч, а у монолитной колонки - 624 см/ч. Продукт, используемый для экспериментов, был полученным из молекулярно-эксклюзионной хроматографической колонки Sephadex G-25, после проведения смены буфера на таковой для равновесного раствора, указанный выше. Для элюирования основных изоформ несколько циклов проводили при помощи монолитной анионообменной колонки, используя 50 ммоль/л натрийацетатного буфера с твин 20 при 0,01% со значениями рН: 4,41; 4,81; 5,06; 5,20. Извлечения, полученные при элюировании гипосиалилированных (основных) изоформ и кислотных изоформ в каждом цикле, показаны на фиг. 7. Из анализа этих результатов определили, что, когда рН раствора буфера для элюирования основных изоформ повышается, их рабочие характеристики снижаются, таким образом 50 ммоль/л натрий-ацетатного буфера при рН 4,41 выбирали для элюирования.
Пример 7. Процесс получения гипосиалилированного rhEPO на промышленном уровне является последовательным с точки зрения разделения изоформ и степени чистоты
Из банка семенных клеток, описанного в примере 1, проводили цикл ферментации, причем исходная выживаемость клеток была больше 90%. Этап ферментации проводили при температуре 35°С в безбелковой культуральной среде, которую дополняли для достижения конечной концентрации 8 ммоль/л глутамина, рН среды поддерживали от 7,2 до 7,3.
Как только получали четыре урожая, проводили стадию очистки, где для важной стадии использовали анионообменник с четвертичным лигандом Q, используя монолитную колонку. Раствор трис-HCl при рН 8 и проводимости 1,5 мСм/см использовали как равновесный буфер и 50 ммоль/л натрийацетатного буфера с рН 4,41 использовали для элюирования.
Профиль изоформ четырех партий активного сырого материала, полученных после процесса очистки, определяли посредством техники изоэлектрического фокусирования. Смесь амфолинов с диапазоном рН от 2 до 5 и от 3 до 10 использовали, и внутренний эталонный материал EPOCIM® использовали как контроль. Фиг. 8 показывает согласованность в разделении изоформ, где наблюдается профиль изоформ, сконфигурированный шестью основными изоформами, из которого только две совпадают с контролем.
Кроме того, содержание сиаловой кислоты очищенных изоформ определяли согласно процедуре для определения этой молекулы, описанной в Европейской фармакопее 8.0 (2014), а чистоту - при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой. Табл. 4 показывает полученные результаты в отношении содержания сиаловой кислоты и чистоты.
Таблица 4. Результаты в отношении содержания сиаловой кислоты и чистоты гипосиалилированного rhEPO
| Продукт | Сиаловая кислота (моль сиаловой кислоты/моль белка) | ВЭЖХ с обращенной фазой (%) |
| Партия 1 | 5,1 | 96,24 |
| Партия 2 | 5,5 | 98,03 |
| Партия 3 | 6,5 | 98,38 |
| Партия 4 | 6,9 | 98,29 |
Содержание сиаловой кислоты было менее 10 моль сиаловой кислоты/молекулу белка, а чистота была больше 95% в четырех партиях, из чего можно сделать вывод, что процесс получения гипосиалилированного rhEPO гарантирует получение изоформ в диапазоне рН от 4,25 до 5,85, что отличается от наблюдаемого в NeuroEPO.
- 7 045369
Пример 8. Третичная структура, связанная с гликозилированием гипосиалилированного rhEPO, показывает характерную микрогетерогенность
Анализ гликанов
Для изучения его профиля N-гликанов гипосиалилированный rhEPO подвергается процессу денатурирования и ферментативного расщепления с пептидом N-гликозидазой F (PNGase F). Как только Nгликаны высвобождались, их очищали твердофазной экстракцией, используя картриджи HyperSep Hypercab SPE (Mancera-Arteu, M. et al. (2016) Anal. Chim. Acta 940: 92-103). Затем их дериватизировали согласно процедуре, описанной Gimenez и соавт. в 2015 (Gimenez, E et al. (2015) Anal. Chim. Acta, 866: 5968).
Капиллярную жидкостную хроматографию цвиттер-ионного-гидрофильного взаимодействия, совмещенную с масс-спектрометрией, проводили, следуя методике, описанной Mancera-Arteu, M. et al. (2016) Anal. Chim. Acta, 940: 92-103.
Фиг. 9 показывает масс-спектры трех гликанов, обнаруженные в гипосиалилированном rhEPO. Как можно увидеть, гликан 3Ant2SiA1Fuc является наиболее распространенным, тогда как гликан 4Ant4SiA1Fuc обнаруживается в сниженных количествах.
Табл. 5 показывает процент относительной площади гликанов согласно структуре.
Таблица 5. Процент относительной площади гликанов согласно структуре
| Гликаны | Площадь (%) ** |
| Биантенарные структуры | 10,3 |
| Триантенарные структуры | 17,2 |
| Тетраантенарные структуры | 72,5 |
Табл. 6 показывает гликаны, обнаруживаемые с соответствующими относительными площадями, моноизопотной экспериментальной молекулярной массой (Мэксп.) и погрешностью по массе. Как можно видеть, есть значительное количество гликанов с менее сиалилированными структурами.
Таблица 6. N-Гликаны, обнаруживаемые в гипосиалилированном rhEPO капиллярной жидкостной хроматографией цвиттерионного-гидрофильного взаимодействия, совмещенной с масс-спектрометрией
| Гликаны | Площа ДЬ | Площад ь (%)* | Площадь (%) ” | Мэксп. [Да] | Погрешно сть | |
| 2 Ant | 2AntlSiAlFu | 608,586 | 2,91 | 10,3 | 2154,8011 | 9,39 |
| 2Ant2SiAlFu | 2321,812 | 11,31 | 2445,8983 | 8,34 | ||
| 3 Ant | 3AntlSiAlFu c | 448,587 | 2,18 | 17,2 | 2519,9309 | 6,25 |
| 3Ant2SiAlFu | 1872,328 | 8,98 | 2811,0307 | 7,25 | ||
| 3Ant3SiAlFu | 2562,955 | 12,46 | 3102,1243 | 6,58 | ||
| 4 Ant | 4AntlSiAlFu c | 589,168 | 2,94 | 30,1 | 28885,0669 | 8,01 |
| 4Ant2SiAlFu | 2122,871 | 10,03 | 3176,1571 | 6,09 | ||
| 4Ant3SiAlFu | 4243,325 | 20,74 | 3467,2550 | 5,60 | ||
| 4Ant4SiAlFu | 1575.249 | 7,80 | 3758,2975 | 5,П | ||
| 4 Ant 1 Lac Ac | 4AntlLacNA clSiAlFuc | 205,545 | 1,01 | 35,0 | 3250,1917 | 5,45 |
| 4AntlLacNA c2SiAlFuc | 1506,731 | 3,67 | 3541,2889 | 5,75 | ||
| 4AntlLacNA c3SiAlFuc | 807,621 | 7,01 | 3832,3847 | 3,44 | ||
| 4AntlLacNA c4SiAlFuc | 8539,613 | 3,00 | 4123,4849 | 4,12 | ||
| 4 Ant 2Lac | 4Ant2LacNA c2SiAlFuc | 185,318 | 0,88 | 3,32 | 3906,4126 | 1,И |
- 8 045369
| Ас | 4Ant2LacNA c3SiAlFuc | 433,265 | 2,06 | 4197,4971 | 5,26 | |
| 4Ant2LacNA c4SiAlFuc | 322,987 | 1,59 | 4488,5519 | 6,33 | ||
| 4Ant 3Lac Ac | 4Ant3LacNA clSiAlFuc | 68,423 | 0,32 | 4 081 | 3980,5185 | 24,3 |
| 4Ant3LacNA c2SiAlFuc | 1092,708 | 0,3 | 4271,4698 | 16,70 | ||
| 4Ant3LacNA c3SiAlFuc | 83,360 | 0,38 | 4562,5930 | 13,0 | ||
| 4Ant3LacNA c4SiAlFuc | 95,315 | 0,43 | 4853,6515 | 16,6 |
* Это представляет относительную площадь относительно всех обнаруженных гликанов.
* * Это представляет относительную площадь, сгруппированную антенарными структурами относительно всех обнаруженных гликанов.
Как можно увидеть в табл. 6, гликаны с более сиалилированными структурами (четыре молекулы сиаловой кислоты) обнаруживаются в низком отношении. Напротив, обнаруживаются структуры с молекулой сиаловой кислоты, которые не были обнаружены в других rhEPO, таких как 3Ant1SiA1Fuc, 4Ant1SiA1Fuc, 4Ant1LacNAc1SiA1Fuc и 4Ant3LacNAc1SiA1Fuc. Гликан 4Ant3Sia1Fuc распространен в гипосиалилированном rhEPO. Также можно увидеть, что процент относительной площади антенарных структур относительно всех обнаруженных гликанов отличается от другого rhEPO и что структуры с одним или двумя остатками сиаловой кислоты представляют более 50% относительной площади антенарных структур.
Анализ гликопептидов
Для обнаружения всех глюкоформ, присутствующих в гликопептидах O126 и N83, rhEPO и rhEPOCRS (эталонный продукт фармакопеи) подвергали ферментативному расщеплению с трипсином и нейраминидазой (HS-TN rhEPO). Все сиалоформы в каждой обнаруженной глюкоформе изучали в анализе ферментативного расщепления с трипсином (HS-T rhEPO). Образцы анализировали масс-спектрометрией согласно процедуре, описанной Gimenez, E. et al. (2011) Rapid Commun Mass Spectrom. 25: 2307-2316.
Фиг. 10А и В показывают EIE гликоформ гликопептида O126, обнаруженного в дигестатах rhEPO HS-TN и HS-T, соответственно. В первом наблюдается один пик, соответствующий таковому гликоформы O126/0SiA, поскольку нейраминидаза дает полное десиалилирование гликопептида, так что все сиалоформы становятся одной гликоформой. Напротив, когда ферментативно расщепляется только с трипсином, наблюдалось три сиалоформы с 0, 1 и 2 молекулами сиаловой кислоты. Табл. 7 показывает сиалоформы O126, обнаруженные с соответствующими относительными площадями, моноизопотной экспериментальной молекулярной массой (Мэксп.) и погрешностью по массе.
Таблица 7. Гликоформы, обнаруженные в гликопептиде O126гипосиалилированного rhEPO и rhEPO CRS, ферментативно расщепляющихся с трипсином
| rhEPO-CRS-T | ||||
| Гликопептид 0126 | Rt [мин] | Отн. площадь [%] | Мэксп. [Да] | Погрешность [части на миллион] |
| OSiA | 12,1 | 1,61 | 1829,9169 | 15,0 |
| ISiA | 14,6 | 60,4 | 2121,0166 | 15,0 |
| 2SiA | 18,4 | 38,0 | 2412,1175 | 15,0 |
| Г ипосиалилированный-Т EPO гипосиалилада-Т | ||||
| Гликопептид 0126 | Rt [мин] | Отн. площадь [%] | Мэксп. [Да] | Погрешность [части на миллион] |
| OSiA | 14,0 | 8,88 | 1829,9173 | 15,2 |
| ISiA | 17,2 | 80,5 | 2121,0173 | 15,3 |
| 2SiA | 22,1 | 10,7 | 2412,1215 | 17,1 |
Полученные результаты показывают, что наиболее распространенная сиалоформа является таковой, которая содержит одну молекулу сиаловой кислоты. Как процент относительной площади асиалилированных изоформ, так и изоформ с только одной сиаловой кислотой выше при сравнении с описанными для другого rhEPO, обнаруживая различия в доле обеих сиалоформ с CRS rhEPO.
В случае гликопептида N83 при анализе ферментативного расщепления rhEPO HS-TN обнаруживали шесть пиков, соответствующих шести различным гликоформам без сиаловой кислоты. Полученные EIE показаны на фиг. 11, а обнаруженные гликоформы - в табл. 8. Полученные результаты показывают, что на сайте N83 есть больший процент сложных десиалилированных тетраантенарных структур.
- 9 045369
Таблица 8. Обнаруженные гликоформы гликопептида N83 EPO HS-TN
| Гликопептид8з | Rt [мин] | Площадьотн [%] | Мэксп. [Да] | Погрешность [части на миллион] |
| 2AntOSiAlFuc | 15,4 | 17,12 | 4126,926 | 13,0 |
| 3AntOSiAlFuc | 15,7 | 27,33 | 4492,067 | 13,9 |
| 4 AntO SiAlFuc | 15,9 | 24,30 | 4857,199 | 12,9 |
| 4AntlLacNAcOSi | 16,2 | 12,50 | 5222,333 | 12,3 |
| 4Ant2LacNAcOSi | 16,4 | 6,75 | 5587,325 | 13,6 |
| 4Ant3LacNAcOSi | 15,9 | 12,0 | 5952,621 | 14,8 |
Фиг. 12А показывает, что нет разделения между различными тетраантенарными структурами в дигестате HS-TN rhEPO. Напротив, когда сиалилированные гликоформы дигестата HS-T rhEPO анализируют, наблюдается явное разделение между ними, причем те, которые имеют три остатка сиаловой кислоты, имеют большую интенсивность (фиг. 12В). Эти результаты согласуются с обнаружениями из исследования гликанов.
Табл. 9 показывает все обнаруженные сиалоформы и соответствующие относительные площади, моноизопотные экспериментальные молекулярные массы (Мэксп.) и погрешность по массе.
Таблица 9. Гликоформы гликопептида N83, обнаруженные в дигестатах с трипсином и трипсином/нейраминидазой
| Гликопептид N«3 | Этал. площадь (%) | Площа ДЬ (%) | Мэксп. [Да] | Погреш ность [части на миллион ] | |
| 2 Ant | 2 Anti SiAlFuc | 2,54 | 10,47 | 4417,9833 | 3,43 |
| 2Ant2SiAlFuc | 7,93 | 4709,1311 | 14,3 | ||
| 3Ant | 3 Anti SiAlFuc | 9,17 | 19,56 | 4783,1079 | 1,58 |
| 3Ant2 SiAlFuc | 7,49 | 5074,2569 | 12,1 | ||
| 3Ant3 SiAlFuc | 2,90 | 5365,3564 | 12,2 | ||
| 4 Ant | 4 Anti SiAlFuc | 4,82 | 29,13 | 5148,2690 | 7,08 |
| 4Ant2SiAlFuc | 9,58 | 5439,4017 | 13,6 | ||
| 4 Ant3 SiAlFuc | 9,06 | 5730,5066 | 14,5 | ||
| 4 Ant4 SiAlFuc | 5,67 | 6021,4347 | 14,0 | ||
| 4 Ant 1 Lac Ac | 4AntlLacNAcl SiAlFuc | 4,40 | 23,79 | 5513,3202 | 8,08 |
| 4AntlLacNAc2SiAlFuc | 7,67 | 5804,5468 | 14,9 | ||
| 4 AntlLacNAc3 SiAlFuc | 5,96 | 6095,5354 | 3,31 | ||
| 4AntlLacNAc4SiAlFuc | 5,76 | 6386,8708 | 34,4 | ||
| 4 Ant 2LacAc | 4Ant2LacNAc2SiAlFuc | 6,42 | 17,05 | 6169,8030 | 34,1 |
| 4 Ant2LacNAc3 SiAlFuc | 4,81 | 6460,6122 | И,7 | ||
| 4Ant2LacNAc4SiAlFuc | 5,82 | 6751,6217 | 23,9 |
Результаты подтверждают, что гипосиалилированный rhEPO отличается наличием меньшего количества сиалилированных структур (например, 2Ant1SiA1Fuc или 3Ant1SiA1Fuc), когда белок расщепляется только с помощью трипсина. Когда подтверждали процент относительных площадей моно- и бисиалилированных структур, результаты показали, что они составляют приблизительно 60%. Тетраантенарные структуры в гликопептиде N83 обнаруживаются в наибольшем проценте по сравнению с другими гликоформами, причем имеющие два остатка сиаловой кислоты являются теми, которые имеют наибольшую долю.
Пример 9. Гипосиалилированный rhEPO имеет восстанавливающее действие для астроцитов против цитотоксичности DMSO
Линию астроцитов PG4 культивировали в культуральной среде - модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, дополненной 3,7 г/л NaHCO3 и 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS). Клетки инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2/95% воздуха. Через определенное время SN экстрагировали и клетки подвергали повреждению, вызванному 8% DMSO, и снова инкубировали в течение 24 ч. Затем SN удаляли и добавляли 2% культуральной среды DMEM с различными концентрациями гипосиалилированного rhEPO (1,25; 2,5; 5 и 10 нг/мл). В 24 и 48 ч добавляли реагент Alamar Blue, затем клетки инкубировали в течение 6 ч и считывания выполняли при 540/630 нм. Все инкубации проводили при температуре 37°С в
-
Claims (3)
- атмосфере 5% СО2/95% воздуха.На фиг. 13 можно увидеть, как при разных концентрациях 1,25; 2,5; 5 и 10 нг/мл гипосиалилированного rhEPO клетки были способны восстанавливать свою жизнеспособность, причем наилучшее условие было 1,25 нг/мл гипосиалилированного rhEPO, что показывает способность к регенерации астроцитов.Пример 10. Гипосиалилированный rhEPO имеет лучшую нейрозащитную активность, чем NeuroEPOПесчанок из Монголии использовали для разработки модели перманентной односторонней ишемии, следуя методике, описанной Kahn K. в 1972 г. (Kahn K. (1972) Minneap 22: 510-515). Затем животных рандомизировали на пять экспериментальных групп:Группа 1: Среда 10 мкл средыГруппа 2: Обрабатываемые 0,142 мг/кг гипосиалилированного rhEPOГруппа 3: Обрабатываемые 0,0142 мг/кг гипосиалилированного rhEPOГруппа 4: Обрабатываемые 0,142 мг/кг NeuroEPOГруппа 5: Обрабатываемые 0,0142 мг/кг NeuroEPOКаждую обработку вводили интраназальным путем три раза в сутки в течение четырех дней. Животных оценивали в течение первых 4 дней обработки, а также в течение восстановления следующие 3 дня.Результаты показали значительно больший коэффициент выживаемости животных, обработанных гипосиалилированным rhEPO в дозах 0,142 и 0,0142 мг/кг по сравнению со средой, тогда как NeuroEPO только снижал значительно смертность в дозе 0,142 мг/кг, но не в 0,0142 мг/мг (фиг. 14).Неврологическая оценка показала нейрозащитное действие гипосиалилированного rhEPO (NeuroEPO plus), что значительно снижало значения неврологической шкалы у животных, обработанных в используемых дозах, по сравнению с группой плацебо и с группами, которых обрабатывали NeuroEPO, в которых такой же результат, полученный с гипосиалилированным rhEPO, можно достигать только с дозой 0,142 мг/кг (фиг. 15) (Статистический тест Дункана, равные буквы р > 0,05; различные буквы р > 0,05).Пример 11. Гипосиалилированный rhEPO не повышает количество ретикулоцитов в нормоцитемической мышиной моделиСамок мышей B6D2F1 рандомизировали на 6 экспериментальных групп по 6 животных в каждой, и они получали одну дозу лечения следующим образом: Группа 1: 0,003 мг/мл рабочего эталонного материала rhEPO в 200 мкл объеме подкожным путем (п/к). Группа 2: 0,006 мг/мл гипосиалилированного rhEPO в 200 мкл объеме п/к путем.Группа 3: 0,5 мг/мл гипосиалилированного rhEPO в 200 мкл объеме интраназальным путем.Группа 4: 1 мг/мл гипосиалилированного rhEPO в 200 мкл объеме интраназальным путем.Группа 5: 2 мг/мл гипосиалилированного rhEPO в 200 мкл объеме интраназальным путем.Группа 6: Контроль, 200 мкл вспомогательного вещества п/к путем.Результаты подсчета ретикулоцитов показаны на фиг. 16. Как можно увидеть, не было значительной разницы между животными в контрольной группе и животными в группах, обработанных как п/к, так и интраназально гипосиалилированным rhEPO. Подсчет ретикулоцитов для животных, обработанных рабочим эталонным материалом rhEPO, был значительно выше, чем у животных в контрольной группе и в группе, обработанной гипосиалилированным rhEPO, при обоих использованных путях (Тест Дункана, равные буквы р > 0,05; различные буквы р < 0,05).Результаты показали, что гипосиалилированный ЕРО не повышает подсчет ретикулоцитов даже при наиболыпе дозе, установленной для этого испытания, что показывает, что он не имеет гематопоэтического эффекта.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента рекомбинантный эритропоэтин человека (rhEPO), профиль изоэлектрической точки которого составляет от 4,25 до 5,85, где микрогетерогенность фукозилированных N-гликанов образована би-, три- и тетраантенарными структурами, которые имеют моно- и бисиалилированные остатки сиаловой кислоты в диапазоне 40-60% всех гликанов, трисиалилированные - в диапазоне 40-43% всех гликанов и тетрасиалилированные - в диапазоне 10-13% всех гликанов, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
- 2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что сайт О-гликозилирования в серине 126 имеет 3 сиалоформы, которые имеют от 0 до 2 остатков сиаловой кислоты, где моносиалилированная структура является наиболее распространенной и составляет 78-82% всех гликанов, и асиалилированные структуры составляют 6-10% всех гликанов.
- 3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что сайт N-гликозилирования аспарагина 83 содержит фукозилированные биантенарные структуры с 1 и 2 остатками сиаловой кислоты, где указанные структуры составляют 8-12% всех гликанов,-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU2019-0077 | 2019-09-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045369B1 true EA045369B1 (ru) | 2023-11-21 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100593143B1 (ko) | 에리트로포이에틴 컨쥬게이트 | |
| EP1781697B1 (en) | Novel carbamylated epo and method for its production | |
| US8883726B2 (en) | Fibroblast growth factor 21 variants | |
| UA121959C2 (uk) | Склад, який містить очищену рекомбінантну ідуронат-2-сульфатазу (i2s) | |
| US20120220757A1 (en) | Novel carbamylated epo and method for its production | |
| US20220305084A1 (en) | Human Recombinant Hyposialylated Erythropoietin, Methods of Purification and Therapeutic Uses Thereof | |
| US20040101524A1 (en) | Precursor N-acetylgalactosamine-4-sulfatase, methods of treatment using said enzyme and methods for producing and purifying said enzyme | |
| EA045369B1 (ru) | Рекомбинантный гипосиалилированный эритропоэтин человека, его способы получения и применения при расстройствах нервной системы | |
| KR20080038440A (ko) | 퇴행성 신경질환의 치료 | |
| KR102414649B1 (ko) | 에리스로포이에틴-유래된 펩타이드, 이의 제조 방법 및 이의 용도 | |
| US7012062B2 (en) | Use of modified lysozyme C to prepare medicinal compositions for the treatment of some serious diseases | |
| CN1997665B (zh) | 新型的氨基甲酰化epo及其制备方法 | |
| CN109196097B (zh) | 用于选择高m6p重组蛋白的方法 | |
| JPH01102100A (ja) | 糖鎖をもつヒト・インターフェロンβ | |
| CN117018167A (zh) | 一种稳定的胸腺素β4滴眼液制剂配方 | |
| DE102009032179A1 (de) | Verfahren zur Reinigung von Interferon beta | |
| CN118581067A (en) | Method for selecting high M6P recombinant proteins | |
| KR20070032000A (ko) | 신규 카르바밀화된 ｅｐｏ 및 그의 제조 방법 |