CN114340653A - 人重组低唾液酸化红细胞生成素、其纯化方法及治疗用途 - Google Patents

人重组低唾液酸化红细胞生成素、其纯化方法及治疗用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术和医药领域，并描述了重组人红细胞生成素的药物组合物，其特征在于具有由双触角、三触角和四触角结构形成的岩藻糖基化的N‑聚糖的微异质性，其中单唾液酸化和双唾液酸化唾液酸残基占总聚糖的40‑60％，三唾液酸化的唾液酸残基占总聚糖的40‑43％，四唾液酸化的唾液酸残基占总聚糖的10‑13％。该糖基化模式赋予所述组合物的性质允许其用于神经系统的病症。还描述了获得本文所述的药物组合物的方法。

Description

人重组低唾液酸化红细胞生成素、其纯化方法及治疗用途
技术领域
本发明涉及生物技术和医药领域，尤其涉及获得重组人红细胞生成素的药物组合物，该重组人红细胞生成素具有赋予使其可用于神经系统病症的性质的糖基化模式。
背景技术
红细胞生成素(EPO)是由166个氨基酸形成的糖蛋白激素，其分子量为30.4kDa(Lanfranco，F和Strasburger，C.J.(2016)Sports Endocrinology 47:115-27)。EPO天然在胎儿和围产期内肝脏的窦周细胞中产生，以及在成人期主要是在肾脏的间质成纤维细胞中产生。该激素刺激骨髓中红细胞的产生，并在脑对神经元损伤的应答中发挥重要作用(SirénL.等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(7):4044-9)。
EPO是一种高度糖基化的分子，其碳水化合物部分构成其分子量的40％。该蛋白含有寡糖与多肽链连接的四个复合链，其中三个通过N型接合一个通过O型接合连接，它们的位置已由不同作者进行了较多描述，参见Elliott,S.等人(2004)The Journal ofBiological Chemistry,279(16):16854-16862；Watson等人(1994)Glycobiology 4(2):227-237。具有N型接合的寡糖可含有可变数量的唾液酸末端残基，且对于分泌、分子稳定性、受体结合和体内活性是关键的(Egrie,J.和Browne,J.(2001)Br.J.Cancer,84(l):3-10；Goldwasser等人(1974)J.Biol.Chem 249:4202-4206)。
在上个世纪的整个九十年代直至现在，已经累积了重组人EPO(rhEPO)的神经保护性质的大量证据。1998年，Sakanara和同事在沙鼠的全局缺血模型中证明了在颈总动脉闭塞后，通过侧脑室供应rhEPO导致CA1区域中的海马神经元上的缺血性损伤降低(Sakanara,M.等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:4635-4640)。
Maiese和同事于2004年证明了EPO对中枢神经系统的细胞保护作用，随后Viviani和同事在2005年也进行了验证(Maiese,K.等人(2004)Trends in PharmacologicalSciences 25(11):577-83；Viviani,D.等人(2005)Journal of Neurochemistry 93(2):257-268)。尽管在对造血EPO的非临床研究中累积了这些信息，但获得的结果未在临床中再现，原因是在患者中发生的与其延长使用相关的不良事件。
在成人中，神经系统中EPO受体的表达主要见于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，而星形胶质细胞产生的EPO是一种低唾液酸化的EPO(Nagai,A.等人(2001)Journal ofNeuropathology&Experimental Neurology,60(4):317-319)。
大量的研究人员已经进行了修饰rhEPO以获得具有相同神经保护性质但没有由造血作用引起的不良事件的药物的任务。通过rhEPO的总酶促去唾液酸化获得的称为AsialoEPO的EPO(US 2004/0122216)具有上述所需的性质，这种EPO对rhEPO受体具有高亲和力，但由于血浆半衰期非常短而保护作用有限。红细胞生成素修饰的另一个例子是通过蛋白质的氨基甲酰化作用将赖氨酸转化为高瓜氨酸，产生氨基甲酰化的EPO称为CEPO(Leist,M.,Ghezzi,P.,Grasso,G.等人(2004)305(5681):239–242)。虽然这两种EPO都没有表现出造血作用，但在用CEPO进行的临床试验中，即使没有观察到不良反应，也没有表现出神经保护有效性。
专利申请WO 2007/009404要求保护具有低唾液酸含量的EPO的不同鼻制剂，该EPO后来在其作者的公开出版物中称为NeuroEPO(García,JC和Sosa,I.(2009),TheScientific World Journal,9:970-981)。通过中空纤维膜发酵过程和纯化中的离子交换层析以分离掉最酸性的同等型(具有更高唾液酸含量的那些与唾液酸含量较低的那些分离)来获得该rhEPO。所述NeuroEPO具有13种同等型的特性谱(profile)，与称为
Figure BDA0003531171890000021
的造血rhEPO共有其中9种。
本发明的作者首次描述了在搅拌罐(ST)中的产生方法与通过层析法进行的纯化步骤组合能够增加rhEPO低唾液酸化同等型的表达而无需另外的化学和遗传修饰，其中所述层析法使用整体式柱作为具有季铵配体Q的阴离子交换器。这些同等型具有4.25至5.85的pH范围内的等电点特性谱和与NeuroEPO的糖基化不同的糖基化相关的三级结构，该三级结构给予其在体外和体内的神经保护和神经修复机制中更大的有效性。
发明概述
在一个实施方案中，本发明的目的是一种药物组合物，其特征在于，它包含具有以下同等型特性谱的作为活性成分的rhEPO，该同等型特性谱的等电点在4.25至5.85的范围内。所述rhEPO具有由双、三和四触角结构形成的岩藻糖基化的N-聚糖的微异质性，该结构具有代表总聚糖的40-60％的单和双唾液酸化的唾液酸残基，代表40-43％的三唾液酸化的唾液酸残基和代表10-13％的四唾液酸化的唾液酸残基，以及药学上可接受的赋形剂。
特别地，丝氨酸126中的O-糖基化位点具有3种唾液酸化形式，其具有0至2个唾液酸残基，单唾液酸化的结构最丰富并且代表总聚糖的78-82％，而非唾液酸化结构代表总聚糖的6-10％。
天冬酰胺83的N-糖基化位点包含：
-具有1和2个唾液酸残基的岩藻糖基化的双触角结构，其中所述结构代表总聚糖的8-12％，
-具有1、2和3个唾液酸残基的岩藻糖基化的三触角结构，其中这些结构代表总聚糖的17-21％，
-岩藻糖基化的四触角结构，其具有1至4个唾液酸残基，其中这些结构代表总聚糖的27-31％，和
-具有N-乙酰乳糖胺1型和2型的岩藻糖基化的四触角结构，其具有1至4个唾液酸残基，这些结构代表总聚糖的38-42％。
本发明要求保护的药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于，生物粘合性聚合物例如羟丙基甲基纤维素，以及蛋白质稳定剂例如L-色氨酸，L-亮氨酸，L-精氨酸盐酸盐和L-组氨酸盐酸盐。
作为本发明的药物组合物对象的一部分的rhEPO同等型的上述结构赋予其在体外和体内神经保护和神经恢复机制中更大的有效性。
在另一个实施方案中，本发明的目的是一种用于获得未修饰的rhEPO的方法，其中发酵过程在34±2℃的温度范围内以灌注模式在ST中进行，使用的培养基没有蛋白质和pH范围从7.2至7.3，向该培养基补充谷氨酰胺，直至获得8-12mmol/L的最终浓度。该方法还包括具有层析步骤的纯化过程，其中使用整体式柱作为阴离子交换器，具有Q季铵配体，平衡缓冲液是20mmol/L Tris 10mmol/L HCl溶液，其pH在7.9至8.10的范围，电导率在1.35-1.65mS/cm的范围，且其使用50mmol/L乙酸钠洗脱缓冲液，pH为4.3至4.5和电导率为2-3.5mS/cm。
利用本申请中描述的方法，药物组合物具有增加数量的低唾液酸含量同等型，其具有与NeuroEPO的糖基化不同的糖基化相关的三级结构，这赋予其在体外和体内神经保护和神经恢复机制中更大的有效性。
本发明的目的还有本文所述的药物组合物用于治疗痴呆、中风、帕金森病、共济失调、颅脑创伤、青光眼、自闭症、新生儿缺氧、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、和创伤、中毒或辐射诱导的神经损伤的用途。特别地，描述了用这种药物组合物治疗需要此类治疗的受试者的方法，其中所述组合物在6至12个月的时段内每周施用一至三次，施用范围为1mL体积中0.1mg至4mg。
发明详述
药物组合物
本发明的rhEPO对象的特征在于，它具有4.25至5.85的等电点特性谱，与rhEPO相似的不与糖基化相关的二级和三级蛋白质结构，以及维持相同的与糖基化相关的三级结构，其中具有一个在丝氨酸126处的O-糖基化位点和三个在天冬酰胺24、38和83处的N-糖基化位点。本文所述的rhEPO的糖类组成与其他rhEPO不同。岩藻糖基化的N-聚糖的微异质性由双、三和四触角结构构成，该结构具有占总碳水化合物的40-60％范围内(优选43-50％的范围内)的单唾液酸化和双唾液酸化的唾液酸残基，占40-43％的三唾液酸化的唾液酸残基和占总碳水化合物的10-13％的四唾液酸化的唾液酸残基。
特别地，丝氨酸126中的O-糖基化位点具有3种唾液酸化形式，其具有0至2个唾液酸残基，单唾液酸化的结构最丰富并且占据总聚糖的78-82％，而非唾液酸化结构占据总聚糖的6-10％。
天冬酰胺83的N-糖基化位点包括：
-具有1和2个唾液酸残基的岩藻糖基化的双触角结构，其中所述结构代表总聚糖的8-12％，
-具有1、2和3个唾液酸残基的岩藻糖基化的三触角结构，其中这些结构代表总聚糖的17-21％，
-岩藻糖基化的四触角结构，其具有1至4个唾液酸残基，其中这些结构代表总聚糖的27-31％，和
-具有N-乙酰乳糖胺1型和2型的岩藻糖基化的四触角结构，其具有1至4个唾液酸残基，其中这些结构在总聚糖的38-42％的范围内。
术语低唾液酸化的rhEPO、EPO、HS或碱性同等型在本发明中可互换使用，指具有上述特征的药物组合物，也通常称为NeuroEPO Plus。
本发明的药物组合物对象具有rhEPO的低唾液酸化同等型作为活性成分。通过本发明中描述的方法获得这些低唾液酸化同等型，这并不含对rhEPO进行化学和/或遗传修饰以获得所述同等型。作为所述药物组合物的活性成分一部分的rhEPO同等型具有与糖基化相关的三级结构，该糖基化不同于NeuroEPO的糖基化，这赋予它们在体外和体内的神经保护和神经恢复机制方面更大的有效性。
本发明的药物组合物对象通过鼻或眼部施用途径施用，并且为水溶液的形式，其成品剂型是鼻滴剂、鼻喷雾或滴眼液。所述药物制剂包含低唾液酸化的rhEPO作为活性成分和任选地药学上合适的赋形剂和/或稳定剂。
药学上可接受的赋形剂和/或稳定剂对以所用剂量和浓度接受它们的受试者无毒，并且可包括生物粘合性聚合物如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和甲基纤维素；蛋白质稳定剂如L-色氨酸、L-亮氨酸、L-精氨酸盐酸盐和/或L-组氨酸盐酸盐及其盐。
治疗应用和治疗方法
本发明提供了可用于治疗神经系统病症例如脑血管、精神病和神经变性疾病的药物组合物。特别是，所述疾病可以是：痴呆、中风、帕金森病、共济失调、颅脑创伤、青光眼、自闭症、新生儿缺氧、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、和由创伤、中毒或辐射诱导的神经损伤。
本发明进一步提供了一种方法，包括将低唾液酸化的rhEPO施用给需要此类治疗(6至12个月的时段内每周一至三次)的受试者。所述施用将通过在粘膜中滴注药物，缓慢地鼻内(IN)进行。施用剂量在0.1mg-4mg的范围内，优选0.5mg-1mg。每剂量的最大施用体积为1mL；每鼻孔0.5mL，总的每日剂量为3mL。所述体积可以以每次应用之间5-15分钟的时间间隔(优选每15分钟)以更小的体积分配。
获得rhEPO的低唾液酸化同等型的方法
本发明中要求保护的方法由不同的阶段组成且采用下面描述的细胞系：
细胞系
可用于执行本发明的方法对象的细胞系是对于rhEPO的产生报道的相同的细胞系。其中使用最多的细胞系是：CHO、COS、BHK、Namalwa、HeLa、Hep3B、HepG2，优选对于本发明使用CHO细胞系。
发酵过程
使用ST技术进行本发明的发酵过程。该过程由几个阶段组成，第一阶段包括将来自工作细胞库的安瓿解冻，直到达到室温(18-24℃)。随后进行扩增阶段，其中将细胞规模调整为确保种子发酵罐的适当接种以实现增加生物质的目的的细胞浓度和细胞活力。
一旦达到≥1×106个细胞/mL的细胞密度，通过不同的操作模式开始发酵。这些模式可以是：分批培养、连续培养(有或没有生物质保留)。
为了获得低唾液酸化的同等型，在发酵的这一阶段应确保温度范围为34±2℃和pH范围为6.8±0.4。
细胞应在无蛋白质培养基中生长，直至获得范围在8-12mmol/L的谷氨酰胺终浓度。
纯化过程
低唾液酸化的rhEPO的纯化过程包括以下层析步骤：
首先，进行通过有色配体的伪亲和层析。该步骤的目的是捕获rhEPO，并且部分去除存在于上清液(SN)中的主要污染物。随后进行凝胶过滤层析以将蛋白质的缓冲液改变为下一层析步骤应用溶液的缓冲液。
然后，进行通过金属螯合物的伪亲和层析。该步骤旨在捕获rhEPO并完全消除在过程的前面步骤中未被除去的污染物级分。再次进行凝胶过滤层析以将缓冲液改变为下一层析步骤应用溶液的缓冲液。
作为生产过程的关键阶段，进行使用Q季铵配体的阴离子交换层析。在该层析步骤中使用整体式柱。该层析的目的是将低唾液酸化的(生物活性的)同等型与酸性同等型分离，保留DNA和产物的浓缩。所有这些都可以保证获得没有污染或与酸性同等型混合的低唾液酸化同等型。
最后，再次进行凝胶过滤层析，其目的是改变缓冲液并允许蛋白质以活性原材料的形式洗脱。
附图简述
图1.同等型特性谱：A)同等型分割的定义；B)在评估的温度和pH条件下培养物中产生的SN。
图2.在评估的温度和pH条件下培养物中低唾液酸化同等型的比例。
图3.在先导规模在评估的条件下每种培养物中低唾液酸化同等型的比例。
图4.SN中酸性较低的同等型的相对强度。
图5.流动相pH和电导率对rhEPO同等型在Q季铵配体中的静态吸附能力的影响：(A)低唾液酸化(碱性)，(B)酸性。
图6.突破曲线A)：层析基质“Q SFF”，B)：整体式柱“CIM QA”。
图7.洗脱缓冲液pH对碱性和酸性同等型性能的影响。
图8.在生产规模下rhEPO的低唾液酸化同等型的分布。
图9.通过两性离子亲水性相互作用液相层析偶联质谱进行的低唾液酸化rhEPO的N-聚糖的研究。
图10.观察到的低唾液酸化的rhEPO O126糖肽糖型的提取离子电泳图(EIE)，所述糖肽糖型由a)胰蛋白酶和神经氨酸酶和b)胰蛋白酶消化产生。
图11.N83糖肽的EIE观察到由胰蛋白酶和神经氨酸酶消化所产生的糖型。
图12.低唾液酸化的rhEPO N83糖肽的EIE观察到由a)胰蛋白酶和神经氨酸酶和b)胰蛋白酶的消化产生的糖型。
图13：用8％二甲亚砜(DMSO)进行细胞损伤并随后用低唾液酸化rhEPO处理后24和48小时时的星形胶质细胞培养的细胞存活力概况。
图14.Kaplan-Meier图表，在观察的7天期间的存活力。
图15.梗塞形成后24小时时动物的神经学状态。
图16.应用不同rhEPO同等型对正常红血球小鼠模型中的网织红细胞数量的影响。
通过以下实施例和附图进一步详细阐述了本发明。然而，这些实施例并不意味着解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1.pH和温度在实验室规模上影响rhEPO同等型特性谱。
从用人EPO基因转染的CHO细胞系获得种子细胞库，使其适于在无蛋白质培养基中悬浮生长。在37代后(代表培养25天)获得对该培养基的完全适应。
为了评估细胞系在存在不同pH和温度条件下的性能，在组合两个变量的情况下进行实验设计。实验条件如表1所示。通过加入0.5mol/L氢氧化钠来控制培养物的pH。
表1.评估pH和温度变量对rhEPO同等型特性谱的影响的实验条件。
Figure BDA0003531171890000081
通过等电聚焦测定对应于在评估的不同条件下的培养物中产生的SN样品对应的rhEPO的同等型特性谱。使用具有pH范围为2至5和3至10的两性电解质(ampholin)的混合物，使用内部
Figure BDA0003531171890000082
参考材料作为对照。使用Gene Tools程序，通过密度测定法分析样品中每种同等型的强度百分比。具有范围在2.80至4.25的pH值的同等型被定义为酸性同等型，具有范围在4.25至6.55的pH值的同等型作为碱性同等型(图1A)。
图1B显示了同等型特性谱强烈受温度影响。无论pH值如何，当在37℃的温度将对应于每个条件的SN样品与对照比较时，观察到7种酸性同等型。另一方面，在35℃观察到酸性同等型的损失，在pH7.2和7.3的条件下更明显。
图2显示，在pH 7.2和7.3和温度35℃的条件下，获得的全部同等型(100％)为碱性同等型。
实施例2.pH和温度在先导规模下影响rhEPO同等型特性谱
评估了在实验室规模中获得的最佳培养条件(温度35℃，pH 7.2和7.3)在更受控和有利的细胞培养环境中的影响。从实施例1中描述的种子细胞库，使用3.5L有效体积的ST型生物反应器(Infors-AGCH 4103,Bottmingen)设计了四种发酵运行。操作条件如表2所示。在评估的所有条件下初始细胞存活力大于90％。
表2.对应于每种发酵运行的操作条件。
参数 条件1 条件2 条件3 条件4
初始Xv(细胞/mL) 0,5x10<sup>6</sup> 1,76x10<sup>6</sup> 1,08x10<sup>6</sup> 2,31x10<sup>6</sup>
操作温度(℃) 37 35 35 37
pH 7,41 7,2 7,3 -
工作体积(L) 1,5 3 3 3
总培养时间(天数) 5 7 7 7
空气流动(mL/min) 15 15 15 15
旋转叶轮速度(rpm) 150 150 150 150
稀释率(vvd) - 0,3 0,3 0,3
在每次发酵结束时取样，并通过等电聚焦技术确定在生物反应器中评估的条件下培养物中产生的SN样品的同等型特性谱。一旦获得了这些特性谱，就使用Gene Tools程序并从对应于等电聚焦凝胶的图像开始，测定凝胶中存在的每个条带的强度并评估对于每种条件的低唾液酸化同等型的比例。
如图3中可看到的，在培养条件2和3(35℃，pH 7.2-7.3)下，低唾液酸化同等型的比例高于在条件1和4下。这些结果证实了在实验室规模获得的结果，即通过修改操作条件为具有pH 7.2-7.3和35℃的温度，改变了rhEPO的同等型特性谱，实现了具有4.25至5.85pH值的那些的更大的强度。
实施例3.通过增加培养基中谷氨酰胺的浓度有利于rhEPO碱性同等型的表达。
为了评估培养基中谷氨酰胺浓度的增加是否对低唾液酸化同等型的增加有影响，评估了生产rhEPO的CHO细胞系的性能。使用暴露于不同谷氨酰胺浓度的培养基的种子细胞库，并使其进行对培养基的适应15天。评估以终体积为300mL培养基中的初始细胞浓度0.5x106个细胞/mL开始，使用保持在37℃培养箱中的旋转瓶，搅拌速度为600rpm。培养基中的最终谷氨酰胺浓度为：8、12和16mmol/L，使用具有6mmol/L谷氨酰胺的培养基作为对照。
使用不同浓度的谷氨酰胺处理七天后，通过密度测定评估培养物的SN中低唾液酸化同等型的相对强度。
图4显示，使用评估的三个变量中的每一个都获得了相对于对照的更高比例的低唾液酸化同等型，从而证实了当培养基中谷氨酰胺浓度的增加时，有利于在SN中获得低唾液酸化同等型。使用8mmol/L谷氨酰胺观察到这些同等型的最高值(87％)。
实施例4.pH和电导率影响在实验室规模下Q强季铵阴离子交换器中酸性和碱性同等型的吸附。
为了确定有利于Q强季铵阴离子交换器中酸性同等型最大吸附的pH和电导率条件，评估了以下缓冲溶液：20mmol/L磷酸钠(无水磷酸氢二钠和磷酸二氢钠二水合物)和20mmol/L Tris 10mmol/L HCL。在不同的pH和电导率值(pH为6至8，电导率为1.5至5mS/cm)研究缓冲溶液。
在pH 6和电导率为1.50mS/cm的条件下观察到酸性同等型对交换器的最大吸附。另一方面，低唾液酸化(碱性)同等型的吸附在pH 8和电导率1.50mS/cm时最大。结果如图5所示。
实施例5.在实验室规模，使用整体式柱技术的Q强阴离子基质与使用常规层析凝胶技术的Q强阴离子基质相比，在分离rhEPO同等型的能力方面具有更好的性能。
采用两种突破性曲线计算研究的每种技术的动态吸附能力(Q)，这两种曲线使用每种技术的制造商推荐的两种线性流速，对于层析凝胶(Q SFF)的技术为100cm/h和600cm/h，对于整体式柱(CIM QA)为156cm/h和624cm/h。根据实施例4中得到的结果，使用常规技术和整体式柱技术的实验所用的平衡溶液是Tris-HCL缓冲液，pH为8且电导率为1.5mS/cm。
将rhEPO样品施用于柱，在不同时间从其出口取样。通过分光光度法测定每个样品中蛋白质的浓度(C)。通过在每个样品中的C的已知值，计算未吸附蛋白的分数C/C0。每个时间计算载荷，其为每单位体积凝胶施加到柱的蛋白质的质量，以每mL Q基质的rhEPO mg数给出。
在图6中，C/C0的值相对于动态吸附能力以图形方式表示在突破曲线中，其允许知晓在指定流速下每分数的未吸附蛋白C/C0＝0.1的凝胶的Q。图6A示出了利用常规的层析凝胶技术获得的突破曲线，其中最低流速是具有最高动态能力的流速。图6B示出了整体式柱使用测试的两个线性流速具有非常相似的动态吸附能力，因此它可以以更高的流速操作，而不用经历在基质的动态吸附能力中的变化。
表3示出了实施不同的测量获得的Q值。
表3.在Q SFF和CIM QA柱中研究的每种流速获得的Q值。
Figure BDA0003531171890000111
当比较填充床和整体式柱技术的强阴离子交换剂中进行的Q研究的结果时，观察到两种技术在研究的最低线性速度处具有相似的Q。然而，在最高线性速度时，整体式柱的动态吸附能力比评估的传统层析基质大1.40倍。因此，可以得出结论，整体式柱允许增加过程的工作流，而不影响处理要纯化的rhEPO质量的能力。
实施例6.在实验室规模下，通过降低pH有利于整体式柱中低唾液酸化rhEPO同等型的洗脱。
使用Q SFF和CIM QA柱进行实验测试。根据实施例4，对于两种技术使用的平衡溶液是Tris-HCl缓冲液，pH 8且电导率为1.5mS/cm。Q SFF柱的工作线性速度为600cm/h，整体式柱的工作线性速度为624cm/h。从“Sephadex”G-25分子排阻层析柱，在进行将缓冲液变为上述平衡溶液的改变之后获得用于实验的产物。对于碱性同等型的洗脱，使用整体式阴离子交换柱进行了几次运行，其使用50mmol/L吐温20乙酸钠缓冲液0.01％，具有以下pH值：4.41；4.81；5.06；5.20。
每次运行中在低唾液酸化(碱性)同等型和酸性同等型的洗脱中获得的回收率如图7所示。从这些结果的分析中确定，当碱性同等型的洗脱缓冲液的pH值增加时，其性能降低，因此选择pH 4.41的50mmol/L乙酸钠缓冲液用于洗脱。
实施例7.在生产规模下获得低唾液酸化的rhEPO的过程在同等型分离和纯度程度方面是一致的。
从实施例1中描述的种子细胞库中，进行发酵运行，初始细胞存活力大于90％。在35℃的温度在不含蛋白质的培养基中进行发酵阶段，该培养基补充有终浓度达到8mmol/L的谷氨酰胺，培养基的pH保持在7.2至7.3。
一旦获得了四次收获，进行纯化阶段，其中对于关键步骤，使用整体式柱进行了使用Q季铵配体的阴离子交换。使用pH 8和电导率为1.5mS/cm的Tris-HCl溶液作为平衡缓冲液，将50mmol/L乙酸钠缓冲液pH 4.41用于洗脱。
通过等电聚焦技术确定在纯化过程之后获得的四批活性原材料的同等型特性谱。使用具有pH范围为2至5和3至10的两性电解质的混合物，并使用内部
Figure BDA0003531171890000122
参考材料作为对照。图8显示了同等型分离的一致性，其中观察到由六种主要同等型配置的同等型特性谱中仅两种在对照中也有。
此外，纯化同等型的唾液酸含量根据欧洲8.0药典(2014)中描述的对于该分子的测定程序测定，并通过反相HPLC测定纯度。表4显示了获得的唾液酸含量和纯度结果。
表4.低唾液酸化rhEPO的唾液酸含量和纯度结果。
Figure BDA0003531171890000121
唾液酸的含量小于10摩尔唾液酸每蛋白分子，在四个批次中纯度大于95％，从中可以得出结论，获得低唾液酸的rhEPO的过程保证在pH 4.25至5.85的范围内获得同等型，这与在NeuroEPO中观察到的不同。
实施例8.与低唾液酸化的rhEPO的糖基化相关的三级结构显示出特征性微异质性。
聚糖分析
为了研究其N-聚糖谱，低唾液酸化rhEPO经历了变性和使用肽N-糖苷酶F(PNGaseF)的酶消化的过程。一旦释放了N-聚糖，通过固相萃取将其纯化，使用了HypersepHypercab SPE套筒(Mancera-Arteu，M.等人(2016)Anal.Chim.Acta 940:92–103)。随后，根据Giménez等人在2015年描述的程序(Gimenez,E等人(2015)Anal.Chim.Acta,866:59–68)将其衍生化。
按照Mancera-Arteu,M.等人(2016)Anal.Chim.Acta,940:92–103描述的方法进行偶联至质谱的两性离子-亲水相互作用毛细管液相层析。
图9显示了在低唾液酸化的rhEPO中检测到的三种聚糖的质谱。可以看出，聚糖3Ant2SiA1Fuc是最丰富的，而发现聚糖4Ant4SiA1Fuc的量下降。
表5显示了根据结构的聚糖的相对面积的百分比。
表5.根据结构的聚糖的相对面积的百分比。
聚糖 面积(％)<sup>**</sup>
双触角结构 10,3
三触角结构 17,2
四触角结构 72,5
表6显示了用相应的相对面积、单同位素实验分子量(Mexp)和质量误差检测的聚糖。可以看出，有大量的聚糖具有较少唾液酸化的结构。
表6.通过与质谱偶联的两性离子-亲水性相互作用毛细管液相层析法检在低唾液酸化rhEPO中检测的N-聚糖。
Figure BDA0003531171890000131
Figure BDA0003531171890000141
Figure BDA0003531171890000151
*表示相对于检测到的总聚糖的相对面积。**代表相对于检测到的总聚糖通过触角分组的相对面积。
如在表6中可以看出，发现低比例的具有更多唾液酸化的结构(四个唾液酸分子)的聚糖。相反，检测到未在其他rhEPO中发现的具有唾液酸分子的结构如3Ant1SiA1Fuc、4Ant1SiA1Fuc、4Ant1LacNAc1SiA1Fuc和4Ant3LacNAc1SiA1Fuc。聚糖4Ant3Sia1Fuc在低唾液酸化的RHEPO中是丰富的。此外，可以看出，相对于检测到的总聚糖通过触角的相对面积的百分比与其他rhEPO的不同，并且具有一个或两个唾液酸残基的结构代表通过触角的相对面积的超过50％。
糖肽分析
为了检测O126和N83糖肽中存在的所有糖型，对rhEPO和rhEPO-CRS(药典参考产品)进行用胰蛋白酶和神经氨酸酶(rhEPO HS-TN)消化。从胰蛋白酶消化分析(rhEPO HS-T)中研究了检测到的每种糖型中的所有唾液酸型。根据Giménez,E.等人(2011)Rapid CommunMass Spectrom.25:2307-2316描述的程序，通过质谱分析样品。
图10A和B分别显示了在rhEPO HS-TN和HS-T消化物中检测到的O126糖肽糖型的EIE。在第一种中，观察到与O126/0SiA糖型的相对应的单一峰，因为神经氨酸酶产生糖肽的完全脱唾液酸化，使得所有唾液酸型变成单一糖型。相反，当仅用胰蛋白酶消化时，观察到具有0、1和2个唾液酸分子的三种唾液酸型。
表7显示了检测到的O126唾液酸型以及相应的相对面积、单同位素实验分子量(Mexp)和质量误差。
表7.在用胰蛋白酶消化的低唾液酸化的和CRS rhEPO的O126糖肽中检测到的糖型。
Figure BDA0003531171890000152
Figure BDA0003531171890000161
得到的结果表明，最丰富的唾液酸型是含有一个唾液酸分子的唾液酸型。与对其他rhEPO描述的相比，未唾液酸化同等型的相对面积的百分比和只有一个唾液酸的同等型的相对面积的百分比均更高，这在两种唾液酸型与CRS rhEPO的比例差异中都发现。
在N83糖肽的情况下，当分析rhEPO HS-TN消化时，检测到六个峰，对应于没有唾液酸的六种不同的糖型。所获得的EIE显示在图11中，检测到的糖型显示在表8中。得到的结果表明，在N83位点中有较高百分比的复合脱唾液酸化的四触角结构。
表8.EPO HS-TN N83糖肽的检测到的糖型
Figure BDA0003531171890000162
图12A示出了rhEPO HS-TN消化物中的不同四触角结构之间没有分离。相反，当分析rhEPO HS-T消化物的唾液酸化糖型时，观察到它们之间的明显分离，其中具有三个唾液酸残基的具有更大强度(图12B)。这些结果与聚糖研究的发现一致。
表9显示了检测到的所有唾液酸型和相应的相对面积、单同位素实验分子量(Mexp)和质量误差。
表9.在胰蛋白酶和胰蛋白酶/神经氨酸酶消化物中检测到的N83糖肽的糖型。
Figure BDA0003531171890000163
Figure BDA0003531171890000171
Figure BDA0003531171890000181
结果证实，低唾液酸化的rhEPO特征在于，当仅用胰蛋白酶消化蛋白质时具有较少唾液酸化的结构(例如，2Ant1SiA1Fuc或3Ant1SiA1Fuc)。当验证单唾液酸化和双唾液酸化结构的相对面积的百分比时，结果表明它们代表了约60％。
与其他糖型相比，发现N83糖肽中的四触角结构以最高的百分比存在，具有两个唾液酸残基的具有最大比例。
实施例9.低唾液酸化的rhEPO在星形胶质细胞上对DMSO的细胞毒性具有恢复效果。
PG4星形胶质细胞系在Dulbecco的改性Eagle培养基(DMEM)中培养，该培养基葡萄糖较高且补充有3.7g/L的NaHCO3和10％胎牛血清(FBS)。将细胞在37℃的温度在5％CO2/95％空气的气氛中温育24小时。在规定的时间后，提取SN并用8％DMSO对细胞进行损伤，再次温育24小时。随后，去除SN并加入具有不同浓度的低唾液酸化rhEPO(1.25；2.5；5和10ng/mL)的2％DMEM培养基。在24h和48h时加入Alamar Blue试剂，然后将细胞孵育6小时，并在540/630nm处进行读数。所有孵育在5％CO2/95％空气的气氛中在37℃的温度进行。
在图13中看到在不同浓度1.25、2.5、5和10ng/mL的低唾液酸化rhEPO细胞是如何能够恢复其存活力的，最佳条件为1.25ng/mL的低唾液酸化rhEPO，其证明了星形胶质细胞的恢复能力。
实施例10.低唾液酸化的rhEPO具有比NeuroEPO更好的神经保护活性。
使用来自蒙古的沙鼠遵循Kahn K.在1972年描述的方法(Kahn K.(1972)Minneap22:510-515)开发持久性单侧缺血模型。随后，将动物随机化为五个实验组：
第1组：媒介物10μL媒介物
第2组：用0.142mg/kg的低唾液酸化的rhEPO处理
第3组：用0.0142mg/kg的低唾液酸化的rhEPO处理
第4组：用0.142mg/kg的NeuroEPO处理
第5组：用0.0142mg/kg的NeuroEPO处理
每次处理都通过IN途径施用，每天三次，施用四天。在前4天的处理期间评估动物，以及在接下来的3天恢复期间评估动物。
结果表明，与媒介物相比，以0.142和0.0142mg/kg的剂量用低唾液酸化的rhEPO治疗的动物的生存率显著更高，而NeuroEPO仅在0.142mg/kg的剂量而非在0.0142mg/kg显著降低死亡率(图14)。
神经系统评估显示低唾液酸化的rhEPO(NeuroEPO Plus)的神经保护作用，与安慰剂组和NeuroEPO处理组相比，其显著降低了用其处理的动物中所用剂量的神经尺度的值，用低唾液酸化的rhEPO获得的相同结果在NeuroEPO处理组中只能通过0.142mg/kg剂量来实现(图15)(Duncan统计检验，相同字母p>0.05；不同字母p<0.05)。
实施例11.低唾液酸化的rhEPO不增加正常红细胞小鼠模型中的网织红细胞计数。
将B6D2F1雌性小鼠随机分为每组6只动物的6个实验组，并接受单剂量的如下处理：
第1组：0.003mg/mL的rhEPO工作参考材料，以200μL体积，通过皮下途径(SC)。
第2组：0.006mg/mL的低唾液酸化的rhEPO，以200μL体积，通过SC途径。
第3组：0.5mg/mL的低唾液酸化的rhEPO，以200μL体积，通过IN途径。
第4组：1mg/mL的低唾液酸化的rhEPO，以200μL体积，通过IN途径。
第5组：2mg/mL的低唾液酸化的rhEPO，以200μL体积，通过IN途径。
第6组：对照，200μL赋形剂，通过SC途径。
网织红细胞计数的结果如图16所示。可以看出，对照组的动物和通过SC和IN用低唾液酸化rhEPO处理的组中的动物之间没有显著差异。用rhEPO工作参考材料处理的动物的网织红细胞计数显著高于对照组中的动物和使用两种途径用低唾液酸化rhEPO处理的组中的动物的网织红细胞计数(Duncan检验，相同字母p>0.05；不同字母p<0.05)。
结果表明，即使在该试验所建立的最高剂量，低唾液酸化EPO也不增加网织红细胞计数，表明它没有造血作用。

Claims (13)

1.一种药物组合物，其特征在于它包含重组人红细胞生成素(rhEPO)作为活性成分，所述重组人红细胞生成素的等电点特性谱为4.25至5.85。
2.权利要求1的药物组合物，其特征在于岩藻糖基化的N-聚糖的微异质性是由双、三和四触角结构形成的，所述结构具有占总聚糖的40-60％范围内的单唾液酸化和双唾液酸化的唾液酸残基，占总聚糖的40-43％范围内的三唾液酸化的唾液酸残基，和占总聚糖的10-13％范围内的四唾液酸化的唾液酸残基，以及药学上可接受的赋形剂。
3.权利要求1的药物组合物，其特征在于丝氨酸126中的O-糖基化位点具有含0至2个唾液酸残基的3种唾液酸化形式，其中单唾液酸化结构是最丰富的并且占总聚糖的78-82％，并且非唾液酸化的结构占总聚糖的6-10％。
4.权利要求1的药物组合物，其特征在于天冬酰胺83的N-糖基化位点包含：
-具有1和2个唾液酸残基的岩藻糖基化的双触角结构，其中所述结构占总聚糖的8-12％，
-具有1、2和3个唾液酸残基的岩藻糖基化的三触角结构，其中所述结构占总聚糖的17-21％，
-具有1至4个唾液酸残基的岩藻糖基化的四触角结构，其中所述结构占总聚糖的27-31％，和
-具有1至4个唾液酸残基的具有N-乙酰乳糖胺1型和2型的岩藻糖基化的四触角结构，其中所述结构占总聚糖的38-42％。
5.权利要求1的药物组合物，其特征在于所述药学上可接受的赋形剂包含生物粘合性聚合物和蛋白质稳定剂。
6.权利要求5的药物组合物，其特征在于所述生物粘合性聚合物选自包含以下的组：
-羟甲基纤维素，
-羟丙基纤维素，和
-甲基纤维素。
7.权利要求5的药物组合物，其特征在于所述蛋白质稳定剂选自包含以下的组：
-L-色氨酸，
-L-亮氨酸，
-L-精氨酸盐酸盐，和
-L-组氨酸盐酸盐。
8.一种用于获得rhEPO的方法，所述rhEPO没有另外的化学和遗传修饰且具有4.25至5.85的等电点特性谱，该方法的特征在于发酵过程发生在搅拌罐中，并且在纯化过程中使用层析步骤，该层析步骤使用整体式柱作为具有Q季铵配体的阴离子交换器。
9.权利要求8的方法，其特征在于在搅拌罐中的rhEPO的发酵过程在35℃的温度下和在7.2-7.3的pH范围内用无蛋白质培养基来进行，该培养基补充有谷氨酰胺以得到8至12mmol/L的最终浓度。
10.权利要求8的方法，其特征在于在纯化过程中使用具有pH 8和电导率1.5mS/cm的20mmol/L Tris 10mmol/L HCl溶液作为平衡缓冲液，以及使用具有pH 4.41的50mmol/L乙酸钠溶液作为洗脱缓冲液。
11.一种药物组合物，其活性成分是用权利要求8-10的方法获得的低唾液酸化的rhEPO。
12.权利要求1-7和11的药物组合物，其用于治疗痴呆、中风、帕金森病、共济失调、颅脑创伤、青光眼、自闭症、新生儿缺氧、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化和创伤、中毒或辐射诱导的神经损伤。
13.一种用于治疗需要以下操作的受试者的方法，所述操作包括以在1mL的体积中0.1mg至4mg的施用范围每周一次至三次施用权利要求1-7和11的药物组合物达6至12个月。
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