CN116196412A - 使用pd-1轴结合拮抗剂和抗gpc3抗体治疗癌症的方法 - Google Patents

使用pd-1轴结合拮抗剂和抗gpc3抗体治疗癌症的方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供用于治疗癌症的组合物和方法。所述方法包括施用PD‑1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。所述组合物包含用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含PD‑1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。还公开了与PD‑1轴结合拮抗剂组合用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含抗GPC3抗体作为活性成分；与抗GPC3抗体组合用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含PD‑1轴结合拮抗剂作为活性成分。

Description

使用PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体治疗癌症的方法
本申请是申请日为2017年3月14日、发明名称为“使用PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体治疗癌症的方法”的中国专利申请No.201780017668.9的分案申请。
发明领域
本发明涉及通过施用PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体来治疗癌症的方法。
发明背景
据报道，肝细胞癌是全世界癌症死亡的第五大原因，每年约有600,000例死亡(非专利文献1)。大多数肝细胞癌患者在被诊断出患有该疾病后1年内死亡。不幸的是，肝细胞癌病例经常在晚期诊断，在晚期很少对治愈性疗法有应答。包括化疗，化学栓塞术，消融术和质子束疗法在内的医学治疗对这些患者来说效果不足。许多患者表现出血管侵入和多发性肝内转移的疾病复发，其迅速发展到晚期。他们的5年生存率仅为7％(非专利文献2)。适合切除局部病灶的肝细胞癌患者预后相对较好，但其5年生存率仍保持在15％和39％的水平(非专利文献3)。因此，本领域需要用于这种恶性疾病肝细胞癌的新疗法。
据报道，在日本肝细胞癌占原发性肝癌病例的90％以上。用于治疗这种肝细胞癌的医疗方法包括例如基于化疗的经导管动脉栓塞(TAE)疗法，其涉及通过注射油基造影剂(Lipiodol)，抗癌剂和阻塞物质(Gelfoam)的混合物进入肝动脉(作为肿瘤的营养供给途径)导致营养动脉阻塞而诱导肝细胞癌的选择性坏死。此外，使用侵入性方法，例如经皮乙醇注射，经皮微波凝固疗法和射频消融。此外，单独地或与干扰素(IFN)组合地使用化疗剂如氟尿嘧啶(5-FU)，尿嘧啶-替加氟(UFT)，丝裂霉素C(MMC)，米托蒽醌(DHAD)，阿霉素(ADR)，表柔比星(EPI)和顺铂(CDDP)进行全身化疗的临床试验(非专利文献4)。
同时，已批准口服活性形式的索拉非尼(Nexavar，BAY43-9006)，其比上述化疗剂更有效，使得该药剂通过抑制Raf/MEK/ERK信号转导中的Raf激酶来阻断癌细胞的生长同时该药剂通过靶向VEGFR-2，VEGFR-3和PDGFR-β酪氨酸激酶发挥抗血管生成作用。索拉非尼的疗效已在针对晚期肝细胞癌的两个III期多中心安慰剂对照试验(索拉非尼HCC评估随机方案(SHARP)试验和亚太试验(Asia-Pacific trial))中进行了研究。在这两个试验中，索拉非尼被证实可延长存活时间，HR为0.68。在SHARP试验中，索拉非尼延长存活时间至10.7个月，而安慰剂则为7.9个月。在亚洲试验中，该药剂延长存活时间至6.5个月，而安慰剂组为4.2个月。然而，该药剂的客观应答率较低，并且没有显示出症状进展时间的延长，尽管在图像上该药剂延长了肿瘤进展时间(在欧洲和美国的试验中是5.5个月对比2.8个月，在亚洲试验中是2.8个月对比1.4个月)。亚洲群体表现出短暂的寿命延长，这可能是因为与欧洲和美国相比，在亚洲地区他们的治疗在疾病过程中的稍微更晚的阶段开始(非专利文献5和6)。
随着肝癌的进展，通常观察到其与肝功能障碍相关的特定症状，例如厌食，体重减轻，全身不适，可触及的右季肋部肿块，右季肋部疼痛，腹部饱胀感，发烧和黄疸。然而，化疗剂(例如索拉非尼)具有需要克服的并发症，包括其固有的不良反应，例如腹泻或便秘，贫血，免疫系统抑制引起感染或败血症(具有致命严重性)，出血，心脏毒性，肝毒性，肾毒性，厌食和体重减轻。
尽管在肝癌中最初没有观察到特定的早期症状，但其与肝功能障碍相关的特定症状，例如厌食，体重减轻，全身不适，可触及的右季肋部肿块，右季肋部疼痛，腹部饱胀感，发烧和黄疸通常随着肝癌的进展被观察到。根据临床观察，通过使用化疗剂增强了这些症状。例如，与不使用化疗剂相比，通过向患者施用化疗剂可以更加增强患有可检测的肝癌细胞的患者的厌食和诸如与厌食相关或独立于厌食的体重减轻之类的症状。在某些情况下，对于患有这些症状的患者，必须中止使用化疗剂。这些增强的症状是用化疗剂治疗的障碍。因此，从例如改善治疗效果或改善待治疗患者的QOL的观点出发，需要建立优异的治疗。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)经常在肝癌中高水平表达，因此似乎可用于鉴定其在肝癌中的功能或作为肝癌的治疗或诊断靶。
在上述情况下，GPC3作为肝癌的治疗靶的药物正在开发中。已经开发了包含抗GPC3抗体作为活性成分的肝癌药物，该抗体具有针对表达GPC3的细胞的抗体依赖性细胞毒性(下文称为“ADCC”)活性和/或补体依赖性细胞毒性(下文称为“CDC”)活性(专利文献1)。此外，已经开发了包含具有ADCC活性和CDC活性的人源化抗GPC3抗体作为活性成分的GPC3靶向药物(专利文献2)。已经开发了另外的GPC3靶向药物，其包含具有增强的ADCC活性的人源化抗GPC3抗体(专利文献3和4)或具有ADCC活性和CDC活性以及改善的血浆动力学的抗GPC3抗体(专利文献5)。已经发现这些与化疗剂如索拉非尼联合治疗的抗GPC3抗体减轻了例如通过化疗剂(例如索拉非尼)的单独治疗引起的不良反应，并且还发现基于这些药剂的协同效应(专利文献6)。因此，从例如改善治疗效果或改善待治疗患者的QOL的观点来看，使用GPC3靶向药物作为核心正在建立用于治疗肝癌的优异方法。
另一方面，向T细胞提供两种不同的信号是广泛接受的抗原呈递细胞(APC)对静息T淋巴细胞的淋巴细胞活化的模型(Lafferty等,Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci53:27-42(1975))。该模型进一步提供了对自我与非自我和免疫耐受的区分(Bretscher等,Science169:1042-1049(1970)；Bretscher,P.A.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 96:185-190(1999)；Jenkins等,J.Exp.Med.165:302-319(1987))。在识别主要组织相容性复合物(MHC)背景下呈现的外来抗原肽后，通过T细胞受体(TCR)转导初级信号或抗原特异性信号。通过在抗原呈递细胞(APC)上表达的共刺激分子将第二或共刺激信号递送至T细胞，诱导T细胞促进克隆扩增，细胞因子分泌和效应子功能(Lenschow等,Ann.Rev.Immunol.14:233(1996))。在没有共刺激的情况下，T细胞可以变得难以抗原刺激，不会产生有效的免疫应答，并且还可能导致疲惫或对外来抗原的耐受。
在双信号模型中，T细胞接收正和负的第二共刺激信号。调节这些阳性和阴性信号对于最大化宿主的保护性免疫应答至关重要，同时保持免疫耐受并防止自身免疫。负的第二信号似乎是诱导T细胞耐受所必需的，而正信号促进T细胞活化。虽然简单的双信号模型仍然为原初淋巴细胞提供了有效的解释，但宿主的免疫应答是一个动态过程，并且还可以向暴露于抗原的T细胞提供共刺激信号。共刺激的机制具有治疗意义，因为共刺激信号的操作已显示提供增强或终止基于细胞的免疫应答的手段。最近，已发现T细胞功能障碍或无反应性与抑制性受体程序性死亡多肽1(PD-1)的诱导和持续表达同时发生。结果，PD-1和通过与PD-1相互作用发信号的其他分子(如程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性死亡配体2(PD-L2))的治疗靶向是一个引起强烈关注的领域。
PD-L1在许多癌症中过度表达，并且通常与预后不良相关(Okazaki T等,Intern.Immun.2007 19(7):813)(Thompson RH等,Cancer Res 2006,66(7):3381)。有趣的是，大多数肿瘤浸润性T淋巴细胞主要表达PD-1，这与正常组织中的T淋巴细胞和外周血T淋巴细胞中相反，表明肿瘤反应性T细胞上PD-1的上调能促使抗肿瘤免疫应答受损(Blood2009 114(8):1537)。这可能是由于表达PD-L1的肿瘤细胞与表达PD-1的T细胞相互作用介导的PD-L1信号传导的利用导致T细胞活化的减弱和免疫监视的逃避(Sharpe等,Nat Rev2002)(Keir ME等,2008Annu.Rev.Immunol.26:677)。因此，抑制PD-L1/PD-1相互作用可以增强CD8+T细胞介导的肿瘤杀伤。
PD-1和通过与PD-1相互作用发信号的其他分子(例如程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性死亡配体2(PD-L2))的治疗靶向是一个引起强烈关注的领域。已经提出抑制PD-L1信号传导作为增强T细胞免疫以治疗癌症(例如，肿瘤免疫)和感染(包括急性和慢性(例如持续)感染)的手段。最佳治疗处理可以将PD-1受体/配体相互作用的阻断与直接抑制肿瘤生长的试剂相组合。仍然需要用于治疗，稳定，预防和/或延迟各种癌症发展的最佳疗法。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请，专利出版物和UniProtKB/Swiss-Prot登录号，均通过引用整体并入本文，如同每个单独的参考文献被具体和单独地指出通过引用并入。
本发明提供：
[1]与PD-1轴结合拮抗剂组合使用的、用于治疗或延迟个体癌症进展的药物组合物，所述组合物包含抗GPC3抗体作为活性成分。
[2][1]的药物组合物，其中抗GPC3抗体在施用PD-1轴结合拮抗剂之前施用，与施用PD-1轴结合拮抗剂同时施用，或在施用PD-1轴结合拮抗剂之后施用。
[3][1]或[2]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂选自由以下组成的组：PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
[4][3]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。
[5][4]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与其配体结合配偶体的结合。
[6][5]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1的结合。
[7][5]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L2的结合。
[8][5]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和与PD-L2的结合。
[9][5]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂是抗体。
[10][5]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂选自由以下组成的组：纳武单抗(nivolumab)，lambrolizumab(帕姆单抗(pembrolizumab))和pidilizumab。
[11][2]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。
[12][11]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。
[13][11]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与B7-1的结合。
[14][11]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和与B7-1的结合。
[15][12]至[14]中任一项的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。
[16][11]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂选自由以下组成的组：YW243.55.S70，阿特珠单抗(Atezolizumab)，MPDL3280A，MDX-1105，avelumab和MEDI4736(durvalumab)。
[17][15]的药物组合物，其中抗PD-L1抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ IDNO:19的HVR-H1序列，SEQ ID NO:20的HVR-H2序列，和SEQID NO:21的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列，SEQID NO:23的HVR-L2序列和SEQ ID NO:24的HVR-L3序列。
[18][15]的药物组合物，其中抗PD-L1抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
[19][3]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。
[20][19]的药物组合物，其中PD-L2结合拮抗剂是抗体。
[21][19]的药物组合物，其中PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
[22][1]至[21]中任一项的药物组合物，其中抗GPC3抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:34的HVR-H1序列，SEQ ID NO:35的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:36的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:37的HVR-L1序列，SEQ ID NO:38的HVR-L2序列和SEQ IDNO:39的HVR-L3序列。
[23][1]至[21]中任一项的药物组合物，其中抗GPC3抗体能够结合第二抗体能结合的表位，其中所述第二抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ IDNO:42的HVR-H1序列，SEQ ID NO:43的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:44的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:45的HVR-L1序列，SEQ ID NO:46的HVR-L2序列和SEQ ID NO:47的HVR-L3序列。
[24][1]至[23]中任一项的药物组合物，其中抗GPC3抗体是人源化抗体。
[25][24]的药物组合物，其中抗GPC3抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQID NO:52的氨基酸序列。
[26][1]至[25]中任一项的药物组合物，其中癌症选自由以下组成的组：肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，结肠癌，肾癌，食道癌和前列腺癌。
本发明还提供：
[27]与抗GPC3抗体组合使用的、用于治疗或延迟个体癌症进展的药物组合物，所述组合物包含PD-1轴结合拮抗剂作为活性成分。
[28][27]的药物组合物，其中抗GPC3抗体在施用PD-1轴结合拮抗剂之前施用，与施用PD-1轴结合拮抗剂同时施用，或在施用PD-1轴结合拮抗剂之后施用。
[29][27]或[28]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂选自由以下组成的组：PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
[30][29]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。
[31][30]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与其配体结合配偶体的结合。
[32][31]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1的结合。
[33][31]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L2的结合。
[34][31]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和与PD-L2的结合。
[35][31]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂是抗体。
[36][31]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂选自由以下组成的组：纳武单抗(nivolumab)，lambrolizumab(帕姆单抗(pembrolizumab))和pidilizumab。
[37][28]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。
[38][37]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。
[39][37]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与B7-1的结合。
[40][37]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和与B7-1的结合。
[41][38]至[40]中任一项的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。
[42][37]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂选自由以下组成的组：YW243.55.S70，阿特珠单抗(Atezolizumab)，MPDL3280A，MDX-1105，avelumab和MEDI4736(durvalumab)。
[43][41]的药物组合物，其中抗PD-L1抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ IDNO:19的HVR-H1序列，SEQ ID NO:20的HVR-H2序列，和SEQID NO:21的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列，SEQID NO:23的HVR-L2序列和SEQ ID NO:24的HVR-L3序列。
[44][41]的药物组合物，其中抗PD-L1抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
[45][29]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。
[46][45]的药物组合物，其中PD-L2结合拮抗剂是抗体。
[47][45]的药物组合物，其中PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
[48][27]至[47]中任一项的药物组合物，其中抗GPC3抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:34的HVR-H1序列，SEQ ID NO:35的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:36的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:37的HVR-L1序列，SEQ ID NO:38的HVR-L2序列和SEQID NO:39的HVR-L3序列。
[49][27]至[47]中任一项的药物组合物，其中抗GPC3抗体能够结合第二抗体能结合的表位，其中所述第二抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ IDNO:42的HVR-H1序列，SEQ ID NO:43的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:44的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:45的HVR-L1序列，SEQ ID NO:46的HVR-L2序列和SEQ ID NO:47的HVR-L3序列。
[50][27]至[49]中任一项的药物组合物，其中抗GPC3抗体是人源化抗体。
[51][50]的药物组合物，其中抗GPC3抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQID NO:52的氨基酸序列。
[52][27]至[51]中任一项的药物组合物，其中癌症选自由以下组成的组：肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，结肠癌，肾癌，食道癌和前列腺癌。
本发明还提供：
[53]用于治疗或延迟个体癌症进展的药物组合物，其包含PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体的组合作为活性成分。
[54][53]的药物组合物，其中药物组合物是组合制剂。
[55][53]的药物组合物，其中抗GPC3抗体在施用PD-1轴结合拮抗剂之前施用，与施用PD-1轴结合拮抗剂同时施用，或在施用PD-1轴结合拮抗剂之后施用。
[56][53]或[55]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂选自由以下组成的组：PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
[57][56]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。
[58][57]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与其配体结合配偶体的结合。
[59][58]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1的结合。
[60][58]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L2的结合。
[61][58]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和与PD-L2的结合。
[62][58]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂是抗体。
[63][58]的药物组合物，其中PD-1结合拮抗剂选自由以下组成的组：纳武单抗(nivolumab)，lambrolizumab(帕姆单抗(pembrolizumab))和pidilizumab。
[64][55]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。
[65][64]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。
[66][64]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与B7-1的结合。
[67][64]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和与B7-1的结合。
[68][65]至[67]中任一项的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。
[69][64]的药物组合物，其中PD-L1结合拮抗剂选自由以下组成的组：YW243.55.S70，阿特珠单抗(Atezolizumab)，MPDL3280A，MDX-1105，avelumab和MEDI4736(durvalumab)。
[70][68]的药物组合物，其中抗PD-L1抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ IDNO:19的HVR-H1序列，SEQ ID NO:20的HVR-H2序列，和SEQID NO:21的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列，SEQID NO:23的HVR-L2序列和SEQ ID NO:24的HVR-L3序列。
[71][68]的药物组合物，其中抗PD-L1抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
[72][56]的药物组合物，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。
[73][72]的药物组合物，其中PD-L2结合拮抗剂是抗体。
[74][72]的药物组合物，其中PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
[75][53]至[74]中任一项的药物组合物，其中抗GPC3抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:34的HVR-H1序列，SEQ ID NO:35的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:36的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:37的HVR-L1序列，SEQ ID NO:38的HVR-L2序列和SEQID NO:39的HVR-L3序列。
[76][53]至[74]中任一项的药物组合物，其中抗GPC3抗体能够结合第二抗体能结合的表位，其中所述第二抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ IDNO:42的HVR-H1序列，SEQ ID NO:43的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:44的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:45的HVR-L1序列，SEQ ID NO:46的HVR-L2序列和SEQ ID NO:47的HVR-L3序列。
[77][53]至[76]中任一项的药物组合物，其中抗GPC3抗体是人源化抗体。
[78][77]的药物组合物，其中抗GPC3抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQID NO:52的氨基酸序列。
[79][53]至[78]中任一项的药物组合物，其中癌症选自由以下组成的组：肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，结肠癌，肾癌，食道癌和前列腺癌。
本发明还提供：
[80]与PD-1轴结合拮抗剂组合使用的、用于增强个体对肿瘤细胞的免疫应答的药物组合物，所述组合物包含抗GPC3抗体作为活性成分。
[81]与抗GPC3抗体组合使用的、用于增强个体对肿瘤细胞的免疫应答的药物组合物，所述组合物包含PD-1轴结合拮抗剂作为活性成分。
[82]用于增强个体对肿瘤细胞的免疫应答的药物组合物，其包含PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体的组合作为活性成分。
[83][80]至[82]中任一项的药物组合物，其中抗GPC3抗体在施用PD-1轴结合拮抗剂之前施用，与施用PD-1轴结合拮抗剂同时施用，或在施用PD-1轴结合拮抗剂之后施用。
[84][80]至[83]中任一项的药物组合物，其中癌症选自由以下组成的组：肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，结肠癌，肾癌，食道癌和前列腺癌。
本发明还提供：
[85]治疗或延迟个体癌症进展的方法，其包括向所述个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。
[86][85]的方法，其中抗GPC3抗体在施用PD-1轴结合拮抗剂之前施用，与施用PD-1轴结合拮抗剂同时施用，或在施用PD-1轴结合拮抗剂之后施用。
[87][85]或[86]的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂选自由以下组成的组：PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
[88][87]的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。
[89][88]的方法，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与其配体结合配偶体的结合。
[90][89]的方法，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1的结合。
[91][89]的方法，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L2的结合。
[92][89]的方法，其中PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和与PD-L2的结合。
[93][89]的方法，其中PD-1结合拮抗剂是抗体。
[94][89]的方法，其中PD-1结合拮抗剂选自由以下组成的组：纳武单抗(nivolumab)，lambrolizumab(帕姆单抗(pembrolizumab))和pidilizumab。
[95][81]的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。
[96][95]的方法，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。
[97][95]的方法，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与B7-1的结合。
[98][95]的方法，其中PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和与B7-1的结合。
[99][96]至[98]中任一项的方法，其中PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。
[100][95]的方法，其中PD-L1结合拮抗剂选自由以下组成的组：YW243.55.S70，阿特珠单抗(Atezolizumab)，MPDL3280A，MDX-1105，avelumab和MEDI4736(durvalumab)。
[101][99]的方法，其中抗PD-L1抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQID NO:19的HVR-H1序列，SEQ ID NO:20的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:21的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列，SEQ ID NO:23的HVR-L2序列和SEQ ID NO:24的HVR-L3序列。
[102][99]的方法，其中抗PD-L1抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQID NO:4的氨基酸序列。
[103][87]的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。
[104][103]的方法，其中PD-L2结合拮抗剂是抗体。
[105][103]的方法，其中PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
[106][85]至[105]中任一项的方法，其中抗GPC3抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:34的HVR-H1序列，SEQ ID NO:35的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:36的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:37的HVR-L1序列，SEQ ID NO:38的HVR-L2序列和SEQ IDNO:39的HVR-L3序列。
[107][85]至[105]中任一项的方法，其中抗GPC3抗体能够结合第二抗体能结合的表位，其中所述第二抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:42的HVR-H1序列，SEQID NO:43的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:44的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:45的HVR-L1序列，SEQ ID NO:46的HVR-L2序列和SEQ ID NO:47的HVR-L3序列。
[108][85]至[107]中任一项的方法，其中抗GPC3抗体是人源化抗体。
[109][108]的方法，其中抗GPC3抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列。
[110][85]至[109]中任一项的方法，其中癌症选自由以下组成的组：肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，结肠癌，肾癌，食道癌和前列腺癌。
本发明还提供：
[111]一种增强个体对肿瘤细胞的免疫应答的方法，其与PD-1轴结合拮抗剂组合使用，所述组合物包含抗GPC3抗体作为活性成分。
[112]一种增强个体对肿瘤细胞的免疫应答的方法，其与抗GPC3抗体组合使用，所述组合物包含PD-1轴结合拮抗剂作为活性成分。
[113]一种增强个体对肿瘤细胞的免疫应答的方法，其包含PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体的组合作为活性成分。
[114][111]至[113]中任一项的方法，其中抗GPC3抗体在施用PD-1轴结合拮抗剂之前施用，与施用PD-1轴结合拮抗剂同时施用，或在施用PD-1轴结合拮抗剂之后施用。
[115][111]至[114]中任一项的方法组合物，其中癌症选自由以下组成的组：肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，结肠癌，肾癌，食道癌和前列腺癌。
本发明还提供：
[116]用于治疗或延迟个体中癌症进展的组合，其包含PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。
[117][116]的组合，其中抗GPC3抗体在施用PD-1轴结合拮抗剂之前施用，与施用PD-1轴结合拮抗剂同时施用，或在施用PD-1轴结合拮抗剂之后施用。
[118][116]或[117]的组合，其中癌症选自由以下组成的组：肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，结肠癌，肾癌，食道癌和前列腺癌。
本发明还提供：
[119]试剂盒，其包含(1)药物组合物，所述药物组合物包含抗GPC3抗体作为活性成分，(2)容器和(3)包装插页或标签，其包含关于与PD-1轴结合拮抗剂组合施用所述药物组合物以用于治疗或延迟个体中癌症的进展的使用说明书。
[120]试剂盒，其包含第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包含PD-1轴结合拮抗剂作为活性成分，所述第二药物组合物包含抗GPC3抗体作为活性成分。
[121][119]或[120]的试剂盒，其中癌症选自由以下组成的组：肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，结肠癌，肾癌，食道癌和前列腺癌。
本发明还提供：
[122]PD-1轴结合拮抗剂在制备用于治疗或延迟个体癌症进展的药物中的用途，其中所述药物包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含抗GPC3抗体和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物。
[123]抗GPC3抗体在制备用于治疗或延迟个体癌症进展的药物中的用途，其中所述药物包含抗GPC3抗体和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物。
发明概述
发明人已经发现，通过将抗GPC3抗体与人PD-1轴结合拮抗剂组合，可以在癌症患者中实现比当这样的抗GPC3抗体或人PD-1轴结合拮抗剂单独使用时更好的治疗效果。
在一个方面，本文提供了用于治疗或延迟个体癌症进展的方法，包括向个体施用有效量的人PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。
另一方面，本文提供了增强患有癌症的个体对肿瘤细胞的免疫应答的方法，其包括施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括免疫细胞(包括巨噬细胞和多核巨细胞)浸润到肿瘤组织中。又例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括在肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)中CD45阳性淋巴细胞，CD3ε阳性淋巴细胞和CD8阳性T淋巴细胞的增加。
另一方面，本文提供了人PD-1轴结合拮抗剂在制备用于治疗或延迟个体癌症进展的药物中的用途，其中所述药物包含人PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含抗GPC3抗体和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物。
另一方面，本文提供抗GPC3抗体在制备用于治疗或延迟个体癌症进展的药物中的用途，其中所述药物包含抗GPC3抗体和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含人PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物。
另一方面，本文提供了包含人PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学上可接受的载体的组合物，其用于治疗或延迟个体的癌症进展，其中所述治疗包括与第二组合物组合施用所述组合物，其中所述第二组合物包含抗GPC3抗体和任选的药学上可接受的载体。
另一方面，本文提供了包含抗GPC3抗体和任选的药学上可接受的载体的组合物，其用于治疗或延迟个体的癌症进展，其中所述治疗包括与第二组合物组合施用所述组合物，其中所述第二组合物包含人PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学上可接受的载体。
另一方面，本文提供了试剂盒，其包含含有PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学上可接受的载体的药物，和包含使用说明书的包装插页，所述使用说明书用于与包含抗GPC3抗体和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物以用于治疗或延迟个体癌症的进展。
另一方面，本文提供了试剂盒，其包含第一药物和第二药物，所述第一药物包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学上可接受的载体，所述第二药物包含抗GPC3抗体和任选的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含包装插页，所述包装插页包含用于施用所述第一药物和所述第二药物以用于治疗或延迟个体的癌症进展的使用说明书。
另一方面，本文提供了试剂盒，其包含含有抗GPC3抗体和任选的药学上可接受的载体的药物，和包含使用说明书的包装插页，所述使用说明书用于与包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物以用于治疗或延迟个体癌症的进展。
在上文和本文所述的方法，用途，组合物和试剂盒的一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂选自由以下组成的组：PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体，嵌合抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab，Fab'，F(ab')2，scFv和Fv。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与其配体结合配偶体的结合。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1的结合。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L2的结合。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和与PD-L2的结合。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂选自由以下组成的组：MDX-1106(纳武单抗(nivolumab))，MK-3475(帕姆单抗(pembrolizumab)，lambrolizumab)，CT-011(pidilizumab)，PDR001，REGN2810，BGB A317，SHR-1210，AMP-514(MEDI0680)和AMP-224。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与B7-1的结合。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和与B7-1的结合。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂选自由以下组成的组：YW243.55.S70，阿特珠单抗(Atezolizumab)，MPDL3280A，MDX-1105，avelumab和MEDI4736(durvalumab)。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含SEQ ID NO:19的HVR-H1序列，SEQ ID NO:20的HVR-H2序列，和SEQID NO:21的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列，SEQID NO:23的HVR-L2序列和SEQID NO:24的HVR-L3序列。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:25或26的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含WO2010/077634和美国专利号8,217,149(通过引用结合于此)中描述的抗体YW243.55.S70的三个重链HVR序列和/或抗体YW243.55.S70的三个轻链HVR序列。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含抗体YW243.55.S70的重链可变区序列和/或抗体YW243.55.S70的轻链可变区序列。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗(Atezolizumab)。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
在以上和本文所述的方法，用途，组合物和试剂盒的一些实施方案中，抗GPC3抗体是人源化抗体，嵌合抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab，Fab'，F(ab')2，scFv和Fv。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体是GC33或codrituzumab。在一些实施方案中，抗GPC3抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含SEQ ID NO:42的HVR-H1序列，SEQ ID NO:43的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:44的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:45的HVR-L1序列，SEQ ID NO:46的HVR-L2序列和SEQ ID NO:47的HVR-L3序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。在可以与任何其他实施方案组合的一些实施方案中，抗GPC3抗体不是GC33或codrituzumab。
在一些实施方案中，本文描述的抗体(例如，PD-1轴结合拮抗剂抗体或抗GPC3抗体)包含无糖基化位点突变。在一些实施方案中，无糖基化位点突变是置换突变。在一些实施方案中，置换突变位于氨基酸残基N297，L234，L235和/或D265(EU编号)。在一些实施方案中，置换突变选自由以下各项组成的组：N297G，N297A，L234A，L235A和D265A。在一些实施方案中，置换突变是D265A突变和N297G突变。在一些实施方案中，无糖基化位点突变降低抗体的效应子功能。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂(例如，抗PD-1抗体，抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体)是在根据EU编号的位置297处具有Asn至Ala置换的人IgG1。
在以上和本文所述的方法，用途，组合物和试剂盒的一些实施方案中，癌症是GPC3阳性癌症。在一些实施方案中，癌症是肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，结肠癌，肾癌，食道癌，前列腺癌或本文所述的其他癌症。在一些实施方案中，个体患有癌症或已被诊断患有癌症。在一些实施方案中，个体中的癌细胞表达PD-L1。
在以上和本文所述的方法，用途，组合物和试剂盒的一些实施方案中，人PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体的治疗或施用导致在停止治疗后个体中的持续应答。在一些实施方案中，抗GPC3抗体在PD-1轴结合拮抗剂之前施用，与PD-1轴结合拮抗剂同时施用，或在PD-1轴结合拮抗剂之后施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体在相同的组合物中。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体在分开的组合物中。
在以上和本文所述的方法，用途，组合物和试剂盒的一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和/或抗GPC3抗体通过静脉内，肌内，皮下，局部，口服，透皮，腹膜内，眶内，植入，吸入，鞘内，心室内或鼻内施用。在以上和本文所述的方法，用途，组合物和试剂盒的一些实施方案中，所述治疗还包括施用化疗剂以治疗或延迟个体的癌症进展。在一些实施方案中，在用PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体的组合治疗之前，已经用化疗剂治疗个体。在一些实施方案中，用PD-1轴结合拮抗剂和/或抗GPC3抗体的组合治疗的个体是化疗剂治疗难治性的。在整个申请中描述的方法，用途，组合物和试剂盒的一些实施方案还包括施用化疗剂以治疗或延迟癌症的进展。
在以上和本文所述的方法，用途，组合物和试剂盒的一些实施方案中，相对于组合施用之前，个体中的CD8 T细胞具有增强的引发，活化，增殖和/或溶细胞活性。在一些实施方案中，相对于组合施用之前，CD8 T细胞的数量升高。在一些实施方案中，CD8 T细胞是抗原特异性CD8 T细胞。
应理解，本文所述的各种实施方案的一个，一些或所有性质可以组合以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些和其他方面对于本领域技术人员而言将变得显而易见。通过下面的详细描述进一步描述本发明的这些和其他实施方案。
附图的简要说明
[图1]
图1是显示用载体对照，1mg/kg或5mg/kg mGC33每周处理三次的每只小鼠中表达人GPC3的Hepa1-6肿瘤体积变化的图。箭头表示注射日期。每组五只小鼠进行处理。
[图2A]
图2A是显示从用载体对照或5mg/kg mGC33处理的小鼠中分离的组织的苏木精和曙红染色(HE)或F4/80免疫组化染色(IHC)的图像的图。
[图2B]
图2B是显示从用载体对照或5mg/kg mGC33处理的小鼠中分离的组织的苏木精和曙红染色(HE)或PD-L1免疫组化染色(IHC)的图像的图。箭头表示在浸润的免疫细胞的细胞膜中观察到的PD-L1免疫反应性。
[图3A]
图3A是显示通过单一疗法(mGC33或10F.9G2(抗PD-L1))或组合(mGC33+10F.9G2)处理的每只小鼠中表达人GPC3的CT26肿瘤体积变化的图。箭头表示注射日期。每组五只小鼠进行处理。绘制每组中肿瘤体积的平均值和SD条。
[图3B]
图3B是显示通过单一疗法(mGC33或10F.9G2(抗PD-L1))或组合(mGC33+10F.9G2)处理的携带CT26/hGPC3的小鼠的无进展存活率的图。当肿瘤大小达到100mm3以上时定义进展。
[图4A]
图4A是显示通过单一疗法或组合处理的每只小鼠中表达人GPC3的CT26肿瘤体积变化的图。箭头表示注射日期。每组五只小鼠进行处理。绘制每组中肿瘤体积的平均值和SD条。5mg/kg或25mg/kg mGC33、10F.9G2，5mg/kg或25mg/kg mGC33+10F.9G2的肿瘤生长抑制值分别为52％，58％，68％，75％和85％。
[图4B]
图4B是显示第29天的个体肿瘤体积的图。还绘制了每组中肿瘤体积的平均值(*)。
[图5A]
图5A是显示用载体对照，1mg/kg，5mg/kg或25mg/kg mGC33，10F.9G2或5mg/kg或25mg/kg GC33和10F.9G2组合处理的每只小鼠中表达人GPC3的Hepa1-6肿瘤体积变化的图。箭头表示注射日期。每组五只小鼠进行处理。
[图5B]
图5B是显示在第34天每个治疗组中个体肿瘤面积或肿瘤面积的平均值±SD的图。在从每只小鼠分离的肿瘤组织的HE染色后，通过(肿瘤组织的长轴的长度(mm))×(肿瘤组织的短轴的长度(mm))计算肿瘤面积(mm2)。并在图的底部添加每个肿瘤组织的病理评估结果。疾病的病理进展(pPD)定义为“没有观察到肿瘤消退”。病理学部分消退(pPR)定义为“观察到具有免疫细胞浸润的肿瘤细胞的变性和/或坏死”。病理学完全消退(pCR)定义为“在肿瘤植入部位未观察到肿瘤细胞”。
[图6A]
图6A是显示通过单一疗法或mGC33和6E11(抗PD-L1)的组合以所示的剂量水平和方案处理的每只小鼠中表达人GPC3的Hepa1-6肿瘤体积变化的图。箭头表示注射日期。每组五只小鼠进行处理。
[图6B]
图6B是显示通过单一疗法或mGC33和6E11的组合处理的每个小鼠组中表达人GPC3的Hepa1-6肿瘤体积变化的平均值的图。与通过GC33或6E11单一疗法处理的组相比，组合组中的肿瘤生长受到显著抑制。箭头表示注射日期。每组五只小鼠进行处理。*:P<0.05，Wilcoxon(SAS Institute Inc.)
[图6C]
图6C是显示携带表达人GPC3的Hepa1-6的小鼠的每个治疗组中体重变化的平均值的图。添加SD条。
[图7]
图7是显示每组的皮下组织中肿瘤组织的显微照片的图。灰色区域表示没有坏死的肿瘤区域或淋巴/肉芽组织。蓝色区域表示坏死的肿瘤区域或肉芽组织。虚线表示团块的边界。L代表淋巴组织，G代表肉芽组织，pCR代表病理学完全应答(组织病理学切片上没有肿瘤组织)，MOR代表由肿瘤进展引起的垂死的牺牲动物。
[图8A]
图8A是显示在每个处理组中调节至间质的团块周围的HE染色的肿瘤组织的代表性显微照片的图。在所有处理组中都观察到包括巨噬细胞/多核巨细胞的免疫细胞浸润的肿瘤的坏死。病变严重程度依次为：单次mGC33 5mg/kg+6E11 q7d×3>单次mGC33 5mg/kg或6E11 q7d x 3。S代表间质调节肿瘤块，P代表肿瘤块的外围。
[图8B]
图8B是显示在每个处理组中调节至间质的团块周围的肿瘤组织的F4/80IHC的代表性显微照片的图。在载体中，F4/80阳性细胞主要在间质中观察到。另一方面，在所有处理组中，主要在肿瘤块周围观察到包括巨噬细胞/多核巨细胞的F4/80阳性免疫细胞的增加的严重程度。阳性细胞浸润的严重程度依次为：单次mGC33 5mg/kg+6E11 q7d×3>单次mGC335mg/kg或6E11 q7d x 3。S代表间质调节肿瘤块，P代表肿瘤块的周围。
[图8C]
图8C是显示在每个处理组中调节至间质的团块周围的肿瘤组织的PD-L1IHC的代表性显微照片的图。在载体中，PD-L1阳性反应主要在具有弱强度的肿瘤细胞的细胞质中观察到。另一方面，在所有治疗组中，观察到包括巨噬细胞/多核巨细胞的免疫细胞中PD-L1阳性反应的弱至中等强度的增加的严重程度。S代表间质调节肿瘤块，P代表肿瘤块的外围。
[图9]
图9是显示在每个处理组中在肿瘤组织中观察到的标志物阳性细胞的百分比的图。绘制每组中的个体值和平均值，并在每个图中指示平均值。
详细说明
该申请中的数据显示，抗GPC3抗体与抗PD-L1免疫疗法的组合导致增强的肿瘤生长抑制，增加的应答率和持久的应答。发明人证明了结合两种疗法的益处：对表达GPC3的肿瘤细胞的细胞毒性活性以及抑制T细胞抑制性PD-1/PD-L1信号传导导致增强的治疗效果和持久的长期应答。
在一个方面，本文提供了用于治疗或延迟个体癌症进展的方法，组合物和用途，其包括施用有效量的人PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。
另一方面，本文提供了用于增强患有癌症的个体中针对肿瘤细胞的免疫应答的方法，组合物和用途，其包括施用有效量的人PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括免疫细胞(包括巨噬细胞和多核巨细胞)浸润到肿瘤组织中。又例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中CD45阳性淋巴细胞，CD3ε阳性淋巴细胞和CD8阳性T淋巴细胞的增加。
I.定义
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定的组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”，“一种”和“所述”除非内容另有明确规定，否则包括复数指示物。因此，例如，提及“一个分子”任选地包括两个或更多个这样的分子的组合等。
术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的实施例。
应理解，本文描述的本发明的各方面和实施方案包括“包含各方面和实施方案”，“由各方面和实施方案组成”和“基本上由各方面和实施方案组成”。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指这样的分子，其抑制PD-1轴结合拮抗剂与其一种或多种结合配偶体相互作用，以便去除由PD-1信号传导轴上的信号传导引起的T细胞功能障碍-结果是恢复或增强T细胞功能(例如，增殖，细胞因子产生，靶细胞杀伤)。如本文所用，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”是指减少，阻断，抑制，消除或干扰由PD-1与其一种或多种结合配偶体如PD-L1，PD-L2相互作用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与一种或多种其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗PD-1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其他减少，阻断，抑制，消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用引起的信号转导的分子。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂减少经由PD-1的信号传导介导的由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍程度降低(例如，增强抗原识别的效应子应答)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在具体方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述的MDX-1106(纳武单抗(nivolumab))。在另一个具体方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述的MK-3475(lambrolizumab)。在另一个具体方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述的CT-011(pidilizumab)。在另一个具体方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述的AMP-224或AMP-514(MEDI0680)。在另一个具体方面，PD-1拮抗剂选自由以下组成的组：本文所述的PDR001，REGN2810，BGB A317和SHR-1210。
术语“PD-L1结合拮抗剂”是指减少，阻断，抑制，消除或干扰由PD-L1与其一种或多种结合配偶体如PD-1，B7-1相互作用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和/或B7-1的结合。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其他减少，阻断，抑制，消除或干扰由PD-L1与其一种或多种结合配偶体如PD-1，B7-1相互作用引起的信号转导的分子。在一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂减少经由PD-L1的信号传导介导的由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍程度降低(例如，增强抗原识别的效应子应答)。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在具体方面，抗PD-L1抗体是本文所述的YW243.55.S70或阿特珠单抗(Atezolizumab)。在另一个具体方面，抗PD-L1抗体是本文所述的MDX-1105。在另一个具体方面，抗PD-L1抗体是本文所述的avelumab。在另一个具体方面，抗PD-L1抗体是本文所述的MPDL3280A。在另一个具体方面，抗PD-L1抗体是本文所述的MEDI4736(durvalumab)。
术语“PD-L2结合拮抗剂”是指减少，阻断，抑制，消除或干扰由PD-L2与其一种或多种结合配偶体如PD-1相互作用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与一种或多种其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1的结合。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂包括抗PD-L2抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其他减少，阻断，抑制，消除或干扰由PD-L2与其一种或多种结合配偶体如PD-1相互作用引起的信号转导的分子。在一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂减少经由PD-L2的信号传导介导的由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍程度降低(例如，增强抗原识别的效应子应答)。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
术语“功能障碍”在免疫功能障碍的背景下是指对抗原刺激的免疫应答性降低的状态。该术语包括疲惫和/或无反应性的共同要素，其中可能发生抗原识别，但随后的免疫应答对控制感染或肿瘤生长无效。
如本文所用，术语“功能障碍”还包括对抗原识别的难治性或无应答性，具体地，将抗原识别转化为下游T细胞效应子功能(例如增殖，细胞因子产生(例如，IL-2)和/或靶细胞杀伤)的能力受损。
术语“无反应性”是指由通过T细胞受体递送的信号不完全或不充分引起的对抗原刺激的无应答状态(例如，在没有ras激活的情况下细胞内Ca+2增加)。在没有共刺激的情况下，在用抗原刺激时也可以产生T细胞无反应性，导致细胞即使在共刺激的情况下也变得难以随后被抗原激活。白细胞介素-2的存在通常可以克服无应答状态。无反应性T细胞不经历克隆扩增和/或不获得效应子功能。
术语“疲惫(exhaustion)”是指由于在许多慢性感染和癌症期间发生的持续TCR信号传导而引起的T细胞疲惫成为T细胞功能障碍状态。它与无反应性的区别在于它不是由不完全或缺乏信号传导而是由持续信号传导产生的。其定义为效应子功能差，抑制性受体的持续表达和不同于功能性效应子或记忆T细胞的转录状态。疲惫阻止了对感染和肿瘤的最佳控制。疲惫可以由外在的负调节通路(例如，免疫调节细胞因子)以及细胞内在的负调节(共刺激)途径(PD-1，B7-H3，B7-H4等)引起。
“增强T细胞功能”是指诱导，引起或刺激T细胞以具有持续或扩大的生物学功能，或更新或重新激活疲惫或失活的T细胞。增强T细胞功能的实例包括：相对于干预前的水平，增加的γ-干扰素从CD8+T细胞的分泌，增加的增殖，增加的抗原应答(例如，病毒，病原体或肿瘤清除)。在一个实施方案中，增强水平为至少50％，备选地60％，70％，80％，90％，100％，120％，150％，200％。测量该增强的方式是本领域普通技术人员已知的。
“T细胞功能障碍性紊乱”是T细胞的紊乱或病症，其特征在于对抗原刺激的应答性降低。在一个具体实施方案中，T细胞功能障碍性紊乱是与通过PD-1的不适当增加的信号传导特异性相关的紊乱。在另一个实施方案中，T细胞功能障碍性紊乱是其中T细胞是无反应性或具有降低的分泌细胞因子，增殖或执行细胞溶解活性的能力的紊乱。在具体方面，降低的应答性导致对表达免疫原的病原体或肿瘤的无效控制。以T细胞功能障碍为特征的T细胞功能障碍性紊乱的实例包括未解决的急性感染，慢性感染和肿瘤免疫。
“肿瘤免疫”是指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。因此，作为治疗概念，当这种逃避减弱以及肿瘤被免疫系统识别和攻击时，肿瘤免疫被“治疗”。肿瘤识别的实例包括肿瘤结合，肿瘤缩小和肿瘤清除。
“免疫原性”是指特定物质引发免疫应答的能力。肿瘤是免疫原性的并且增强肿瘤免疫原性有助于通过免疫应答清除肿瘤细胞。增强肿瘤免疫原性的实例包括用PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体治疗。
“持续应答”是指停止治疗后对减少肿瘤生长的持续作用。例如，与施用阶段开始时的大小相比，肿瘤大小可以保持相同或更小。在一些实施方案中，持续应答的持续时间至少与治疗持续时间相同，治疗持续时间长度的至少1.5倍，2.0倍，2.5倍或3.0倍。
术语“药物配制品”是指药物制剂，其所处的形式使得活性成分的生物活性有效，并且不含对施用配制品的受试者具有不可接受的毒性的其他成分。这种配制品是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(载体，添加剂)是可以合理地施用于受试哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些。
如本文所用，术语“治疗”是指旨在改变临床病理学过程中所治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。期望的治疗效果包括降低疾病进展速度，改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。例如，如果与癌症相关的一种或多种症状被减轻或消除，包括但不限于减少(或破坏)癌细胞的增殖，减少肿瘤生长，减少由疾病引起的症状，提高患有该疾病的那些的生活质量，减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量，和/或延长个体的存活，则个体被成功地“治疗”。
如本文所用，“延迟疾病的进展”意味着推迟，阻碍，减缓，延缓，稳定和/或推延疾病(如癌症)的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以包括预防，因为个体不会发展疾病。例如，可延迟晚期癌症，如转移的发展。
“有效量”至少是实现特定紊乱的可测量的改善或预防所需的最小量。本文的有效量可以根据诸如疾病状态，年龄，性别和患者体重等因素以及抗体在个体中引发期望应答的能力而变化。有效量也是治疗有益效果超过治疗的任何毒性或有害作用的量。对于预防性使用，有益或期望的结果包括以下结果：例如消除或降低风险，减轻严重性或延迟疾病发作，包括疾病的生化，组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病的发展过程中呈现的中间病理表型。对于治疗用途，有益或期望的结果包括以下临床结果：例如减少由疾病引起的一种或多种症状，提高患有疾病的人的生活质量，减少治疗疾病所需的其他药物的剂量，例如通过靶向增强另一种药物的效果，延迟疾病的进展和/或延长存活期。在癌症或肿瘤的情况下，有效量的药物可以具有以下效果：减少癌细胞数量；减小肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上减缓或理想地终止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在某种程度上减缓并且理想地终止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上缓解与该紊乱相关的一种或多种症状。有效量可以在一次或多次施用中施用。出于本发明的目的，有效量的药物，化合物或药物组合物是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景中所理解的，有效量的药物，化合物或药物组合物可以或可以不与另一种药物，化合物或药物组合物联合实现。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他试剂联合可以实现或实现期望的结果，则可以考虑单一药剂以有效量施用。
如本文所用，“与...联合”是指除了另一种治疗模式外还施用一种治疗模式。因此，“与...联合”是指在向个体施用其他治疗模式之前，期间或之后施用一种治疗模式。
“紊乱”是指可以从治疗中受益的任何病症，包括但不限于慢性和急性紊乱或疾病，包括使哺乳动物易患所述紊乱的那些病理病症。
术语“细胞增殖性紊乱”和“增殖性紊乱”是指与某种程度的异常细胞增殖有关的紊乱。在一个实施方案中，细胞增殖性紊乱是癌症。在一个实施方案中，细胞增殖性紊乱是肿瘤。
如本文所用，术语“肿瘤”是指所有瘤细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有癌前细胞和组织和癌细胞和组织。术语“癌症”，“癌性”，“细胞增殖性紊乱”，“增殖性紊乱”和“肿瘤”如这里提到的并不相互排斥。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理病症。癌症的实例包括但不限于上皮癌，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤和白血病或恶性淋巴瘤。此类癌症的更具体的实例，包括但不限于，鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌，包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌和肺鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌，包括胃肠癌和胃肠道间质癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，黑色素瘤，浅表性扩散黑色素瘤，恶性雀斑样黑色素瘤，肢端雀斑样黑色素瘤，结节性黑色素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级/卵泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级成淋巴细胞NHL；高级小非裂解细胞NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；和移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)，以及与瘢痣病，水肿(如与脑肿瘤相关的)，梅格斯综合征(Meigs'syndrome)，脑以及头颈癌和相关转移相关的异常血管增生。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体治疗的癌症包括乳腺癌，结直肠癌，直肠癌，非小细胞肺癌，成胶质细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，肾细胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，软组织肉瘤，卡波西肉瘤，类癌，头颈癌，卵巢癌，间皮瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑色素瘤，乳腺癌，胃癌，结直肠癌(CRC)和肝细胞癌。而在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌，结直肠癌，成胶质细胞瘤，乳腺癌和肝细胞癌，包括那些癌症的转移形式。
如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指对细胞有害(例如，导致细胞死亡，抑制增殖或以其他方式阻碍细胞功能)的任何试剂。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂；生长抑制剂；酶及其片段例如核溶酶；和毒素例如小分子毒素或细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。示例性细胞毒性剂可选自抗微管剂，铂配位络合物，烷化剂，抗生素剂，拓扑异构酶II抑制剂，抗代谢物，拓扑异构酶I抑制剂，激素和激素类似物，信号转导通路抑制剂，非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂，免疫治疗剂，促凋亡剂，LDH-A抑制剂，脂肪酸生物合成抑制剂，细胞周期信号传导抑制剂，HDAC抑制剂，蛋白酶体抑制剂和癌症代谢抑制剂。在一个实施方案中，细胞毒性剂是紫杉烷。在一个实施方案中，紫杉烷是紫杉醇或多西他赛。在一个实施方案中，细胞毒性剂是铂剂。在一个实施方案中，细胞毒性剂是EGFR的拮抗剂。在一个实施方案中，EGFR的拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(例如厄洛替尼)。在一个实施方案中，细胞毒性剂是RAF抑制剂。在一个实施方案中，RAF抑制剂是BRAF和/或CRAF抑制剂。在一个实施方案中，RAF抑制剂是维莫非尼(vemurafenib)。在一个实施方案中，细胞毒性剂是PI3K抑制剂。
“化疗剂”包括但不限于氮芥类似物，烷基磺酸酯，亚乙基亚胺，亚硝基脲，环氧化物，其他烷基化剂，叶酸类似物，嘌呤类似物，嘧啶类似物，其他抗代谢剂，长春花生物碱或类似物，鬼臼毒素衍生物，喜树碱类似物，秋水仙碱衍生物，紫杉烷，其他植物生物碱或天然产物，放线菌素，蒽环类或相关物质，其他细胞毒性抗生素，铂化合物，甲基肼，激酶抑制剂，酶，组蛋白去乙酰化酶抑制剂，维甲类，免疫检查点抑制剂，抗体和其他分子靶向药物。
“化疗剂”还包括可用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括厄洛替尼(TARCEVA(注册的)，Genentech/OSI Pharm.)，硼替佐米(VELCADE(注册的)，Millennium Pharm.)，双硫仑，表没食子儿茶素没食子酸酯，salinosporamide A，卡非佐米，17-AAG(格尔德霉素)，根赤壳菌素，乳酸脱氢酶A(LDH-A)，氟维司群(FASLODEX(注册的)，AstraZeneca)，sunitib(SUTENT(注册的)，Pfizer/Sugen)，来曲唑(FEMARA(注册的)，Novartis)，甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC(注册的)，Novartis))，finasunate(VATALANIB(注册的)，Novartis)，奥沙利铂(ELOXATIN(注册的)，Sanofi)，5-FU(5-氟尿嘧啶)，甲酰四氢叶酸，雷帕霉素(西罗莫司，RAPAMUNE(注册的)，Wyeth)，拉帕替尼(TYKERB(注册的)，GSK572016，Glaxo Smith Kline)，Lonafamib(SCH 66336)，索拉非尼(NEXAVAR(注册的)，Bayer Labs)，吉非替尼(IRESSA(注册的)，AstraZeneca)，AG1478，烷化剂如thiotepa和CYTOXAN(注册的)环磷酰胺；烷基磺酸酯如白消安，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷如苯并二氮(benzodopa)，卡波醌，meturedopa和uredopa；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲三聚氰胺，三亚乙基三聚氰胺，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；acetogenins(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括托泊替康和伊立替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycins)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；肾上腺皮质甾类(包括泼尼松和泼尼松龙)；醋酸环丙孕酮；5α-还原酶，包括非那雄胺和度他雄胺)；伏立诺他，罗米地辛，帕比司他(panobinostat)，丙戊酸，mocetinostat dolastatin；阿地白介素，滑石多米卡新(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；五加素(eleutherobin)，水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；软海绵素(spongistatin)；氮芥如苯丁酸氮芥，氯吡嗪，氯磷酰胺，雌莫司汀，异环磷酰胺，二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)，盐酸氧化二氯甲基二乙胺(mechlorethamine oxide hydrochloride)，美法仑，新恩比兴(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，泼尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类如卡莫司汀，氯脲霉素(chlorozotocin)，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，和雷尼莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素，特别是加利车霉素γ1I和加利车霉素ω1I(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.1994 33:183-186)；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯佩拉霉素(esperamicin)；以及neocarzino他汀类生色团和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)，aclacinomysins，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，cactinomycin，carabicin，caminomycin，嗜癌菌素，chromomycinis，更生霉素，道诺霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，ADRIAMYCIN(注册的)(多柔比星)，吗啉代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星，2-吡咯啉基-多柔比星和去氧多柔比星)，表柔比星，依索比星，伊达比星，麻西罗霉素，丝裂霉素如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素(olivomycins)，培洛霉素(Peplomycin)，泊非霉素(porfiromycin)，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星，链黑霉素(streptonigrin)，链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(Ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸，甲氨蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨，阿扎胞苷，6-氮杂尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，多西氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷；雄激素如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸酯，环硫雄醇，美雄烷，睾内酯酮；抗肾上腺素如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；edatraxate；defofamine；地美可辛；亚丝醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登素类如美登素和安丝菌素；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；mopidamnol；nitraerine；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌(losoxantrone)；足叶草酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK(注册的)多糖复合物(JHS NaturalProducts,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素；sizofuran；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙基胺；单端孢霉烯毒素(trichothecenes)(特别是T-2毒素，verracurin A，漆斑菌素A和anguidine)；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如，TAXOL(紫杉醇；Bristol-MyersSquibb Oncology,Princeton,N.J.)，ABRAXANE(注册的)(无克列莫佛(Cremophor-free))，紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂((American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,I11.)，和TAXOTERE(注册的)(多西紫杉醇，多西他赛；Sanofi-Aventis)；瘤可宁(chloranmbucil)；GEMZAR(注册的)(吉西他滨)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINE(注册的)(长春瑞滨)；盐酸米托恩醌(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；卡培他滨(XELODA(注册的))；伊班膦酸钠；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲类如维甲酸；和任何上述的药学上可接受的盐，酸和衍生物。
化疗剂还包括抗体如阿仑单抗(Campath)，贝伐单抗(AVASTIN(注册的)，Genentech)；西妥昔单抗(ERBITUX(注册的)，Imclone)；帕尼单抗(VECTIBIX(注册的)，Amgen)，利妥昔单抗(RITUXAN(注册的)，Genentech/Biogen Idec)，帕妥珠单抗(OMNITARG(注册的)，2C4，Genentech)，曲妥珠单抗(HERCEPTIN(注册的)，Genentech)，托西莫单抗(Bexxar，Corixia)，和抗体药物缀合物，吉妥珠单抗奥佐米星(MYLOTARG(注册的)，Wyeth)。作为与本发明化合物组合的作为药剂的具有治疗潜力的其他人源化单克隆抗体包括：阿普利珠单抗(apolizumab)，阿塞珠单抗(aselizumab)，atlizumab，bapineuzumab，bivatuzumab mertansine，cantuzumab mertansine，赛妥珠单抗(certolizumab)，certolizumab pegol，cidfusituzumab，cidtuzumab，达克珠单抗(daclizumab)，依库丽单抗(eculizumab)，依法利珠单抗(efalizumab)，依帕珠单抗(epratuzumab)，erlizumab，felvizumab，fontolizumab，吉妥珠单抗奥佐米星，inotuzumab奥佐米星，伊匹单抗(ipilimumab)，labetuzumab，林妥珠单抗(Lintuzumab)，马妥珠单抗(matuzumab)，美泊利单抗(mepolizumab)，莫维珠单抗(motavizumab)，motovizumab，那他珠单抗(natalizumab)，尼妥珠单抗(nimotuzumab)，nolovizumab，numavizumab，ocrelizumab，奥马珠单抗(omalizumab)，帕利珠单抗(palivizumab)，帕考珠单抗(pascolizumab)，pecfusituzumab，pectuzumab，培克珠单抗(pexelizumab)，ralivizumab，兰尼单抗(ranibizumab)，reslivizumab，reslizumab，resyvizumab，rovelizumab，ruplizumab，sibrotuzumab，siplizumab，索土珠单抗(sontuzumab)，tacatuzumab tetraxetan，他度珠单抗(tadocizumab)，他利珠单抗(talizumab)，tefibazumab，托珠单抗(tocilizumab)，toralizumab，tucotuzumab西莫白介素(celmoleukin)，tucusituzumab，umavizumab，urtoxazumab，优特克单抗(ustekinumab)，visilizumab，和抗白细胞介素12(ABT-874/J695，Wyeth Research和Abbott Laboratories)，其是一种重组完全人序列，全长IgG1λ抗体，经遗传修饰以识别白细胞介素-12p40蛋白。
“生长抑制剂”当在本文中使用时是指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。在一个实施方案中，生长抑制剂是生长抑制性抗体，其预防或减少表达抗体结合的抗原的细胞的增殖。在另一个实施方案中，生长抑制剂可以是显著降低S期细胞百分比的生长抑制剂。生长抑制剂的实例包括(在S期以外的位置)阻断细胞周期进展的试剂，例如诱导G1停滞和M期停滞的试剂。经典的M期阻断剂包括长春花(长春新碱和长春碱)，紫杉烷和拓扑异构酶II抑制剂，例如多柔比星，表柔比星，柔红霉素，依托泊苷和博来霉素。那些阻滞G1的药剂也会进入S期阻滞，例如，DNA烷化剂例如他莫昔芬，泼尼松，达卡巴嗪，二氯甲基二乙胺，顺铂，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶和ara-C。进一步的信息可以在以下中找到：Mendelsohn和Israel,eds.,The Molecular Basis of Cancer,Chapter 1,标题"Cellcycleregulation,oncogenes,and antineoplastic drugs"，Murakami等(W.B.Saunders,Philadelphia,1995),例如,p.13。紫杉烷(紫杉醇和多西他赛)是来源于紫杉树的抗癌药物。来源于欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE(注册的)，Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇的半合成类似物(TAXOL(注册的)，Bristol-Myers Squibb)。紫杉醇和多西他赛促进微管蛋白二聚体的微管组装，并通过防止解聚来稳定微管，这导致细胞中有丝分裂的抑制。
“放射疗法”是指使用定向γ射线或β射线来诱导细胞的足够损伤，从而限制其正常发挥功能的能力或完全破坏细胞。应当理解，本领域已知有许多方法来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗以一次性施用给予，典型的剂量范围为每天10至200单位(Grays)。
“受试者”或“个体”用于治疗目的是指任何被分类为哺乳动物的动物，包括人，家畜和农场动物，以及动物园动物，竞技动物或宠物动物，例如狗，马，猫，牛等。优选地，哺乳动物是人。
术语“抗体”在本文以最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性即可。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是会干扰抗体的研究，诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶，激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化(1)至如通过例如Lowry方法测定的按抗体的重量计大于95％，并且在一些实施方案中，至按重量计大于99％；(2)至一定程度，所述程度足以通过使用例如旋转杯测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基，或(3)至同质(通过在还原或非还原条件下使用例如考马斯蓝或银染色的SDS-PAGE)。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是若干恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的部分，所述部分相对于免疫球蛋白的其他部分(包含抗原结合位点的可变结构域)具有更保守的氨基酸序列。恒定结构域含有重链的CH1，CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可称为“VH”。轻链的可变结构域可以称为“VL”。这些结构域通常是抗体中变化最大的部分并含有抗原结合位点。
术语“可变”是指以下事实：可变结构域的某些部分在抗体之间序列差异很大，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性不是均匀地分布在抗体的可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区(HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，其主要采用β片构型，通过三个HVR连接，所述HVR形成连接β片结构的环，以及在一些情况下形成β片结构的一部分。每个链中的HVR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一个链的HVR一起助力于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等,SequencesofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性。
可以将来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于其恒定结构域的氨基酸序列分配为两种明显不同的类型之一，称为κ和λ。
本文使用的术语IgG“同种型”或“亚类”是指由恒定区的化学和抗原特征限定的免疫球蛋白的任何亚类。
根据重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白)分配为不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α，γ，ε，γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的，并且通常在例如Abbas等Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)中描述。抗体可以是较大融合分子的一部分，所述融合分子通过抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成。
术语“全长抗体”，“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用，是指基本上完整形式的抗体，而不是如下定义的抗体片段。所述术语特别指具有含有Fc区的重链的抗体。
“裸抗体”用于本文目的是未与细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。在一些实施方案中，本文描述的抗体片段是抗原结合片段。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab')2，scFv和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
"Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密，非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链能以类似于双链Fv种类中的结构的“二聚体”结构缔合。在该构型中，每个可变结构域的三个HVR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。总的来说，六个HVR赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单可变结构域(或仅包含三个对抗原特异的HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整结合位点。
Fab片段含有重链和轻链可变结构域，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab')2抗体片段最初是作为Fab'片段对产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。关于scFv的综述，参见例如Pluckthuen,in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,NewYork,1994),pp.269-315。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包含与同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体(例如，除了可能以少量存在的可能突变(例如天然存在的突变)之外，构成群体的各个抗体是相同的)获得的抗体。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这种单克隆抗体通常包括含有结合靶的多肽序列的抗体，其中所述靶结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶结合多肽序列的方法获得。例如，选择过程可以是从多个克隆(例如杂交瘤克隆，噬菌体克隆或重组DNA克隆的库)中选择独特的克隆。应当理解，可以进一步改变选择的靶结合序列，例如，以提高对靶的亲和力，使靶结合序列人源化，改善其在细胞培养物中的产生，降低其在体内的免疫原性，以产生多特异性抗体等，以及包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体制剂的优点还在于它们通常不被其它免疫球蛋白污染。
修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling等,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))，重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)，噬菌体展示技术(参见，例如，Clackson等,Nature,352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))，以及在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见，例如，WO1998/24893；WO1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源)，以及这些抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性(参见，例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括PRIMATTZED(注册的)抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用目标抗原免疫猕猴产生的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最少序列。在一个实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的HVR的残基被来自非人物种如小鼠，大鼠，兔(供体抗体)或具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人灵长类动物的HVR的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可以进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。进一步的细节参见，例如，Jones等,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见，例如，Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；和美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体和/或使用本文公开的制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这种定义特异性地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，所述技术包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.,222:581(1991))。同样可用于制备人单克隆抗体的方法描述于Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner等,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。还参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可以通过将抗原施用于转基因动物(例如免疫的异种小鼠)来制备人抗体，所述转基因动物已被修饰以响应抗原攻击产生此类抗体，但其内源基因座已被禁用(参见，例如，关于XENOMOUSE(商标)技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。还参见，例如，关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体的Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
“物种依赖性抗体”是指其对于来自第一哺乳动物物种的抗原具有比来自第二哺乳动物物种的抗原的同源物更强的结合亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人抗原(例如，具有不超过约1x10-7M，优选不超过约1x10-8M，优选不超过约1x10-9M的结合亲和力(Kd)值)，但其对来自第二非人哺乳动物物种的抗原的同源物的结合亲和力比其对人抗原的结合亲和力弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍。物种依赖性抗体可以是如上定义的各种类型的抗体中的任何一种，但优选是人源化抗体或人抗体。
术语“高变区”，“HVR”，或“HV”当在本文中使用时是指序列高变的和/或形成结构上限定的环的抗体可变结构域区域。通常，抗体包含六个HVR；VH中的三个(HI，H2，H3)和VL中的三个(L1，L2，L3)。在天然抗体中，在六种HVR中H3和L3显示的最大的多样性，特别是H3被认为在赋予抗体精细特异性方面发挥独特作用。参见，例如，Xu等,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu,Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。实际上，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在没有轻链的情况下是功能性的和稳定的。参见，例如，Hamers-Casterman等,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
许多HVR描绘正在使用中并且包含在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性并且是最常用的(Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia改为涉及结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbMHVR代表Kabat HVR和Chothia结构环之间的折衷，并由OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR是基于对可用的复杂晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一个的残基如下所述。
Figure BDA0003991355990000371
HVR可以包括“扩展的HVR”，如下：VL中的24-36或24-34(L1)，46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)，50-65或49-65(H2)和93-102，94-102，或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基根据Kabat等人(同上)编号。
“框架”或“FR”残基是除本文定义的HVR残基之外的那些可变结构域残基。
术语“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指用于Kabat等(同上)中的抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有较少或额外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或向可变结构域的FR或HVR中的插入。例如，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如根据Kabat的残基82a，82b和82c等)。通过在抗体序列的同源区域与“标准”抗体的比对，可以确定给定抗体的残基的Kabat编号。
当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)(例如，Kabat等,Sequences of Immunological Interest.5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))时，通常使用Kabat编号系统。“EU编号系统”或“EU指数”通常在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如，同上的Kabat等中报道的EU指数)。“Kabat中的EU指数”是指人IgG1EU抗体的残基编号。
表达“线性抗体”是指“线性抗体”是指Zapata等(1995Protein Eng,8(10):1057-1062)中描述的抗体。简而言之，这些抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
如本文所用，术语“结合”，“特异性结合”或“特异性的”是指靶和抗体之间的可测量的和可再现的相互作用例如结合，其是在包括生物分子的异质分子群存在下决定靶的存在。例如，结合或特异性结合靶(可以是表位)的抗体是以比其结合其他靶更大的亲和力，亲合力，更容易和/或更长的持续时间结合该靶的抗体。在一个实施方案中，例如通过放射免疫测定法(RIA)测量，抗体与不相关靶的结合程度小于抗体与靶结合的约10％。在某些实施方案中，特异性结合靶的抗体具有≦1μΜ，≦100nM，≦10nM，≦1nM或≦0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在来自不同物种的蛋白质中是保守的。在另一个实施方案中，特异性结合可以包括但不需要排他性结合。
II.PD-1轴结合拮抗剂
本文提供了治疗或延迟个体癌症进展的方法，其包括向所述个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。本文还提供了增强患有癌症的个体针对肿瘤细胞的免疫应答的方法，其包括向所述个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括免疫细胞(包括巨噬细胞和多核巨细胞)浸润到肿瘤组织中。又例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中CD45阳性淋巴细胞，CD3ε阳性淋巴细胞和CD8阳性T淋巴细胞的增加。例如，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。PD-1(程序性死亡1)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1”，PDCD1，CD279和SLEB2。PD-L1(程序性死亡配体1)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1配体1”，PDCD1LG1，CD274，B7-H和PD-L1。PD-L2(程序性死亡配体2)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1配体2”，PDCD1LG2，CD273，B7-DC，Btdc和PDL2。在一些实施方案中，PD-1，PD-L1和PD-L2是人PD-1，PD-L1和PD-L2。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。在另一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白或寡肽。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体，人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自由以下组成的组：MDX-1106(纳武单抗(nivolumab))，MK-3475(lambrolizumab)和CT-011(pidilizumab)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224或AMP-514(MEDI0680)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂选自由以下组成的组：PDR001，REGN2810，BGB A317和SHR-1210。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1结合拮抗剂选自由以下组成的组：YW243.55.S70，阿特珠单抗(Atezolizumab)，MPDL3280A，MDX-1105，avelumab和MEDI4736(durvalumab)。抗体YW243.55.S70是WO2010/077634中描述的抗PD-L1。MDX-1105，也称为BMS-936559，是WO2007/005874中描述的抗PD-L1抗体。Avelumab是WO2013079174中描述的抗PDL1抗体。MEDI4736(durvalumab)是WO2011/066389和US2013/034559中描述的抗PD-L1单克隆抗体。纳武单抗(nivolumab)，也称为MDX-1106-04，MDX-1106，ONO-4538，BMS-936558和OPDIVO(注册的)，是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。Pembrolizumab，也称为MK-3475，Merck3475，lambrolizumab，KEYTRUDA(注册的)和SCH-900475，是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT，hBAT-1或pidilizumab，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PD-L2-Fc融合可溶性受体。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1和PD-1之间和/或PD-L1和B7-1之间的结合。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是选自由以下组成的组的抗体片段：Fab，Fab'-SH，Fv，scFv和(Fab')2片段。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是人抗体。
可用于本发明方法的抗PD-L1抗体的实例及其制备方法描述于PCT专利申请WO2010/077634，WO2007/005874，WO2011/066389和US2013/034559中，其通过引用并入本文。可用于本发明的抗PD-L1抗体，包括含有这种抗体的组合物，可与抗GPC3抗体组合使用以治疗癌症。
抗PD1抗体
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是MDX-1106。“MDX-1106”的替代名称包括MDX-1106-04，ONO-4538，BMS-936558或纳武单抗(nivolumab)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)(CAS登记号：946414-94-4)。在又另外的实施方案中，提供了分离的抗PD-1抗体，其包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:2的轻链可变区氨基酸序列。在另外的实施方案中，提供了包含重链和/或轻链序列的分离的抗PD-1抗体，其中：
(a)所述重链序列与SEQ ID NO:1所示的重链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，和
(b)所述轻链序列与SEQ ID NO:2所示的轻链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。
抗PD-L1抗体
在一些实施方案中，配制品中的抗体包含重链和/或轻链序列中的至少一个色氨酸(例如，至少两个，至少三个，或至少四个)。在一些实施方案中，氨基酸色氨酸位于抗体的CDR区，框架区和/或恒定区中。在一些实施方案中，抗体在CDR区中包含两个或三个色氨酸残基。在一些实施方案中，配制品中的抗体是抗PD-L1抗体。PD-L1(程序性死亡配体1)，也称为PD-L1，B7-H1，B7-4，CD274和B7-H，是一种跨膜蛋白，其与PD-1的相互作用抑制T细胞活化和细胞因子产生。在一些实施方案中，本文所述的抗PD-L1抗体结合人PD-L1。可用于本文所述方法的抗PD-L1抗体的实例是阿特珠单抗(Atezolizumab)，或PCT专利申请WO2010/077634A1和US 8,217,149(其通过引用并入本文)中描述的抗PD-L1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1和PD-1之间和/或PD-L1和B7-1之间的结合。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是选自由以下组成的组的抗体片段：Fab，Fab'-SH，Fv，scFv和(Fab')2片段。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是人抗体。
WO 2010/077634 A1和US 8,217,149中描述的抗PD-L1抗体可用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:3的重链可变区序列和/或SEQ IDNO:4的轻链可变区序列。在又另外的实施方案中，提供了包含重链和/或轻链序列的分离的抗PD-L1抗体，其中：
(a)所述重链序列与SEQ ID NO:3所示的重链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，和
(b)所述轻链序列与SEQ ID NO:4所示的轻链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体包含重链可变区多肽，其包含HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3序列，其中：
(a)HVR-H1序列是GFTFSX1SWIH(SEQ ID NO:5)；
(b)HVR-H2序列是AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO:6)；
(c)HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO:7)；
进一步地，其中：X1是D或G；X2是S或L；X3是T或S。在一个具体方面，X1是D；X2是S，并且X3是T。
在另一个方面，所述多肽还包含根据下式的并置在HVR之间的可变区重链框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)。在另一方面，框架序列衍生自人共有框架序列。在另外方面，框架序列是VH亚组III共有框架。在另外的方面，框架序列中的至少一个如下：
HC-FR1是EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:8)
HC-FR2是WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:9)
HC-FR3是RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:10)
HC-FR4是WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:11)。
在另外的方面，重链多肽进一步与包含HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3的可变区轻链组合，其中：
(a)HVR-L1序列是RASQX4X5X6TX7X8A(SEQ ID NO:12)；
(b)HVR-L2序列是SASX9LX10S(SEQ ID NO:13)；
(c)HVR-L3序列是QQX11X12X13X14PX15T(SEQ ID NO:14)；
其中：X4是D或V；X5是V或I；X6是S或N；X7是A或F；X8是V或L；X9是F或T；X10是Y或A；X11是Y，G，F，或S；X12是L，Y，F或W；X13是Y，N，A，T，G，F或I；X14是H，V，P，T或I；X15是A，W，R，P或T。在另外的方面，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H；X15是A。
在另外的方面，轻链还包含根据下式的并置在HVR之间的可变区轻链框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在另外的方面，框架序列衍生自人共有框架序列。在又另外方面，框架序列是VLκI共有框架。在另外的方面，框架序列中的至少一个如下：
LC-FR1是DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:15)
LC-FR2是WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:16)
LC-FR3是GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:17)
LC-FR4是FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:18)。
在另一个实施方案中，提供了包含重链和轻链可变区序列的分离的抗PD-L1抗体或抗原结合片段，其中：
(a)重链包含HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中进一步地：
(i)HVR-H1序列是GFTFSX1SWIH(SEQ ID NO:5)
(ii)HVR-H2序列是AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO:6)
(iii)HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO:7)，并且
(b)轻链包括HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3，其中进一步地：
(i)HVR-L1序列是RASQX4X5X6TX7X8 A (SEQ ID NO:12)
(ii)HVR-L2序列是SASX9LX10S(SEQ ID NO:13)
(iii)HVR-L3序列是QQX11X12X13X14PX15T(SEQ ID NO:14)
其中：X1是D或G；X2是S或L；X3是T或S；X4是D或V；X5是V或I；X6是S或N；X7是A或F；X8是V或L；X9是F或T；X10是Y或A；X11是Y，G，F或S；X12是L，Y，F或W；X13是Y，N，A，T，G，F或I；X14是H，V，P，T或I；X15是A，W，R，P或T。在具体方面，X1是D；X2是S并且X3是T。在另一方面，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H；X15是A。在另一方面，X1是D；X2是S并且X3是T，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H并且X15是A。
在另外的方面，重链可变区包含如下的并置在HVR之间的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，并且轻链可变区包含如下的并置在HVR之间的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在另外的方面，框架序列衍生自人共有框架序列。在另外的方面，重链框架序列衍生自Kabat亚组I，II或III序列。在另外的方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在另外的方面，重链框架序列中的一个或多个如SEQ ID NO:8，9，10和11所示。在另外的方面，轻链框架序列衍生自KabatκI，II，III或IV亚组序列。在另外的方面，轻链框架序列是VLκI共有框架。在另外的方面，一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15，16，17和18所示。
在另外的具体方面，抗体还包含人或鼠恒定区。在另外的方面，人恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4组成的组。在另外的具体方面，人恒定区是IgG1。在另外的方面，鼠恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3组成的组。在另外的方面，鼠恒定区是IgG2A。在另外的具体方面，抗体具有降低的或最小的效应子功能。在另外的具体方面，最小效应子功能由“效应子降低性Fc突变”或无糖基化产生。在另外的实施方案中，效应子降低性Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A置换。
在又一个实施方案中，提供了包含重链和轻链可变区序列的抗PD-L1抗体，其中：
(a)重链还包含HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3序列，其分别与GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:19)，AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:20)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO:21)具有至少85％的序列同一性，或
(b)轻链还包含HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3序列，其分别与RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:22)，SASFLYS(SEQ ID NO:23)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO:24)具有至少85％的序列同一性。
在具体方面，序列同一性为86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。
在另一方面，重链可变区包含如下的并置在HVR之间的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，并且轻链可变区包含如下的并置在HVR之间的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在另一方面，框架序列衍生自人共有框架序列。在另外的方面，重链框架序列衍生自Kabat亚组I，II或III序列。在另外的方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在另外的方面，重链框架序列中的一个或多个如SEQ ID NO:8，9，10和11所示。在另外的方面，轻链框架序列衍生自KabatκI，II，III或IV亚组序列。在另外的方面，轻链框架序列是VLκI共有框架。在另外的方面，一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15，16，17和18所示。
在另外的具体方面，抗体还包含人或鼠恒定区。在另外的方面，人恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4组成的组。在另外的具体方面，人恒定区是IgG1。在另外的方面，鼠恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3组成的组。在另外的方面，鼠恒定区是IgG2A。在另外的具体方面，抗体具有降低的或最小的效应子功能。在另外的具体方面，最小效应子功能由“效应子降低性Fc突变”或无糖基化产生。在另外的实施方案中，效应子降低性Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A置换。
在另一个另外的实施方案中，提供了包含重链和轻链可变区序列的分离的抗PD-L1抗体，其中：
(a)重链序列与SEQ ID NO:25所示的重链序列具有至少85％的序列同一性，和/或
(b)轻链序列与SEQ ID NO:4所示的轻链序列具有至少85％的序列同一性。
在具体方面，序列同一性为86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在另一方面，重链可变区包含如下的并置在HVR之间的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，并且轻链可变区包含如下的并置在HVR之间的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在另一方面，框架序列衍生自人共有框架序列。在另外方面，重链框架序列衍生自Kabat亚组I，II或III序列。在另外的方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在另外的方面，重链框架序列中的一个或多个如SEQ ID NO:8，9，10和WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)所示。
在另外的方面，轻链框架序列衍生自KabatκI，II，III或IV亚组序列。在另外的方面，轻链框架序列是VLκI共有框架。在另外的方面，一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15，16，17和18所示。
在另外的具体方面，抗体还包含人或鼠恒定区。在另外的方面，人恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4组成的组。在另外的具体方面，人恒定区是IgG1。在另外的方面，鼠恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3组成的组。在另外的方面，鼠恒定区是IgG2A。在另外的具体方面，抗体具有降低的或最小的效应子功能。在另外的具体方面，最小效应子功能是由在原核细胞中产生而引起的。在另外的具体方面，最小效应子功能由“效应子降低性Fc突变”或无糖基化产生。在另外的实施方案中，效应子降低性Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A置换。
在另外方面，重链可变区包含并置在HVR之间的一个或多个框架序列，如下：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，并且轻链可变区包含并置在HVR之间的一个或多个框架序列，如下：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在另外的方面，框架序列衍生自人共有框架序列。在另外的方面，重链框架序列衍生自Kabat亚组I，II或III序列。在另外的方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在另外的方面，重链框架序列中的一个或多个如下：
HC-FR1是EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:29)
HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:30)
HC-FR3是RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:10)
HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。
在另外的方面，轻链框架序列衍生自KabatκI，II，III或IV亚组序列。在另外的方面，轻链框架序列是VLκI共有框架。在另外的方面，轻链框架序列中的一个或多个如下：
LC-FR1是DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:15)
LC-FR2是WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:16)
LC-FR3是GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:17)
LC-FR4是FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:28)。
在另外的具体方面，抗体还包含人或鼠恒定区。在另外的方面，人恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4组成的组。在另外的具体方面，人恒定区是IgG1。在另外的方面，鼠恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3组成的组。在另外的方面，鼠恒定区是IgG2A。在另外的具体方面，抗体具有降低的或最小的效应子功能。在另外的具体方面，最小效应子功能由“效应子降低性Fc突变”或无糖基化产生。在另外的实施方案中，效应子降低性Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A置换。
在又一个实施方案中，提供了包含重链和轻链可变区序列的抗PD-L1抗体，其中：
(c)重链还包含HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3序列，其分别与GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:19)，AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:20)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO:21)具有至少85％的序列同一性，和/或
(d)轻链还包含HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3序列，其分别与RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:22)，SASFLYS(SEQ ID NO:23)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO:24)具有至少85％的序列同一性。
在具体方面，序列同一性为86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。
在另一方面，重链可变区包含并置在HVR之间的一个或多个框架序列，如下：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，并且轻链可变区包含并置在HVR之间的一个或多个框架序列，如下：(LC-FRl)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在另一方面，框架序列衍生自人共有框架序列。在另外的方面，重链框架序列衍生自Kabat亚组I，II或III序列。在另外的方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在另外的方面，重链框架序列中的一个或多个如SEQ ID NO:8，9，10和WGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO:31)所示。
在另外的方面，轻链框架序列衍生自KabatκI，II，III或IV亚组序列。在另外的方面，轻链框架序列是VLκI共有框架。在另外的方面，一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15，16，17和18所示。在另外的具体方面，抗体还包含人或鼠恒定区。在另外的方面，人恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4组成的组。在另外的具体方面，人恒定区是IgG1。在另外的方面，鼠恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3组成的组。在另外的方面，鼠恒定区是IgG2A。在另外的具体方面，抗体具有降低的或最小的效应子功能。在另外的具体方面，最小效应子功能由“效应子降低性Fc突变”或无糖基化产生。在另外的实施方案中，效应子降低性Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A置换。
在另外的实施方案中，提供了包含重链和轻链可变区序列的分离的抗PD-L1抗体，其中：
(a)重链序列与SEQ ID NO:26所示的重链序列具有至少85％的序列同一性，或
(b)轻链序列与SEQ ID NO:4所示的轻链序列具有至少85％的序列同一性。
在一些实施方案中，提供了包含重链和轻链可变区序列的分离的抗PD-L1抗体，其中所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，提供了包含重链和轻链可变区序列的分离的抗PD-L1抗体，其中所述重链可变区序列与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，提供了包含重链和轻链可变区序列的分离的抗PD-L1抗体，其中所述轻链可变区序列与SEQ IDNO:4的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性并且所述重链可变区序列与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，重链和/或轻链的N端的一个，两个，三个，四个或五个氨基酸残基可以缺失，置换或修饰。
在又一个实施方案中，提供了包含重链和轻链序列的分离的抗PD-L1抗体，其中：
(a)重链序列与SEQ ID NO:32所示的重链序列具有至少85％的序列同一性，和/或
(b)轻链序列与SEQ ID NO:33所示的轻链序列具有至少85％的序列同一性。
在又一个实施方案中，提供了包含重链和轻链序列的分离的抗PD-L1抗体，其中：
(a)重链序列与SEQ ID NO:55所示的重链序列具有至少85％的序列同一性，和/或
(b)轻链序列与SEQ ID NO:33所示的轻链序列具有至少85％的序列同一性。
在一些实施方案中，提供了包含重链和轻链序列的分离的抗PD-L1抗体，其中所述轻链序列与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，提供了包含重链和轻链序列的分离的抗PD-L1抗体，其中所述重链序列与SEQ ID NO:32或55的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，提供了包含重链和轻链序列的分离的抗PD-L1抗体，其中所述轻链序列与SEQ IDNO:33的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的序列同一性并且所述重链序列与SEQ ID NO:32或55的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的序列同一性。
在一些实施方案中，分离的抗PD-L1抗体是无糖基化的。抗体的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生了潜在的糖基化位点。O连接的糖基化是指糖N乙酰半乳糖胺，半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但是也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸)的连接。通过改变氨基酸序列从而除去上述三肽序列之一(对于N连接的糖基化位点)可以方便地从抗体除去糖基化位点。可以通过将糖基化位点内的天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸残基置换为另一种氨基酸残基(例如甘氨酸，丙氨酸或保守置换)来进行改变。
在本文的任何实施方案中，分离的抗PD-L1抗体可以结合人PD-L1，例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1中所示的人PD-L1，或其变体。
在另外的实施方案中，提供了编码本文所述抗体中任一个的分离的核酸。在一些实施方案中，核酸还包含适于表达编码任何前述抗PD-L1抗体的核酸的载体。在另外的具体方面，载体位于适于表达核酸的宿主细胞中。在另外的具体方面，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在另外的具体方面，真核细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
抗体或其抗原结合片段可以使用本领域已知的方法制备，例如，通过包括以下的方法：将含有编码任何前述的处于适合表达的形式的抗PD-L1抗体或抗原结合片段的核酸的宿主细胞在适合产生这种抗体或片段的条件下培养，并回收所述抗体或片段。
III.抗GPC3抗体
本文提供了治疗或延迟个体癌症进展的方法，其包括向所述个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。本文还提供了增强患有癌症的个体针对肿瘤细胞的免疫应答的方法，其包括向所述个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括免疫细胞(包括巨噬细胞和多核巨细胞)浸润到肿瘤组织中。又例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中CD45阳性淋巴细胞，CD3ε阳性淋巴细胞和CD8阳性T淋巴细胞的增加。
本文提供了与人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)结合的抗体。“GPC3”的替代名称包括SGB，DGSX，MXR7，SDYS，SGBS，OCI-5，SGBS1和GTR2-2。本文使用的术语“GPC3”是指来自任何人源的任何天然GPC3。该术语包括“全长”和未加工的GPC3以及由细胞中加工产生的任何形式的GPC3(例如，成熟蛋白质)，包括但不限于GPC3的C端肽。该术语还包括天然存在的GPC3变体和同种型，例如剪接变体或等位基因变体。例如，GPC3和序列的描述在UniProtKB/Swiss-Prot登录号P51654.1中提供。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体结合GPC3并抑制癌细胞的细胞增殖或生长。在一些实施方案中，抗GPC3抗体是codrituzumab。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体可包括抗体-药物缀合物(ADC)(WO2007/137170)，其包含与细胞毒性物质缀合的1G12抗体(WO2003/100429)(由BioMosaics Inc.以商品号B0134R销售)。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体是WO2006/006693或WO2007/047291中描述的人源化抗GPC3抗体。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体包括WO2006/006693或WO2009/041062中描述的人源化抗GPC3抗体。在一些实施方案中，提供了包含重链和轻链可变区序列的人源化抗GPC3抗体，其中：
(a)重链包含HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中进一步地：
(i)HVR-H1序列是DYSMH(SEQ ID NO:34)
(ii)HVR-H2序列是WINTETGEPTYADDFKG(SEQ ID NO:35)
(iii)HVR-H3序列是LY(SEQ ID NO:36)
(b)轻链包括HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3，其中进一步地：
(i)HVR-L1序列是KSSQSLLHSDGKTFLN(SEQ ID NO:37)
(ii)HVR-L2序列是LVSRLDS(SEQ ID NO:38)
(iii)HVR-L3序列是CQGTHFPRT(SEQ ID NO:39)。
在具体方面，抗GPC3抗体是人源化的。人源化抗GPC3抗体可以使用以下作为人源化模板来制备：适当选择的人框架序列，所述人框架序列与由SEQ IDNO:40表示的重链框架序列或由SEQ ID NO:41表示的轻链框架序列具有高的序列同一性。
在一些实施方案中，本文提供了抗GPC3嵌合抗体或包含重链和轻链可变区序列的人源化抗GPC3抗体，其中：
(a)重链包含HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中进一步地：
(i)HVR-H1序列是DYEMH(SEQ ID NO:42)
(ii)HVR-H2序列是ALDPKTGDTAYSQKFKG(SEQ ID NO:43)
(iii)HVR-H3序列是FYSYTY(SEQ ID NO:44)
(b)轻链包括HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3，其中进一步地：
(i)HVR-L1序列是RSSQSLVHSNRNTYLH(SEQ ID NO:45)
(ii)HVR-L2序列是KVSNRFS(SEQ ID NO:46)
(iii)HVR-L3序列是SQNTHVPPT(SEQ ID NO:47)。
人源化抗GPC3抗体可以使用以下作为人源化模板来制备：适当选择的人框架序列，所述人框架序列与由SEQ ID NO:48表示的重链框架序列或由SEQ IDNO:49表示的轻链框架序列具有高的序列同一性。
在另外实施方案中，本文提供了能够结合第二抗体能结合的表位的人源化抗GPC3抗体，其中所述第二抗体包含重链和轻链可变区序列，其中：
(a)重链包含HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中进一步地：
(i)HVR-H1序列是DYEMH(SEQ ID NO:42)
(ii)HVR-H2序列是ALDPKTGDTAYSQKFKG(SEQ ID NO:43)
(iii)HVR-H3序列是FYSYTY(SEQ ID NO:44)
(b)轻链包括HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3，其中进一步地：
(i)HVR-L1序列是RSSQSLVHSNRNTYLH(SEQ ID NO:45)
(ii)HVR-L2序列是KVSNRFS(SEQ ID NO:46)
(iii)HVR-L3序列是SQNTHVPPT(SEQ ID NO:47)。
在另外实施方案中，提供了人源化抗GPC3抗体，其包含选自由SEQ ID NO:50表示的重链可变区的组的重链可变区和由SEQ ID NO:51表示的轻链可变区。在另外的备选非限制性方面，提供了人源化抗GPC3抗体，其包含选自由SEQ IDNO:50表示的重链可变区的组的重链可变区和选自SEQ ID NO:52表示的轻链可变区的组的轻链可变区。
在另外实施方案中，提供了人源化抗GPC3抗体，其包含由SEQ ID NO:53表示的重链可变区和由SEQ ID NO:54表示的轻链可变区。
本发明的抗GPC3抗体的备选实例包括具有细胞毒性活性的抗GPC3抗体。在本发明中，细胞毒性活性的非限制性实例包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性，补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和基于T细胞的细胞毒性活性。在本发明中，CDC活性是指补体系统带来的细胞毒性活性。另一方面，ADCC活性是指例如免疫细胞破坏靶细胞的活性，其是通过免疫细胞经由免疫细胞上表达的Fcγ受体与包含能够与靶细胞的细胞膜上表达的膜分子结合的抗原结合结构域的抗原结合分子的Fc区结合。目标抗原结合分子是否具有ADCC活性或具有CDC活性可以通过本领域已知的方法测定(例如，Currentprotocols in Immunology,第7章,Immunologic studies in humans,Coligan等,ed.(1993))。
在一些实施方案中，本发明的抗GPC3抗体的备选实例包括与细胞毒性物质缀合的抗GPC3抗体。这种抗GPC3抗体-药物缀合物(ADC)具体公开于例如WO2007/137170中，尽管本发明的缀合物不限于其中所述的那些。具体地，细胞毒性物质可以是下面列出的任何化疗剂，或者可以是Alley等(Curr.Opin.Chem.Biol.(2010)14,529-537)或WO2009/140242中公开的化合物。抗原结合分子通过适当的接头等与这些化合物缀合。
在一些实施方案中，本发明的抗GPC3抗体的备选实例包括抗GPC3抗体，所述抗体包含FcγR结合修饰的Fc区，其对Fcγ受体的结合活性高于天然人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性。修饰可以包括在任何位置的氨基酸修饰，只要所得Fc区对Fcγ受体的结合活性高于天然人IgG Fc区对Fcγ受体的结合活性。当抗原结合分子含有人IgG1 Fc区作为人Fc区时，该修饰优选允许Fc区含有含岩藻糖的糖链作为与第297位(EU编号)结合的糖链并且对于以下是有效的：产生的对Fcγ受体的结合活性高于天然人IgG Fc区对Fcγ受体的结合活性。这种氨基酸修饰已经在例如国际公布号WO2007/024249，WO2007/021841，WO2006/031370，WO2000/042072，WO2004/029207，WO2004/099249，WO2006/105338，WO2007/041635，WO2008/092117，WO2005/070963，WO2006/020114，WO2006/116260，WO2006/023403，和WO2014/097648中报道。
在一些实施方案中，本发明提供的抗GPC3抗体中包含的Fc区还可以包括经修饰的Fc区，使得在与Fc区结合的糖链的组合物中，较高比例的岩藻糖缺乏的糖链与Fc区结合或较高比例的分叉的N乙酰葡糖胺添加至Fc区。WO2006/046751和WO2009/041062公开了抗GPC3抗体的具体实例，其包含经修饰的Fc区，使得在与Fc区结合的糖链的组合物中，较高比例的岩藻糖缺乏的糖链与Fc区结合或较高比例的分叉的N乙酰葡糖胺添加至Fc区。
在一些实施方案中，可用于本发明的抗GPC3抗体包括具有经修饰的氨基酸残基以改变其等电点(pI)的抗GPC3抗体。抗-GPC3抗体中“氨基酸残基电荷的改变”的优选实例描述于WO2009/041062中。
在一些实施方案中，抗GPC3抗体包括抗体的修饰形式，其已经接受构成抗GPC3抗体一级结构的多肽的翻译后修饰。多肽的翻译后修饰是指在多肽生物合成期间翻译的多肽的化学修饰。例如，已经接受通过焦谷氨酰化将N端谷氨酰胺修饰为焦谷氨酸的抗GPC3抗体当然也包括在本发明的抗GPC3抗体中。另外，例如，包含重链和轻链或通过“二硫键”连接的重链的翻译后修饰的抗GPC3抗体，其意指在两个硫原子之间形成的共价键包括在本发明的抗GPC3抗体中。氨基酸半胱氨酸中含有的硫醇基可以与第二硫醇基形成二硫键或交联。在常见的IgG分子中，CH1和CL区域通过二硫键连接，并且构成重链的两个多肽通过基于EU编号的第226位和第229位处的半胱氨酸残基之间的二硫键连接。具有通过二硫键的这种连接的翻译后修饰的抗GPC3抗体也包括在本发明的抗GPC3抗体中。
在另外的实施方案中，提供了编码本文所述抗体中任一个的分离的核酸。在一些实施方案中，核酸还包含适于表达编码任何前述抗GPC3抗体的核酸的载体。在另外的具体方面，载体位于适于表达核酸的宿主细胞中。在另外的具体方面，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在另外的具体方面，真核细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
抗体或其抗原结合片段可以使用本领域已知的方法制备，例如，通过包括以下的方法：将含有编码任何前述的处于适合表达的形式的抗GPC3抗体或抗原结合片段的核酸的宿主细胞在适合产生这种抗体或片段的条件下培养，并回收所述抗体或片段。
IV.抗体制备
使用本领域可用于产生抗体的技术制备本文所述的抗体，其示例性方法在以下部分中更详细地描述。
抗体针对目标抗原(即PD-L1(如人PD-L1)或GPC3(如人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3))。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，并且将抗体施用于患有疾病的哺乳动物可以在该哺乳动物中产生治疗益处。
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≦1μΜ，≦150nM，≦100nM，≦50nM，≦10nM，≦1nM，≦0.1nM，≦0.01nM，或≦0.001nM(例如，10-8M或更低，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，如以下测定所述，通过用目标抗体的Fab形式及其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定(RIA)测量Kd。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过以下来测量：在滴定系列的未标记抗原存在下，用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原(参见，例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定条件，将MICROTITER(注册的)多孔板(Thermo Scientific)用在50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml的捕获性抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭2至5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目标Fab的连续稀释液混合。然后将目标Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长的时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移到捕获板中，在室温孵育(例如，1小时)。然后除去溶液，用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20(TWEEN-20(注册的))洗涤板8次。当板干燥后，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20(商标)；Packard)，并在TOPCOUNT(商标)γ计数器(Packard)上对板计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定。
根据另一个实施方案，使用BIACORE(注册的)-2000或BIACORE(注册的)-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用表面等离子体共振测定法使用固定化抗原CM5芯片以～10个响应单位(RU)测量Kd。简言之，根据供应商的说明，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射，以获得偶联蛋白的约10个响应单位(RU)。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)在25℃以大约25μl/min的流速注射到含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20(商标))的PBS表面活性剂(PBST)中。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIACORE(注册的)评估软件版本3.2)计算缔合速率(kon)和解离速率(k0ff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率k0ff/kon。参见，例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果上述表面等离子体共振测定的缔合速率超过106M-1s-1，那么可以通过使用荧光淬灭技术测定结合速率，该技术在增加抗原浓度的情况下在25℃测量PBS pH7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在光谱仪中测量的，例如带有停流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅拌比色皿的8000系列SLM-AMINCO(商标)分光光度计(ThermoSpectronic)。
(i)抗原制备
任选与其他分子缀合的可溶性抗原或其片段可用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子，例如受体，这些的片段(例如受体的细胞外结构域)可用作免疫原。备选地，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可以源自天然来源(例如，癌细胞系)，或者可以是通过重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。用于制备抗体的其他抗原及其形式对于本领域技术人员而言是显而易见的。
(ii)某些基于抗体的方法
多克隆抗体优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中产生。使用双功能剂或衍生剂(例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基)将相关抗原缀合至在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质(例如，钥孔戚血蓝蛋白，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)可以是有用的。
通过将例如100μg或5μg的蛋白质或缀合物(分别针对兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合并在多个部位皮内注射溶液，针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。一个月后，通过在多个部位皮下注射，用弗氏完全佐剂中的原初量的肽或缀合物的1/5至1/10加强动物。7至14天后，将动物放血并测定血清的抗体滴度。将动物加强至滴度平稳。优选地，用相同抗原的缀合物加强动物，但所述抗原与不同的蛋白质和/或通过不同的交联剂缀合。缀合物也可以在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物制备。此外，诸如明矾的聚集剂适合用于增强免疫应答。
本发明的单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，这些方法首先描述于Kohler等,Nature,256:495(1975)中，并进一步描述于例如关于人-人杂交瘤的以下中：Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等,Antibodies:A LaboratoryManual,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling等,MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981),和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826中描述的那些，其涉及从杂交瘤细胞系产生单克隆人天然IgM抗体。人杂交瘤技术(Trioma技术)描述于Vollmers和Brandlein,Histology andHistopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods andFindings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。
对于各种其他杂交瘤技术，参见，例如，US2006/258841；US2006/183887(完全人抗体)，US2006/059575；US2005/287149；US2005/100546；US2005/026229；和美国专利号7,078,492和7,153,507。使用杂交瘤方法产生单克隆抗体的示例性方案描述如下。在一个实施方案中，免疫小鼠或其他合适的宿主动物(例如仓鼠)以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射本发明的多肽或其片段，和佐剂(例如单磷酰脂质A(MPL)/海藻糖二霉菌酸酯(TDM)(RibiImmunochem.Research,Inc.,Hamilton,Mont.))在动物中产生抗体。可以使用本领域熟知的方法制备本发明的多肽(例如抗原)或其片段，所述方法是例如重组方法，其中一些在本文中进一步描述。测定来自免疫动物的血清的抗-抗原抗体，并任选地施用加强免疫。分离来自产生抗-抗原抗体的动物的淋巴细胞。备选地，可以在体外免疫淋巴细胞。
然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞。参见，例如，Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986)。可以使用以下骨髓瘤细胞，其是有效融合的，通过选择的产生抗体的细胞支持稳定的高水平抗体产生，并且对例如HAT培养基的培养基敏感。示例性骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨髓瘤细胞系，例如衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可获得自Salk Institute Cell Distribution Center,SanDiego,Calif.USA)的那些，和衍生自SP-2或X63-Ag8-653细胞(可获得自AmericanType Culture Collection,Rockville,Md.USA)的那些。已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种并在合适的培养基(例如含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的培养基)中生长。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤，氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质防止缺乏HGPRT的细胞生长。优选地，无血清杂交瘤细胞培养方法用于减少动物来源的血清如胎牛血清的使用，例如Even等,Trends inBiotechnology,24(3),105-108(2006)所描述的。
在Franek,Trends in Monoclonal Antibody Research,111-122(2005)中描述了寡肽作为提高杂交瘤细胞培养物生产力的工具。具体地，标准培养基富含某些氨基酸(丙氨酸，丝氨酸，天冬酰胺，脯氨酸)或蛋白质水解级分，并且可以通过由3-6个氨基酸残基构成的合成寡肽显著抑制细胞凋亡。所述肽以毫摩尔或更高的浓度存在。
可以针对与本发明的抗体结合的单克隆抗体的产生来测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定(例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定。单克隆抗体的结合亲和力可以通过例如Scatchard分析来确定。参见，例如，Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)。
在鉴定产生具有期望特异性，亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序亚克隆这些克隆并通过标准方法培养。参见，例如，Goding，同上。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在体内作为动物的腹水肿瘤生长。通过常规免疫球蛋白纯化方法(例如蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石色谱，凝胶电泳，透析或亲和色谱)将亚克隆分泌的单克隆抗体适当地与培养基，腹水或血清分离。从杂交瘤细胞中分离蛋白质的一种方法描述于US2005/176122和美国专利号6,919,436中。该方法包括在结合过程中使用最少量的盐，如易溶盐，并且优选在洗脱过程中使用少量有机溶剂。
(iii)来源于文库的抗体
可以通过从组合文库筛选具有期望活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选这些文库以获得具有期望结合特征的抗体。其他方法在例如Hoogenboom等，Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)进行了综述，并且在例如以下中进行了进一步描述：McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的组库通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以如Winter等,Ann.Rev.Immunol,12:433-455(1994)中所述筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段的抗体片段。来自免疫源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。备选地，可以克隆天然组库(例如，来自人)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的单一抗体来源，而无需任何免疫，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol,227:381-388(1992)所述，通过克隆来自干细胞的未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区域并完成体外重排，也可以合成地制备原初文库。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如：美国专利号5,750,373，和美国专利公布号2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
(iv)嵌合抗体，人源化抗体和人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。在一个实施例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，衍生自小鼠，大鼠，仓鼠，兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实施例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR，(或其部分)衍生自非人抗体，并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选还包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基置换，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中进行了综述，并且进一步在例如以下中描述：Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述"表面再塑")；Dall'Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述"FR重排")；和Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR重排的“导向选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区域(参见，例如，Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；从具有特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列衍生的框架区(参见，例如，Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和从筛选FR文库衍生的框架区(参见，例如，Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过将免疫原施用于转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物已被修饰以响应抗原攻击产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这些动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源性免疫球蛋白基因座，或者在染色体外存在或随机整合到动物的染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSE(商标)技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述HUMAB(注册的)技术的美国专利号5,770,429；描述K-M MOUSE(注册的)技术的美国专利号7,041,870和描述VELOCIMOUSE(注册的)技术的美国专利申请公布号US2007/0061900。可以进一步修饰由这些动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见，例如，Kozbor J.Immunol,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其他方法包括例如美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)还描述于Vollmers和Brandlein,Histology andHistopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods andFindings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。
还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这种可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
(v)抗体片段
抗体片段可以通过传统方法产生，例如酶消化，或通过重组技术产生。在某些情况下，使用抗体片段而不是完整抗体是有利的。较小尺寸的片段允许快速清除，并且可以导致改善的实体瘤进入。有关某些抗体片段的综述，请参见Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134。
已经开发了各种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段是通过蛋白水解消化完整抗体得到的(参见，例如，Morimoto等,Journal of Biochemical andBiophysicalMethods 24:107-117(1992)；和Brennan等,Science,229:81(1985))。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。Fab，Fv和ScFv抗体片段都可以在大肠杆菌中表达和分泌，因此可以容易地产生大量的这些片段。可以从上面讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。备选地，可直接从大肠杆菌中回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab')2片段。在美国专利号5,869,046中描述了具有增加的体内半衰期的包含补救受体结合表位残基的Fab和F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其他技术对于技术人员来说是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利号5,571,894；和5,587,458。Fv和scFv是唯一具有没有恒定区域的完整结合位点的种类；因此，它们可适用于体内使用期间减少的非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白以在scFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合。参见Antibody Engineering,ed.Borrebaeck，同上。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，如美国专利号5,641,870中所述。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)单结构域抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体是单结构域抗体。单结构域抗体是单多肽链，其包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.；参见，例如，美国专利号6,248,516)。在一个实施方案中，单结构域抗体由抗体的全部或部分重链可变结构域组成。
(vii)抗体变体
在一些实施方案中，涵盖本文描述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过将适当的变化引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。可以进行缺失，插入和置换的任何组合达到最终构建体，条件是最终构建体具有期望特征。可以在制备序列时在目标抗体氨基酸序列中引入氨基酸改变。
(viii)置换，插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目标位点包括HVR和FR。保守置换显示在表1中“优选置换”的标题下。表1中在“示例性置换”的标题下提供了更实质的变化并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述。可以将氨基酸置换引入目标抗体中，并针对期望活性(例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
[表1]
表1：示例性置换
原残基 示例性置换 优选置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；G1n；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Net；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可根据常见的侧链特性分组：
a.疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
b.中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
c.酸性：Asp，Glu；
d.碱性：His，Lys，Arg；
e.影响链取向的残基：Gly，Pro；
f.芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守置换将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体具有某些生物学特性(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)的修饰(例如，改善)和/或将基本上保留了亲本抗体的某些生物学特性。示例性的置换变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文所述的那些。简而言之，突变一个或多个HVR残基并在噬菌体上展示变体抗体并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如，置换)，例如，以改善抗体亲和力。这种改变可以在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基)(参见，例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库并从中重新选择的亲和力成熟已经描述在例如在Hoogenboom等Methods in MolecularBiology 178:1-37(O'Brien等,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任何一种(例如，易错PCR，链重排或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中若干个HVR残基(例如，每次4-6个残基)被随机化。参与抗原结合的HVR残基可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模特异性地被鉴定。特别地，通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换，插入或缺失可以在一个或多个HVR内发生，只要这种改变不会显著降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守置换)。这种改变可在HVR“热点”或SDR之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR未改变，或含有不超过一个，两个或三个氨基酸置换。
用于鉴定可以靶向诱变的抗体残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在该方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如带电残基，例如arg，asp，his，lys和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)代替以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入另外的置换，证明对初始置换的功能敏感性。备选地或者另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除这些作为置换候选物的接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的性质。
氨基酸序列插入包括长度为一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如，对于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。
(ix)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。向抗体添加或缺失糖基化位点可以通过改变氨基酸序列以便产生或除去一个或多个糖基化位点而方便地完成。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的二分支寡糖，其通常通过N连接连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖和唾液酸，以及连接至二分支寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明的抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改善的性质的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了包含Fc区的抗体变体，其中与Fc区连接的碳水化合物结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，这可以改善ADCC功能。具体地，本文考虑的抗体相对于野生型CHO细胞中产生的相同抗体上的岩藻糖量具有减少的岩藻糖。也就是说，它们的特征在于具有比由天然CHO细胞(例如，产生天然糖基化模式的CHO细胞，例如含有天然FUT8基因的CHO细胞)产生的岩藻糖量更低的岩藻糖量。在某些实施方案中，抗体是其上少于约50％，40％，30％，20％，10％或5％的N连接聚糖包含岩藻糖的抗体。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。在某些实施方案中，抗体是其上没有N连接的聚糖包含岩藻糖的抗体，即，其中抗体完全没有岩藻糖，或者不具有岩藻糖或者是非岩藻糖基化的。岩藻糖的量通过如下方式确定：计算糖链内Asn297处岩藻糖相对于与Asn 297连接的所有糖结构(例如复合物，杂合和高甘露糖结构)的总和的平均量，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，例如，如WO2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区的第297位左右(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可位于第297位上游或下游的约±3个氨基酸，即第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公布号US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利公布号US2003/0157108,Presta,L；和WO2004/056312,Adams等,具体地实施例11)，以及敲除细胞系，例如敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗体变体进一步具有二等分型寡糖，例如，其中附着于抗体Fc区的二分支寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这种抗体变体的实例描述于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等)；US2005/0123546(Umana等),和Ferrara等,Biotechnology and Bioengineering,93(5):851-861(2006)。还提供了其中寡糖中至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。这种抗体变体可具有改善的CDC功能。这种抗体变体描述于例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO1999/22764(Raju,S.)中。
在某些实施方案中，包含本文所述的Fc区的抗体变体能够结合FcγRIII。在某些实施方案中，与包含人野生型IgG1 Fc区的其他方面相同的抗体相比，包含本文所述的Fc区的抗体变体在人效应细胞存在下具有ADCC活性或在人效应细胞存在下具有增加的ADCC活性。
(x)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是所有效应子功能的抗体变体，这使其成为以下应用的期望候选者：其中抗体在体内的半衰期很重要，但某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I.等,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。备选地，可以使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTI(商标)非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox 96(注册的)非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于这种测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或者另外地，可以在体内(例如在Clynes等Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)公布的动物模型中)评估目标分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova,S.B.等,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的置换的抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在两个或更多个氨基酸位置265，269，270，297和327处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297被丙氨酸置换的所谓的“DANA”突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有与FcR的改善或减弱的结合的某些抗体变体(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312,和Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸置换(例如Fc区的第298，333和/或334位(EU残基编号)的置换)的Fc区。在一个示例性实施方案中，抗体在其Fc区中包含以下氨基酸置换：S298A，E333A和K334A。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，所述改变导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改善或减少)，例如，如美国专利号6,194,551,WO99/51642,以及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
具有增加的半衰期和改善的与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))在US2005/0014934(Hinton等人)中描述。那些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这种Fc变体包括在Fc区残基中的以下一个或多个处具有置换的那些：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如，Fc区残基434的置换(美国专利号7,371,826)。另参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和涉及Fc区变体的其他实例的WO94/29351。
(xi)抗体衍生物
可以进一步修饰本发明的抗体以含有本领域已知的并且容易获得的其他非蛋白质部分。在某些实施方案中，适于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧环戊烷，聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)，和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)，聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造中具有优势。聚合物可以是任何分子量，并且可以是支链或非支链的。与抗体连接的聚合物的数量可以变化，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于考虑因素来确定，所述考虑因素包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否将用于限定条件下的治疗中等。
(xii)载体，宿主细胞和重组方法
也可以使用重组方法产生抗体。为了重组产生抗-抗原抗体，分离编码抗体的核酸并插入可复制的载体中以进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。编码抗体的DNA可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。有很多载体可供使用。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列，复制起点，一个或多个标记基因，增强子元件，启动子和转录终止序列。
(a)信号序列组分
本发明的抗体不仅可以直接重组产生，而且可以作为与异源多肽的融合多肽产生，所述异源多肽优选是在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特异性切割位点的信号序列或其他多肽。选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和加工(例如，被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和处理天然抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列被选自例如碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列置换。对于酵母分泌，天然信号序列可以被例如酵母转化酶前导序列，因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导序列)，或酸性磷酸酶前导序列，白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列或者描述于WO90/13646中的信号所置换。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯性疱疹gD信号。
(b)复制起点
表达和克隆载体均含有使载体能够在一种或多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，该序列是使载体能够独立于宿主染色体DNA复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。这种序列对于各种细菌，酵母和病毒是众所周知的。质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒起点适用于酵母，各种病毒起点(SV40，多瘤，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常只能使用SV40起点，因为它含有早期启动子。
(c)选择性基因组分
表达和克隆载体可含有选择性基因，也称为可选择性标记。典型的选择性基因编码蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素，新霉素，甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型，或(c)提供复杂培养基无法获得的关键营养素，例如，编码芽孢杆菌(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择性方案的一个实施例利用药物来阻止宿主细胞的生长。那些用异源基因成功转化的细胞产生赋予抗药性的蛋白质，从而在选择性方案中存活。这种显性选择的实施例使用药物新霉素，霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适的可选择性标记的另一个实例是能够鉴定能够摄取编码抗体的核酸的细胞的那些，例如DHFR，谷氨酰胺合成酶(GS)，胸苷激酶，金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类动物金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。
例如，通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养转化体来鉴定用DHFR基因转化的细胞。在这些条件下，DHFR基因与任何其他共转化的核酸一起被扩增。可以使用缺乏内源性DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
备选地，通过在含有L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)(GS的抑制剂)的培养基中培养转化体来鉴定用GS基因转化的细胞。在这些条件下，GS基因与任何其他共转化的核酸一起被扩增。GS选择/扩增系统可以与上述DHFR选择/扩增系统组合使用。
备选地，用编码目标抗体，野生型DHFR基因和另一种可选择性标记(例如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)能通过细胞在含有针对可选择标记的选择性试剂(例如卡那霉素，新霉素或G418)的培养基中生长来进行选择。参见美国专利号4,965,199。
适用于酵母的选择性基因是酵母质粒YRp7中存在的trp1基因(Stinchcomb等,Nature,282:39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株(例如ATCCNo.44076或PEP4-1)提供选择性标记。Jones,Genetics,85:12(1977)。然后，酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在提供了在不存在色氨酸的情况下通过生长检测转化的有效环境。类似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)由带有Leu2基因的已知质粒补充。
此外，衍生自1.6μm环形质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维酵母属酵母。备选地，报道了用于乳酸克鲁维酵母(K.lactis)的大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Vanden Berg,Bio/Technology,8:135(1990)。还公开了用于通过克鲁维酵母属的工业菌株分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体。Fleer等,Bio/Technology,9:968-975(1991)。
(d)启动子组分
表达和克隆载体通常含有被宿主生物识别并与编码抗体的核酸可操作连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶启动子，色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子例如tac启动子。然而，其他已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还含有与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
启动子序列对于真核生物是已知的。事实上，所有真核基因都具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基的富含AT的区域。在许多基因的转录起始上游70至80个碱基处发现的另一个序列是CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'末端是AATAAA序列，其可以是将poly A尾添加到编码序列的3'末端的信号。所有这些序列都适合插入真核表达载体中。
用于酵母宿主的合适启动子序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶(例如烯醇酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶)的启动子。
其他作为具有受生长条件控制的转录的额外优势的诱导型启动子的酵母启动子是醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢相关的降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。用于酵母表达的合适载体和启动子进一步描述于EP73,657中。酵母增强剂也有利地与酵母启动子一起使用。
哺乳动物宿主细胞中来自载体的抗体转录可以由例如从以下获得的启动子来控制：病毒基因组，所述病毒如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(如腺病毒2)，牛乳头瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒，猿病毒40(SV40)；或异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)，热休克蛋白启动子，条件是这些启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为SV40限制性片段获得，该片段还含有SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子可方便地作为HindIII E限制性片段获得。在美国专利号4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。在美国专利号4,601,978中描述了该系统的改进。还参见Reyes等,Nature297:598-601(1982)，其关于在来自单纯性疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人β-干扰素cDNA。备选地，Rous肉瘤病毒长末端重复序列可用作启动子。
(e)增强子元件组分
通过将增强子序列插入载体中，通常可以提高高等真核生物对编码本发明抗体的DNA的转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，α-胎蛋白和胰岛素)。然而，通常，人们将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点后侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。还参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)，其关于用于激活真核启动子的增强元件。增强子可以在抗体编码序列的5'或3'位置剪接到载体中，但优选位于启动子的5'位点。
(f)转录终止组分
用于真核宿主细胞(酵母，真菌，昆虫，植物，动物，人或来自其他多细胞生物的有核细胞)的表达载体也将含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔3'非翻译区获得。这些区域含有在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录为多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区域。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
(g)宿主细胞的选择和转化
用于在本文载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是上述原核生物，酵母或高等真核细胞。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但其他菌株如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些示例是说明性的而非限制性的。
全长抗体，抗体融合蛋白和抗体片段可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时，例如当治疗性抗体与本身显示有效于破坏肿瘤细胞的细胞毒性剂(例如，毒素)缀合时。全长抗体在循环中具有更长的半衰期。在大肠杆菌中产生是更快，更具成本效益的。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利号5,648,237(Carter等)，美国专利号5,789,199(Joly等)，美国专利号5,840,523(Simmons等)，其描述了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列。参见Charlton,Methods in MolecularBiology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),pp.245-254，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。表达后，抗体可以从大肠杆菌细胞糊中以可溶性级分分离，并且可以通过例如蛋白A或G柱(取决于同种型)纯化。最后的纯化可以类似于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法进行。
除原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属，种和菌株通常是可用的并且用于本文，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)宿主，如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆壁克鲁维酵母(K.Fragilis)(ATCC12,424)，K.Bulgaricus(ATCC 16,045)，K.Wickeramii(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，K.drosophilarum(ATCC 36,906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)，和马克斯克鲁维酵母(K.Marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；以及丝状真菌如例如脉孢菌属(Neurospora)，青霉菌属(Penicillium)，弯颈霉属(Tolypocladium)，以及曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.Nidulans)和黑曲霉(A.niger)。关于讨论酵母和丝状真菌用于产生治疗性蛋白质的用途的综述，参见例如Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。
可以选择某些真菌和酵母菌株，其中糖基化通路已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见，例如，Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)(描述巴斯德毕赤酵母中糖基化通路的人源化)；和Gerngross等，同上。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体以及来自以下宿主的相应的允许的昆虫宿主细胞，例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫(caterpillar))，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子(mosquito))，白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子(mosquito))，黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇(fruitfly))和家蚕(Bombyx mori)。用于转染的多种病毒株是公众可获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且这种病毒可以根据本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
棉花，玉米，马铃薯，大豆，矮牵牛，番茄，浮萍(Leninaceae)，苜蓿(M.truncatula)和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES(商标)技术)。
脊椎动物细胞可用作宿主，并且脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL 1651)；人胚肾细胞系(亚克隆用于悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等,J.GenVirol.36:59(1977))；小仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL 10)；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等,AnnalsNY.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),pp.255-268。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞用于产生抗体，并在适当修饰的常规营养培养基中培养，以诱导启动子，选择转化子或扩增编码期望序列的基因。
(h)培养宿主细胞
用于产生本发明抗体的宿主细胞可以在各种培养基中培养。可商购的培养基如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium(DMEM),Sigma)适合培养宿主细胞。此外，Ham等,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；或美国专利Re.30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素，转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷酸(如腺苷和胸苷)，抗生素(如GENTAMYCIN(商标)药物)，微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等效能量来源。还可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必需的补充剂。培养条件，如温度，pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员是显而易见的。
(xiii)抗体的纯化
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内，周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生抗体，作为第一步，例如通过离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简而言之，经30分钟在乙酸钠(pH 3.5)，EDTA和苯基甲基磺酰氟(PMSF)存在下解冻细胞糊。可以通过离心除去细胞碎片。当抗体分泌到培养基中时，通常首先使用市售的蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂例如PMSF可以包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石色谱，疏水相互作用色谱，凝胶电泳，透析和亲和色谱来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和色谱是通常优选的纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人γ3，推荐蛋白G(Guss等,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所连接的基质通常是琼脂糖，但也可以使用其他基质。机械稳定的基质，例如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，与琼脂糖相比可以实现更快的流速和更短的加工时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABX(商标)树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。根据待回收的抗体还可以使用用于蛋白质纯化的其他技术，例如离子交换柱分馏，乙醇沉淀，反相HPLC，硅胶色谱，肝素SEPHAROSE(商标)色谱，阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)色谱，色谱聚焦，SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
通常，用于制备用于研究，测试和临床的抗体的各种方法论在本领域中是公认的，与上述方法论一致和/或本领域技术人员认为对于特定目的抗体是合适的。
C.选择生物活性抗体
如上所述产生的抗体可以经历一种或多种“生物活性”测定以从治疗角度选择具有有益特性的抗体或选择保留抗体生物活性的配制品和条件。可以测试抗体与所述抗体所针对产生的抗原的结合的能力。例如，可以使用本领域已知的方法(例如ELISA，蛋白质印迹等)。
例如，对于抗PD-L1抗体，可以在检测结合PD-L1的能力的测定中评估抗体的抗原结合特性。在一些实施方案中，抗体的结合可以通过例如饱和结合；ELISA；和/或竞争测定(例如RIA)来确定。而且，抗体可以进行其他生物活性测定，例如，以评估其作为治疗剂的有效性。此类测定是本领域已知的，并且取决于靶抗原和抗体的预期用途。例如，可以在例如如美国专利8,217,149中所述的CD8+T细胞，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)小鼠模型和/或同系肿瘤模型中评估抗体对PD-L1阻断的生物学效应。
为了筛选与目标抗原上的特定表位结合的抗体(例如，阻断实例的抗PD-L1抗体与PD-L1结合的抗体)，可以进行例如在Antibodies,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的常规交叉阻断测定。备选地，可以进行例如如Champe等,J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)中描述的表位定位以确定抗体是否结合目标表位。
D.药物组合物和配制品
本文还提供了药物组合物和配制品，其包含作为活性成分的PD-1轴结合拮抗剂和/或本文所述的抗体(如抗PD-L1抗体或抗GPC3抗体)和药学上可接受的载体。
如本文所述的“组合”是指用于组合使用的活性成分的组合，并且包括两种模式，其中在施用时组合使用单独的物质或者其作为混合物提供(组合制剂)。
本文所述的药物组合物和配制品可以通过将具有期望纯度的活性成分(如抗PD-L1抗体和/或抗GPC3抗体)与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington'sPharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))混合，以冻干配制品或水溶液的形式来制备。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐，柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(HYLENEX(注册的)，Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体配制品描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体配制品包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后者配制品包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，本文所述的抗PD-L1抗体在配制品中，所述配制品包含浓度为约60mg/mL的抗体，浓度为约20mM的组氨酸乙酸盐，浓度为约120mM的蔗糖，和浓度为0.04％(w/v)的聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20)，并且所述配制品具有约5.8的pH。在一些实施方案中，本文所述的抗PD-L1抗体在配制品中，所述配制品包含浓度为约125mg/mL的抗体，浓度为约20mM的组氨酸乙酸盐，浓度为约240mM的蔗糖，和浓度为0.02％(w/v)的聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20)，并且所述配制品具有约5.5的pH。
本文的组合物和配制品还可含有一种以上的活性成分，这些活性成分对于所治疗的具体适应症是必需的，优选那些具有互补活性但不会相互产生不利影响的活性成分。这种活性成分合适地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如，羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊)中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳液，纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质是成形制品的形式，例如薄膜或微胶囊。用于体内施用的配制品通常是无菌的。例如，通过无菌过滤膜过滤可以容易地实现无菌。
IV.治疗方法
本文提供了用于治疗，预防或延迟个体癌症进展的方法，其包括向所述个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。在一些实施方案中，治疗导致在停止治疗后个体的持续应答。本文所述的方法可用于治疗期望增强免疫原性(如增加肿瘤免疫原性以治疗癌症)的病症。本文还提供了增强患有癌症的个体针对肿瘤细胞的免疫应答的方法，其包括向所述个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括免疫细胞(包括巨噬细胞和多核巨细胞)浸润到肿瘤组织中。又例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中CD45阳性淋巴细胞，CD3ε阳性淋巴细胞和CD8阳性T淋巴细胞的增加。本领域已知或本文描述的任何PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体均可用于所述方法中。
在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，个体患有GPC3阳性癌症。在一些实施方案中，GPC3阳性癌症是肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，结肠癌，肾癌，食道癌或前列腺癌。在一些实施方案中，肝癌是肝细胞上皮癌。在一些实施方案中，乳腺癌是乳腺上皮癌或乳腺腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌是浸润性导管癌。在一些实施方案中，肺癌是肺腺癌。在一些实施方案中，结肠癌是结肠直肠腺癌。在一些实施方案中，个体中的癌细胞表达PD-L1。在一些实施方案中，个体中的癌细胞以可检测的水平(例如，使用本领域已知的方法检测)表达GPC3蛋白。
在一些实施方案中，在用PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体的组合治疗之前，已经用GPC3靶向疗法治疗个体。在一些实施方案中，GPC3靶向疗法包括用一种或多种小分子例如索拉非尼治疗。
在一些实施方案中，本发明的组合疗法包括施用PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体。PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体可以以本领域已知的任何合适的方式施用。例如，PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体可以顺序(在不同时间)或同时(在相同时间)施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂与抗GPC3抗体在分开的组合物中。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂与抗GPC3抗体在同一的组合物中。
PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂通过静脉内，肌内，皮下，局部，口服，透皮，腹膜内，眶内，植入，吸入，鞘内，心室内或鼻内施用。在一些实施方案中，抗GPC3抗体通过静脉内，肌内，皮下，局部，口服，透皮，腹膜内，眶内，植入，吸入，鞘内，心室内或鼻内施用。可以施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体用于预防或治疗疾病。PD-1轴结合拮抗剂和/或抗GPC3抗体的合适剂量可以基于以下来确定：待治疗的疾病类型，PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体的类型，疾病的严重程度和病程，个体的临床状况，个体的临床病史和对治疗的反应，以及主治医师的自由裁量。
作为一般性建议，无论是通过一次或多次施用，给予人的抗体的治疗有效量将在约0.01至约50mg/kg患者体重的范围内。在一些实施方案中，使用的抗体为例如每日施用约0.01至约45mg/kg，约0.01至约40mg/kg，约0.01至约35mg/kg，约0.01至约30mg/kg，约0.01至约25mg/kg，约0.01至约20mg/kg，约0.01至约15mg/kg，约0.01至约10mg/kg，约0.01至约5mg/kg，或约0.01至约1mg/kg。在一些实施方案中，抗体以15mg/kg施用。然而，其他剂量方案可以是有用的。在一个实施方案中，本文所述的抗PD-L1抗体在21天周期的第1天以约100mg，约200mg，约300mg，约400mg，约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg或约1400mg的剂量施用于人。所述剂量可以单剂量或多剂量(例如2或3剂量)如输注施用。与单一治疗相比，联合治疗中施用的抗体剂量可以减少。通过常规技术可以容易地监测该疗法的进展。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括另外的疗法。另外的疗法可以是放射疗法，手术(例如，乳房肿瘤切除术和乳房切除术)，化疗，基因疗法，DNA疗法，病毒疗法，RNA疗法，免疫疗法，骨髓移植，纳米疗法，单克隆抗体疗法或前述的组合。另外的疗法可以是辅助或新辅助疗法的形式。在一些实施方案中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减轻治疗副作用的发生和/或严重性的药剂，例如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ辐射。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向PI3K/AKT/mTOR通路的疗法，HSP90抑制剂，微管蛋白抑制剂，凋亡抑制剂和/或化学预防剂。另外的疗法可以是一种或多种本文所述的化疗剂。
V.制品或试剂盒
在本发明的另一个实施方案中，提供了制品或试剂盒，其包含PD-1轴结合拮抗剂和/或抗GPC3抗体。在一些实施方案中，所述制品或试剂盒还包含包装说明书，所述包装说明书包含用于将PD-1轴结合拮抗剂与抗GPC3抗体联合使用以治疗或延迟个体癌症的进展或增强对患有癌症的个体的肿瘤细胞的免疫应答的说明。例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括免疫细胞(包括巨噬细胞和多核巨细胞)浸润到肿瘤组织中。又例如，针对肿瘤细胞的增强的免疫应答包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中CD45阳性淋巴细胞，CD3ε阳性淋巴细胞和CD8阳性T淋巴细胞的增加。本文所述的任何PD-1轴结合拮抗剂和/或抗GPC3抗体可包括在制品或试剂盒中。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗GPC3抗体在相同的容器或分开的容器中。合适的容器包括例如瓶子，小瓶，袋子和注射器。容器可以由多种材料形成，例如玻璃，塑料(如聚氯乙烯或聚烯烃)，或金属合金(如不锈钢或哈氏合金)。在一些实施方案中，容器容纳配制品，并且容器上或与容器相关联的标签可指示使用说明。制品或试剂盒可以进一步包括从商业和用户角度期望的其他材料，包括其他缓冲剂，稀释剂，过滤器，针头，注射器和具有使用说明的包装说明书。在一些实施方案中，制品还包括一种或多种另外药剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)。用于一种或多种药剂的合适容器包括例如瓶子，小瓶，袋子和注射器。
该说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。除了本文所示和所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述中变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用整体并入本文。
[实施例1]
表达人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的小鼠细胞系
使用FuGENE6(Roche Diagnostics Corp)用人GPC3表达载体pCXND2/hGPC3(FL)[Ishiguro T.等,Cancer Res.2008；68:9832-9838]转染小鼠癌细胞系Hepa1-6(ATCCNo.CRL-1830)和CT26(ATCC No.CRL-2638)并用1mg/mLG418(Invitrogen)选择。收集甚至在G418存在下仍生长的细胞，并通过有限稀释分离菌落。使用抗人GPC3抗体GC33通过FACS确认人GPC3的表达[Ishiguro T.等,Cancer Res.2008；68:9832-9838]。选择代表性克隆并用于实验。
[实施例2]
在使用表达人GPC3的Hepa1-6细胞系的同系小鼠模型中抗GPC3抗体的抗肿瘤活性
使用细胞培养瓶在培养箱(设定在37℃和5％CO2)中培养Hepa1-6/hGPC3细胞。用胰蛋白酶使细胞与烧瓶分离，并用含有10％(v/v)FBS，0.6mg/mL G418的D MEM洗涤。然后将细胞重悬于D-MEM(2×108细胞/mL)中，并加入等体积的基质胶。用于植入的细胞浓度为1×108个细胞/mL。将细胞皮下接种到每只C57BL/6J小鼠(Charles River LaboratoriesJapan)的右胁腹(1×107细胞/小鼠)中。一旦建立可触及的肿瘤，将动物随机分入测试组，以便在研究开始时每组具有相似的平均肿瘤体积。在肿瘤接种后第14，21和28天静脉注射1或5mg/kg在PBS中稀释的小鼠GC33抗人GPC3单克隆抗体[WO2006/006693]或作为载体对照的PBS。与载体对照相比，小鼠GC33显示出具有剂量依赖性的肿瘤生长抑制(图1)。
[实施例3]
在使用表达人GPC3的Hepa1-6细胞系的同系小鼠模型中抗GPC3抗体诱导的病理学 变化
为了评估通过小鼠GC33处理的Hepa1-6肿瘤组织的变化，在单次注射小鼠GC33抗体或载体对照3或7天后分离的肿瘤组织用于病理学检查。用4％多聚甲醛(PFA)固定肿瘤组织，并通过AMeX方法将其包埋在石蜡中[Suzuki等,JToxicol Sci.2002；27:165-172,Watanabe等,J Toxicol Pathol.2015；28:43-49]。用苏木精和曙红(HE)或免疫组织化学(IHC)染色三个微米石蜡切片。根据标记的链霉亲和素-生物素(LSAB)方法(RTU辣根过氧化物酶链霉亲和素)进行IHC染色。抗F4/80抗体(鼠巨噬细胞的标记抗原；A3-1，BioLegend)，PD-L1(小鼠B7-H1/PD-L1的标记抗原；AF1019，R&D systems)用作一抗。通过过氧化物酶-二氨基联苯胺反应显现阳性信号，并用苏木精复染切片。
通过小鼠GC33注射，在肿瘤组织的外周区域中观察到免疫细胞浸润和肿瘤细胞死亡。在用小鼠GC33处理的肿瘤组织中观察到肿瘤细胞死亡的区域中观察到F4/80阳性巨噬细胞的浸润增加，而F4/80阳性细胞主要在具有载体对照的肿瘤组织的基质区域中观察到(图2A)。随后，与载体对照相比，小鼠GC33增加了PD-L1表达，尤其是在浸润的免疫细胞上，这表明PD-L1可以被诱导以抑制小鼠GC33的抗肿瘤活性(图2B)。
[实施例4]
在使用表达人GPC3的CT26细胞系的同系小鼠模型中与抗GPC3(GC33)和抗PD-L1抗 体(10F.9G2)组合的抗肿瘤活性
为了评估小鼠CT26/hGPC3模型中抗GPC3或抗PD-L1单一疗法或组合的抗肿瘤活性，在皮下接种1x106个CT26/hGPC3细胞后的第3天(早期治疗模型)或第15天(已建立的模型)注射小鼠GC33抗体和/或500μg抗小鼠PD-L1大鼠抗体10F.9G2(购自BioXCell)。在早期治疗模型中，在第3，6，10和13天静脉内注射5或25mg/kg小鼠GC33，并且以相同的时间表作为单试剂或组合地注射500μg抗PD-L1抗体10F.9G2。在已建立的模型中，在第15天和第18天静脉内注射5或25mg/kg小鼠GC33，并且以相同的时间表作为单试剂或组合地注射500μg抗PD-L1抗体10F.9G2。
在两种模型中，与每种单一疗法相比，25mg/kg GC33和10F.9G2的组合显示出最有效的抗肿瘤活性(图3和4)。
[实施例5]
在使用表达人GPC3的Hepa1-6细胞系的同系小鼠模型中与抗GPC3(GC33)和抗PD- L1抗体(10F.9G2)组合的抗肿瘤活性
将1mg/kg、5mg/kg或25mg/kg小鼠GC33抗体每周1次持续3周，或将200μg抗小鼠PD-L1大鼠抗体10F.9G2随后每周100μg持续2周作为单一药剂或组合地静脉内注射如上所述携带Hepa1-6的小鼠。用HE染色切片进行病理学检查，所述HE染色切片用上述常规方法制备。关于IHC，表2中列出的第一抗体用于每种标记，并通过上述LSAB方法或ENV+方法可视化。对来自每组的3只代表性动物进行IHC。
[表2]
Figure BDA0003991355990000831
虽然与载体对照相比，小鼠GC33或10F.9G2显示出对肿瘤生长的抑制，但小鼠GC33和10F.9G2组合显示出最强的抗肿瘤活性(图5A)。第3次注射后5天，对所有小鼠进行尸检，并在病理学上评估肿瘤组织。在检查的肿瘤组织中，在用25mg/kg小鼠GC33与PD-L1抗体组合处理的所有小鼠中以及在用5mg/kg小鼠GC33与PD-L1抗体组合处理的5只小鼠中的4只中未观察到活的肿瘤细胞(图5B)。
处理的各肿瘤组织的病理检查显示，与载体对照相比，各处理使得F4/80阳性细胞数量增加，浸润入肿瘤组织的多核巨细胞(MNGC)和CD3阳性细胞上的PD-L1表达，CD206、CD163和CD11b阳性细胞数量减少，以及单核细胞(MNC)上的PD-L1表达。与每种单一疗法相比，通过组合，CD3阳性T细胞的浸润增加，其倾向于与抗肿瘤活性有关(表3)。
[表3]
[表3]
表3：经处理的肿瘤的病理评估
Figure BDA0003991355990000841
[实施例6]
在使用表达人GPC3的Hepa1-6细胞系的同系小鼠模型中与抗GPC3(GC33)和抗PD- L1抗体(6E11)组合的抗肿瘤活性
每周一次或三次(q7d x 3)将1mg/kg或5mg/kg的小鼠GC33静脉内给予具有已建立的Hepa1-6/hGPC3肿瘤的C57BL/6J小鼠。静脉内给予10mg/kg抗小鼠PD-L1 mAb(克隆6E11，mIgG2A，D265A和N297A；Genentech[WO2015/095418])一次，随后腹膜内给予5mg/kg每周两次(q7d x 3)。
与用任一单一疗法治疗相比，联合疗法增加了对肿瘤生长的抑制(图6A，B)。单次1mg/kg mGC33，单次5mg/kg mGC33，1mg/kg mGC33 q7d x 3，5mg/kgmGC33 q7d x 3，6E11q7d x 3，6E11q7d x 3+单次1mg/kg mGC33，6E11q7d x 3+单次5mg/kg mGC33，和6E11q7d x 3+1mg/kg mGC33 q7d x 3，6E11q7d x 3+5mg/kg mGC33 q7d x 3的肿瘤生长抑制值的最终测量值分别为73％，84％，73％，80％，88％，85％，95％，88％和104％。5mg/kgmGC33 q7d x 3组中的一只小鼠，1mg/kg mGC33 q7d x 3组中的一只小鼠，单次5mg/kgmGC33中的一只小鼠，单次1mg/kg mGC33组中的两只小鼠由于肿瘤进展实施安乐死。在施用期间没有观察到小鼠死亡并且没有观察到严重的体重减轻(图6C)。
根据组织病理学的结果，通过施用mGC33，6E11和组合观察到伴随或不伴随坏死严重性增加的肿瘤面积减少(图7)。在6E11 q7d×3+单次5mg/kgmGC33或q7d×3组中，在五只小鼠中的一只或两只中观察到病理学完全应答(pCR；组织病理学切片上没有肿瘤组织)。此外，在所有治疗组中都注意到肿瘤坏死(伴有包括巨噬细胞/多核巨细胞在内的免疫细胞的浸润)；病损严重程度为如下次序：单次mGC33 5mg/kg或q7d x 3，6E11 q7d x 3<单次mGC335mg/kg或q7d x 3+6E11 q7d x 3(图8A)。如图8B所示，在肿瘤块周围观察到的F4/80阳性细胞在组合病例中最丰富，然后依此顺序是mGC33或6E11 q7d×3和载体(图8B)。在载体中，PD-L1阳性反应主要在具有弱强度的肿瘤细胞的细胞质中观察到。另一方面，在所有处理组中注意到免疫细胞(包括巨噬细胞/多核巨细胞)中PD-L1阳性反应的强度(弱至中等)增加和频率增加(图8C)。
[实施例7]
在使用表达人GPC3的Hepa1-6细胞系的同系小鼠模型中的细胞毒性T细胞的诱导
除NK细胞和巨噬细胞的先天免疫外，细胞毒性T细胞对获得性免疫的诱导对杀伤肿瘤细胞也很重要。为了评估所治疗小鼠中获得性免疫的诱导，评估了浸润进入肿瘤组织的T细胞。将表达人GPC3的Hepa1-6细胞皮下接种到C57BL/6J小鼠中。在可触及的肿瘤建立后，将小鼠分成12组；3组作为对照，3组在肿瘤接种后第13天和第20天用5mg/kg小鼠GC33处理2次，3组在肿瘤接种后第13天用10mg/kg的6E11处理并且在第20天用5mg/kg的6E11处理，或3组用小鼠GC33(肿瘤接种后第13天和第20天2次)和6E11(在肿瘤接种后第13天10mg/kg6E11并且在第20天5mg/kg 6E11)联合处理。在第二次施用1，3和8天后，分离肿瘤组织并切碎。通过温和的MACS(商标)Octo Dissociator消化后，洗涤细胞并用于流式细胞术以定量CD45，CD3ε，CD4或CD8阳性肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)。
如图9所示，在用小鼠GC33或6E11处理的小鼠中，观察到CD45阳性淋巴细胞，CD3ε阳性和CD8阳性T淋巴细胞的增加，而CD4阳性淋巴细胞则没有。与上述抗肿瘤活性相同，与每种单一疗法相比，在小鼠GC33和6E11的组合中，观察到更强的淋巴细胞(包括CD8阳性TIL)诱导。
工业适用性
本发明有助于PD-1轴结合拮抗剂或抗GPC3抗体通过彼此组合的功效提高以及待治疗患者的QOL的改善，并且可用于治疗包括肝癌在内的癌症。

Claims (15)

1.与PD-1轴结合拮抗剂组合使用的、用于治疗或延迟个体癌症进展的药物组合物，所述组合物包含抗GPC3抗体作为活性成分。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述抗GPC3抗体在施用所述PD-1轴结合拮抗剂之前施用，与施用所述PD-1轴结合拮抗剂同时施用，或在施用所述PD-1轴结合拮抗剂之后施用。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中所述PD-1轴结合拮抗剂选自由以下组成的组：PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
4.权利要求3的药物组合物，其中所述PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。
5.权利要求3的药物组合物，其中所述PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与B7-1的结合。
6.权利要求3的药物组合物，其中所述PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和与B7-1的结合。
7.权利要求4-6中任一项的药物组合物，其中所述PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。
8.权利要求3的药物组合物，其中所述PD-L1结合拮抗剂选自由以下组成的组：YW243.55.S70，阿特珠单抗，MPDL3280A，MDX-1105和MEDI4736。
9.权利要求7的药物组合物，其中所述抗PD-L1抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQID NO:19的HVR-H1序列，SEQ ID NO:20的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:21的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列，SEQ ID NO:23的HVR-L2序列和SEQ ID NO:24的HVR-L3序列。
10.权利要求7的药物组合物，其中所述抗PD-L1抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
11.权利要求1-10中任一项的药物组合物，其中所述抗GPC3抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:34的HVR-H1序列，SEQ ID NO:35的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:36的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:37的HVR-L1序列，SEQ ID NO:38的HVR-L2序列和SEQID NO:39的HVR-L3IA224206X
序列。
12.权利要求1-10中任一项的药物组合物，其中所述抗GPC3抗体能够结合第二抗体能结合的表位，
其中所述第二抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:42的HVR-H1序列，SEQID NO:43的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:44的HVR-H3序列；所述轻链包含SEQ ID NO:45的HVR-L1序列，SEQ ID NO:46的HVR-L2序列和SEQ ID NO:47的HVR-L3序列。
13.权利要求1至12中任一项的药物组合物，其中所述抗GPC3抗体是人源化抗体。
14.权利要求13的药物组合物，其中所述抗GPC3抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
15.权利要求1至14中任一项的药物组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，结肠癌，肾癌，食道癌和前列腺癌。
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