KR20180120063A

KR20180120063A - Pd-1 축 결합 길항제 및 항-gpc3 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법

Info

Publication number: KR20180120063A
Application number: KR1020177016450A
Authority: KR
Inventors: 미카 엔도; 아쓰히코 가토; 도시히코 오토모; 겐지 아다치; 야스코 기노시타; 요시노리 나리타
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤; 제넨테크, 인크.
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2018-11-05
Also published as: EP3430054A1; BR112018067923A2; JP2018516842A; EP3430054B1; PL3430054T3; CA3016552A1; CN116196412A; WO2017159699A1; TW202248213A; AU2017235097B2; MX2018010546A; KR102046235B1; JP2019031552A; EP4112641A1; JP6430025B2; US11767362B1; TW201740975A; JP2023002720A; AU2017235097A1; ES2904286T3

Abstract

본 발명은 암을 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 방법은 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 암을 치료하는 약학 조성물을 포함하는 조성물은 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 포함한다. 활성 성분으로서 항-GPC3 항체를 포함하는, 암을 치료하기 위해 PD-1 축 결합 길항제와 병용되는 약학 조성물; 및 활성 성분으로서 PD-1 축 결합 길항제를 포함하는, 암을 치료하기 위해 항-GPC3 항체와 병용되는 약학 조성물도 개시되어 있다.

Description

PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법{METHODS OF TREATING CANCERS USING PD-1 AXIS BINDING ANTAGONISTS AND ANTI-GPC3 ANTIBODIES}

본 발명은 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 투여하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

간세포암은 보고에 의하면 해마다 약 600,000명 사망의 이유가 되는, 전세계적으로 암 사망의 다섯 번째 주요 원인이다(비특허문헌 1). 간세포암을 가진 대다수의 환자들은 이 질환으로 진단된 후 1년 이내에 사망한다. 불행하게도, 간세포암 사례는 치유적 요법에 거의 반응하지 않는 말기 단계에서 빈번히 진단된다. 여전히, 화학요법, 화학색전술, 절제술 및 양성자 광선 요법을 비롯한 의학적 치료는 이러한 환자에 불충분하게 효과적이다. 많은 환자들은 진행된 단계로 급속히 진행되는, 혈관 침습 및 다발성 간내 전이를 가진 질환의 재발을 나타낸다. 이들의 5년 생존율은 겨우 7%이다(비특허문헌 2). 국소적 병소의 절제로 처리될 수 있는 간세포암을 가진 환자들은 상대적으로 우수한 예후를 갖지만, 그들의 5년 생존율은 여전히 15% 내지 39%의 수준에서 유지될 것이다(비특허문헌 3). 따라서, 이러한 악성 질환 간세포암을 위한 신규 요법에 대한 요구가 당분야에 존재한다.

간세포암은 보고에 의하면 일본에서 90% 초과의 일차 간암 사례의 원인이 된다. 이러한 간세포암을 치료하는 의학적 방법은 예를 들면, 오일계 조영 매질(리피오돌(Lipiodol)), 항암제 및 폐쇄 물질(젤폼(Gelfoam))의 혼합물을 간 동맥(종양으로의 영양분 공급 경로로서 작용함) 내로 주사하여 영양분 동맥의 폐쇄를 야기함으로써 간세포암의 선택적 괴사를 유도하는 단계를 포함하는 화학요법-기반 경도관 동맥 색전술(TAE) 요법을 포함한다. 추가로, 침습적 방법, 예컨대, 경피 에탄올 주사, 경피 마이크로파 응고 요법 및 고주파 절제술이 이용된다. 또한, 화학요법제, 예컨대, 플루오로우라실(fluorouracil)(5-FU), 우라실-테가푸르(uracil-tegafur)(UFT), 미토마이신(mitomycin) C(MMC), 미톡산트론(mitoxantrone)(DHAD), 아드리아마이신(adriamycin)(ADR), 에피루비신(epirubicin)(EPI) 및 시스플라틴(cisplatin)(CDDP)을 단독으로 또는 인터페론(IFN)과 함께 사용하는 전신 화학요법에 대한 임상 시험이 수행되었다(비특허문헌 4).

한편, 소라페닙(sorafenib)(Nexavar, BAY43-9006)의 경구 활성 형태가 승인되어 있고, 이 물질은 Raf/MEK/ERK 신호 전달도입에서 Raf 키나제를 억제함으로써 암세포의 성장을 차단하는 방식으로 상기 화학요법제들보다 더 유리하게 효과적인 반면, 상기 물질은 EGFR-2, VEGFR-3 및 PDGFR-.베타. 티로신 키나제를 표적화함으로써 항혈관신생 효과를 발휘한다. 소라페닙의 효능은 진행된 간세포암을 표적화하는 2종의 III기 다중심 플라세보-대조된 시험(소라페닙 HCC 평가 무작위배정 프로토콜(SHARP) 시험 및 아시아-퍼시픽 시험)에서 연구되었다. 소라페닙은 이들 시험들 둘 다에서 0.68의 HR로 생존 기간을 연장하는 것으로 확인되었다. SHARP 시험에서, 소라페닙은 생존 기간을 10.7개월까지 연장시킨 반면, 플라세보는 생존 기간을 7.9개월까지 연장시켰다. 동양인 시험에서, 이 물질은 생존 기간을 6.5개월까지 연장시킨 반면, 플라세보는 생존 기간을 4.2개월까지 연장시켰다. 그러나, 상기 물질은 영상에서 종양 진행까지의 시간(유럽인 및 미국인 시험에서 5.5개월 대 2.8개월, 및 동양인 시험에서 2.8개월 대 1.4개월)을 연장시켰음에도 불구하고 낮은 객관적 반응률을 가졌고 증상을 보이는 진행까지의 시간을 연장시키지 않았다. 동양인 코호트(cohorts)는 생존 연장의 짧은 지속을 나타내었는데, 이것은 아마도 그들의 치료가 유럽 및 미국에 비해 아시아 지역에서 질환 진행 동안 다소 후기 단계에서 시작되었기 때문이다(비특허문헌 5 및 6).

간암이 진행됨에 따라, 간 기능이상과 관련된 그의 특정 증상, 예컨대, 거식증, 체중 감소, 전신 권태, 촉진가능한 우측 계륵부 덩어리, 우측 계륵부 통증, 복부 풍만감, 발열 및 황달이 일반적으로 관찰된다. 그러나, 화학요법제(예를 들면, 소라페닙)는 그들 고유의 불리한 반응, 예컨대, 설사 또는 변비, 빈혈, (치명적인 중증도로) 감염 또는 패혈증을 야기하는 면역 시스템의 억제, 출혈, 심장 독성, 간 독성, 신장 독성, 거식증 및 체중 감소를 비롯한, 극복되어야 할 합병증을 가진다.

특정 초기 증상이 간암에서 처음에 관찰되지 않을지라도, 간 기능이상과 관련된 그의 특정 증상, 예컨대, 거식증, 체중 감소, 전신 권태, 촉진가능한 우측 계륵부 덩어리, 우측 계륵부 통증, 복부 풍만감, 발열 및 황달은 일반적으로 간암이 진행함에 따라 관찰된다. 임상적 관찰에 따르면, 이러한 증상들은 화학요법제의 사용에 의해 향상된다. 예를 들면, 검출가능한 간암 세포를 가진 환자에서의 거식증, 및 거식증과 관련되어 있거나 무관한 증상, 예컨대, 체중 감소는 화학요법제를 사용하지 않은 경우보다 화학요법제를 환자에게 투여함으로써 더 향상될 수 있다. 일부 사례에서, 화학요법제의 사용은 이러한 증상을 가진 환자의 경우 중단되어야 한다. 이들 향상된 증상들은 화학요법제를 사용한 치료를 방해한다. 따라서, 예를 들면, 치료될 환자의 치료 효과를 개선하거나 QQL을 개선한다는 관점에서 볼 때 뛰어난 요법의 확립에 대한 요구가 있다.

글리피칸 3(GPC3)은 종종 간암에서 고수준으로 발현되므로, 간암에서 그의 기능의 확인에 유용하거나 간암의 치료적 또는 진단적 표적으로서 유용한 듯하다.

전술된 환경 하에서, 간암의 치료적 표적으로서 GPC3을 사용하여 약물을 개발하고 있다. GPC3을 발현하는 세포에 대한 항체 의존적 세포 세포독성(이하, "ADCC"로서 지칭됨) 활성 및/또는 보체 의존적 세포독성(이하, "CDC"로서 지칭됨) 활성을 가진 항-GPC3 항체를 활성 성분으로서 포함하는 간암 약물이 개발되었다(특허문헌 1). 또한, ADCC 활성 및 CDC 활성을 가진 인간화된 항-GPC3 항체를 활성 성분으로서 포함하는 GPC3 표적화 약물이 개발되었다(특허문헌 2). 향상된 ADCC 활성을 가진 인간화된 항-GPC3 항체(특허문헌 3 및 4) 또는 ADCC 활성 및 CDC 활성뿐만 아니라 개선된 혈장 동력학도 가진 항-GPC3 항체(특허문헌 5)를 포함하는, GPC3 표적화 약물도 개발되었다. 화학요법제, 예컨대, 소라페닙을 사용한 병용요법에서 이 항-GPC3 항체는 예를 들면, 화학요법제(예를 들면, 소라페닙)의 단독 요법에 의해 발생된 불리한 반응을 약화시키는 것으로 발견되었고, 이들 물질들에 근거한 상승작용적 효과를 나타내는 것으로도 발견되었다(특허문헌 6). 따라서, 예를 들면, 치료되는 환자의 치료 효과를 개선하거나 QQL을 개선한다는 관점에서 볼 때 GPC3 표적화 약물을 핵으로서 사용하여 간암을 치료하는 탁월한 방법이 확립되고 있는 중이다.

다른 한편으로, T 세포에의 2개의 상이한 신호의 제공은 항원 제시 세포(APC)에 의한 휴면 T 림프구의 림프구 활성화에 대한 널리 허용되는 모델이다(Lafferty et al, Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci 53: 27-42 (1975)). 이 모델은 비-자신으로부터의 자신의 식별 및 면역 내성도 제공한다(Bretscher et al, Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al, J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987)). 일차 신호 또는 항원 특이적 신호는 주조직적합성 복합체(MHC)의 환경에서 제시된 외래 항원 펩티드의 인식 후 T 세포 수용체(TCR)를 통해 변환된다. 제2 또는 보조자극 신호는 항원 제시 세포(APC) 상에서 발현된 보조자극 분자에 의해 T 세포에게 전달되어, T 세포가 클론 증폭, 사이토카인 분비 및 이펙터 기능을 촉진하도록 유도한다(Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14:233 (1996)). 보조자극의 부재 하에서, T 세포는 항원 자극에 불응성을 나타내게 될 수 있고 효과적인 면역 반응을 유발시키지 않고 외래 항원에 대한 소진 또는 내성도 초래할 수 있다.

2-신호 모델에서, T 세포는 양성 이차 보조자극 신호 및 음성 이차 보조자극 신호 둘 다를 받는다. 이러한 양성 신호 및 음성 신호의 조절은 면역 내성을 유지하고 자가면역을 예방하면서 숙주의 보호 면역 반응을 최대화하는 데 매우 중요하다. 음성 이차 신호는 T 세포 내성의 유도에 필요한 듯한 반면, 양성 신호는 T 세포 활성화를 촉진한다. 단순한 2-신호 모델은 무자극(naive) 림프구에 대한 유효한 설명을 여전히 제공하지만, 숙주의 면역 반응은 동적 과정이고, 보조자극 신호는 항원-노출된 T 세포에게 제공될 수도 있다. 보조자극 신호의 조작이 세포-기반 면역 반응을 향상시키거나 종결하기 위한 수단을 제공하는 것으로 밝혀져 있기 때문에 보조자극의 기작은 치료적으로 흥미롭다. 최근에, T 세포 기능이상 또는 아네르기(anergy)는 억제성 수용체인 프로그래밍된 사멸 1 폴리펩티드(PD-1)의 유도된 및 지속된 발현과 동시에 일어난다. 그 결과, PD-1, 및 PD-1과의 상호작용을 통해 신호를 전달하는 다른 분자, 예컨대, 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1) 및 프로그래밍된 사멸 리간드 2(PD-L2)의 치료적 표적화는 매우 관심을 끄는 분야이다.

PD-L1은 많은 암들에서 과다발현되고 종종 좋지 않은 예후와 관련되어 있다(Okazaki T et al., Intern. Immun. 2007 19(7):813; Thompson RH et al., Cancer Res 2006, 66(7):3381). 흥미롭게도, 정상 조직 내의 T 림프구 및 말초 혈액 T 림프구와 대조적으로, 대다수의 종양 침윤 T 림프구들은 PD-1을 우세하게 발현하고, 이것은 종양 반응성 T 세포 상에서의 PD-1의 상향조절이 손상된 항종양 면역 반응에 기여할 수 있다는 것을 시사한다(Blood 2009 114(8): 1537). 이것은 PD-1 발현 T 세포와 상호작용하여 T 세포 활성화의 약화 및 면역 감시의 회피를 초래하는 PD-L1 발현 종양 세포에 의해 매개된 PD-L1 신호전달의 활용에 기인할 수 있다(Sharpe et al., Nat Rev 2002)(Keir ME et al., 2008 Annu. Rev. Immunol. 26:677). 따라서, PD-L1/PD-1 상호작용의 억제는 종양의 CD8+ T 세포 매개 사멸을 향상시킬 수 있다.

PD-1, 및 PD-1과의 상호작용을 통해 신호를 전달하는 다른 분자, 예컨대, 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1) 및 프로그래밍된 사멸 리간드 2(PD-L2)의 치료적 표적화는 매우 관심을 끄는 분야이다. PD-L1 신호전달의 억제는 암의 치료(예를 들면, 종양 면역), 및 급성 감염 및 만성(예를 들면, 지속적) 감염 둘 다를 포함하는 감염에 대한 T 세포 면역을 향상시키는 수단으로서 제안되었다. 최적 치료적 치료는 PD-1 수용체/리간드 상호작용의 차단을, 종양 성장을 직접적으로 억제하는 물질과 병용할 수 있다. 다양한 암들의 치료, 안정화, 예방 및/또는 발생 지연을 위한 최적 요법에 대한 필요성이 남아있다.

특허출원, 특허공보 및 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁번호를 비롯한, 본원에서 인용된 모든 참고문헌들은 각각의 개별 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 도입되는 것으로 표시되어 있는 것처럼 전체적으로 본원에 참고로 도입된다.

본 발명은 하기 실시양태들을 제공한다:

[1] PD-1 축 결합 길항제와 병용되는, 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 약학 조성물로서, 활성 성분으로서 항-GPC3 항체를 포함하는 약학 조성물.

[2] 실시양태 [1]에 있어서, 항-GPC3 항체가 PD-1 축 결합 길항제의 투여 전에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여와 동시에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여 후에 투여되는, 약학 조성물.

[3] 실시양태 [1] 또는 [2]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

[4] 실시양태 [3]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제인, 약학 조성물.

[5] 실시양태 [4]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 그의 리간드 결합 파트너의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[6] 실시양태 [5]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L1의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[7] 실시양태 [5]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L2의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[8] 실시양태 [5]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L1 및 PD-L2 둘 다의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[9] 실시양태 [5]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 항체인, 약학 조성물.

[10] 실시양태 [5]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 니볼루맙(nivolumab), 람브롤리주맙(lambrolizumab)(펨브롤리주맙(pembrolizumab)) 및 피딜리주맙(pidilizumab)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

[11] 실시양태 [2]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-L1 결합 길항제인, 약학 조성물.

[12] 실시양태 [11]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 PD-1의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[13] 실시양태 [11]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 B7-1의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[14] 실시양태 [11]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 PD-1 및 B7-1 둘 다의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[15] 실시양태 [12] 내지 [14] 중 어느 한 실시양태에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 항-PD-L1 항체인, 약학 조성물.

[16] 실시양태 [11]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 YW243.55.S70, 아테졸리주맙(Atezolizumab), MPDL3280A, MDX-1105, 아벨루맙(avelumab) 및 MEDI4736(두르발루맙(durvalumab))으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

[17] 실시양태 [15]에 있어서, 항-PD-L1 항체가 서열번호 19의 HVR-H1 서열, 서열번호 20의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 21의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 22의 HVR-L1 서열, 서열번호 23의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 24의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.

[18] 실시양태 [15]에 있어서, 항-PD-L1 항체가 서열번호 25 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.

[19] 실시양태 [3]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-L2 결합 길항제인, 약학 조성물.

[20] 실시양태 [19]에 있어서, PD-L2 결합 길항제가 항체인, 약학 조성물.

[21] 실시양태 [19]에 있어서, PD-L2 결합 길항제가 이뮤노어드헤신(immunoadhesin)인, 약학 조성물.

[22] 실시양태 [1] 내지 [21] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가 서열번호 34의 HVR-H1 서열, 서열번호 35의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 36의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 37의 HVR-L1 서열, 서열번호 38의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 39의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.

[23] 실시양태 [1] 내지 [21] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가, 제2 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 상기 제2 항체가 서열번호 42의 HVR-H1 서열, 서열번호 43의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 44의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 45의 HVR-L1 서열, 서열번호 46의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 47의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.

[24] 실시양태 [1] 내지 [23] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가 인간화된 항체인, 약학 조성물.

[25] 실시양태 [24]에 있어서, 항-GPC3 항체가 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.

[26] 실시양태 [1] 내지 [25] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 결장암, 신장암, 식도암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

본 발명은 하기 실시양태들도 제공한다:

[27] 항-GPC3 항체와 병용되는, 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 약학 조성물로서, PD-1 축 결합 길항제를 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물.

[28] 실시양태 [27]에 있어서, 항-GPC3 항체가 PD-1 축 결합 길항제의 투여 전에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여와 동시에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여 후에 투여되는, 약학 조성물.

[29] 실시양태 [27] 또는 [28]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

[30] 실시양태 [29]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제인, 약학 조성물.

[31] 실시양태 [30]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 그의 리간드 결합 파트너의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[32] 실시양태 [31]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L1의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[33] 실시양태 [31]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L2의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[34] 실시양태 [31]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L1 및 PD-L2 둘 다의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[35] 실시양태 [31]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 항체인, 약학 조성물.

[36] 실시양태 [31]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 니볼루맙, 람브롤리주맙(펨브롤리주맙) 및 피딜리주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

[37] 실시양태 [28]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-L1 결합 길항제인, 약학 조성물.

[38] 실시양태 [37]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 PD-1의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[39] 실시양태 [37]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 B7-1의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[40] 실시양태 [37]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 PD-1 및 B7-1 둘 다의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[41] 실시양태 [38] 내지 [40] 중 어느 한 실시양태에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 항-PD-L1 항체인, 약학 조성물.

[42] 실시양태 [37]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 YW243.55.S70, 아테졸리주맙, MPDL3280A, MDX-1105, 아벨루맙 및 MEDI4736(두르발루맙)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

[43] 실시양태 [41]에 있어서, 항-PD-L1 항체가 서열번호 19의 HVR-H1 서열, 서열번호 20의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 21의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 22의 HVR-L1 서열, 서열번호 23의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 24의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.

[44] 실시양태 [41]에 있어서, 항-PD-L1 항체가 서열번호 25 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.

[45] 실시양태 [29]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-L2 결합 길항제인, 약학 조성물.

[46] 실시양태 [45]에 있어서, PD-L2 결합 길항제가 항체인, 약학 조성물.

[47] 실시양태 [45]에 있어서, PD-L2 결합 길항제가 이뮤노어드헤신인, 약학 조성물.

[48] 실시양태 [27] 내지 [47] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가 서열번호 34의 HVR-H1 서열, 서열번호 35의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 36의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 37의 HVR-L1 서열, 서열번호 38의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 39의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.

[49] 실시양태 [27] 내지 [47] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가, 제2 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 상기 제2 항체가 서열번호 42의 HVR-H1 서열, 서열번호 43의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 44의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 45의 HVR-L1 서열, 서열번호 46의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 47의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.

[50] 실시양태 [27] 내지 [49] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가 인간화된 항체인, 약학 조성물.

[51] 실시양태 [50]에 있어서, 항-GPC3 항체가 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.

[52] 실시양태 [27] 내지 [51] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 결장암, 신장암, 식도암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

본 발명은 하기 실시양태들도 제공한다:

[53] 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 약학 조성물로서, PD-1 축 결합 길항제와 항-GPC3 항체의 조합물을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물.

[54] 실시양태 [53]에 있어서, 조합 제제인 약학 조성물.

[55] 실시양태 [53]에 있어서, 항-GPC3 항체가 PD-1 축 결합 길항제의 투여 전에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여와 동시에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여 후에 투여되는, 약학 조성물.

[56] 실시양태 [53] 또는 [55]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

[57] 실시양태 [56]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제인, 약학 조성물.

[58] 실시양태 [57]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 그의 리간드 결합 파트너의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[59] 실시양태 [58]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L1의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[60] 실시양태 [58]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L2의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[61] 실시양태 [58]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L1 및 PD-L2 둘 다의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[62] 실시양태 [58]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 항체인, 약학 조성물.

[63] 실시양태 [58]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 니볼루맙, 람브롤리주맙(펨브롤리주맙) 및 피딜리주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

[64] 실시양태 [55]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-L1 결합 길항제인, 약학 조성물.

[65] 실시양태 [64]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 PD-1의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[66] 실시양태 [64]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 B7-1의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[67] 실시양태 [64]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 PD-1 및 B7-1 둘 다의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

[68] 실시양태 [65] 내지 [67] 중 어느 한 실시양태에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 항-PD-L1 항체인, 약학 조성물.

[69] 실시양태 [64]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 YW243.55.S70, 아테졸리주맙, MPDL3280A, MDX-1105, 아벨루맙 및 MEDI4736(두르발루맙)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

[70] 실시양태 [68]에 있어서, 항-PD-L1 항체가 서열번호 19의 HVR-H1 서열, 서열번호 20의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 21의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 22의 HVR-L1 서열, 서열번호 23의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 24의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.

[71] 실시양태 [68]에 있어서, 항-PD-L1 항체가 서열번호 25 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.

[72] 실시양태 [56]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-L2 결합 길항제인, 약학 조성물.

[73] 실시양태 [72]에 있어서, PD-L2 결합 길항제가 항체인, 약학 조성물.

[74] 실시양태 [72]에 있어서, PD-L2 결합 길항제가 이뮤노어드헤신인, 약학 조성물.

[75] 실시양태 [53] 내지 [74] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가 서열번호 34의 HVR-H1 서열, 서열번호 35의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 36의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 37의 HVR-L1 서열, 서열번호 38의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 39의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.

[76] 실시양태 [53] 내지 [74] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가, 제2 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 상기 제2 항체가 서열번호 42의 HVR-H1 서열, 서열번호 43의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 44의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 45의 HVR-L1 서열, 서열번호 46의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 47의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.

[77] 실시양태 [53] 내지 [76] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가 인간화된 항체인, 약학 조성물.

[78] 실시양태 [77]에 있어서, 항-GPC3 항체가 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.

[79] 실시양태 [53] 내지 [78] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 결장암, 신장암, 식도암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

본 발명은 하기 실시양태들도 제공한다:

[80] PD-1 축 결합 길항제와 병용되는, 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 약학 조성물로서, 항-GPC3 항체를 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물.

[81] 항-GPC3 항체와 병용되는, 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 약학 조성물로서, PD-1 축 결합 길항제를 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물.

[82] 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 약학 조성물로서, PD-1 축 결합 길항제와 항-GPC3 항체의 조합물을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물.

[83] 실시양태 [80] 내지 [82] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가 PD-1 축 결합 길항제의 투여 전에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여와 동시에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여 후에 투여되는, 약학 조성물.

[84] 실시양태 [80] 내지 [83] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 결장암, 신장암, 식도암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.

본 발명은 하기 실시양태들을 제공한다:

[85] 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법으로서, 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.

[86] 실시양태 [85]에 있어서, 항-GPC3 항체가 PD-1 축 결합 길항제의 투여 전에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여와 동시에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여 후에 투여되는, 방법.

[87] 실시양태 [85] 또는 [86]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.

[88] 실시양태 [87]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제인, 방법.

[89] 실시양태 [88]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 그의 리간드 결합 파트너의 결합을 억제하는, 방법.

[90] 실시양태 [89]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L1의 결합을 억제하는, 방법.

[91] 실시양태 [89]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L2의 결합을 억제하는, 방법.

[92] 실시양태 [89]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 PD-1과 PD-L1 및 PD-L2 둘 다의 결합을 억제하는, 방법.

[93] 실시양태 [89]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 항체인, 방법.

[94] 실시양태 [89]에 있어서, PD-1 결합 길항제가 니볼루맙, 람브롤리주맙(펨브롤리주맙) 및 피딜리주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.

[95] 실시양태 [81]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-L1 결합 길항제인, 방법.

[96] 실시양태 [95]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 PD-1의 결합을 억제하는, 방법.

[97] 실시양태 [95]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 B7-1의 결합을 억제하는, 방법.

[98] 실시양태 [95]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 PD-1 및 B7-1 둘 다의 결합을 억제하는, 방법.

[99] 실시양태 [96] 내지 [98] 중 어느 한 실시양태에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 항-PD-L1 항체인, 방법.

[100] 실시양태 [95]에 있어서, PD-L1 결합 길항제가 YW243.55.S70, 아테졸리주맙, MPDL3280A, MDX-1105, 아벨루맙 및 MEDI4736(두르발루맙)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.

[101] 실시양태 [99]에 있어서, 항-PD-L1 항체가 서열번호 19의 HVR-H1 서열, 서열번호 20의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 21의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 22의 HVR-L1 서열, 서열번호 23의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 24의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 방법.

[102] 실시양태 [99]에 있어서, 항-PD-L1 항체가 서열번호 25 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.

[103] 실시양태 [87]에 있어서, PD-1 축 결합 길항제가 PD-L2 결합 길항제인, 방법.

[104] 실시양태 [103]에 있어서, PD-L2 결합 길항제가 항체인, 방법.

[105] 실시양태 [103]에 있어서, PD-L2 결합 길항제가 이뮤노어드헤신인, 방법.

[106] 실시양태 [85] 내지 [105] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가 서열번호 34의 HVR-H1 서열, 서열번호 35의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 36의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 37의 HVR-L1 서열, 서열번호 38의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 39의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 방법.

[107] 실시양태 [85] 내지 [105] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가, 제2 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 상기 제2 항체가 서열번호 42의 HVR-H1 서열, 서열번호 43의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 44의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 45의 HVR-L1 서열, 서열번호 46의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 47의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 방법.

[108] 실시양태 [85] 내지 [107] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가 인간화된 항체인, 방법.

[109] 실시양태 [108]에 있어서, 항-GPC3 항체가 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.

[110] 실시양태 [85] 내지 [109] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 결장암, 신장암, 식도암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.

본 발명은 하기 실시양태들도 제공한다:

[111] PD-1 축 결합 길항제와 병용되는, 항-GPC3 항체를 활성 성분으로서 포함하는 조성물로 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법.

[112] 항-GPC3 항체와 병용되는, PD-1 축 결합 길항제를 활성 성분으로서 포함하는 조성물로 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법.

[113] PD-1 축 결합 길항제와 항-GPC3 항체의 조합물을 활성 성분으로서 포함하는 조성물로 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법.

[114] 실시양태 [111] 내지 [113] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-GPC3 항체가 PD-1 축 결합 길항제의 투여 전에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여와 동시에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여 후에 투여되는, 방법.

[115] 실시양태 [111] 내지 [114] 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암이 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 결장암, 신장암, 식도암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.

본 발명은 하기 실시양태들을 제공한다:

[116] 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 조합물로서, PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 포함하는 조합물.

[117] 실시양태 [116]에 있어서, 항-GPC3 항체가 PD-1 축 결합 길항제의 투여 전에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여와 동시에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제의 투여 후에 투여되는, 조합물.

[118] 실시양태 [116] 또는 [117]에 있어서, 암이 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 결장암, 신장암, 식도암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조합물.

본 발명은 하기 실시양태들도 제공한다:

[119] (1) 항-GPC3 항체를 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물, (2) 용기, 및 (3) 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위해 PD-1 축 결합 길항제와 함께 약학 조성물을 투여하는 것에 대한 설명서를 포함하는 포장 삽지 또는 표지를 포함하는 키트.

[120] PD-1 축 결합 길항제를 활성 성분으로서 포함하는 제1 약학 조성물, 및 항-GPC3 항체를 활성 성분으로서 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하는 키트.

[121] 실시양태 [119] 또는 [120]에 있어서, 암이 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 결장암, 신장암, 식도암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 키트.

본 발명은 하기 실시양태들도 제공한다:

[122] 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 약제의 제조에 있어서 PD-1 축 결합 길항제의 용도로서, 상기 약제가 PD-1 축 결합 길항제 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 치료가 항-GPC3 항체 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 함께 상기 약제를 투여하는 단계를 포함하는, 용도.

[123] 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 약제의 제조에 있어서 항-GPC3 항체의 용도로서, 상기 약제가 항-GPC3 항체 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 치료가 PD-1 축 결합 길항제 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 함께 상기 약제를 투여하는 단계를 포함하는, 용도.

본 발명자들은 항-GPC3 항체를 인간 PD-1 축 결합 길항제와 병용함으로써 이러한 항-GPC3 항체 또는 인간 PD-1 축 결합 길항제가 단독으로 사용될 때보다 더 우수한 치료 효과를 암 환자에서 달성할 수 있다는 것을 발견하였다.

또 다른 양태에서, 본원은 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법으로서, 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본원은 암을 가진 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법으로서, 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응은 대식세포 및 다핵 거대세포를 포함하는 면역세포가 종양 조직 내로 침윤되는 것을 포함한다. 또 다른 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응이 종양 침윤된 림프구(TIL)에서의 CD45-양성 림프구, CD3ε-양성 림프구 및 CD8-양성 T 림프구의 증가를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본원은 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 약제의 제조에 있어서 인간 PD-1 축 결합 길항제의 용도로서, 상기 약제가 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 치료가 항-GPC3 항체 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 함께 상기 약제를 투여하는 단계를 포함하는, 용도를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본원은 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 약제의 제조에 있어서 항-GPC3 항체의 용도로서, 상기 약제가 항-GPC3 항체 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 치료가 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 함께 상기 약제를 투여하는 단계를 포함하는, 용도를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본원은 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 데 사용될, 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로서, 상기 치료가 제2 조성물과 함께 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제2 조성물이 항-GPC3 항체 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본원은 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 데 사용될, 항-GPC3 항체 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로서, 상기 치료가 제2 조성물과 함께 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제2 조성물이 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본원은 PD-1 축 결합 길항제 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제, 및 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위해 항-GPC3 항체 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 함께 상기 약제를 투여하기 위한 설명서를 포함하는 포장 삽지를 포함하는 키트를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본원은 PD-1 축 결합 길항제 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제1 약제, 및 항-GPC3 항체 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제2 약제를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위해 제1 약제 및 제2 약제를 투여하기 위한 설명서를 포함하는 포장 삽지를 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 본원은 항-GPC3 항체 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제, 및 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위해 PD-1 축 결합 길항제 및 임의적 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 함께 상기 약제를 투여하기 위한 설명서를 포함하는 포장 삽지를 포함하는 키트를 제공한다.

앞서 및 본원에 기재된 방법, 용도, 조성물 및 키트의 일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv 및 Fv로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제이다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1과 그의 리간드 결합 파트너의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1과 PD-L1의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1과 PD-L2의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1과 PD-L1 및 PD-L2 둘 다의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 MDX-1106(니볼루맙), MK-3475(펨브롤리주맙, 람브롤리주맙), CT-011(피딜리주맙), PDR001, REGN2810, BGB A317, SHR-1210, AMP-514(MEDI0680) 및 AMP-224로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-L1 결합 길항제이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1과 PD-1의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1과 B7-1의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1과 PD-1 및 B7-1 둘 다의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 YW243.55.S70, 아테졸리주맙, MPDL3280A, MDX-1105, 아벨루맙 및 MEDI4736(두르발루맙)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 19의 HVR-H1 서열, 서열번호 20의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 21의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열번호 22의 HVR-L1 서열, 서열번호 23의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 24의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 25 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 참고로 도입되는 PCT 특허출원 공개 제WO2010/077634호 및 미국 특허 제8,217,149호에 기재된 항체 YW243.55.S70의 3개 중쇄 HVR 서열 및/또는 항체 YW243.55.S70의 3개 경쇄 HVR 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 항체 YW243.55.S70의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 항체 YW243.55.S70의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다.

일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-L2 결합 길항제이다. 일부 실시양태에서, PD-L2 결합 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, PD-L2 결합 길항제는 이뮤노어드헤신이다.

앞서 및 본원에 기재된 방법, 용도, 조성물 및 키트의 일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv 및 Fv로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 GC33 또는 코드리투주맙(codrituzumab)이다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 서열번호 42의 HVR-H1 서열, 서열번호 43의 HVR-H2 서열, 및 서열번호 44의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열번호 45의 HVR-L1 서열, 서열번호 46의 HVR-L2 서열, 및 서열번호 47의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 임의의 다른 실시양태와 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 GC33 또는 코드리투주맙이 아니다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체(예를 들면, PD-1 축 결합 길항제 항체 또는 항-GPC3 항체)는 아글리코실화(aglycosylation) 부위 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아글리코실화 부위 돌연변이는 치환 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 치환 돌연변이는 아미노산 잔기 N297, L234, L235 및/또는 D265(EU 넘버링)에 존재한다. 일부 실시양태에서, 치환 돌연변이는 N297G, N297A, L234A, L235A 및 D265A로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 치환 돌연변이는 D265A 돌연변이 및 N297G 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 아글리코실화 부위 돌연변이는 항체의 이펙터 기능을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제(예를 들면, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 항-PD-L2 항체)는 EU 넘버링에 따른 위치 297에서 Ala로의 Asn의 치환을 가진 인간 IgG1이다.

앞서 및 본원에 기재된 방법, 용도, 조성물 및 키트의 일부 실시양태에서, 암은 GPC3-양성 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 결장암, 신장암, 식도암, 전립선암 또는 본원에 기재된 다른 암이다. 일부 실시양태에서, 개체는 암을 갖거나 암으로 진단받았다. 일부 실시양태에서, 개체 내의 암세포는 PD-L1을 발현한다.

앞서 및 본원에 기재된 방법, 용도, 조성물 및 키트의 일부 실시양태에서, 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체의 치료 또는 투여는 치료의 중단 후 개체에서 지속된 반응을 일으킨다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 PD-1 축 결합 길항제 전에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제와 동시에 투여되거나, PD-1 축 결합 길항제 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체는 동일한 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체는 별개의 조성물에 존재한다.

앞서 및 본원에 기재된 방법, 용도, 조성물 및 키트의 일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제 및/또는 항-GPC3 항체는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 안구내, 이식, 흡입, 경막내, 뇌실내 또는 코내로 투여된다. 앞서 및 본원에 기재된 방법, 용도, 조성물 및 키트의 일부 실시양태에서, 치료는 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위해 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 사용한 병용치료 전에 화학요법제로 치료된다. 일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제 및/또는 항-GPC3 항체의 조합물로 치료된 개체는 화학요법제 치료에 대한 불응성을 나타낸다. 본원 전체에 기재된 방법, 용도, 조성물 및 키트의 일부 실시양태는 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위해 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

앞서 및 본원에 기재된 방법, 용도, 조성물 및 키트의 일부 실시양태에서, 개체에서 CD8 T 세포는 조합물의 투여 전에 비해 향상된 프라이밍, 활성화, 증식 및/또는 세포용해 활성을 가진다. 일부 실시양태에서, CD8 T 세포의 수는 조합물의 투여 전에 비해 향상된다. 일부 실시양태에서, CD8 T 세포는 항원 특이적 CD8 T 세포이다.

본원에 기재된 다양한 실시양태들의 한, 일부 또는 모든 성질은 조합되어 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 이들 양태들 및 다른 양태들은 당분야에서 숙련된 자에게 명확해질 것이다. 본 발명의 이들 실시양태들 및 다른 실시양태들은 하기 상세한 설명에 의해 더 기재된다.

도 1은 비히클 대조군, 또는 1 mg/kg 또는 5 mg/kg의 mGC33으로 매주 3회 치료받은 각각의 마우스에서 인간 GPC3을 발현하는 Hepa1-6 종양 부피 변화를 보여주는 도면이다. 화살표는 주사 날짜를 표시한다. 각각의 군당 5마리의 마우스들을 치료하였다.
도 2a는 비히클 대조군 또는 5 mg/kg의 mGC33으로 치료받은 마우스로부터 단리된 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색(HE) 또는 F4/80 면역-조직화학적 염색(IHC)의 영상을 보여주는 도면이다.
도 2b는 비히클 대조군 또는 5 mg/kg의 mGC33으로 치료받은 마우스로부터 단리된 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색(HE) 또는 PD-L1 면역-조직화학적 염색(IHC)의 영상을 보여주는 도면이다. 화살표는 침윤된 면역세포의 세포막에서 관찰된 PD-L1 면역반응성을 표시한다.
도 3a는 단일요법(mGC33 또는 10F.9G2(항-PD-L1)) 또는 조합물(mGC33 + 10F.9G2)로 치료받은 각각의 마우스에서 인간 GPC3을 발현하는 CT26 종양 부피 변화를 보여주는 도면이다. 화살표는 주사 날짜를 표시한다. 군당 5마리의 마우스들을 치료하였다. 각각의 군에서의 종양 부피의 평균 및 SD 막대를 작도하였다.
도 3b는 단일요법(mGC33 또는 10F.9G2(항-PD-L1)) 또는 조합물(mGC33 + 10F.9G2)로 치료받은 CT26/hGPC3 보유 마우스에서 무진행 생존율을 보여주는 도면이다. 종양 크기가 100 mm³ 초과의 수준에 도달하였을 때 진행이 정의되었다.
도 4a는 단일요법 또는 조합물로 치료받은 각각의 마우스에서 인간 GPC3을 발현하는 CT26 종양 부피 변화를 보여주는 도면이다. 화살표는 주사 날짜를 표시한다. 군당 5마리의 마우스들을 치료하였다. 각각의 군에서의 종양 부피의 평균 및 SD 막대를 작도하였다. 5 mg/kg 또는 25 mg/kg의 mGC33, 10F.9G2, 5 mg/kg 또는 25 mg/kg의 mGC33 + 10F.9G2의 종양 성장 억제 값은 각각 52%, 58%, 68%, 75% 및 85%였다.
도 4b는 29일째 날 개별 종양 부피를 보여주는 도면이다. 각각의 군에서 종양 부피의 평균(*)도 작도하였다.
도 5a는 비히클 대조군, 1 mg/kg, 5 mg/kg 또는 25 mg/kg의 mGC33 또는 10F.9G2, 또는 5 mg/kg 또는 25 mg/kg의 GC33과 10F.9G2의 조합물로 치료받은 각각의 마우스에서 인간 GPC3을 발현하는 Hepa1-6 종양 부피 변화를 보여주는 도면이다. 화살표는 주사 날짜를 표시한다. 각각의 군당 5마리의 마우스들을 치료하였다.
도 5b는 34일째 날 각각의 치료군에서 개별 종양 면역 또는 종양 면적의 평균 + SD를 보여주는 도면이다. 각각의 마우스로부터 단리된 종양 조직의 HE 염색 후 (종양 조직의 장축 길이(mm)) x (종양 조직의 단축 길이(mm))로 종양 면적(mm²)을 계산하였다. 각각의 종양 조직의 병리학적 평가의 결과를 그래프의 하부에 추가하였다. 질환의 병리학적 진행(pPD)을 "종양 퇴행이 인지되지 않았음"으로서 정의하였다. 병리학적 부분적 퇴행(pPR)을 "면역세포 침윤을 가진 종양 세포의 변성 및/또는 괴사가 인지되었음"으로서 정의하였다. 병리학적 완전 퇴행(pCR)을 "종양 이식 부위에서 종양 세포가 인지되지 않았음"으로서 정의하였다.
도 6a는 표시된 다양한 용량 수준 및 일정으로 단일요법 또는 mGC33과 6E11(항-PD-L1)의 병용으로 치료받은 각각의 마우스에서 인간 GPC3을 발현하는 Hepa1-6 종양 부피 변화를 보여주는 도면이다. 화살표는 주사 날짜를 표시한다. 각각의 군당 5마리의 마우스들을 치료하였다.
도 6b는 단일요법 또는 mGC33과 6E11의 병용으로 치료받은 각각의 마우스 군에서 인간 GPC3을 발현하는 Hepa1-6 종양 부피 변화의 평균 값을 보여주는 도면이다. 병용 군에서의 종양 성장은 GC33 또는 6E11 단일요법으로 치료받은 군에서의 종양 성장에 비해 유의하게 억제되었다. 화살표는 주사 날짜를 표시한다. 각각의 군당 5마리의 마우스들을 치료하였다. *: 윌콕손(Wilcoxon)(SAS 인스티튜트 인코포레이티드(Institute Inc.))에 의할 때 P < 0.05.
도 6c는 인간 GPC3을 발현하는 Hepa1-6을 보유하는 마우스의 각각의 치료군에서 체중 변화의 평균 값을 보여주는 도면이다. SD 막대가 추가되어 있다.
도 7은 각각의 군에서 피하조직 내의 종양 조직의 현미경사진을 보여주는 도면이다. 회색 영역은 괴사가 없는 종양 영역 또는 림프/과립화 조직을 표시한다. 청색 영역은 괴사가 있는 종양 영역 또는 과립화 조직을 표시한다. 점선은 질량의 경계를 표시한다. L은 림프 조직을 표시하고, G는 과립화 조직을 표시하고, pCR은 병리학적 완전 반응(조직병리학적 슬라이드 상에서의 종양 조직 부재)을 표시하고, MOR은 종양 진행에 의해 야기된 빈사 상태의 희생 동물을 표시한다.
도 8a는 각각의 치료군에서 간질(stroma)에 적응하는 덩어리의 주변부에서 HE 염색된 종양 조직의 대표적인 현미경사진을 보여주는 도면이다. 대식세포/다핵 거대세포를 비롯한 면역세포의 침윤을 가진 종양의 괴사는 모든 치료군들에서 인지된다. 병변의 중증도는 하기 순서와 같다: mGC33 5 mg/kg 단회 + 6E11 q7d x 3 > mGC33 5 mg/kg 단회 또는 6E11 q7d x 3. S는 간질 조절 종양 덩어리를 표시하고, P는 종양 덩어리의 주변부를 표시한다.
도 8b는 각각의 치료군에서 간질에 적응하는 덩어리의 주변부에서 종양 조직의 F4/80 IHC의 대표적인 현미경사진을 보여주는 도면이다. 비히클에서, F4/80-양성 세포는 간질에서 주로 인식된다. 다른 한편으로, 대식세포/다핵 거대세포를 비롯한 F4/80-양성 면역세포의 증가된 중증도는 모든 치료군들에서 종양 덩어리의 주변부에서 주로 인지된다. 양성 세포 침윤의 중증도는 하기 순서와 같다: mGC33 5 mg/kg 단회 + 6E11 q7d x 3 > mGC33 5 mg/kg 단회 또는 6E11 q7d x 3. S는 간질 조절 종양 덩어리를 표시하고, P는 종양 덩어리의 주변부를 표시한다.
도 8c는 각각의 치료군에서 간질에 적응하는 덩어리의 주변부에서 종양 조직의 PD-L1 IHC의 대표적인 현미경사진을 보여주는 도면이다. 비히클에서, PD-L1-양성 반응은 약한 강도로 종양 세포의 세포질에서 주로 인지된다. 다른 한편으로, 대식세포/다핵 거대세포를 비롯한 면역세포에서 PD-L1-양성 반응의 증가된 중증도는 모든 치료군들에서 약한 내지 중간 강도로 인지된다. S는 간질 조절 종양 덩어리를 표시하고, P는 종양 덩어리의 주변부를 표시한다.
도 9는 각각의 치료군에서 종양 조직에서 관찰된 마커-양성 세포의 백분율을 보여주는 도면이다. 각각의 군에서 개별 값 및 평균이 작도되어 있고, 평균 값이 각각의 그래프에 표시되어 있다.

본원의 데이터는 항-GPC3 항체와 항-PD-L1 면역 요법의 병용이 종양 성장의 억제를 향상시켰고 반응률을 증가시켰고 반응을 지속시켰다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 두 요법들의 병용의 이익을 입증하였다: T 세포 억제성 PD-1/PD-L1 신호전달의 억제와 함께 GPC3 발현 종양 세포에 대한 세포독성적 활성은 치료 효과를 향상시키고 장기간 반응을 지속시킨다.

한 양태에서, 본원은 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법, 조성물 및 용도를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본원은 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법, 조성물 및 용도를 제공한다. 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응은 대식세포 및 다핵 거대세포를 비롯한 면역세포가 종양 조직 내로 침윤되는 것을 포함한다. 또 다른 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응은 종양 침윤된 림프구(TIL)에서의 CD45-양성 림프구, CD3ε-양성 림프구 및 CD8-양성 T 림프구의 증가를 포함한다.

[I. 정의]

본 발명을 상세히 기술하기 전에, 본 발명은 당연히 변경될 수 있는 특정 조성물 또는 생물학적 시스템으로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이며, 한정하기 위한 것이 아니라는 것도 이해해야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형은 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "분자"의 언급은 임의적으로 2개 이상의 이러한 분자들의 조합물 등을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "약"은 본 기술 분야에서 숙련된 자에게 용이하게 공지되어 있는 각각의 값에 대한 통상의 오차 범위를 의미한다. 본원에서 "약" 값 또는 파라미터의 언급은 그 값 또는 파라미터 그 자체에 대한 실시양태를 포함한다(그리고 기술한다).

본원에 기재된 본 발명의 양태 및 실시양태는 양태 및 실시양태를 "포함하는", 또는 양태 및 실시양태로 "구성된" 및 "본질적으로 구성된"을 포함한다는 것이 이해된다.

용어 "PD-1 축 결합 길항제"는 PD-1 신호전달 축 상에서의 신호전달로부터 비롯한 T 세포 기능이상을 제거함으로써 T 세포 기능(예를 들면, 증식, 사이토카인 생성, 표적 세포 사멸)을 회복시키거나 향상시키도록 PD-1 축 결합 파트너와 하나 이상의 그의 결합 파트너의 상호작용을 억제하는 분자를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제를 포함한다.

용어 "PD-1 결합 길항제"는 PD-1과 하나 이상의 그의 결합 파트너, 예컨대, PD-L1 또는 PD-L2의 상호작용으로부터 비롯된 신호 전달도입을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 방해하는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1과 하나 이상의 그의 결합 파트너의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합을 억제한다. 예를 들면, PD-1 결합 길항제는 PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2의 상호작용으로부터 비롯된 신호 전달도입을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 방해하는 항-PD-1 항체, 이의 항원 결합 단편, 이뮤노어드헤신, 융합 단백질, 올리고펩티드 및 다른 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 기능이상적 T 세포의 기능이상을 낮추도록(예를 들면, 항원 인식에 대한 이펙터 반응을 향상시키도록) PD-1을 통한, T 림프구 상에서 발현된 세포 표면 단백질 매개 신호전달에 의해 또는 이러한 신호전달을 통해 매개된 음성 보조자극 신호를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체이다. 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 MDX-1106(니볼루맙)이다. 또 다른 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 MK-3475(람브롤리주맙)이다. 또 다른 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 CT-011(피딜리주맙)이다. 또 다른 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 AMP-224 또는 AMP-514(MEDI0680)이다. 또 다른 특정 양태에서, PD-1 길항제는 본원에 기재된 PDR001, REGN2810, BGB A317 및 SHR-1210으로 구성된 군으로부터 선택된다.

용어 "PD-L1 결합 길항제"는 PD-L1과 하나 이상의 그의 결합 파트너, 예컨대, PD-1 또는 B7-1의 상호작용으로부터 비롯된 신호 전달도입을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 방해하는 분자를 의미한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1과 그의 결합 파트너의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1과 PD-1 및/또는 B7-1의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1과 하나 이상의 그의 결합 파트너, 예컨대, PD-1 또는 B7-1의 상호작용으로부터 비롯된 신호 전달도입을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 방해하는 항-PD-L1 항체, 이의 항원 결합 단편, 이뮤노어드헤신, 융합 단백질, 올리고펩티드 및 다른 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 기능이상적 T 세포의 기능이상을 낮추도록(예를 들면, 항원 인식에 대한 이펙터 반응을 향상시키도록) PD-L1을 통한, T 림프구 상에서 발현된 세포 표면 단백질 매개 신호전달에 의해 또는 이러한 신호전달을 통해 매개된 음성 보조자극 신호를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 YW243.55.S70 또는 아테졸리주맙이다. 또 다른 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 MDX-1105이다. 또 다른 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 아벨루맙이다. 또 다른 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 MPDL3280A이다. 또 다른 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 MEDI4736(두르발루맙)이다.

용어 "PD-L2 결합 길항제"는 PD-L2와 하나 이상의 그의 결합 파트너, 예컨대, PD-1의 상호작용으로부터 비롯된 신호 전달도입을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 방해하는 분자를 의미한다. 일부 실시양태에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2와 하나 이상의 그의 결합 파트너의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2와 PD-1의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, PD-L2 길항제는 PD-L2와 하나 이상의 그의 결합 파트너, 예컨대, PD-1의 상호작용으로부터 비롯된 신호 전달도입을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 방해하는 항-PD-L2 항체, 이의 항원 결합 단편, 이뮤노어드헤신, 융합 단백질, 올리고펩티드 및 다른 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 기능이상적 T 세포의 기능이상을 낮추도록(예를 들면, 항원 인식에 대한 이펙터 반응을 향상시키도록) PD-L2를 통한, T 림프구 상에서 발현된 세포 표면 단백질 매개 신호전달에 의해 또는 이러한 신호전달을 통해 매개된 음성 보조자극 신호를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, PD-L2 결합 길항제는 이뮤노어드헤신이다.

면역 기능이상과 관련하여 용어 "기능이상"은 항원성 자극에 대한 감소된 면역 반응성의 상태를 의미한다. 상기 용어는 항원 인식이 일어날 수 있는 소진 및/또는 아네르기 둘 다의 공통된 요소를 포함하지만, 뒤이어 일어나는 면역 반응은 감염 또는 종양 성장을 조절하는 데 비효과적이다.

본원에서 사용된 용어 "기능이상"은 항원 인식에 대한 불응성 또는 비반응성, 구체적으로 항원 인식을 다운스트림 T 세포 이펙터 기능, 예컨대, 증식, 사이토카인 생성(예를 들면, IL-2) 및/또는 표적 세포 사멸로 해석하는 능력의 손상도 포함한다.

용어 "아네르기"는 T 세포 수용체를 통해 전달된 불완전한 또는 불충분한 신호(예를 들면, ras-활성화의 부재 하에서 세포내 Ca⁺²의 증가)로부터 비롯된 항원 자극에 대한 비반응성의 상태를 의미한다. T 세포 아네르기는 보조자극의 부재 하에서 항원에 의한 자극 시에도 발생하여, 세포가 심지어 보조자극의 환경에서도 항원에 의한 후속 활성화에 불응성을 갖게 할 수도 있다. 비반응성 상태는 종종 인터류킨-2의 존재에 의해 무효화될 수 있다. 아네르기성 T 세포는 클론 증폭을 겪지 않고/않거나 이펙터 기능을 획득한다.

용어 "소진"은 많은 만성 감염 및 암 동안 일어나는 지속된 TCR 신호전달로부터 발생된 T 세포 기능이상의 상태로서의 T 세포 소진을 의미한다. 이것은 불완전한 또는 부족한 신호전달을 통해 발생하는 것이 아니라 지속된 신호전달로부터 발생한다는 점에서 아네르기와 구별된다. 이것은 빈약한 이펙터 기능, 억제 수용체의 지속된 발현, 및 기능성 이펙터 또는 메모리 T 세포의 전사 상태와 상이한 전사 상태로 정의된다. 소진은 감염 및 종양의 최적 조절을 방해한다. 소진은 외인성 음성 조절 경로(예를 들면, 면역조절 사이토카인) 및 세포 내인성 음성 조절(보조자극) 경로(PD-1, B7-H3, B7-H4 등) 둘 다로부터 발생될 수 있다.

"T 세포 기능의 향상"은 지속된 또는 증폭된 생물학적 기능을 갖도록 T 세포를 유도하거나, 야기하거나 자극하거나, 소진된 또는 불활성 T 세포를 재생시키거나 재활성화시키는 것을 의미한다. T 세포 기능의 향상의 예에는 중재 전 수준에 비해 CD8+ T 세포로부터의 γ-인터페론의 증가된 분비, 증가된 증식 및 증가된 항원 반응성(예를 들면, 바이러스, 병원체 또는 종양 제거)이 포함된다. 한 실시양태에서, 향상의 수준은 적어도 50%, 대안적으로 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150% 또는 200%이다. 이 향상을 측정하는 방식은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다.

"T 세포 기능이상 장애"는 항원성 자극에 대한 감소된 반응성을 특징으로 하는 T 세포 장애 또는 질환이다. 특정 실시양태에서, T 세포 기능이상 장애는 PD-1을 통한 부적절한 증가된 신호전달과 구체적으로 관련되어 있는 장애이다. 또 다른 실시양태에서, T 세포 기능이상 장애는 T 세포가 아네르기 상태인 T 세포 기능이상 장애, 또는 T 세포가 사이토카인을 분비하거나, 증식하거나 세포용해적 활성을 발휘하는 감소된 능력을 가진 T 세포 기능이상 장애이다. 특정 양태에서, 감소된 반응성은 면역원을 발현하는 병원체 또는 종양의 비효과적 조절을 초래한다. T 세포 기능이상을 특징으로 하는 T 세포 기능이상 장애의 예에는 해결되지 않은 급성 감염, 만성 감염 및 종양 면역이 포함된다.

"종양 면역"은 종양이 면역 인식 및 제거를 회피하는 과정을 지칭한다. 따라서, 치료 개념으로서, 종양 면역은 이러한 회피가 약화될 때 "치료"되고, 종양은 면역 시스템에 의해 인식되고 공격을 받는다. 종양 인식의 예에는 종양 결합, 종양 수축 및 종양 제거가 포함된다.

"면역원성"은 면역 반응을 일으키는 특정 물질의 능력을 의미한다. 종양은 면역원성을 갖고 종양 면역원성의 향상은 면역 반응에 의한 종양 세포의 제거에 도움을 준다. 종양 면역원성의 향상의 예에는 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 사용한 치료가 포함된다.

"지속된 반응"은 치료의 중단 후 종양 성장의 감소에 대한 지속된 효과를 의미한다. 예를 들면, 종양 크기는 투여 단계의 시작 전 크기에 비해 동일하거나 더 작은 상태로 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지속된 반응은 치료 지속기간과 적어도 동일한 지속기간, 또는 치료 지속기간의 적어도 1.5배, 2.0배, 2.5배 또는 3.0배 길이의 지속기간을 가진다.

용어 "약학 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태로 존재하고 제형이 투여될 대상체에게 허용불가능한 독성을 나타내는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다. 이러한 제형은 멸균 상태이다. "약학적으로 허용가능한" 부형제(비히클, 첨가제)는 사용되는 유효 용량의 활성 성분을 제공하도록 대상체 포유동물에게 적절히 투여될 수 있는 부형제이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 임상 병리학 과정 동안 치료되는 개체 또는 세포의 천연 과정을 변경시키도록 디자인된 임상적 중재를 의미한다. 치료의 바람직한 효과는 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 완화 또는 경감, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함한다. 예를 들면, 개체는 암성 세포의 증식 감소(또는 파괴), 종양 성장의 감소, 질환으로부터 비롯된 증상의 감소, 질환을 앓고 있는 개체의 삶의 질의 증가, 질환의 치료를 위해 요구되는 다른 약물의 용량 감소 및/또는 개체의 생존의 연장을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 암과 관련된 하나 이상의 증상의 경감 또는 제거가 일어나는 경우 성공적으로 "치료"된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "질환의 진행을 지연시키는"은 질환(예컨대, 암)의 발생을 미루고/미루거나, 방해하고/방해하거나, 늦추고/늦추거나, 지연시키고/지연시키거나, 안정화시키고/안정화시키거나 연기하는 것을 의미한다. 이 지연은 병력 및/또는 치료되는 개체에 따라 다양한 길이의 시간 지연일 수 있다. 당분야에서 숙련된 자에게 자명한 바와 같이, 충분한 또는 상당한 지연은 개체가 질환을 발생시키지 않는다는 점에서 사실상 예방을 포괄할 수 있다. 예를 들면, 말기 암, 예컨대, 전이의 발생이 지연될 수 있다.

"유효량"은 특정 장애의 측정가능한 개선 또는 예방을 달성하기 위해 요구되는 적어도 최소량이다. 본원에서 유효량은 질환 상태, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 항체의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 치료적으로 유리한 효과가 치료의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 양이기도 하다. 예방적 용도의 경우, 유리한 또는 원하는 결과는 위험의 제거 또는 감소, 중증도의 경감, 또는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동 증상, 그의 합병증 및 질환의 발생 동안 호소하는 중간 병리학적 표현형을 비롯한 질환의 발병 지연과 같은 결과를 포함한다. 치료적 용도의 경우, 유리한 또는 원하는 결과는 질환으로부터 비롯된 하나 이상의 증상의 감소, 질환을 앓고 있는 개체의 삶의 질 증가, 질환을 치료하기 위해 요구되는 다른 약물의 용량 감소, 예컨대, 표적화를 통한 또 다른 약물의 효과 상승, 질환의 진행 지연 및/또는 생존 연장과 같은 임상 결과를 포함한다. 암 또는 종양의 경우, 유효량의 약물은 암세포의 수를 감소시키고/감소시키거나; 종양 크기를 감소시키고/감소시키거나; 말초 장기 내로의 암세포 침윤을 억제하고/억제하거나(즉, 어느 정도까지 지연시키거나 바람직하게는 중단시키고/중단시키거나); 종양 전이를 억제하고/억제하거나(즉, 어느 정도까지 지연시키고 바람직하게는 중단시키고/중단시키거나); 종양 성장을 어느 정도까지 억제하고/억제하거나; 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 경감시키는 데 효과를 가질 수 있다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 유효량은 예방적 또는 치유적 치료를 직접적으로 또는 간접적으로 달성하기에 충분한 양이다. 임상 환경에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물 또는 약학 조성물과 함께 달성될 수 있거나 달성될 수 없다. 따라서, "유효량"은 하나 이상의 치료제의 투여와 관련하여 고려될 수 있고, 단일 물질은 하나 이상의 다른 물질과 함께 바람직한 결과를 달성할 수 있거나 달성하는 경우 유효량으로 제공된 것으로 간주될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "와 함께"는 한 치료 방식 이외에 또 다른 치료 방식의 투여를 의미한다. 따라서, "와 함께"는 다른 치료 방식을 개체에게 투여하기 전, 동안 또는 후에 한 치료 방식을 투여하는 것을 의미한다.

"장애"는 포유동물이 해당 장애에 잘 걸리게 하는 병리학적 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 치료로부터 이익을 얻을 임의의 상태이다.

용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련되어 있는 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 종양이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "종양"은 모든 악성 또는 양성 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전구-암성 및 암성 세포 및 조직을 의미한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에서 지칭된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적인 상태를 의미하거나 기술한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프 악성종양이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예에는 편평세포암(예를 들면, 상피편평세포암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 비롯한 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암 및 위장간질암을 비롯한 위암 또는 복부암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 표피 산발성 흑색종, 악성 흑색점 흑색종, 말단 흑자 흑색종, 결절성 흑색종, 다발성 골수종 및 B 세포 림프종(저등급/소포성 비-호지킨 림프종(NHL); 소림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포성 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 비-절단된 소세포 NHL; 벌키 질환 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 포함함); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 골수모구성 백혈병; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라, 모반증과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종(예컨대, 뇌 종양과 관련된 부종), 메이그 증후군, 뇌암 및 두경부암, 및 관련 전이도 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의해 치료될 수 있는 암은 유방암, 대장암, 직장암, 비-소세포 폐암, 교모세포종, 비-호지킨 림프종(NHL), 신장세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종 및 다발성 골수종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위암, 대장암(CRC) 및 간세포 암종으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 비-소세포 폐암, 대장암, 교모세포종, 유방 암종 및 간세포 암종(이들 암들의 전이성 형태를 포함함)으로부터 선택된다.

본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포에 유해한(예를 들면, 세포 사멸을 야기하거나, 증식을 억제하거나 세포 기능을 다른 방식으로 방해하는) 임의의 물질을 의미한다. 세포독성제는 방사성 동위원소(예를 들면, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹², 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제; 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대, 핵용해성 효소; 및 독소, 예컨대, 소분자 독소, 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소(이들의 단편 및/또는 변이체를 포함함)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예시적인 세포독성제는 항-마이크로튜불제, 백금 배위 착물, 알킬화제, 항생제, 토포이소머라제 II 억제제, 항대사물질, 토포이소머라제 I 억제제, 호르몬 및 호르몬 유사체, 신호 전달도입 경로 억제제, 비-수용체 티로신 키나제 혈관신생 억제제, 면역치료제, 전구아폽토시스제, LDH-A의 억제제, 지방산 생합성의 억제제, 세포 주기 신호전달 억제제, HDAC 억제제, 프로테아좀 억제제 및 암 대사의 억제제로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 탁산이다. 한 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)이다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 백금 물질이다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 EGFR의 길항제이다. 한 실시양태에서, EGFR의 길항제는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민(예를 들면, 에를로티닙)이다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 RAF 억제제이다. 한 실시양태에서, RAF 억제제는 BRAF 및/또는 CRAF 억제제이다. 한 실시양태에서, RAF 억제제는 베무라페닙이다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 PI3K 억제제이다.

"화학요법제"는 질소 머스타드 유사체, 알킬 설포네이트, 에틸렌 이민, 니트로소우레아, 에폭사이드, 다른 알킬화제, 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 다른 항대사물질제, 빈카 알칼로이드 또는 유사체, 포도필로톡신 유도체, 캄프토테칸 유사체, 콜히친 유도체, 탁산, 다른 식물 알칼로이드 또는 천연 생성물, 악티노마이신, 안쓰라사이클린 또는 관련 물질, 다른 세포독성 항생제, 백금 화합물, 메틸하이드라진, 키나제 억제제, 효소, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 레티노이드, 면역 검사점 억제제, 항체 및 다른 분자적 표적 약물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화합물도 포함한다. 화학요법제의 예에는 에를로티닙(erlotinib)(TARCEVA(등록됨), 제넨텍(Genentech)/OSI 팜(Pharm.)), 보르테조밉(bortezomib)(VELCADE(등록됨), 밀레늄 팜(Millennium Pharm.)), 디설피람(disulfiram), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 살리노스포라마이드(salinosporamide) A, 카필조밉(carfilzomib), 17-AAG(겔다나마이신(geldanamycin)), 라디시콜(radicicol), 락테이트 데하이드로게나제(lactate dehydrogenase) A(LDH-A), 풀베스트란트(fulvestrant)(FASLODEX(등록됨), 아스트라제네카(AstraZeneca)), 수니팁(sunitib)(SUTENT(등록됨), 화이자(Pfizer)/수겐(Sugen)), 레트로졸(letrozole)(FEMARA(등록됨), 노바티스(Novartis)), 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate)(GLEEVEC(등록됨), 노바티스), 피나수네이트(finasunate)(VATALANIB(등록됨), 노바티스), 옥살리플라틴(oxaliplatin)(ELOXATIN(등록됨), 사노피(Sanofi)), 5-FU(5-플루오로우라실(fluorouracil)), 류코보린(leucovorin), 라파마이신(Rapamycin)(시롤리무스(Sirolimus), RAPAMUNE(등록됨), 와이어쓰(Wyeth)), 라파티닙(Lapatinib)(TYKERB(등록됨), GSK572016, 글락소 스미쓰 클라인(Glaxo Smith Kline)), 로나파밉(Lonafamib)(SCH 66336), 소라페닙(sorafenib)(NEXAVAR(등록됨), 바이엘 랩스(Bayer Labs)), 제피티닙(gefitinib)(IRESSA(등록됨), 아스트라제네카(AstraZeneca)), AG1478, 알킬화제, 예컨대, 티오테파(thiotepa) 및 CYTOXAN(등록됨) 사이클로스포스파마이드; 알킬 설포네이트, 예컨대, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘(aziridines), 예컨대, 벤조도파(benzodopa), 카보쿠온(carboquone), 메투레도파(meturedopa), 및 우레도파(uredopa); 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포라마이드(triethylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포라마이드(triethylenethiophosphoramide) 및 트리메틸로멜라민(trimethylomelamine)을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민(methylamelamines); 아세토게닌(acetogenins)(특히 불라타신(bullatacin) 및 불라타시논(bullatacinone)); 캄프토테신(camptothecin)(토포테칸(topotecan) 및 이리노테칸(irinotecan)을 포함함); 브리오스타틴(bryostatin); 칼리스타틴(callystatin); CC-1065(그의 아도젤레신(adozelesin), 카젤레신(carzelesin) 및 비젤레신(bizelesin) 합성 유사체를 포함함); 크립토파이신(cryptophycins)(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8을 포함함); 아드레노코르티코스테로이드(adrenocorticosteroids)(프레드니손(prednisone) 및 프레드니솔론(prednisolone)을 포함함); 사이프로테론(cyproterone) 아세테이트; 피나스테라이드(finasteride) 및 두타스테라이드(dutasteride)를 포함하는 5α-리덕타제); 보리노스타트(vorinostat), 로미뎁신(romidepsin), 파노비노스타트(panobinostat), 발프로산(valproic acid), 모세티노스타트 돌라스타틴(mocetinostat dolastatin); 알데스류킨(aldesleukin), 탈크 듀오카마이신(talc duocarmycin)(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함함); 엘류테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴(pancratistatin); 사르코딕티인(sarcodictyin); 스폰기스타틴(spongistatin); 질소 머스타드, 예컨대, 클로람부실(chlorambucil), 클로마파진(chlomaphazine), 클로로포스파마이드(chlorophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파마이드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란(melphalan), 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파마이드(trofosfamide), 우라실 머스타드; 니트로소우레아(nitrosoureas), 예컨대, 카무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine) 및 라님누스틴(ranimnustine); 항생제, 예컨대, 에네디인(enediyne) 항생제(예를 들면, 칼리케아미신(calicheamicin), 특히 칼리케아미신 γ1I 및 칼리케아미신 ω1I(Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 1994 33: 183-186); 다이네미신(dynemicin) A를 포함하는 다이네미신; 비스포스포네이트, 예컨대, 클로드로네이트(clodronate); 에스퍼라미신(esperamicin); 및 네오카지노 스타틴(neocarzino statin) 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신(aclacinomysins), 악티노마이신(actinomycin), 아우쓰라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycins), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카미노마이신(caminomycin), 카지노필린(carzinophilin), 크로모마이시니스(chromomycinis), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN(등록됨)(독소루비신), 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycins), 예컨대, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포르피로마이신(porfiromycin), 푸로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투버시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 항-대사물질, 예컨대, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대, 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트, 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate); 푸린 유사체, 예컨대, 플루다라빈(fludarabine), 6-머캡토푸린, 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine); 피리미딘 유사체, 예컨대, 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카모푸르(carmofur), 사이타라빈(cytarabine), 다이데옥시우리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine); 안드로겐, 예컨대, 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone); 항-아드레날, 예컨대, 아미노글루테티마이드(aminoglutethimide), 미토탄(mitotane), 트릴로스탄(trilostane); 엽산 보충제, 예컨대, 프롤린산; 아세글라톤(aceglatone); 알도포스파마이드(aldophosphamide) 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실(eniluracil); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트렉세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 다이아지쿠온(diaziquone); 엘포미틴(elfomithine); 엘립티늄(elliptinium) 아세테이트; 에포틸론(epothilone); 에토글루시드(etoglucid); 갈륨(gallium) 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난(lentinan); 로니다이닌(lonidainine); 메이탄시노이드(maytansinoids), 예컨대, 메이탄신(maytansine) 및 안사미토신(ansamitocins); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피담놀(mopidamnol); 니트래린(nitraerine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 로속산트론(losoxantrone); 포도필린산(podophyllinic acid); 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진(procarbazine); PSK(등록됨) 폴리사카라이드 복합체(JHS 내추럴 프로덕츠(Natural Products), 미국 오레곤주 유진 소재); 라족산(razoxane); 리족신(rhizoxin); 시조푸란(sizofuran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지쿠온(triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(trichothecenes)(특히 T-2 독소, 베라쿠린(verracurin) A, 로리딘(roridin) A 및 안구이딘(anguidine)); 우레탄(urethan); 빈데신(vindesine); 다카바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가사이토신(gacytosine); 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파(thiotepa); 탁소이드(taxoids), 예를 들면, TAXOL(파클리탁셀; 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재), ABRAXANE(등록됨)(크레모포르(Cremophor) 무함유), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(어메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 미국 일리노이주 샤움버그 소재), 및 TAXOTERE(등록됨)(도세탁셀, 독세탁셀(doxetaxel); 사노피-아벤티스); 클로람부실; GEMZAR(등록됨)(겜시타빈(gemcitabine)); 6-티오구아닌(thioguanine); 머캡토푸린(mercaptopurine); 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대, 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE(등록됨)(비노렐빈(vinorelbine)); 노반트론(novantrone); 테니포사이드(teniposide); 에다트렉세이트(edatrexate); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 카페시타빈(capecitabine)(XELODA(등록됨)); 이반드로네이트(ibandronate); CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대, 레티노산; 및 상기 화학요법제들 중 임의의 화학요법제의 약학적으로 허용가능한 염, 산 및 유도체가 포함된다.

화학요법제는 항체, 예컨대, 알렘투주맙(alemtuzumab)(Campath), 베바시주맙(bevacizumab)(AVASTIN(등록됨), 제넨텍); 세툭시맙(cetuximab)(ERBITUX(등록됨), 임클론(Imclone)); 파니투무맙(panitumumab)(VECTIBIX(등록됨), 암젠(A mgen)), 리툭시맙(rituximab)(RITUXAN(등록됨), 제넨텍/바이오겐 아이덱(Biogen Idec)), 퍼투주맙(pertuzumab)(OMNITARG(등록됨), 2C4, 제넨텍), 트라스투주맙(trastuzumab)(HERCEPTIN(등록됨), 제넨텍), 토시투모맙(tositumomab)(Bexxar, 코릭시아(Corixia)), 및 항체 약물 접합체, 겜투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin)(MYLOTARG(등록됨), 와이어쓰)도 포함한다. 본 발명의 화합물과 함께 약제로서 치료적 잠재력을 가진 추가 인간화된 단일클론 항체는 아폴리주맙(apolizumab), 아셀리주맙(aselizumab), 아틀리주맙(atlizumab), 바피뉴주맙(bapineuzumab), 비바투주맙(bivatuzumab) 메르탄신(mertansine), 칸투주맙(cantuzumab) 메르탄신), 세델리주맙(cedelizumab), 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 시드푸시투주맙(cidfusituzumab), 시드투주맙(cidtuzumab), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 에프라투주맙(epratuzumab), 에를리주맙(erlizumab), 펠비주맙(felvizumab), 폰톨리주맙(fontolizumab), 겜투주맙(gemtuzumab) 오조가미신(ozogamicin), 이노투주맙(inotuzumab) 오조가미신, 이필리무맙(ipilimumab), 라베투주맙(labetuzumab), 린투주맙(lintuzumab), 마투주맙(matuzumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 모타비주맙(motavizumab), 모토비주맙(motovizumab), 나탈리주맙(natalizumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 놀로비주맙(nolovizumab), 누마비주맙(numavizumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 파스콜리주맙(pascolizumab), 펙푸시투주맙(pecfusituzumab), 펙투주맙(pectuzumab), 펙셀리주맙(pexelizumab), 랄리비주맙(ralivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 레슬리비주맙(reslivizumab), 레슬리주맙(reslizumab), 레시비주맙(resyvizumab), 로벨리주맙(rovelizumab), 루플리주맙(ruplizumab), 시브로투주맙(sibrotuzumab), 시플리주맙(siplizumab), 손투주맙(sontuzumab), 타카투주맙 테트락세탄(tacatuzumab tetraxetan), 타도시주맙(tadocizumab), 탈리주맙(talizumab), 테피바주맙(tefibazumab), 토실리주맙(tocilizumab), 토랄리주맙(toralizumab), 투코투주맙 셀모류킨(tucotuzumab celmoleukin), 투쿠시투주맙(tucusituzumab), 우마비주맙(umavizumab), 우르톡사주맙(urtoxazumab), 유스테키누맙(ustekinumab), 비실리주맙(visilizumab), 및 인터류킨-12 p40 단백질을 인식하도록 유전적으로 변경된 재조합 배타적 인간 서열 전장 IgG1 λ 항체인 항-인터류킨-12(ABT-874/J695, 와이어쓰 리서치 및 애보트 래보라토리스(Wyeth Research and Abbott Laboratories))를 포함한다.

본원에서 사용될 때 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 한 실시양태에서, 성장 억제제는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 방해하거나 감소시키는 성장 억제 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 성장 억제제는 S-기에서의 세포의 백분율을 유의하게 감소시키는 성장 억제제일 수 있다. 성장 억제제의 예에는 (S-기 이외의 단계에서) 세포 주기 진행을 차단하는 물질, 예컨대, G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 물질이 포함된다. 고전적인 M-기 차단제는 빈카스(vincas)(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포사이드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 물질, 예를 들면, DNA 알킬화제, 예컨대, 타목시펜, 프레드니손, 다카바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S-기 정지로도 넘어온다. 추가 정보는 문헌(Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), e.g., p. 13)에서 발견될 수 있다. 탁산(파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목 나무로부터 유래한 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유래한 도세탁셀(TAXOTERE(등록됨), 롱-프랑 로라(Rhone-Poulenc Rorer))은 파클리탁셀의 반합성 유도체(TAXOL(등록됨), 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb))이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 마이크로튜불의 조립을 촉진하고 탈중합을 방해함으로써 마이크로튜불을 안정화시켜, 세포에서 유사분열을 억제한다.

"방사선 요법"은 정상적으로 작용하거나 함께 세포를 파괴하는 그의 능력을 한정하도록 세포에 대한 충분한 손상을 유도하기 위한 유도된 감마 선 또는 베타 선의 사용을 의미한다. 치료의 용량 및 지속시간을 결정하는 많은 방식들이 당분야에서 공지되어 있을 것임이 인식될 것이다. 전형적인 치료는 1회 투여로서 제공되고 전형적인 용량은 일당 10 내지 200 유닛(그레이(Grays))이다.

치료를 목적으로 하는 "대상체" 또는 "개체"는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체(전장 단일클론 항체를 포함함), 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 구체적으로 포괄한다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리되고/되거나 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들면, 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정될 때 95중량% 초과의 항체, 일부 실시양태에서 99중량% 초과의 수준까지; (2) 예를 들면, 스피닝 컵 서열분석기(spinning cup sequenator)를 이용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도까지; 또는 (3) 예를 들면, 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 이용하는 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질한 정도까지 정제된다. 항체의 천연 환경의 적어도 한 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 단리된 항체는 재조합 세포 내에서 제자리 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 디설파이드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄들 사이에 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 가교도 가진다. 각각의 중쇄는 한 말단에서 가변 도메인(VH)을 갖고, 그 뒤에 다수의 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 한 말단에서 가변 도메인(VL)을 갖고 그의 다른 말단에서 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.

용어 "불변 도메인"은 면역글로불린의 다른 부분, 즉 항원 결합 부위를 함유하는 가변 도메인에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 가진 면역글로불린 분자의 부분을 의미한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인들(총체적으로, CH), 및 경쇄의 CHL(또는 CL) 도메인을 함유한다.

항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 의미한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로서 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인들은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고 항원 결합 부위를 함유한다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 일부 부분들이 항체들 사이에 서열 면에서 광범위하게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되어 있지 않다. 이것은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역(HVR)으로서 지칭되는 3개의 분절들에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 골격 영역(FR)으로서 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들은 루프 연결을 형성하고 일부 경우에서 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 HVR들에 의해 연결된, 주로 베타-시트 배열을 채택하는 4개의 FR 영역들을 각각 포함한다. 각각의 쇄에서 HVR들은 FR 영역에 의해 가까이 인접하여 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 HVR들은 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)) 참조). 불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대, 항체 의존적 세포 독성에의 항체의 참여를 나타낸다.

임의의 포유동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄들"은 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파("κ") 및 람다("λ")로서 지칭되는 2종의 명확히 상이한 유형들 중 하나로 배정될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 IgG "이소타입" 또는 "서브클래스"는 그들의 불변 영역의 화학적 및 항원성 특성에 의해 정의된 면역글로불린의 서브클래스들 중 임의의 서브클래스를 의미한다.

항체들(면역글로불린들)은 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5개 주요 클래스들, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 여러 클래스들이 서브클래스(이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 α, γ, ε, γ 및 μ로서 지칭된다. 면역글로불린의 상이한 클래스들의 서브유닛 구조 및 3차원적 배열은 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌(Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000))에 일반적으로 기재되어 있다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 연결에 의해 형성된 보다 큰 융합 단백질의 일부일 수 있다.

용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 하기 정의된 항체 단편이 아니라 실질적으로 온전한 형태의 항체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어들은 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 가진 항체를 의미한다.

본원의 목적상 "네이키드(naked) 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지에 접합되어 있지 않은 항체이다.

"항체 단편"은 바람직하게는 그의 항원 결합 영역을 포함하는, 온전한 항체의 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 단편은 항원 결합 단편이다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv 및 Fv 단편; 다이아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.

항체의 파파인 분해는 단일 항원 결합 부위 및 잔류 "Fc" 단편(이의 명칭은 용이하게 결정화하는 그의 능력을 반영함)을 각각 가진, "Fab" 단편으로서 지칭되는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원 조합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교연결할 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성한다.

"Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fc 종은 단단하게 비-공유적으로 연결된 1개의 중쇄 가변 도메인 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일 쇄 Fv(scFv) 종에서, 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄와 중쇄가 2-쇄 Fv 종의 이량체 구조와 유사한 "이량체" 구조로 연결될 수 있도록 유연성 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 이 배열에서 각각의 가변 도메인의 3개의 HVR들은 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원 결합 부위를 한정하도록 상호작용한다. 총체적으로, 6개의 HVR들은 항원 결합 특이성을 항체에게 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 HVR들만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화성으로 항원을 인식하고 항원에 결합하는 능력을 가진다.

Fab 단편은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)도 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇몇 잔기의 추가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 자유 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 본원의 표기이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 가진 Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.

"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고, 이때 이들 도메인들은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에서 추가로 포함한다. scFv의 논평에 대해서는 예를 들면, 문헌(Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315)을 참조한다.

용어 "다이아바디"는 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위들을 가진 항체 단편을 의미한다. 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인들 사이에 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커의 사용에 의해, 상기 도메인들은 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 강제로 페어링되고 2개의 항원 결합 부위들을 생성한다. 다이아바디는 2가 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 다이아바디는 예를 들면, 유럽 특허 제404,097호; PCT 특허출원 공개 제WO1993/01161호; 문헌(Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003)); 및 문헌(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993))에 더 상세히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디도 문헌(Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003))에 기재되어 있다.

본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하고, 예를 들면, 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들면, 천연 생성 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 특성을 상이한 항체들의 혼합물이 아닌 것으로서 표시한다. 일부 실시양태에서, 이러한 단일클론 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 이때 표적 결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열들로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열을 선택하는 단계를 포함하는 과정에 의해 수득되었다. 예를 들면, 선택 과정은 복수의 클론들, 예컨대, 하이브리도마 클론들, 파지 클론들 또는 재조합 DNA 클론들의 풀(pool)로부터의 유일무이한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들면, 표적에 대한 친화성을 개선하거나, 표적 결합 서열을 인간화하거나, 세포 배양물에서의 그의 생성을 개선하거나, 생체내에서의 그의 면역원성을 감소시키거나 다중특이적 항체를 생성하도록 더 변경될 수 있고 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 단일클론 항체라는 것을 이해해야 한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 단일클론 항체 제제는 그의 특이성 이외에 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되어 있지 않다는 점에서 유리하다.

수식어 "단일클론"은 항체의 특성을 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된다는 것으로서 표시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 예를 들면, 하이브리도마 방법(예를 들면, 문헌(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)); 문헌(Hongo et al, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)); 문헌(Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)); 문헌(Hammerling et al, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참조), 파지-디스플레이 기술(예를 들면, 문헌(Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991)); 문헌(Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)); 문헌(Sidhu et al, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)); 문헌(Lee et al, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)); 문헌(Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)); 및 문헌(Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)) 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 좌위 또는 유전자의 일부 또는 전부를 가진 동물에서 인간 또는 인간 유사 항체를 제조하는 기술(예를 들면, PCT 특허출원 공개 제WO1998/24893호; PCT 특허출원 공개 제WO1996/34096호; PCT 특허출원 공개 제WO1996/33735호; PCT 특허출원 공개 제WO1991/10741호; 문헌(Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)); 문헌(Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)); 문헌(Bruggemann et al, Year in Immunol. 7:33 (1993)); 미국 특허 제5,545,807호; 미국 특허 제5,545,806호; 미국 특허 제5,569,825호; 미국 특허 제5,625,126호; 미국 특허 제5,633,425호; 미국 특허 제5,661,016호; 문헌(Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)); 문헌(Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)); 문헌(Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)); 문헌(Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)); 문헌(Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)); 및 문헌(Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)) 참조)을 비롯한 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.

본원에서 단일클론 항체는 특히 "키메라" 항체뿐만 아니라 이러한 항체의 단편도 포함하는데, 이때 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래한 항체, 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동한 반면, 상기 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래한 항체, 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동하지만, 이들은 원하는 생물학적 활성을 나타낸다(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌(Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)) 참조). 키메라 항체는 PRIMATTZED(등록됨) 항체를 포함하는데, 이때 상기 항체의 항원 결합 영역은 예를 들면, 마카크(macaque) 원숭이를 관심 있는 항원으로 면역화시킴으로써 생성된 항체로부터 유래한다.

비인간(예를 들면, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화된 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 비인간 종(기증자 항체), 예컨대, 원하는 특이성, 친화성 및/또는 성능을 가진 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 HVR로부터의 잔기로 대체되어 있는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 나아가, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 기증자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변경은 항체 성능을 더 개선하도록 만들어질 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프들이 비인간 면역글로불린의 초가변 루프들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR들이 인간 면역글로불린 서열의 FR들인 실질적으로 모든 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인들을 포함할 것이다. 인간화된 항체는 임의적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부도 포함할 것이다. 더 상세한 내용에 대해서는 예를 들면, 문헌(Jones et al, Nature 321:522-525 (1986)); 문헌(Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988)); 및 문헌(Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992))을 참조한다. 예를 들면, 문헌(Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998)); 문헌(Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)); 문헌(Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)); 및 미국 특허 제6,982,321호 및 제7,087,409호도 참조한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 인간 항체 제조 기법들 중 임의의 제조 기법의 이용에 의해 제조된 항체이다. 인간 항체의 이 정의는 특히 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 비롯한, 당분야에서 공지된 다양한 기법들의 이용에 의해 제조될 수 있다(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). 문헌(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)); 및 문헌(Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991))에 기재된 방법도 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 이용될 수 있다. 문헌(van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5:368-74 (2001))도 참조한다. 인간 항체는 항원성 챌린지에 반응하여 이러한 항체를 생성하도록 변경되어 있지만, 불능화된 내재성 좌위를 가진 형질전환 동물, 예를 들면, 면역화된 제노마우스(예를 들면, XENOMOUSE(상표명) 기술에 대해 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조)에게 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 대해 예를 들면, 문헌(Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006))도 참조한다.

"종 의존적 항체"는 제2 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 그의 결합 친화성보다 제1 포유동물 종으로부터의 항원에 대해 더 강한 결합 친화성을 가진 항체이다. 일반적으로, 종 의존적 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합하지만"(예를 들면, 약 1x10^-7M 이하, 바람직하게는 약 1x10^-8M 이하, 바람직하게는 약 1x10^-9M 이하의 결합 친화성(Kd) 값을 갖지만), 인간 항원에 대한 그의 결합 친화성보다 적어도 약 50배, 적어도 약 500배 또는 적어도 약 1000배 더 약한, 제2 비인간 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화성을 가진다. 종 의존적 항체는 상기 정의된 다양한 유형의 항체들 중 임의의 항체일 수 있으나, 바람직하게는 인간화된 또는 인간 항체이다.

본원에서 사용될 때 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열에서 초가변적이고/초가변적이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 의미한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR들, 즉 VH에서 3개의 HVR들(H1, H2, H3) 및 VL에서 3개의 HVR들(L1, L2, L3)을 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR들 중 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 정교한 특이성을 항체에게 부여하는 데 있어서 유일무이한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 예를 들면, 문헌(Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)); 및 문헌(Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003))을 참조한다. 사실상, 중쇄만으로 구성된 천연 생성 낙타 항체는 경쇄의 부재 하에서 기능적이고 안정하다. 예를 들면, 문헌(Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)); 및 문헌(Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996))을 참조한다.

다수의 HVR 묘사가 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성에 근거하고 가장 흔히 사용된다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 대신에, 초티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 언급한다(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 카바트 HVR과 초티아 구조적 루프 사이의 절충물을 대표하고, 옥스퍼드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 입수가능한 복합 결정 구조의 분석에 근거한다. 이들 HVR들 각각으로부터의 잔기는 하기 표시되어 있다.

HVR은 다음과 같은 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34(L1), 46-56 또는 50-56(L2) 및 89-97 또는 89-96(L3), 및 VH에서 26-35(H1), 50-65 또는 49-65(H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102(H3). 이들 정의 각각에 대한 가변 도메인 잔기는 상기 문헌(Kabat et al.)에 따라 넘버링된다.

"골격" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

표현 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이들의 어미변화는 상기 문헌(Kabat et al.)에서 항체의 컴파일레이션(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용되는 넘버링 시스템을 의미한다. 이 넘버링 시스템을 이용할 때, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 이러한 FR 또는 HVR 내로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물(카바트에 따라 잔기 52a)을 포함할 수 있고 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기(예를 들면, 카바트에 따라 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체의 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬함으로써 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다.

카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인의 잔기(경쇄의 대략 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭할 때 이용된다(예를 들면, 문헌(Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 참조). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 지칭할 때 이용된다(예를 들면, 상기 문헌(Kabat et al.)에 보고된 EU 지수). "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.

표현 "선형 항체"는 문헌(Zapata et al. (1995) Protein Eng, 8(10): 1057-1062)에 기재된 항체를 의미한다. 요약하건대, 이 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬 Fd 분절들(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적일 수 있거나 단일특이적일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합한다", "특이적으로 결합하는" 또는 "에 특이적인"은 생물학적 분자를 포함하는 분자의 불균질한 집단의 존재 하에서 표적의 존재를 확인시켜주는, 표적과 항체 사이의 측정가능한 및 재현가능한 상호작용, 예컨대, 결합을 의미한다. 예를 들면, (에피토프일 수 있는) 표적에 결합하거나 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적에 결합할 때보다 더 큰 친화성, 친화력, 더 높은 용이성 및/또는 더 큰 지속성으로 이 표적에 결합하는 항체이다. 한 실시양태에서, 항체와 무관한 표적의 결합 정도는 예를 들면, 방사면역어세이(RIA)에 의해 측정될 때 항체와 표적의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 ≤ 1 μΜ, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.1 nM의 해리 상수(Kd)를 가진다. 일부 실시양태에서, 항체는 상이한 종으로부터의 단백질 사이에 보존되어 있는, 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있으나, 요구하지 않는다.

[II. PD-1 축 결합 길항제]

본원은 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 본원은 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법도 제공한다. 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응은 대식세포 및 다핵 거대세포를 비롯한 면역세포가 종양 조직 내로 침윤되는 것을 포함한다. 또 다른 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응은 종양 침윤된 림프구(TIL)에서의 CD45-양성 림프구, CD3ε-양성 림프구 및 CD8-양성 T 림프구의 증가를 포함한다. 예를 들면, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제를 포함한다. PD-1(프로그래밍된 사멸 1)은 당분야에서 "프로그래밍된 세포 사멸 1", PDCD1, CD279 및 SLEB2로서도 지칭된다. PD-L1(프로그래밍된 사멸 리간드 1)은 당분야에서 "프로그래밍된 세포 사멸 1 리간드 1", PDCD1LG1, CD274, B7-H 및 PD-L1로서도 지칭된다. PD-L2(프로그래밍된 사멸 리간드 2)는 당분야에서 "프로그래밍된 세포 사멸 1 리간드 2", PDCD1LG2, CD273, B7-DC, Btdc 및 PDL2로서도 지칭된다. 일부 실시양태에서, PD-1, PD-L1 및 PD-L2는 인간 PD-1, PD-L1 및 PD-L2이다.

일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1과 그의 리간드 결합 파트너의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PD-L1 및/또는 PD-L2이다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1과 그의 결합 파트너의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-L1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 실시양태에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2와 그의 결합 파트너의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-L2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 이뮤노어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩티드일 수 있다.

일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체)이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 MDX-1106(니볼루맙), MK-3475(람브롤리주맙) 및 CT-011(피딜리주맙)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 이뮤노어드헤신(예를 들면, 불변 영역(예를 들면, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 이뮤노어드헤신)이다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224 또는 AMP-514(MEDI0680)이다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PDR001, REGN2810, BGB A317 및 SHR-1210으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 결합 길항제는 YW243.55.S70, 아테졸리주맙, MPDL3280A, MDX-1105, 아벨루맙 및 MEDI4736(두르발루맙)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 항체 YW243.55.S70은 PCT 특허출원 공개 제WO2010/077634호에 기재된 항-PD-L1이다. BMS-936559로서도 공지되어 있는 MDX-1105는 PCT 특허출원 공개 제WO2007/005874호에 기재된 항-PD-L1 항체이다. 아벨루맙은 PCT 특허출원 공개 제WO2013079174호에 기재된 항-PDL1 항체이다. MEDI4736(두르발루맙)은 PCT 특허출원 공개 제WO2011/066389호 및 미국 특허출원 공개 제2013/034559호에 기재된 항-PD-L1 단일클론 항체이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 및 OPDIVO(등록됨)로서도 공지되어 있는 니볼루맙은 PCT 특허출원 공개 제WO2006/121168호에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA(등록됨) 및 SCH-900475로서도 공지되어 있는 펨브롤리주맙은 PCT 특허출원 공개 제WO2009/114335호에 기재된 항-PD-1 항체이다. hBAT, hBAT-1 또는 피딜리주맙으로서도 공지되어 있는 CT-011은 PCT 특허출원 공개 제WO2009/101611호에 기재된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로서도 공지되어 있는 AMP-224는 PCT 특허출원 공개 제WO2010/027827호 및 제WO2011/066342호에 기재된 PD-L2-Fc 융합 가용성 수용체이다.

일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 PD-L1과 PD-1 사이 및/또는 PD-L1과 B7-1 사이의 결합을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 (Fab')₂ 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 인간화된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 인간 항체이다.

본 발명의 방법에 유용한 항-PD-L1 항체 및 이의 제조 방법의 예는 본원에 참고로 도입되는 PCT 특허출원 공개 제WO2010/077634호, PCT 특허출원 공개 제WO2007/005874호, PCT 특허출원 공개 제WO2011/066389호 및 미국 특허출원 공개 제2013/034559호에 기재되어 있다. 본 발명에 유용한 항-PD-L1 항체(이러한 항체를 함유하는 조성물을 포함함)는 암을 치료하기 위해 항-GPC3 항체와 함께 사용될 수 있다.

항-PD1 항체

일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 MDX-1106이다. "MDX-1106"의 대안적 명칭은 MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 또는 니볼루맙을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙(CAS 등록번호: 946414-94-4)이다. 추가 실시양태에서, 서열번호 1로부터의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 2로부터의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-PD-1 항체가 제공된다. 추가 실시양태에서, 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PD-1 항체로서, (a) 중쇄 서열이 서열번호 1에 기재된 중쇄 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, (b) 경쇄 서열이 서열번호 2에 기재된 경쇄 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-1 항체가 제공된다.

항-PD-L1 항체

일부 실시양태에서, 제형 중의 항체는 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열에서 적어도 1개(예를 들면, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개)의 트립토판을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 트립토판은 항체의 CDR 영역, 골격 영역 및/또는 불변 영역에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항체는 CDR 영역에서 2개 또는 3개의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제형 중의 항체는 항-PD-L1 항체이다. PD-L1, B7-H1, B7-4, CD274 및 B7-H로서도 공지되어 있는 PD-L1(프로그래밍된 사멸 리간드 1)은 경막 단백질이고, 그와 PD-1의 상호작용은 T 세포 활성화 및 사이토카인 생성을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1에 결합한다. 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있는 항-PD-L1 항체의 예는 아테졸리주맙, 또는 본원에 참고로 도입되는 PCT 특허출원 공개 제WO 2010/077634 A1호 및 미국 특허 제8,217,149호에 기재된 항-PD-L1 항체이다.

일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 PD-L1과 PD-1 사이 및/또는 PD-L1과 B7-1 사이의 결합을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 (Fab')₂ 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 인간화된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 인간 항체이다.

PCT 특허출원 공개 제WO 2010/077634 A1호 및 미국 특허 제8,217,149호에 기재된 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열번호 3의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열번호 4의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체로서, (a) 중쇄 서열이 서열번호 3에 기재된 중쇄 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, (b) 경쇄 서열이 서열번호 4에 기재된 경쇄 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-L1 항체가 제공된다.

한 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하고, 이때

(a) HVR-H1 서열은 GFTFSX₁SWIH(서열번호 5)이고;

(b) HVR-H2 서열은 AWIX₂PYGGSX₃YYADSVKG(서열번호 6)이고;

(c) HVR-H3 서열은 RHWPGGFDY(서열번호 7)이고;

추가로, 이때 X₁은 D 또는 G이고; X₂는 S 또는 L이고; X₃은 T 또는 S이다. 한 특정 양태에서, X₁은 D이고; X₂는 S이고; X₃은 T이다.

또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 하기 식에 따라 HVR들 사이에 병치된 가변 영역 중쇄 골격 서열을 추가로 포함한다: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4). 또 다른 양태에서, 골격 서열은 인간 컨센서스 골격 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 골격 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 적어도 1개의 골격 서열은 다음과 같다:

HC-FR1은 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(서열번호 8)이고;

HC-FR2는 WVRQAPGKGLEWV(서열번호 9)이고;

HC-FR3은 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열번호 10)이고;

HC-FR4는 WGQGTLVTVSA(서열번호 11)이다.

추가 양태에서, 중쇄 폴리펩티드는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 가변 영역 경쇄와도 조합되고, 이때

(a) HVR-L1 서열은 RASQX₄X₅X₆TX₇X₈A(서열번호 12)이고;

(b) HVR-L2 서열은 SASX₉LX₁₀S(서열번호 13)이고;

(c) HVR-L3 서열은 QQX₁₁X₁₂X₁₃X₁₄PX₁₅T(서열번호 14)이고;

이때, X₄는 D 또는 V이고; X₅는 V 또는 I이고; X₆은 S 또는 N이고; X₇은 A 또는 F이고; X₈은 V 또는 L이고; X₉는 F 또는 T이고; X₁₀은 Y 또는 A이고; X₁₁은 Y, G, F 또는 S이고; X₁₂는 L, Y, F 또는 W이고; X₁₃은 Y, N, A, T, G, F 또는 I이고; X₁₄는 H, V, P, T 또는 I이고; X₁₅는 A, W, R, P 또는 T이다. 추가 양태에서, X₄는 D이고; X₅는 V이고; X₆은 S이고; X₇은 A이고; X₈은 V이고; X₉는 F이고; X₁₀은 Y이고; X₁₁은 Y이고; X₁₂는 L이고; X₁₃은 Y이고; X₁₄는 H이고; X₁₅는 A이다.

추가 양태에서, 경쇄는 하기 식에 따라 HVR들 사이에 병치된 가변 영역 경쇄 골격 서열을 추가로 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 추가 양태에서, 골격 서열은 인간 컨센서스 골격 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 골격 서열은 VL 카파 I 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 적어도 1개의 골격 서열은 다음과 같다:

LC-FR1은 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호 15)이고;

LC-FR2는 WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호 16)이고;

LC-FR3은 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호 17)이고;

LC-FR4는 FGQGTKVEIKR(서열번호 18)이다.

또 다른 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편이 제공되고, 이때 (a) 중쇄는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 추가로 (i) HVR-H1 서열은 GFTFSX₁SWIH(서열번호 5)이고, (ii) HVR-H2 서열은 AWIX₂PYGGSX₃YYADSVKG(서열번호 6)이고, (iii) HVR-H3 서열은 RHWPGGFDY(서열번호 7)이고, (b) 경쇄는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고, 이때 추가로 (i) HVR-L1 서열은 RASQX₄X₅X₆TX₇X₈A(서열번호 12)이고; (ii) HVR-L2 서열은 SASX₉LX₁₀S(서열번호 13)이고, (iii) HVR-L3 서열은 QQX₁₁X₁₂X₁₃X₁₄PX₁₅T(서열번호 14)이고, 이때 X₁은 D 또는 G이고; X₂는 S 또는 L이고; X₃은 T 또는 S이고; X₄는 D 또는 V이고; X₅는 V 또는 I이고; X₆은 S 또는 N이고; X₇은 A 또는 F이고; X₈은 V 또는 L이고; X₉는 F 또는 T이고; X₁₀은 Y 또는 A이고; X₁₁은 Y, G, F 또는 S이고; X₁₂는 L, Y, F 또는 W이고; X₁₃은 Y, N, A, T, G, F 또는 I이고; X₁₄는 H, V, P, T 또는 I이고; X₁₅는 A, W, R, P 또는 T이다. 특정 양태에서, X₁은 D이고; X₂는 S이고; X₃은 T이다. 또 다른 양태에서, X₄는 D이고; X₅는 V이고; X₆은 S이고; X₇은 A이고; X₈은 V이고; X₉는 F이고; X₁₀은 Y이고; X₁₁은 Y이고; X₁₂는 L이고; X₁₃은 Y이고; X₁₄는 H이고; X₁₅는 A이다. 또 다른 양태에서, X₁은 D이고; X₂는 S이고; X₃은 T이고; X₄는 D이고; X₅는 V이고; X₆은 S이고; X₇은 A이고; X₈은 V이고; X₉는 F이고; X₁₀은 Y이고; X₁₁은 Y이고; X₁₂는 L이고; X₁₃은 Y이고; X₁₄는 H이고; X₁₅는 A이다.

추가 양태에서, 중쇄 가변 영역은 HVR들 사이에 (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)로서 병치된 하나 이상의 골격 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 HVR들 사이에 (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)로서 병치된 하나 이상의 골격 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 골격 서열은 인간 컨센서스 골격 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 중쇄 골격 서열은 카바트 하위군 I, II 또는 III 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 중쇄 골격 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 하나 이상의 중쇄 골격 서열은 서열번호 8, 9, 10 및 11로서 기재되어 있다. 추가 양태에서, 경쇄 골격 서열은 카바트 카파 I, II, III 또는 IV 하위군 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 경쇄 골격 서열은 VL 카파 I 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 하나 이상의 경쇄 골격 서열은 서열번호 15, 16, 17 및 18로서 기재되어 있다.

추가 특정 양태에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 추가 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 특정 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B 및 IgG3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 추가 특정 양태에서, 항체는 감소된 또는 최소한의 이펙터 기능을 가진다. 추가 특정 양태에서, 최소한의 이펙터 기능은 "이펙터-부재 Fc 돌연변이" 또는 아글리코실화로부터 비롯된다. 추가 실시양태에서, 이펙터-부재 Fc 돌연변이는 불변 영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.

또 다른 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체로서, (a) 중쇄가 각각 GFTFSDSWIH(서열번호 19), AWISPYGGSTYYADSVKG(서열번호 20) 및 RHWPGGFDY(서열번호 21)와 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 추가로 포함하거나, (b) 경쇄가 각각 RASQDVSTAVA(서열번호 22), SASFLYS(서열번호 23) 및 QQYLYHPAT(서열번호 24)와 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 추가로 포함하는, 항-PD-L1 항체가 제공된다.

특정 양태에서, 서열 동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.

또 다른 양태에서, 중쇄 가변 영역은 HVR들 사이에 (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)로서 병치된 하나 이상의 골격 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 HVR들 사이에 (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)로서 병치된 하나 이상의 골격 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 골격 서열은 인간 컨센서스 골격 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 중쇄 골격 서열은 카바트 하위군 I, II 또는 III 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 중쇄 골격 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 하나 이상의 중쇄 골격 서열은 서열번호 8, 9, 10 및 11로서 기재되어 있다. 추가 양태에서, 경쇄 골격 서열은 카바트 카파 I, II, III 또는 IV 하위군 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 경쇄 골격 서열은 VL 카파 I 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 하나 이상의 경쇄 골격 서열은 서열번호 15, 16, 17 및 18로서 기재되어 있다.

또 다른 추가 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체로서, (a) 중쇄 서열이 서열번호 25에 기재된 중쇄 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고/갖거나, (b) 경쇄 서열이 서열번호 4에 기재된 경쇄 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-L1 항체가 제공된다.

특정 양태에서, 서열 동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 또 다른 양태에서, 중쇄 가변 영역은 HVR들 사이에 (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)로서 병치된 하나 이상의 골격 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 HVR들 사이에 (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)로서 병치된 하나 이상의 골격 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 골격 서열은 인간 컨센서스 골격 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 중쇄 골격 서열은 카바트 하위군 I, II 또는 III 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 중쇄 골격 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 하나 이상의 중쇄 골격 서열은 서열번호 8, 9, 10 및 WGQGTLVTVSS(서열번호 27)로서 기재되어 있다. 추가 양태에서, 경쇄 골격 서열은 카바트 카파 I, II, III 또는 IV 하위군 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 경쇄 골격 서열은 VL 카파 I 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 하나 이상의 경쇄 골격 서열은 서열번호 15, 16, 17 및 18로서 기재되어 있다.

추가 특정 양태에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 추가 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 특정 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B 및 IgG3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 추가 특정 양태에서, 항체는 감소된 또는 최소한의 이펙터 기능을 가진다. 추가 특정 양태에서, 최소한의 이펙터 기능은 원핵세포에서의 생성으로부터 비롯된다. 추가 특정 양태에서, 최소한의 이펙터 기능은 "이펙터-부재 Fc 돌연변이" 또는 아글리코실화로부터 비롯된다. 추가 실시양태에서, 이펙터-부재 Fc 돌연변이는 불변 영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.

추가 양태에서, 중쇄 가변 영역은 HVR들 사이에 (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)로서 병치된 하나 이상의 골격 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 HVR들 사이에 (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)로서 병치된 하나 이상의 골격 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 골격 서열은 인간 컨센서스 골격 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 중쇄 골격 서열은 카바트 하위군 I, II 또는 III 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 중쇄 골격 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 하나 이상의 중쇄 골격 서열은 다음과 같다:

HC-FR1은 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 29)이고;

HC-FR2는 WVRQAPGKGLEWVA(서열번호 30)이고;

HC-FR3은 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열번호 10)이고;

HC-FR4는 WGQGTLVTVSS(서열번호 27)이다.

추가 양태에서, 경쇄 골격 서열은 카바트 카파 I, II, III 또는 IV 하위군 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 경쇄 골격 서열은 VL 카파 I 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 하나 이상의 경쇄 골격 서열은 다음과 같다:

LC-FR1은 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호 15)이고;

LC-FR2는 WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호 16)이고;

LC-FR3은 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호 17)이고;

LC-FR4는 FGQGTKVEIK(서열번호 28)이다.

또 다른 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체로서, (c) 중쇄가 각각 GFTFSDSWIH(서열번호 19), AWISPYGGSTYYADSVKG(서열번호 20) 및 RHWPGGFDY(서열번호 21)와 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 추가로 포함하고/포함하거나, (d) 경쇄가 각각 RASQDVSTAVA(서열번호 22), SASFLYS(서열번호 23) 및 QQYLYHPAT(서열번호 24)와 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 추가로 포함하는, 항-PD-L1 항체가 제공된다.

또 다른 양태에서, 중쇄 가변 영역은 HVR들 사이에 (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)로서 병치된 하나 이상의 골격 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 HVR들 사이에 (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)로서 병치된 하나 이상의 골격 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 골격 서열은 인간 컨센서스 골격 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 중쇄 골격 서열은 카바트 하위군 I, II 또는 III 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 중쇄 골격 서열은 VH 하위군 III 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 하나 이상의 중쇄 골격 서열은 서열번호 8, 9, 10 및 WGQGTLVTVSSASTK(서열번호 31)로서 기재되어 있다.

추가 양태에서, 경쇄 골격 서열은 카바트 카파 I, II, III 또는 IV 하위군 서열로부터 유래한다. 추가 양태에서, 경쇄 골격 서열은 VL 카파 I 컨센서스 골격이다. 추가 양태에서, 하나 이상의 경쇄 골격 서열은 서열번호 15, 16, 17 및 18로서 기재되어 있다. 추가 특정 양태에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 추가 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 특정 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B 및 IgG3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 추가 특정 양태에서, 항체는 감소된 또는 최소한의 이펙터 기능을 가진다. 추가 특정 양태에서, 최소한의 이펙터 기능은 "이펙터-부재 Fc 돌연변이" 또는 아글리코실화로부터 비롯된다. 추가 실시양태에서, 이펙터-부재 Fc 돌연변이는 불변 영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.

추가 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체로서, (a) 중쇄 서열이 서열번호 26에 기재된 중쇄 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖거나, (b) 경쇄 서열이 서열번호 4에 기재된 경쇄 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-L1 항체가 제공된다.

일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체로서, 경쇄 가변 영역 서열이 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-L1 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체로서, 중쇄 가변 영역 서열이 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-L1 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체로서, 경쇄 가변 영역 서열이 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고 중쇄 가변 영역 서열이 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-L1 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 잔기가 결실될 수 있거나, 치환될 수 있거나 변경될 수 있다.

추가 실시양태에서, 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체로서, (a) 중쇄 서열이 서열번호 32에 기재된 중쇄 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고/갖거나, (b) 경쇄 서열이 서열번호 33에 기재된 경쇄 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-L1 항체가 제공된다.

추가 실시양태에서, 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체로서, (a) 중쇄 서열이 서열번호 55에 기재된 중쇄 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고/갖거나, (b) 경쇄 서열이 서열번호 33에 기재된 경쇄 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-L1 항체가 제공된다.

일부 실시양태에서, 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체로서, 경쇄 서열이 서열번호 33의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-L1 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체로서, 중쇄 서열이 서열번호 32 또는 55의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-L1 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체로서, 경쇄 서열이 서열번호 33의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 중쇄 서열이 서열번호 32 또는 55의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가진, 단리된 항-PD-L1 항체가 제공된다.

일부 실시양태에서, 단리된 항-PD-L1 항체는 아글리코실화되어 있다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화이다. "N-연결"은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착시키는 것을 의미한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-쓰레오닌(이때, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 효소를 사용하여 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 이들 트리펩티드 서열들 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 당들 중 하나인 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스를 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로 세린 또는 쓰레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신도 사용될 수 있다. 항체로부터의 글리코실화 부위의 제거는 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우) 상기 트리펩티드 서열들 중 하나가 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다. 글리코실화 부위 내부의 아스파라긴, 세린 또는 쓰레오닌 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 치환시킴으로써(예를 들면, 글리신, 알라닌 또는 보존적 치환으로) 변경시킬 수 있다.

본원의 실시양태들 중 임의의 실시양태에서, 단리된 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1, 예를 들면, UniProtKB/Swiss-Prot 수탁번호 Q9NZQ7.1로 표시된 인간 PD-L1, 또는 이의 변이체에 결합할 수 있다.

추가 실시양태에서, 본원에 기재된 항체들 중 임의의 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 핵산은 앞서 기재된 항-PD-L1 항체들 중 임의의 항-PD-L1 항체를 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 벡터를 추가로 포함한다. 추가 특정 양태에서, 벡터는 핵산의 발현에 적합한 숙주 세포에 존재한다. 추가 특정 양태에서, 숙주 세포는 진핵세포 또는 원핵세포이다. 추가 특정 양태에서, 진핵세포는 포유동물 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.

당분야에서 공지되어 있는 방법, 예를 들면, 앞서 기재된 항-PD-L1 항체들 중 임의의 항-PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 발현에 적합한 형태로 함유하는 숙주 세포를 이러한 항체 또는 단편의 생성에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 상기 항체 또는 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법을 이용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조할 수 있다.

[III. 항-GPC3 항체]

본원은 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 본원은 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응은 대식세포 및 다핵 거대세포를 비롯한 면역세포가 종양 조직 내로 침윤되는 것을 포함한다. 또 다른 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응은 종양 침윤된 림프구(TIL)에서의 CD45-양성 림프구, CD3ε-양성 림프구 및 CD8-양성 T 림프구의 증가를 포함한다.

본원은 인간 글리피칸 3(GPC3)에 결합하는 항체를 제공한다. "GPC3"에 대한 별칭은 SGB, DGSX, MXR7, SDYS, SGBS, OCI-5, SGBS1 및 GTR2-2를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "GPC3"은 임의의 인간 공급원으로부터의 임의의 천연 GPC3을 의미한다. 상기 용어는 "전장" GPC3 및 프로세싱되지 않은 GPC3뿐만 아니라, 세포에서의 프로세싱(예를 들면, 성숙 단백질)으로부터 발생된, GPC3의 C-말단 펩티드를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 임의의 형태의 GPC3도 포괄한다. 상기 용어는 GPC3의 천연 생성 변이체 및 이소폼, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체도 포괄한다. 예를 들면, GPC3 및 서열의 설명은 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁번호 P51654.1에 제공되어 있다.

일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 GPC3에 결합하고 암세포의 세포 증식 또는 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 코드리투주맙이다.

일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 세포독성 물질에 접합된 1G12 항체(PCT 특허출원 공개 제WO2003/100429호)(바이오모자이크 인코포레이티드(BioMosaics Inc.)에 의해 카탈로그 번호 B0134R 하에 시판됨)를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)(PCT 특허출원 공개 제WO2007/137170호)를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 PCT 특허출원 공개 제WO2006/006693호 또는 제WO2007/047291호에 기재된 인간화된 항-GPC3 항체이다.

일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 PCT 특허출원 공개 제WO2006/006693호 또는 제WO2009/041062호에 기재된 인간화된 항-GPC3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 인간화된 항-GPC3 항체로서, (a) 중쇄가 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 추가로 (i) HVR-H1 서열이 DYSMH(서열번호 34)이고, (ii) HVR-H2 서열이 WINTETGEPTYADDFKG(서열번호 35)이고, (iii) HVR-H3 서열이 LY(서열번호 36)이고, (b) 경쇄가 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고, 이때 추가로 (i) HVR-L1 서열이 KSSQSLLHSDGKTFLN(서열번호 37)이고, (ii) HVR-L2 서열이 LVSRLDS(서열번호 38)이고, (iii) HVR-L3 서열이 CQGTHFPRT(서열번호 39)인, 인간화된 항-GPC3 항체가 제공된다.

추가 양태에서, 항-GPC3 항체는 인간화되어 있다. 인간화된 항-GPC3 항체는 서열번호 40으로 표시된 중쇄 골격 서열 또는 서열번호 41로 표시된 경쇄 골격 서열과 높은 서열 동일성을 가진 적절하게 선택된 인간 골격 서열을 인간화용 주형으로서 사용함으로써 제조될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원은 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-GPC3 키메라 항체 또는 인간화된 항-GPC3 항체로서, (a) 중쇄가 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 추가로 (i) HVR-H1 서열이 DYEMH(서열번호 42)이고, (ii) HVR-H2 서열이 ALDPKTGDTAYSQKFKG(서열번호 43)이고, (iii) HVR-H3 서열이 FYSYTY(서열번호 44)이고, (b) 경쇄가 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고, 이때 추가로 (i) HVR-L1 서열이 RSSQSLVHSNRNTYLH(서열번호 45)이고, (ii) HVR-L2 서열이 KVSNRFS(서열번호 46)이고, (iii) HVR-L3 서열이 SQNTHVPPT(서열번호 47)인, 항-GPC3 키메라 항체 또는 인간화된 항-GPC3 항체를 제공한다.

인간화된 항-GPC3 항체는 서열번호 48로 표시된 중쇄 골격 서열 또는 서열번호 49로 표시된 경쇄 골격 서열과 높은 서열 동일성을 가진 적절하게 선택된 인간 골격 서열을 인간화용 주형으로서 사용함으로써 제조될 수 있다.

추가 실시양태에서, 본원은 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있는 인간화된 항-GPC3 항체로서, (a) 중쇄가 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 추가로 (i) HVR-H1 서열이 DYEMH(서열번호 42)이고, (ii) HVR-H2 서열이 ALDPKTGDTAYSQKFKG(서열번호 43)이고, (iii) HVR-H3 서열이 FYSYTY(서열번호 44)이고, (b) 경쇄가 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고, 이때 추가로 (i) HVR-L1 서열이 RSSQSLVHSNRNTYLH(서열번호 45)이고, (ii) HVR-L2 서열이 KVSNRFS(서열번호 46)이고, (iii) HVR-L3 서열이 SQNTHVPPT(서열번호 47)인, 인간화된 항-GPC3 항체를 제공한다.

추가 실시양태에서, 서열번호 50으로 표시된 중쇄 가변 영역들의 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 51로 표시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항-GPC3 항체가 제공된다. 추가 대안적 비-한정적 양태에서, 서열번호 50으로 표시된 중쇄 가변 영역들의 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 52로 표시된 경쇄 가변 영역들의 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항-GPC3 항체가 제공된다.

추가 실시양태에서, 서열번호 53으로 표시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 54로 표시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항-GPC3 항체가 제공된다.

본 발명의 항-GPC3 항체의 대안적 예에는 세포독성적 활성을 가진 항-GPC3 항체가 포함된다. 본 발명에서, 세포독성적 활성의 비-한정적 예에는 항체 의존적 세포 매개 세포독성 또는 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC) 활성, 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성 및 T 세포 기반 세포독성적 활성이 포함된다. 본 발명에서, CDC 활성은 보체 시스템에 의해 발생된 세포독성적 활성을 의미한다. 다른 한편으로, ADCC 활성은 예를 들면, 면역세포 상에서 발현된 Fcγ 수용체를 통해 면역세포가 표적 세포의 세포막 상에서 발현된 막 분자에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 Fc 영역에 결합함으로써, 예를 들면, 면역세포로 표적 세포를 손상시키는 활성을 의미한다. 관심 있는 항원 결합 분자가 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 갖는지 아니면 갖지 않는지를 당분야에서 공지되어 있는 방법으로 확인할 수 있다(예를 들면, 문헌(Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Coligan et al., ed. (1993)) 참조).

일부 실시양태에서, 본 발명의 항-GPC3 항체의 대안적 예에는 세포독성 물질과 접합된 항-GPC3 항체가 포함된다. 본 발명의 접합체가 본원에 기재된 접합체들로 한정되지 않지만, 이러한 항-GPC3 항체-약물 접합체(ADC)는 예를 들면, PCT 특허출원 공개 제WO2007/137170호에 구체적으로 개시되어 있다. 구체적으로, 세포독성 물질은 하기 나열된 화학요법제들 중 임의의 화학요법제일 수 있거나, 문헌(Alley et al., Curr. Opin. Chem. Biol. (2010) 14, 529-537) 또는 PCT 특허출원 공개 제WO2009/140242호에 개시된 화합물일 수 있다. 항원 결합 분자는 적절한 링커 등을 통해 이 화합물들과 접합된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항-GPC3 항체의 대안적 예에는 Fcγ 수용체에 대한 천연 인간 IgG의 Fc 영역의 결합 활성보다 Fcγ 수용체에 대한 더 높은 결합 활성을 가진 FcγR 결합 변경된 Fc 영역을 포함하는 항-GPC3 항체가 포함된다. 생성된 Fc 영역이 Fcγ 수용체에 대한 천연 인간 IgG Fc 영역의 결합 활성보다 Fcγ 수용체에 대한 더 높은 결합 활성을 가진 한, 변경은 임의의 위치에서의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 항원 결합 분자가 인간 Fc 영역으로서 인간 IgG1 Fc 영역을 함유할 때, 변경은 바람직하게는 Fc 영역으로 하여금 위치 297(EU 넘버링)에 결합된 당 쇄로서 푸코스 함유 당 쇄를 함유하게 하고 Fcγ 수용체에 대한 천연 인간 IgG Fc 영역의 결합 활성보다 Fcγ 수용체에 대한 더 높은 결합 활성을 생성하는 데 효과적이다. 이러한 아미노산 변경은 예를 들면, PCT 특허출원 공개 제WO2007/024249호, PCT 특허출원 공개 제WO2007/021841호, PCT 특허출원 공개 제WO2006/031370호, PCT 특허출원 공개 제WO2000/042072호, PCT 특허출원 공개 WO2004/029207호, PCT 특허출원 공개 제WO2004/099249호, PCT 특허출원 공개 제WO2006/105338호, PCT 특허출원 공개 제WO2007/041635호, PCT 특허출원 공개 제WO2008/092117호, PCT 특허출원 공개 제WO2005/070963호, PCT 특허출원 공개 제WO2006/020114호, PCT 특허출원 공개 제WO2006/116260호, PCT 특허출원 공개 제WO2006/023403호 및 PCT 특허출원 공개 제WO2014/097648호에 보고되어 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 항-GPC3 항체에 함유된 Fc 영역은 보다 높은 비율의 푸코스 결핍 당 쇄가 Fc 영역에 결합되도록, 또는 보다 높은 비율의 이등분 N-아세틸글루코사민이 Fc 영역에 결합된 당 쇄의 조성물에서 Fc 영역에 추가되도록 변경된 Fc 영역도 포함할 수 있다. PCT 특허출원 공개 제WO2006/046751호 및 PCT 특허출원 공개 제WO2009/041062호는 보다 높은 비율의 푸코스 결핍 당 쇄가 Fc 영역에 결합되도록, 또는 보다 높은 비율의 이등분 N-아세틸글루코사민이 Fc 영역에 결합된 당 쇄의 조성물에서 Fc 영역에 추가되도록 변경된 Fc 영역을 포함하는 항-GPC3 항체의 구체적인 예를 개시한다.

일부 실시양태에서, 본 발명에서 사용될 수 있는 항-GPC3 항체는 그의 등전점(pI)을 변경시키도록 변경된 아미노산 잔기를 가진 항-GPC3 항체를 포함한다. 항-GPC3 항체에서 "아미노산 잔기의 전기적 전하의 변경"의 바람직한 예는 PCT 특허출원 공개 제WO2009/041062호에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 항-GPC3 항체의 일차 구조를 구성하는 폴리펩티드의 번역 후 변경을 받은 변경된 형태의 항체를 포함한다. 폴리펩티드의 번역 후 변경은 폴리펩티드 생합성 동안 번역된 폴리펩티드에 제공된 화학적 변경을 지칭한다. 예를 들면, 피로글루타밀화에 의해 피로글루탐산으로의 N-말단 글루타민의 변경을 받는 항-GPC3 항체도 당연히 본 발명의 항-GPC3 항체에 포함된다. 또한, 예를 들면, 2개의 황 원자들 사이에 형성된 공유 결합을 의미하는 "디설파이드 결합"을 통해 연결된 중쇄 및 경쇄 또는 중쇄를 포함하는 번역 후 변경된 항-GPC3 항체는 본 발명의 항-GPC3 항체에 포함된다. 아미노산 시스테인에 함유된 티올기는 제2 티올기와 디설파이드 결합 또는 가교연결을 형성할 수 있다. 일반적인 IgG 분자에서, CH1 영역과 CL 영역은 디설파이드 결합을 통해 연결되고, 중쇄를 구성하는 2개의 폴리펩티드들은 EU 넘버링에 근거할 때 위치 226 및 229에서 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 디설파이드 결합을 통해 이러한 연결을 가진 번역 후 변경된 항-GPC3 항체도 본 발명의 항-GPC3 항체에 포함된다.

추가 실시양태에서, 본원에 기재된 항체들 중 임의의 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 전술된 항-GPC3 항체들 중 임의의 항체를 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 벡터를 추가로 포함한다. 추가 특정 양태에서, 벡터는 핵산의 발현에 적합한 숙주 세포에 존재한다. 추가 특정 양태에서, 숙주 세포는 진핵세포 또는 원핵세포이다. 추가 특정 양태에서, 진핵세포는 포유동물 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.

당분야에서 공지되어 있는 방법, 예를 들면, 앞서 기재된 항-GPC3 항체들 중 임의의 항-GPC3 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 발현에 적합한 형태로 함유하는 숙주 세포를 이러한 항체 또는 단편의 생성에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 상기 항체 또는 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법을 이용하여 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조할 수 있다.

[IV. 항체 제조]

항체를 생성하기 위한 당분야에서 이용가능한 기법(이의 예시적인 방법은 하기 단락에 더 상세히 기재되어 있음)을 이용하여 본원에 기재된 항체를 제조한다.

관심 있는 항원(즉, PD-L1(예컨대, 인간 PD-L1) 또는 GPC3(예컨대, 인간 글리피칸 3))에 대한 항체가 유도된다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 장애를 앓고 있는 포유동물에게의 항체의 투여는 그 포유동물에서 치료적 이점을 발생시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 ≤ 1 μΜ, ≤ 150 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들면, 10^-8M 이하, 예를 들면, 10^-8M 내지 10^-13M, 예를 들면, 10^-9M 내지 10^-13M)의 해리 상수(Kd)를 가진다.

한 실시양태에서, Kd는 하기 어세이에 의해 기재된 바와 같이 관심 있는 항체의 Fab 버전 및 이의 항원으로 수행된 방사성표지된 항원 결합 어세이(RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성은 적정 시리즈의 비표지된 항원의 존재 하에서 Fab를 최소 농도의 (¹²⁵I)-표지된 항원으로 평형화시킨 후, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다(예를 들면, 문헌(Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)) 참조). 어세이를 위한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER(등록됨) 다중-웰 플레이트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨(pH 9.6) 중의 5 ㎍/㎖의 포획 항-Fab 항체(Cappel Labs)로 밤새 코팅한 후, 실온(대략 23℃)에서 2시간 내지 5시간 동안 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단한다. 비-흡착 플레이트(Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]-항원을 관심 있는 일련의 Fab 희석물들과 혼합한다. 그 다음, 관심 있는 Fab를 밤새 항온처리하지만, 평형이 도달되는 것을 보장하기 위해 항온처리를 더 긴 시간(예를 들면, 약 65시간) 동안 계속할 수 있다. 그 후, (예를 들면, 1시간 동안) 실온에서 항온처리하기 위해 혼합물을 포획 플레이트로 옮긴다. 그 다음, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20(등록됨))으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되었을 때, 150 ㎕/웰의 신틸란트(MICROSCINT-20(상표명); 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 TOPCOUNT(상표명) 감마 카운터(팩커드) 상에서 카운팅한다. 최대 결합의 20% 이하의 결합을 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁 결합 어세이에서 사용하기 위해 선택한다.

또 다른 실시양태에 따라, 약 10 반응 유닛(RU)에서 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 BIACORE(등록됨)-2000 또는 BIACORE(등록됨)-3000(비아코어 인코포레이티드(BIAcore, Inc.), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용하는 표면 플라스몬 공명 어세이를 이용하여 Kd를 측정한다. 요약하건대, 공급자의 지시에 따라 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨(pH 4.8)으로 5 ㎍/㎖(약 0.2μM)까지 희석한 후, 약 10 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성하도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원의 주입 후, 1M 에탄올아민을 주입하여 미반응된 기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을, 약 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20(상표명)) 계면활성제를 가진 PBS(PBST)로 주입한다. 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(BIACORE(등록됨) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 계산한다. 평형 해리 상수(Kd)를 비 k_off/k_on으로서 계산한다. 예를 들면, 문헌(Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999))을 참조한다. 결합 속도가 상기 표면 플라스몬 공명 어세이에 의해 측정될 때 10⁶ M^- ¹s^- ¹를 초과할 경우, 분광계, 예컨대, 정지-유동 장착 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반된 큐벳을 가진 8000-시리즈 SLM-AMINCO(상표명) 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정될 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에서 25℃에서 PBS(pH 7.2) 중의 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 형광 방사 강도(여기 = 295 nm; 방사 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기법을 이용함으로써 결합 속도를 측정할 수 있다.

(i) 항원 제조

임의적으로 다른 분자에 접합된 가용성 항원 또는 이의 단편을 면역원으로서 사용하여 항체를 생성할 수 있다. 경막 분자들, 예컨대, 수용체들의 경우, 이들의 단편(예를 들면, 수용체의 세포외 도메인)은 면역원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 경막 분자를 발현하는 세포는 면역원으로서 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원(예를 들면, 암세포주)으로부터 유래할 수 있거나, 경막 분자를 발현하도록 재조합 기법에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체의 제조에 유용한 다른 항원 및 이의 형태는 당업자에게 자명할 것이다.

(ii) 일부 항체-기반 방법

다중클론 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 항원보강제(adjuvant)의 다회 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 생성된다. 이작용성 또는 유도체화 물질, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(라이신 잔기를 통함), 글루타르알데하이드, 석신 무수물, SOCl₂ 또는 R¹N=C=NR(이때, R 및 R¹은 상이한 알킬기임)을 사용하여 관련 항원을, 면역화될 종에서 면역원성을 나타내는 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제와 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

예를 들면, (각각 토끼 또는 마우스의 경우) 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체를 3 부피의 프로인트 완전 항원보강제(Freund's complete adjuvant)와 조합하고 용액을 다수의 부위에서 피내로 주사함으로써 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후, 원래 양의 1/5 내지 1/10 양의 프로인트 완전 항원보강제 중의 펩티드 또는 접합체를 다수의 부위에서 피하 주사함으로써 동물을 부스팅한다. 7일 내지 14일 후, 동물을 채혈하고 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 역가 정체기까지 동물을 부스팅한다. 바람직하게는, 상이한 단백질에 접합되어 있고/있거나 상이한 가교연결제를 통해 접합되어 있는 동일한 항원의 접합체로 동물을 부스팅한다. 재조합 세포 배양물에서 접합체를 단백질 융합체로서 제조할 수도 있다. 또한, 응집제, 예컨대, 명반을 적절하게 사용하여 면역 반응을 향상시킨다.

문헌(Kohler et al., Nature, 256:495 (1975))에 최초로 기재되어 있고, 예를 들면, 문헌(Hongo et al., Hybridoma, 14(3): 253-260 (1995)), 문헌(Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)), 문헌(Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 및 인간-인간 하이브리도마에 대한 문헌(Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006))에도 기재되어 있는 하이브리도마 방법을 이용하여 본 발명의 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 추가 방법은 예를 들면, 하이브리도마 세포주로부터의 단일클론 인간 천연 IgM 항체의 생성에 대한 미국 특허 제7,189,826호에 기재된 방법들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트라이오마(Trioma) 기술)은 문헌(Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)) 및 문헌(Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005))에 기재되어 있다.

다양한 다른 하이브리도마 기법들에 대해서는 예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2006/258841호; 미국 특허출원 공개 제2006/183887호(전체 인간 항체); 미국 특허출원 공개 제2006/059575호; 미국 특허출원 공개 제2005/287149호; 미국 특허출원 공개 제2005/100546호; 미국 특허출원 공개 제2005/026229호; 미국 특허 제7,078,492호; 및 미국 특허 제7,153,507호를 참조한다. 하이브리도마 방법을 이용하여 단일클론 항체를 제조하는 예시적인 프로토콜은 다음과 같이 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 이끌어내도록 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대, 햄스터를 면역화시킨다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편 및 항원보강제, 예컨대, 모노포스포릴 지질 A(MPL)/트레할로스 다이크리노마이콜레이트(TDM)(리비 이뮤노켐. 리서치 인코레이티드(Ribi Immunochem. Research, Inc.), 미국 몬타나주 해밀톤 소재)를 다회 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사하여 동물에서 항체를 생성한다. 당분야에서 잘 공지되어 있는 방법들, 예컨대, 재조합 방법들(이들 중 일부는 본원에도 기재되어 있음)을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드(예를 들면, 항원) 또는 이의 단편을 제조할 수 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 항-항원 항체에 대해 분석하고, 부스터 면역화를 임의적으로 투여한다. 항-항원 항체를 생성하는 동물로부터 림프구를 단리한다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다.

그 다음, 적합한 융합제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다. 예를 들면, 문헌(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))을 참조한다. 효율적으로 융합되고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생성을 뒷받침하고 배지, 예컨대, HAT 배지에 민감한 골수종 세포를 사용할 수 있다. 예시적인 골수종 세포는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대, 살크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래한 뮤린 골수종 세포주, 및 어메리칸 타입 컬처 콜렉션(미국 메릴랜드주 록빌 소재)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 인간 단일클론 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 기재되어 있다(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

이로써 제조된 하이브리도마 세포를, 적합한 배양 배지, 예를 들면, 비융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 배지에 시딩하고 성장시킨다. 예를 들면, 모 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)를 결여하는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로, HGPRT 결핍 세포의 성장을 방해하는 물질들인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 타이미딘을 포함할 것이다(HAT 배지). 바람직하게는, 무혈청 하이브리도마 세포 배양 배지를 사용하여 예를 들면, 문헌(Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006))에 기재된 바와 같이 동물 유래의 혈청, 예컨대, 태아 소 혈청의 사용을 감소시킨다.

하이브리도마 세포 배양의 생산성을 개선하기 위한 수단으로서의 올리고펩티드는 문헌(Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005))에 기재되어 있다. 구체적으로, 일부 아미노산들(알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린) 또는 단백질 가수분해물 분획은 표준 배양 배지에 풍부하게 존재하고, 아폽토시스는 3개 내지 6개의 아미노산 잔기들로 구성된 합성 올리고펩티드에 의해 유의하게 억제될 수 있다. 상기 펩티드는 밀리몰 이상의 농도로 존재한다.

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를, 본 발명의 항체에 결합하는 단일클론 항체의 생성에 대해 분석할 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성을 면역침전 또는 시험관내 결합 어세이, 예컨대, 방사면역어세이(RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 어세이(ELISA)로 측정할 수 있다. 단일클론 항체의 결합 친화성을 예를 들면, 스캐차드(Scatchard) 분석으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Munson et al, Anal. Biochem., 107:220 (1980))을 참조한다.

원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 제한 희석 절차로 서브클로닝할 수 있고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 문헌(Goding)을 참조한다. 이 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 추가로, 하이브리도마 세포를 동물 내의 복수 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체를 통상의 면역글로불린 정제 절차, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피로 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리한다. 하이브리도마 세포로부터 단백질을 단리하는 한 절차는 미국 특허출원 공개 제2005/176122호 및 미국 특허 제6,919,436호에 기재되어 있다. 상기 방법은 결합 과정에서 최소한의 염, 예컨대, 이액순(lyotropic) 염을 사용하는 단계 및 바람직하게는 용출 과정에서 소량의 유기 용매를 사용하는 단계도 포함한다.

(iii) 라이브러리 유래의 항체

원하는 활성 또는 활성들을 가진 항체에 대해 조합적 라이브러리를 스크리닝함으로써 본 발명의 항체를 단리할 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법들이 당분야에서 공지되어 있다. 추가 방법은 예를 들면, 문헌(Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001))에서 검토되어 있고, 예를 들면, 문헌(McCafferty et al., Nature 348:552-554); 문헌(Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)); 문헌(Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)); 문헌(Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)); 문헌(Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)); 문헌(Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)); 문헌(Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)); 및 문헌(Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132(2004))에도 기재되어 있다.

일부 파지 디스플레이 방법들에서, VH 및 VL 유전자들의 레퍼토리를 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 따로 클로닝하고 파지 라이브러리에서 무작위적으로 재조합한 후, 이 라이브러리를 문헌(Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12:433-455 (1994))에 기재된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 스크리닝할 수 있다. 파지는 전형적으로 단일 쇄 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마의 구축을 요구하지 않으면서 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 무자극 레퍼토리를 (예를 들면, 인간으로부터) 클로닝하여 문헌(Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993))에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 항원들 및 자가 항원들에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 문헌(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381-388 (1992))에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 비재배열된 V-유전자 분절을 클로닝하고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도 가변성 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 무자극 라이브러리를 합성으로 제조할 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하는 특허 공개문헌은 예를 들면, 미국 특허 제5,750,373호, 미국 특허출원 공개 제2005/0079574호, 미국 특허출원 공개 제2005/0119455호, 미국 특허출원 공개 제2005/0266000호, 미국 특허출원 공개 제2007/0117126호, 미국 특허출원 공개 제2007/0160598호, 미국 특허출원 공개 제2007/0237764호, 미국 특허출원 공개 제2007/0292936호 및 미국 특허출원 공개 제2009/0002360호를 포함한다.

인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로서 간주된다.

(iv) 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체

일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 키메라 항체이다. 일부 키메라 항체들은 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래한 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 바뀌어 있는 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

일부 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비인간 항체는 모 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 보유하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하고, 이때 HVR들, 예를 들면, CDR들(또는 이들의 일부)은 비인간 항체로부터 유래하고, FR들(또는 이들의 일부)은 인간 항체 서열로부터 유래한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부도 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화된 항체 내의 일부 FR 잔기들을 비인간 항체(예를 들면, 이 항체로부터 HVR 잔기들이 유래함)로부터의 상응하는 잔기로 치환하여, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 회복시키거나 개선한다.

인간화된 항체 및 이를 제조하는 방법은 예를 들면, 문헌(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))에서 검토되어 있고, 예를 들면, 문헌(Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)); 문헌(Queen et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)); 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호 및 제7,087,409호; 문헌(Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005))(SDR(a-CDR) 이식을 기술함)); 문헌(Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991))("재표면화(resurfacing)"를 기술함); 문헌(Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005))("FR 셔플링"을 기술함); 및 문헌(Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)) 및 문헌(Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000))(FR 셔플링을 위한 "안내된 선택" 방법을 기술함)에도 기재되어 있다.

인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 골격 영역은 "베스트-피트" 방법을 이용함으로써 선택된 골격 영역(예를 들면, 문헌(Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)) 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 골격 영역(예를 들면, 문헌(Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)); 및 문헌(Presta et al. J. Immunol, 151:2623 (1993)) 참조); 인간 성숙(체세포 돌연변이된) 골격 영역 또는 인간 생식세포주 골격 영역(예를 들면, 문헌(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)) 참조); 및 FR 라이브러리의 스크리닝으로부터 유래한 골격 영역(예를 들면, 문헌(Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)) 및 문헌(Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)) 참조)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 인간 항체이다. 당분야에서 공지되어 있는 다양한 기법들을 이용하여 인간 항체를 생성할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌(van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001)) 및 문헌(Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008))에 기재되어 있다.

항원성 챌린지에 반응하여 온전한 인간 항체, 또는 인간 가변 영역을 가진 온전한 항체를 생성하도록 변경되어 있는 형질전환 동물에게 면역원을 투여함으로써 인간 항체를 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내재성 면역글로불린 좌위를 대체하거나 염색체 외부에 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위적으로 삽입되어 있는 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 형질전환 마우스에서, 내재성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 불활성화되어 있다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 논평에 대해서는 문헌(Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005))을 참조한다. 예를 들면, XENOMOUSE(상표명) 기술을 기술하는 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; HUMAB(등록됨) 기술을 기술하는 미국 특허 제5,770,429호; K-M MOUSE(등록됨) 기술을 기술하는 미국 특허 제7,041,870호; 및 VELOCIMOUSE(등록됨) 기술을 기술하는 미국 특허출원 공개 제2007/006190호도 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과 조합됨으로써 더 변경될 수 있다.

인간 항체는 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수도 있다. 인간 단일클론 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다(예를 들면, 문헌(Kozbor J. Immunol, 133:3001 (1984)); 문헌(Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)); 및 문헌(Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991)) 참조). 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체도 문헌(Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006))에 기재되어 있다. 추가 방법은 예를 들면, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터의 단일클론 인간 IgM 항체의 제조를 기술함) 및 문헌(Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006))(인간-인간 하이브리도마를 기술함)에 기재된 방법들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트라이오마 기술)도 문헌(Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)) 및 문헌(Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005))에 기재되어 있다.

인간 항체는 인간 유래의 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수도 있다. 그 다음, 이러한 가변 도메인 서열은 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법은 이하에 기재되어 있다.

(v) 항체 단편

항체 단편은 전통적인 수단, 예컨대, 효소적 분해 또는 재조합 기법에 의해 생성될 수 있다. 일부 환경에서, 전체 항체보다 오히려 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 보다 작은 크기의 단편은 신속한 제거를 가능하게 하고, 고형 종양에의 개선된 접근으로 이어질 수 있다. 일부 항체 단편의 논평에 대해서는 문헌(Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134)을 참조한다.

항체 단편을 생성하는 다양한 기법들이 개발되었다. 전통적으로, 이 단편은 온전한 항체의 단백질용해성 분해를 통해 유도되었다(예를 들면, 문헌(Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)); 및 문헌(Brennan et al., Science, 229:81 (1985)) 참조). 그러나, 이 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 대장균에서 발현될 수 있고 대장균으로부터 분비될 수 있으므로, 다량의 이 단편의 용이한 생성을 가능하게 한다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접적으로 회수될 수 있고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 방식에 따르면, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 에피토프 잔기에 결합하는 살비지 수용체를 포함하는, 증가된 생체내 반감기를 가진 Fab 및 F(ab')₂ 단편은 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편의 다른 제조 기법은 숙련된 자에게 명확할 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일 쇄 Fv 단편(scFv)이다. PCT 특허출원 공개 제WO93/16185호; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호를 참조한다. Fv 및 scFv는 불변 영역을 결여하는 온전한 조합 부위를 가진 유일한 종이므로; 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합체를 생성하도록 구축될 수 있다. 상기 문헌(Antibody Engineering, ed. Borrebaeck)을 참조한다. 예를 들면, 항체 단편은 예를 들면, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수도 있다. 이러한 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

(vi) 단일 도메인 항체

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단일 도메인 항체이다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재; 예를 들면, 미국 특허 제6,248,516호 참조). 한 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 구성된다.

(vii) 항체 변이체

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변경(들)이 예상된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 변화를, 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변경은 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성을 보유하는 한, 최종 구축물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 만들 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 만들어지는 시점에서 본 항체 아미노산 서열 내로 도입될 수 있다.

(viii) 치환, 삽입 및 결실 변이체

일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발에 대한 관심 있는 부위는 HVR들 및 FR들을 포함한다. 보존적 치환이 "바람직한 치환"의 표제 하에서 표 1에 표시되어 있다. 보다 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하에서 표 1에 제공되어 있고 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 이하에 더 기재된 바와 같다. 아미노산 치환을 관심 있는 항체 내로 도입할 수 있고 생성물을 원하는 활성, 예를 들면, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝할 수 있다.

아미노산들은 공통된 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:

a. 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

b. 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

c. 산성: Asp, Glu;

d. 염기성: His, Lys, Arg;

e. 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

f. 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이들 클래스들 중 한 클래스의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.

한 유형의 치환 변이체는 모 항체(예를 들면, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 일부 생물학적 성질(예를 들면, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)에서 변경(예를 들면, 개선)을 가질 것이고/가질 것이거나 모 항체의 일부 생물학적 성질을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들면, 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙 기법, 예컨대, 본원에 기재된 기법을 이용함으로써 편리하게 생성될 수 있는 친화성 성숙된 항체이다. 요약하건대, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 변이체 항체를 파지 상에서 디스플레이하고 특정 생물학적 활성(예를 들면, 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다.

예를 들면, 항체 친화성을 개선하기 위해 HVR에서 변경(예를 들면, 치환)을 만들 수 있다. HVR "핫스폿", 즉 체세포 성숙 과정(예를 들면, 문헌(Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) 참조) 동안 고빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기, 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이러한 변경을 만들 수 있고, 이로써 생성된 변이체 VH 또는 VL을 결합 친화성에 대해 시험한다. 이차 라이브러리의 구축 및 이차 라이브러리로부터의 재선택에 의한 친화성 성숙은 예를 들면, 문헌(Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 기재되어 있다. 친화성 성숙의 일부 실시양태에서, 다양한 방법들 중 임의의 방법(예를 들면, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발)으로 다양성을, 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입한다. 그 다음, 이차 라이브러리를 생성한다. 그 다음, 상기 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화성을 가진 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 여러 HVR 잔기(예를 들면, 한 번에 4개 내지 6개의 잔기)를 무작위화하는 HVR-지정된 방법을 포함한다. 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기를 구체적으로 확인할 수 있다. 특히, 종종 CDR-H3 및 CDR-L3을 표적화한다.

일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있지만, 이러한 변경은 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는다. 예를 들면, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들면, 본원에서 제공된 보존적 치환)을 HVR에서 만들 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스폿" 또는 SDR의 외부에 존재할 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 일부 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 1개, 2개 또는 3 ㎕의 아미노산 치환을 함유한다.

돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌(Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085)에 기재된 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로서 지칭된다. 이 방법에서, 표적 잔기들(예를 들면, 하전된 잔기, 예컨대, arg, asp, his, lys 및 glu) 중 한 잔기 또는 이들의 군을 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여, 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 확인한다. 추가 치환을 아미노산 위치에서 도입하여, 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 이용하여 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인할 수 있다. 치환을 위한 후보로서 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기를 표적화할 수 있거나 제거할 수 있다. 변이체가 원하는 성질을 함유하는지를 확인하기 위해 상기 변이체를 스크리닝할 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 1개 잔기 길이 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이를 가진 아미노-말단 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라, 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입도 포함한다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 가진 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N-말단 또는 C-말단과, 효소(예를 들면, ADEPT의 경우), 또는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드의 융합체를 포함한다.

(ix) 글리코실화 변이체

일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써, 항체에의 글리코실화 부위의 추가 또는 항체로부터의 글리코실화 부위의 결실을 편리하게 달성할 수 있다.

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 부착된 탄수화물을 변경시킬 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지된 바이안테나리(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들면, 문헌(Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997))을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라, 바이안테나리 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 일부 개선된 성질을 가진 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고사카라이드의 변경을 만들 수 있다.

한 실시양태에서, Fc 영역을 포함하는 항체 변이체가 제공되고, 이때 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조물은 감소된 푸코스를 갖거나 푸코스를 결여하고, 이것은 ADCC 기능을 개선할 수 있다. 구체적으로, 야생형 CHO 세포에서 생성된 동일한 항체 상의 푸코스의 양에 비해 감소된 푸코스를 가진 항체가 본원에서 예상된다. 즉, 이 항체는 천연 CHO 세포(예를 들면, 천연 글리코실화 패턴을 생성하는 CHO 세포, 예컨대, 천연 FUT8 유전자를 함유하는 CHO 세포)에 의해 생성된 경우 가질 푸코스의 양보다 더 적은 양의 푸코스를 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 항체는 푸코스를 포함하는 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만의 N-연결된 글리칸을 가진 항체이다. 예를 들면, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65%, 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 푸코스를 포함하는 N-연결된 글리칸을 갖지 않는 항체이고, 즉 상기 항체는 푸코스를 완전히 결여하거나, 푸코스를 갖지 않거나 아푸코실화되어 있다. 예를 들면, PCT 특허출원 공개 제WO2008/077546호에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광측정에 의해 측정될 때 Asn297에 부착된 모든 당구조물들(예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합계를 기준으로 Asn297에서 당쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 푸코스의 양을 측정한다. Asn297은 Fc 영역 내의 약 위치 297(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치하는 아스파라긴 잔기를 지칭하나; Asn297은 항체의 소수 서열 변이로 인해 위치 297의 ±3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수도 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2003/0157108호(Presta, L.); 및 미국 특허출원 공개 제2004/0093621호(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스 결핍" 항체 변이체와 관련된 공개문헌의 예에는 미국 특허출원 공개 제2003/0157108호; PCT 특허출원 공개 제WO2000/61739호; PCT 특허출원 공개 제WO2001/29246호; 미국 특허출원 공개 제2003/0115614호; 미국 특허출원 공개 제2002/0164328호; 미국 특허출원 공개 제2004/0093621호; 미국 특허출원 공개 제2004/0132140호; 미국 특허출원 공개 제2004/0110704호; 미국 특허출원 공개 제2004/0110282호; 미국 특허출원 공개 제2004/0109865호; PCT 특허출원 공개 제WO2003/085119호; PCT 특허출원 공개 제WO2003/084570호; PCT 특허출원 공개 제WO2005/035586호; PCT 특허출원 공개 제WO2005/035778호; PCT 특허출원 공개 제WO2005/053742호; PCT 특허출원 공개 제WO2002/031140호; 문헌(Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)); 및 문헌(Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004))이 포함된다. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화에서 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허출원 공개 제2003/0157108호(Presta, L); 및 PCT 특허출원 공개 제WO2004/056312호(Adams et al.), 특히 실시예 11), 및 넉아웃 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 넉아웃 CHO 세포(예를 들면, 문헌(Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)); 문헌(Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)); 및 PCT 특허출원 공개 제WO2003/085107호)가 포함된다.

항체 변이체는 이등분된 올리고사카라이드도 구비하고 있고, 예를 들면, 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테나리 올리고사카라이드는 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들면, PCT 특허출원 공개 제 WO2003/011878호(Jean-Mairet et al.); 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al.); 미국 특허출원 공개 제2005/0123546호(Umana et al.); 및 문헌(Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5):851-861 (2006))에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에서 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 가진 항체 변이체도 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들면, PCT 특허출원 공개 제WO1997/30087호(Patel et al.); PCT 특허출원 공개 제WO1998/58964호(Raju, S.); 및 PCT 특허출원 공개 제WO1999/22764호(Raju, S.)에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Fc 영역을 포함하는 항체 변이체는 FcγRIII에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Fc 영역을 포함하는 항체 변이체는 인간 이펙터 세포의 존재 하에서 ADCC 활성을 갖거나, 인간 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 동일한 항체에 비해 인간 이펙터 세포의 존재 하에서 증가된 ADCC 활성을 가진다.

(x) Fc 영역 변이체

일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변경은 본원에서 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입됨으로써, Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변경(예를 들면, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능이 아닌 일부 이펙터 기능을 보유함으로써, 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 일부 이펙터 기능(예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 적용분야를 위한 바람직한 후보가 될 항체 변이체를 예상한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 어세이를 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결실을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체(FcR) 결합 어세이를 수행하여, 항체가 FcγR 결합을 결여하지만(이로써 ADCC 활성을 결여할 가능성이 있지만) FcRn 결합 능력을 보유한다는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵세포는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌(Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991))의 제464면 상의 표 3에 요약되어 있다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 어세이의 비-한정적 예는 미국 특허 제5,500,362호(예를 들면, 문헌(Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 및 문헌(Hellstrom, I. et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)) 참조); 및 미국 특허 제5,821,337호(문헌(Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)) 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 어세이 방법이 이용될 수 있다(예를 들면, 유세포측정을 위한 ACTI(상표명) 비-방사성 세포독성 어세이(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재); 및 CytoTox 96(등록됨) 비-방사성 세포독성 어세이(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 이러한 어세이에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 천연 킬러(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들면, 동물 모델, 예컨대, 문헌(Clynes et al. Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 95:652-656 (1998))에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다. C1q 결합 어세이를 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없으므로 CDC 활성을 결여한다는 것을 확인할 수도 있다. 예를 들면, PCT 특허출원 공개 제WO2006/029879호 및 제WO2005/100402호에 기재된 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 어세이를 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌(Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)); 문헌(Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)); 및 문헌(Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)) 참조). 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용하여 FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정도 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌(Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)) 참조).

감소된 이펙터 기능을 가진 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329(미국 특허 제6,737,056호) 중 하나 이상의 Fc 영역 잔기가 치환된 항체를 포함한다. 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯한, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상의 아미노산 위치에서 치환된 Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 제7,332,581호).

FcR에의 개선된 또는 감소된 결합을 가진 일부 항체 변이체가 기재되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,737,056호; PCT 특허출원 공개 제WO2004/056312호; 및 문헌(Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)) 참조).

일부 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 항체는 그의 Fc 영역에서 아미노산 치환 S298A, E333A 및 K334A를 포함한다.

일부 실시양태에서, 예를 들면, 미국 특허 제6,194,551호, PCT 특허출원 공개 제WO99/51642호 및 문헌(Idusogie et al. J. Immunol. 164:4178-4184 (2000))에 기재된 바와 같이 C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변경시키는(즉, 개선하거나 감소시키는) 변경을 Fc 영역에서 만든다.

증가된 반감기를 갖고, 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))에의 개선된 결합을 가진 항체는 미국 특허출원 공개 제2005/0014934(Hinton et al.)호에 기재되어 있다. 항체는 Fc 영역과 FcRn의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상의 Fc 영역 잔기에서 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 가진 Fc 변이체를 포함한다(미국 특허 제7,371,826호). Fc 영역 변이체의 다른 예에 대한 문헌(Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)); 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 PCT 특허출원 공개 제WO94/29351호를 참조한다.

(xi) 항체 유도체

본 발명의 항체는 당분야에서 공지되어 있고 용이하게 입수될 수 있는 추가 비단백질성 모이어티를 함유하도록 더 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-한정적 예에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조에 있어서 장점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지될 수 있거나 비분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 상이할 수 있고, 1개 초과의 중합체들이 부착되는 경우, 이들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화를 위해 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체가 소정의 조건 하에서 요법에 사용될지 여부 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 고려사항에 근거하여 결정될 수 있다.

(xii) 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

재조합 방법을 이용하여 항체를 제조할 수도 있다. 항-항원 항체의 재조합 제조를 위해, 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고 추가 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA를 용이하게 단리할 수 있고, 통상의 절차를 이용하여(예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열결정할 수 있다. 많은 벡터들이 이용될 수 있다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 성분들 중 하나 이상의 성분을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.

(a) 신호 서열 성분

본 발명의 항체는 직접적으로 재조합 제조될 수 있을 뿐만 아니라, 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특정 절단 부위를 가진 다른 폴리펩티드인 이종 폴리펩티드를 가진 융합 폴리펩티드로서 제조될 수도 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는(예를 들면, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 이종 신호 서열이다. 천연 항체 신호 서열을 인식하지 못하고 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들면, 알칼리성 포스파타제(phosphatase), 페니실리나제(penicillinase), lpp 및 열-안정성 장독소 II 리더로 구성된 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은 예를 들면, 효모 인버타제(invertase) 리더, 인자 리더(사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더를 포함함), 또는 산 포스파타제 리더, 칸디다 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제(glucoamylase) 리더, 또는 PCT 특허출원 공개 제WO90/13646호에 기재된 신호로 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들면, 헤르페스 심플렉스 gD 신호도 이용될 수 있다.

(b) 복제 기점

발현 벡터 및 클로닝 벡터는 벡터로 하여금 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이 서열은 벡터로 하여금 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있게 하고 복제 기점 또는 자가 복제 서열을 포함하는 서열이다. 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대한 이러한 서열은 잘 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대다수의 그람-음성 세균들에 적합하고, 플라스미드 기점 2μ는 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점들(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터를 위해 요구되지 않는다(SV40 기점은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 전형적으로 단독으로 사용될 수 있다).

(c) 선택 유전자 성분

발현 벡터 및 클로닝 벡터는 선택 마커로서 지칭되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, (c) 복합 배지로부터 이용될 수 없는 핵심 영양분을 공급하는 단백질을 코딩한다(예를 들면, 바실러스(Bacilli)의 경우 D-알라닌 라세마제(racemase)를 코딩하는 유전자).

선택 방식의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키기 위해 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하므로 선택 방식에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.

포유동물 세포에 적합한 선택 마커의 또 다른 예는 항체 코딩 핵산을 흡수하는 데 유능한 세포의 확인을 가능하게 하는 선택 마커, 예컨대, DHFR, 글루타민 신쎄타제(synthetase)(GS), 타이미딘 키나제(kinase), 메탈로티오네인(metallothionein)-I 및 메탈로티오네인-II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제(deaminase), 오르니틴 데카복실라제(ornithine decarboxylase) 등이다

예를 들면, DHFR 유전자로 형질전환된 세포는 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이 조건 하에서, 임의의 다른 공-형질전환된 핵산과 함께 DHFR 유전자를 증폭한다. 내인성 DHFR 활성에서 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주(예를 들면, ATCC CRL-9096)를 사용할 수 있다.

대안적으로, GS 유전자로 형질전환된 세포는 GS의 억제제인 L-메티오닌 설폭시민(Msx)을 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이 조건 하에서, 임의의 다른 공-형질전환된 핵산과 함께 GS 유전자를 증폭한다. 전술된 DHFR 선택/증폭 시스템과 함께 GS 선택/증폭 시스템을 사용할 수 있다.

대안적으로, 관심 있는 항체를 코딩하는 DNA 서열, 야생형 DHFR 유전자 및 또 다른 선택 마커, 예컨대, 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)로 형질전환되었거나 공-형질전환된 숙주 세포(특히, 내재성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 상기 선택 마커에 대한 선택 물질, 예컨대, 아미노글리코시드산 항생제, 예를 들면, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418을 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.

효모에서 사용되기에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp 1 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp 1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력을 결여하는 돌연변이체 효모 균주, 예를 들면, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다(Jones, Genetics, 85:12 (1977)). 그 다음, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp 1 병변의 존재는 트립토판의 부재 하에서의 성장으로 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

추가로, 1.6㎛ 원형 플라스미드 pKD1로부터 유도된 벡터가 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 대안적으로, 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis)의 경우 재조합 소 카이모신(chymosin)의 대규모 제조를 위한 발현 시스템이 보고되었다(Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)). 클루이베로마이세스의 산업용 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-카피 발현 벡터도 개시되어 있다(Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)).

(d) 프로모터 성분

발현 벡터 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 함께 사용되기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대, tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 세균 프로모터가 적합하다. 세균 시스템에서 사용될 프로모터는 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno)(S.D.) 서열도 함유할 것이다.

진핵생물에 대한 프로모터 서열은 공지되어 있다. 사실상, 모든 진핵 유전자들은 전사가 시작되는 부위로부터 약 25 내지 30 염기 업스트림에 위치하는 AT-풍부 영역을 가진다. 많은 유전자들의 전사의 시작 부위로부터 79 내지 80 염기 업스트림에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역이고, 이때 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대다수의 진핵 유전자들의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에의 폴리 A 꼬리의 추가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이 서열들 전부가 진핵 발현 벡터 내로 적절하게 삽입된다.

효모 숙주와 함께 사용되기에 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소, 예컨대, 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트라이오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.

성장 조건에 의해 조절되는 전사라는 추가 장점을 가진 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 데하이드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 사용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용되기에 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 제73,657호에도 기재되어 있다. 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

포유동물 숙주 세포에서의 벡터로부터의 항체 전사는 예를 들면, 바이러스, 예컨대, 폴리오마 바이러스, 파울폭스 바이러스, 아데노바이러스(예컨대, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 또는 원숭이 바이러스 40(SV40)의 게놈으로부터 수득된 프로모터, 또는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들면, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 또는 열-충격 프로모터에 의해 조절될 수 있지만, 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용가능하다.

SV40 바이러스의 초기 프로모터 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점도 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 소 파필로마 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키는 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이 시스템의 변경은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 타이미딘 키나제 프로모터의 조절 하에서 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현시키는 것에 대해서는 문헌(Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982))도 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부를 프로모터로서 사용할 수 있다.

(e) 인핸서 요소 성분

고등 진핵생물에 의한 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 종종 증가된다. 많은 인핸서 서열들이 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 현재 공지되어 있다. 전형적으로, 그러나, 진핵세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예에는 복제 기점(bp 100-270)의 뒤쪽에 있는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒤쪽에 있는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해서는 문헌(Yaniv, Nature 297:17-18 (1982))도 참조한다. 인핸서는 항체 코딩 서열에 대한 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있으나, 바람직하게는 프로모터로부터의 위치 5'에 위치한다.

(f) 전사 종결 성분

진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다핵 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 전사의 종결 및 mRNA의 안정화를 위해 필요한 서열도 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 비번역된 영역 및 종종 3' 비번역된 영역으로부터 이용될 수 있다. 이 영역들은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역된 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 분절을 함유한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. PCT 특허출원 공개 제W094/11026호 및 본원에 개시된 발현 벡터를 참조한다.

(g) 숙주 세포의 선택 및 형질전환

본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키는 데 적합한 숙주 세포는 전술된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 이 목적에 적합한 원핵생물은 유박테리아(eubacteria), 예컨대, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae), 예컨대, 에스케리키아(Escherichia), 예를 들면, 대장균(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella)뿐만 아니라, 바실러스(Bacilli), 예컨대, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis)(예를 들면, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 개시된 바실러스 리체니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대, 슈도모나스 애루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 한 바람직한 대장균 클로닝 숙주는 대장균 294(ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예컨대, 대장균 B, 대장균 X1776(ATCC 31,537) 및 대장균 W3110(ATCC 27,325)도 적합하다. 이 예들은 한정하기 위한 것이기보다는 예시하기 위한 것이다.

특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 때, 예컨대, 치료 항체가 종양 세포 파괴에서 그 자체로 효과를 보이는 세포독성제(예를 들면, 독소)에 접합되어 있을 때, 전장 항체, 항체 융합 단백질 및 항체 단편을 세균에서 생성할 수 있다. 전장 항체는 순환계에서 더 큰 반감기를 가진다. 대장균에서의 생성은 더 빠르고 더 비용 효율적이다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는 예를 들면, 발현 및 분비를 최적화하기 위한 번역 시작 영역(TIR) 및 신호 서열을 기술하는 미국 특허 제5,648,237호(Carter et al.), 미국 특허 제5,789,199호(Joly et al.) 및 미국 특허 제5,840,523호(Simmons et al.)를 참조한다. 대장균에서의 항체 단편의 발현을 기술하는 문헌(Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254)도 참조한다. 발현 후, 가용성 분획 중의 대장균 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 예를 들면, 이소타입에 따라 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제할 수 있다. 예를 들면, CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하는 방법과 유사한 방법으로 최종 정제를 수행할 수 있다.

원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대, 사상 진균 또는 효모도 항체 코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 베이커 효모는 하등 진핵 숙주 미생물들 중에서 가장 흔히 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주, 예컨대, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대, 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위커라미이(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이(K. waltii)(ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 클루이베로마이세스 써모톨러란스(K. thermotolerans) 및 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레시아(Trichoderma reesia)(EP244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈반니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대, 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들면, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼길러스(Aspergillus) 숙주, 예컨대, 아스퍼길러스 니둘란스(A. nidulans) 및 아스퍼길러스 니게르(A. niger)가 통상적으로 이용될 수 있고 본원에서 유용하다. 치료 단백질의 생성을 위한 효모 및 사상 진균의 사용을 논의하는 논평에 대해서는 예를 들면, 문헌(Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004))을 참조한다.

글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 가진 항체를 생성하는 일부 진균 및 효모 균주들이 선택될 수 있다. 예를 들면, (피키아 파스토리스에서 글리코실화 경로의 인간화를 기술하는) 문헌(Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)); 및 상기 문헌(Gerngross et al.)을 참조한다.

글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터도 유래한다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 숙주, 예컨대, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 애데스 애집티(Aedes aegypti)(모기), 애데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(초파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)로부터 다수의 바큘로바이러스 균주들 및 변이체들, 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주들, 예를 들면, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하고, 이러한 바이러스들은 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원의 바이러스로서 사용될 수 있다.

목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 좀개구리밥(레니나세애(Leninaceae)), 자주개자리(메디카고 트룬카툴라(M. truncatula)) 및 담배도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, (형질전환 식물에서 항체를 생성하는 PLANTIBODIES(상표명) 기술을 기술하는) 미국 특허 제5,959,177호, 미국 특허 제6,040,498호, 미국 특허 제6,420,548호, 미국 특허 제7,125,978호 및 미국 특허 제6,417,429호를 참조한다.

척추동물 세포는 숙주로서 사용될 수 있고, 배양물(조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 상용적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(293 세포, 또는 현탁 배양물에서 성장되도록 서브클로닝된 293 세포, Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리(Sertoli) 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al, Annals NY. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주(Hep G2)이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포(Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 비롯한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주들의 논평에 대해서는 예를 들면, 문헌(Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268)을 참조한다.

항체 생성을 위해 숙주 세포를 전술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환하고, 적절한 경우 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하도록 변경된 통상의 영양 배지에서 상기 숙주 세포를 배양한다.

(h) 숙주 세포의 배양

본 발명의 항체를 생성하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대, 햄스(Ham's) F10(시그마(Sigma)), 최소 필수 배지((MEM), 시그마), RPMI-1640(시그마), 및 둘베코스 변경 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM), 시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 추가로, 문헌(Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)), 문헌(Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)), 미국 특허 제4,767,704호, 미국 특허 제4,657,866호, 미국 특허 제4,927,762호, 미국 특허 제4,560,655호 또는 미국 특허 제5,122,469호, PCT 특허출원 공개 제WO90/03430호, PCT 특허출원 공개 제WO87/00195호 또는 미국 특허 재발행 제30,985호에 기재된 배지들 중 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지들 중 임의의 배지는 필요한 경우 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오티드(예컨대, 아데노신 및 타이미딘), 항생제(예컨대, GENTAMYCIN(상표명) 약물), 미량 원소(통상적으로 마이크로몰 범위 내의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 균등한 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 당분야의 숙련된 자에게 공지되어 있을 임의의 다른 필요한 보충제도 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있는 배양 조건이고, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 자명할 것이다.

(xiii) 항체의 정제

재조합 기법을 이용할 때, 항체는 세포 내에서 생성될 수 있거나, 주변세포질 공간 내에서 생성될 수 있거나, 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생성되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 잔해물(debris)을 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과로 제거한다. 문헌(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992))에는 대장균의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하는 절차가 기재되어 있다. 요약하건대, 세포 페이스트를 약 30분에 걸쳐 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에서 해동시킨다. 세포 잔해물을 원심분리로 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 일반적으로 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 이용하여 이러한 발현 시스템으로부터 상청액을 먼저 농축시킨다. 상기 단계들 중 임의의 단계에서 프로테아제 억제제, 예컨대, PMSF를 포함시켜 단백질용해를 억제할 수 있고, 항생제를 포함시켜 우연한 오염물질의 성장을 방지할 수 있다.

예를 들면, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여, 세포로부터 준비된 항체 조성물을 정제할 수 있고, 이때 친화성 크로마토그래피는 전형적으로 바람직한 정제 단계들 중 하나이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 의해 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 기반한 항체를 정제할 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 모든 마우스 이소타입들 및 인간 γ3의 경우 단백질 G가 권장된다(Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되어 있는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용될 수 있다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대, 조절된 공극 유리 또는 폴리(스티렌다이비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 유속 및 프로세싱 시간보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX(상표명) 수지(제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 미국 뉴저지주 필립스버그 소재)가 정제에 유용하다. 다른 단백질 정제 기법, 예컨대, 이온-교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE(상표명) 크로마토그래피 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대, 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전도 회수될 항체에 따라 이용될 수 있다.

일반적으로, 상기 방법들과 일치하고/일치하거나 당분야에서 숙련된 자에 의해 관심 있는 특정 항체에 적합한 방법으로서 간주되는, 연구, 시험 및 임상에서 사용될 다양한 항체 제조 방법들이 당분야에서 잘 확립되어 있다.

C. 생물학적 활성 항체의 선택

치료적 관점에서 볼 때 유리한 성질을 가진 항체를 선택하기 위해, 또는 항체의 생물학적 성질을 보유하는 제형 및 조건을 선택하기 위해 전술된 바와 같이 생성된 항체를 하나 이상의 "생물학적 활성" 어세이로 처리할 수 있다. 항체를 그의 생성에 사용된 항원에 결합하는 그의 능력에 대해 시험할 수 있다. 예를 들면, 당분야에서 공지되어 있는 방법(예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯 등)을 이용할 수 있다.

예를 들면, 항-PD-L1 항체의 경우, PD-L1에 결합하는 능력을 검출하는 어세이에서 항체의 항원 결합 성질을 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 결합을 예를 들면, 포화 결합; ELISA; 및/또는 경쟁 어세이(예를 들면, RIA)로 측정할 수 있다. 또한, 예를 들면, 치료제로서의 그의 효과를 평가하기 위해 항체를 다른 생물학적 활성 어세이로 처리할 수 있다. 이러한 어세이는 당분야에서 공지되어 있고 표적 항원 및 항체에 대한 의도된 용도에 의해 좌우된다. 예를 들면, 항체에 의한 PD-L1 차단의 생물학적 효과를, 예를 들면, 미국 특허 제8,217,149호에 기재된 바와 같이 CD8+ T 세포, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV) 마우스 모델 및/또는 동계(syngeneic) 종양 모델에서 평가할 수 있다.

관심 있는 항원 상의 특정 에피토프에 결합하는 항체(예를 들면, 항-PD-L1 항체와 PD-L1의 결합을 차단하는 항체)에 대해 스크리닝하기 위해, 상용적인 교차차단 어세이, 예컨대, 문헌(Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988))에 기재된 어세이를 수행할 수 있다. 대안적으로, 예를 들면, 문헌(Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995))에 기재된 바와 같이, 에피토프 맵핑을 수행하여 항체가 관심 있는 에피토프에 결합하는지를 확인할 수 있다.

D. 약학 조성물 및 제형

본원은 활성 성분으로서 PD-1 축 결합 길항제 및/또는 본원에 기재된 항체(예컨대, 항-PD-L1 항체 또는 항-GPC3 항체) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물 및 제형도 제공한다.

본원에 기재된 "조합물"은 병용을 위한 활성 성분들의 조합물을 의미하고, 별도의 물질들이 투여 시 병용되는 방식, 및 이들이 혼합물(조합 제제)로서 제공되는 방식 둘 다를 포함한다.

원하는 순도를 가진 활성 성분들(예컨대, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-GPC3 항체)을 하나 이상의 임의적 약학적으로 허용가능한 담체(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여, 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 본원에 기재된 약학 조성물 및 제형을 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용된 용량 및 농도에서 일반적으로 수용자에게 독성을 나타내지 않고, 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대-이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 간질 약물 분산제, 예컨대, 가용성 중성-활성 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예컨대, rHuPH20(HYLENEX(등록됨), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))도 포함한다. rHuPH20을 비롯한 일부 예시적인 sHASEGP들 및 사용 방법은 미국 특허출원 공개 제2005/0260186호 및 미국 특허출원 공개 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가 글리코사미노글리카나제, 예컨대, 콘드로이티나제와 병용된다.

예시적인 동결건조된 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 PCT 특허출원 공개 제WO2006/044908호에 기재된, 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함하는 수성 항체 제형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PD-L1 항체는 약 60 mg/㎖ 농도의 항체, 약 20 mM 농도의 히스티딘 아세테이트, 약 120 mM 농도의 수크로스 및 0.04%(w/v) 농도의 폴리소르베이트(예를 들면, 폴리소르베이트 20)를 포함하는 제형에 존재하고, 상기 제형은 약 5.8의 pH를 가진다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PD-L1 항체는 약 125 mg/㎖ 농도의 항체, 약 20 mM 농도의 히스티딘 아세테이트, 약 240 mM 농도의 수크로스 및 0.02%(w/v) 농도의 폴리소르베이트(예를 들면, 폴리소르베이트 20)를 포함하는 제형에 존재하고, 상기 제형은 약 5.5의 pH를 가진다.

본원의 조성물 및 제형은 치료되는 특정 징후에 필요한 하나 초과의 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 가진 활성 성분들도 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분들은 적절하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다.

활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법들은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))에 개시되어 있다.

지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다. 생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 일반적으로 멸균 상태이다. 멸균성은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.

[IV. 치료 방법]

본원은 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하거나, 암을 예방하거나 암의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 치료의 중단 후 개체에서 지속된 반응을 발생시킨다. 본원에 기재된 방법은 향상된 면역원성이 요구되는 상태를 치료하는 데, 예컨대, 암의 치료를 위해 종양 면역원성을 증가시키는 데 이용될 수 있다. 본원은 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법도 제공한다. 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응은 대식세포 및 다핵 거대세포를 비롯한 면역세포가 종양 조직 내로 침윤되는 것을 포함한다. 또 다른 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응은 종양 침윤된 림프구(TIL)에서의 CD45-양성 림프구, CD3ε-양성 림프구 및 CD8-양성 T 림프구의 증가를 포함한다. 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 PD-1 축 결합 길항제들 및 항-GPC3 항체들 중 임의의 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체가 본 방법에서 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 개체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 개체는 GPC3-양성 암을 가진다. 일부 실시양태에서, GPC3-양성 암은 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 결장암, 신장암, 식도암 또는 전립선암이다. 일부 실시양태에서, 간암은 간세포 암종이다. 일부 실시양태에서, 유방암은 유방 암종 또는 유방 선암종이다. 일부 실시양태에서, 유방 암종은 침습성 유관 암종이다. 일부 실시양태에서, 폐암은 폐 선암종이다. 일부 실시양태에서, 결장암은 대장 선암종이다. 일부 실시양태에서, 개체에서 암세포는 PD-L1을 발현한다. 일부 실시양태에서, 개체에서 암세포는 검출가능한(예를 들면, 당분야에서 공지되어 있는 방법의 이용을 통해 검출가능한) 수준에서 GPC3 단백질을 발현한다.

일부 실시양태에서, 개체는 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체를 사용한 병용 치료 전에 GPC3 표적화된 요법으로 치료받는다. 일부 실시양태에서, GPC3 표적화된 요법은 하나 이상의 소분자, 예를 들면, 소라페닙을 사용한 치료를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 병용요법은 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체의 투여를 포함한다. PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체는 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들면, PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체는 순차적으로(상이한 시간에) 또는 동시적으로(동일한 시간에) 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제는 항-GPC3 항체와 분리된 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제는 항-GPC3 항체와 동일한 조성물에 존재한다.

PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체는 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 안구내, 이식, 흡입, 경막내, 뇌실내 또는 코내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 안구내, 이식, 흡입, 경막내, 뇌실내 또는 코내로 투여된다. 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체는 질환의 예방 또는 치료를 위해 투여될 수 있다. PD-1 축 결합 길항제 및/또는 항-GPC3 항체의 적절한 용량은 치료될 질환의 유형, PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 개체의 임상적 상태, 개체의 임상적 이력 및 치료에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 근거하여 결정될 수 있다.

일반적인 제안으로서, 인간에게 투여되는 항체의 치료 유효량은 1회 이상의 투여에 의한 약 0.01 내지 약 50 mg/환자 체중 kg의 범위 내에 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 사용되는 항체는 예를 들면, 매일 투여되는 약 0.01 내지 약 45 mg/kg, 약 0.01 내지 약 40 mg/kg, 약 0.01 내지 약 35 mg/kg, 약 0.01 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 내지 약 25 mg/kg, 약 0.01 내지 약 20 mg/kg, 약 0.01 내지 약 15 mg/kg, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 약 1 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 항체는 15 mg/kg으로 투여된다. 그러나, 다른 복용법도 유용할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PD-L1 항체는 21일 주기의 1일째 날 약 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg 또는 약 1400 mg의 용량으로 인간에게 투여된다. 용량은 단회 용량 또는 다회 용량(예를 들면, 2회 또는 3회 용량), 예컨대, 주입으로서 투여될 수 있다. 병용 치료에서 투여되는 항체의 용량은 단일 치료에 비해 감소될 수 있다. 이 요법의 진행은 통상의 기법에 의해 용이하게 모니터링된다.

일부 실시양태에서, 상기 방법들은 추가 요법을 추가로 포함할 수 있다. 추가 요법은 방사선 요법, 수술(예를 들면, 소괴절제술 및 유방절제술), 화학요법, 유전자 요법, DNA 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 면역요법, 골수 이식, 나노요법, 단일클론 항체 요법, 또는 이들의 병용일 수 있다. 추가 요법은 항원보강제 또는 신생항원보강제(neoadjuvant) 요법의 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 요법은 소분자 효소 억제제 또는 항-전이성 물질의 투여이다. 일부 실시양태에서, 추가 요법은 부작용 제한 물질(예를 들면, 치료의 부작용의 발생 및/또는 중증도를 감소시키기 위한 물질, 예컨대, 진토제 등)의 투여이다. 일부 실시양태에서, 추가 요법은 방사선 요법이다. 일부 실시양태에서, 추가 요법은 수술이다. 일부 실시양태에서, 추가 요법은 방사선 요법과 수술의 병용이다. 일부 실시양태에서, 추가 요법은 감마 방사선조사이다. 일부 실시양태에서, 추가 요법은 PI3K/AKT/mTOR 경로를 표적화하는 요법, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 아폽토시스 억제제 및/또는 화학예방제이다. 추가 요법은 본원에 기재된 화학요법제들 중 하나 이상의 화학요법제일 수 있다.

[V. 제품 또는 키트]

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제 및/또는 항-GPC3 항체를 포함하는 제품 또는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 제품 또는 키트는 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키거나 암을 가진 개체의 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시키기 위해 항-GPC3 항체와 함께 PD-1 축 결합 길항제를 사용하는 것에 대한 설명서를 포함하는 포장 삽지도 포함한다. 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응은 대식세포 및 다핵 거대세포를 비롯한 면역세포가 종양 조직 내로 침윤되는 것을 포함한다. 또 다른 예를 들면, 종양 세포에 대한 향상된 면역 반응은 종양 침윤된 림프구(TIL)에서의 CD45-양성 림프구, CD3ε-양성 림프구 및 CD8-양성 T 림프구의 증가를 포함한다. 본원에 기재된 PD-1 축 결합 길항제들 및/또는 항-GPC3 항체들 중 임의의 PD-1 축 결합 길항제 및/또는 항-GPC3 항체가 제품 또는 키트에 포함될 수 있다.

일부 실시양태에서, PD-1 축 결합 길항제 및 항-GPC3 항체는 동일한 용기 또는 별도의 용기 내에 존재한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 백(bags) 및 주사기를 포함한다. 상기 용기는 다양한 재료들, 예컨대, 유리, 플라스틱(예컨대, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀), 또는 금속 합금(예컨대, 스테인레스 스틸 또는 하스텔로이)으로부터 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 제형을 보유하고, 용기 상에 존재하거나 용기와 회합되어 있는 표지는 사용 지침을 표시할 수 있다. 제품 또는 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서를 가진 포장 삽지를 비롯한, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 볼 때 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제품은 하나 이상의 또 다른 물질(예를 들면, 화학요법제 및 항-신생물성 물질)도 포함한다. 하나 이상의 물질에 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 백 및 주사기를 포함한다.

본 명세서는 당분야에서 숙련된 자로 하여금 본 발명을 실시할 수 있게 하기에 충분한 것으로 간주된다. 본원에 제시되어 있고 기재되어 있는 변경 이외의 본 발명의 다양한 변경이 상기 설명으로부터 당분야에서 숙련된 자에게 명확해질 것이고 첨부된 청구범위 내에 속한다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌들, 특허들 및 특허출원들은 모든 목적을 위해 전체적으로 본원에 참고로 도입된다.

[실시예 1]

인간 글리피칸-3(GPC3)을 발현하는 마우스 세포주

FuGENE6(로슈 다이아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corp))을 사용하여 마우스 암세포주 Hepa1-6(ATCC 번호 CRL-1830) 및 CT26(ATCC 번호 CRL-2638)을 인간 GPC3 발현 벡터 pCXND2/hGPC3(FL)[Ishiguro T. et al., Cancer Res. 2008; 68: 9832-9838]으로 형질감염시키고 1 mg/㎖ G418(인비트로겐(Invitrogen))로 선택하였다. 심지어 G418의 존재 하에서도 성장하는 세포를 수집하였고 콜로니를 제한 희석으로 단리하였다. 인간 GPC3의 발현을, 항-인간 GPC3 항체인 GC33[Ishiguro T. et al., Cancer Res. 2008; 68: 9832-9838]을 사용하는 FACS로 확인하였다. 대표적인 클론을 선택하여 실험을 위해 사용하였다.

[실시예 2]

인간 GPC3을 발현하는 Hepa1-6 세포주를 사용하는 동계 마우스 모델에서 항-GPC3 항체의 항-종양 활성

항온처리기(37℃ 및 5% CO₂로 설정됨)에서 세포 배양 플라스크를 이용하여 Hepa1-6/hGPC3 세포를 배양하였다. 트립신을 사용하여 세포를 플라스크로부터 탈착시켰고 10%(v/v) FBS 및 0.6 mg/㎖ G418을 함유하는 D-MEM으로 세척하였다. 그 다음, 세포를 D-MEM에 재현탁하였고(2x10⁸개 세포/㎖), 동등한 부피의 매트리겔을 첨가하였다. 이식을 위한 세포 농도는 1x10⁸개 세포/㎖였다. 세포를 각각의 C57BL/6J 마우스(찰스 리버 래보라토리스 재팬(Charles River Laboratories Japan))의 우측 옆구리 내로 피하 접종하였다(1x10⁷개 세포/마우스). 일단 촉진가능한 종양이 확립되면, 연구가 시작되었을 때 각각의 군이 유사한 평균 종양 부피를 갖도록 동물들을 시험군으로 무작위배정하였다. PBS에 희석된 1 또는 5 mg/kg의 마우스 GC33 항-인간 GPC3 단일클론 항체[PCT 특허출원 공개 제WO2006/006693호], 또는 비히클 대조군으로서 PBS를 종양 접종 후 14일째 날, 21일째 날 및 28일째 날에 정맥내로 주사하였다. 마우스 GC33은 비히클 대조군에 비해 용량 의존적으로 종양 성장의 억제를 보였다(도 1).

[실시예 3]

인간 GPC3을 발현하는 Hepa1-6 세포주를 사용하는 동계 마우스 모델에서 항-GPC3 항체에 의해 유도된 병리학적 변화

마우스 GC33 치료에 의한 Hepa1-6 종양 조직에서의 변화를 평가하기 위해, 마우스 GC33 항체 또는 비히클 대조군의 단회 주사로부터 3일 또는 7일 후 단리된 종양 조직을 병리학적 검사에 사용하였다. 종양 조직을 4% 포름알데하이드(PFA)로 고정시키고 AMeX 방법[Suzuki et al, J Toxicol Sci. 2002; 27:165-172, Watanabe et al, J Toxicol Pathol. 2015; 28: 43-49]으로 파라핀에 매립하였다. 3개의 마이크로미터 파라핀 박편들을 헤마톡실린 및 에오신(HE) 또는 면역조직화학(IHC)으로 염색하였다. IHC 염색을 표지된 스트렙타비딘-바이오틴(LSAB) 방법(RTU 호스라디쉬 퍼록시다제 스트렙타비딘)에 따라 수행하였다. F4/80(뮤린 대식세포의 마커 항원; A3-1, 바이오레전드(BioLegend)) 또는 PD-L1(마우스 B7-H1/PD-L1의 마커 항원; AF1019, 알&디 시스템스(R&D systems))에 대한 항체를 일차 항체로서 사용하였다. 양성 신호를 퍼록시다제-다이아미노벤지딘 반응으로 가시화하였고, 박편을 헤마톡실린으로 반대염색하였다.

마우스 GC33 주사에 의해 면역세포 침윤 및 종양 세포 사멸이 종양 조직의 주변 영역에서 관찰되었다. 종양 세포 사멸이 마우스 GC33에 의해 치료된 종양 조직에서 관찰된 영역에서 F4/80-양성 대식세포의 증가된 침윤도 관찰된 반면, F4/80-양성 세포는 비히클 대조군으로 치료된 종양 조직의 간질 영역에서 주로 관찰되었다(도 2a). 그 후, PD-L1 발현은 대조군 비히클에 비해, 특히 침윤된 면역세포 상에서 마우스 GC33에 의해 증가되었는데, 이것은 PD-L1이 마우스 GC33에 의한 항-종양 활성을 억제하기 위해 유도되었을 것임을 암시하였다(도 2b).

[실시예 4]

인간 GPC3을 발현하는 CT26 세포주를 사용하는 동계 마우스 모델에서 항-GPC3 항체(GC33)와 항-PD-L1 항체( 10F.9G2 ) 의 병용 시 항-종양 활성

마우스 CT26/hGPC3 모델에서 항-GPC3 또는 항-PD-L1 단일요법 또는 병용요법의 항-종양 활성을 평가하기 위해, 1x10⁶개의 CT26/hGPC3 세포의 피하 접종 후 3일째 날(초기 치료 모델) 또는 15일째 날(확립된 모델)부터 마우스 GC33 항체 및/또는 500 ㎍의 항-마우스 PD-L1 래트 항체 10F.9G2(바이오엑스셀(BioXCell)로부터 구입됨)를 주사하였다. 초기 치료 모델에서, 5 또는 25 mg/kg의 마우스 GC33을 3일째 날, 6일째 날, 10일째 날 및 13일째 날에 정맥내로 주사하였고, 500 ㎍의 항-PD-L1 항체 10F.9G2를 단일 물질 또는 조합물로서 동일한 스케쥴로 주사하였다. 확립된 모델에서, 5 또는 25 mg/kg의 마우스 GC33을 15일째 날 및 18일째 날에 정맥내로 주사하였고 500 ㎍의 항-PD-L1 항체 10F.9G2를 단일 물질 또는 조합물로서 동일한 스케쥴로 주사하였다.

두 모델들에서, 25 mg/kg의 GC33과 10F.9G2의 병용은 각각의 단일요법에 의한 항-종양 활성에 비해 가장 강력한 항-종양 활성을 보였다(도 3 및 4).

[실시예 5]

인간 GPC3을 발현하는 Hepa1 -6 세포주를 사용하는 동계 마우스 모델에서 항-GPC3 항체(GC33)와 항-PD-L1 항체(10F.9G2)의 병용 시 항-종양 활성

3주 동안 주당 1회 1, 5 또는 25 mg/kg의 마우스 GC33 항체, 또는 200 ㎍의 항-마우스 PD-L1 래트 항체 10F.9G2에 이어, 2주 동안 매주 100 ㎍을 전술된 바와 동일한 Hepa1-6 보유 마우스에게 단일 약제 또는 조합물로서 정맥내로 주사하였다. 전술된 통상의 방법으로 제조된 HE 염색 박편을 사용하여 병리학적 검사를 수행하였다. IHC의 경우, 표 2에 나열된 일차 항체를 각각의 마커에 대해 사용하였고 전술된 LSAB 방법 또는 ENV+ 방법으로 가시화하였다. 각각의 군으로부터 3마리 대표적인 동물들에 대해 IHC를 수행하였다.

마우스 GC33 또는 10F.9G2는 비히클 대조군에 비해 종양 성장의 억제를 보였지만, 마우스 GC33 및 10F.9G2 병용은 가장 강한 항-종양 활성을 보였다(도 5a). 3차 주사 후 5일째 날, 모든 마우스들을 부검하였고 종양 조직을 병리학적으로 평가하였다. 검사된 종양 조직에서, 25 mg/kg의 마우스 GC33을 PD-L1 항체와 병용하여 치료한 모든 마우스들, 및 5 mg/kg의 마우스 GC33을 PD-L1 항체와 병용하여 치료한 5마리의 마우스들 중 4마리의 마우스들에서 가시적인 종양 세포가 관찰되지 않았다(도 5b).

각각의 치료된 종양 조직의 병리학적 검사는 비히클 대조군에 비해 각각의 치료에 의해 F4/80-양성 세포의 수, 및 종양 조직 내로 침윤된 단핵 거대세포(MNGC) 및 CD3-양성 세포 상에서의 PD-L1 발현의 증가, 및 CD206-양성 세포, CD163-양성 세포 및 CD11b-양성 세포의 수 및 다핵 세포(MNC) 상에서의 PD-L1 발현의 감소를 보여주었다. 병용에 의해, CD3-양성 T 세포의 침윤은 항-종양 활성과 관련되어 있는 경향을 가진 각각의 단일요법보다 더 증가되었다(표 3)

[실시예 6]

인간 GPC3을 발현하는 Hepa1 -6 세포주를 사용하는 동계 마우스 모델에서 항-GPC3 항체(GC33)와 항-PD-L1 항체(6E11)의 병용 시 항-종양 활성

1 mg/kg 또는 5 mg/kg의 마우스 GC33을, 확립된 Hepa1-6/hGPC3 종양을 가진 C57BL/6J 마우스에게 매주 1회 또는 3회(q7d x 3) 정맥내로 제공하였다. 항-마우스 PD-L1 mAb(클론 6E11, mIgG2A, D265A 및 N297A; 제넨텍[PCT 특허출원 공개 제WO2015/095418호])를 10 mg/kg의 양으로 매주 1회 정맥내로 제공한 후, 5 mg/kg의 양으로 매주 2회 복강내로 제공하였다(q7d x 3).

병용요법은 단일요법을 사용한 치료에 비해 종양 성장의 억제를 증가시켰다(도 6a 및 6b). 1 mg/kg mGC33 단회, 5 mg/kg mGC33 단회, 1 mg/kg mGC33 q7d x 3, 5 mg/kg mGC33 q7d x 3, 6E11 q7d x 3, 6E11 q7d x 3 + 1 mg/kg mGC33 단회, 6E11 q7d x 3 + 5 mg/kg mGC33 단회, 및 6E11 q7d x 3 + 1 mg/kg mGC33 q7d x 3, 6E11 q7d x 3 + 5 mg/kg mGC33 q7d x 3의 종양 성장 억제 값의 최종 측정치는 각각 73%, 84%, 73%, 80%, 88%, 85%, 95%, 88% 및 104%였다. 5 mg/kg mGC33 q7d x 3 군에서 1마리 마우스, 1 mg/kg mGC33 q7d x 3 군에서 1마리 마우스, 5 mg/kg mGC33 단회 군에서 1마리 마우스, 및 1 mg/kg mGC33 단회 군에서 2마리 마우스들이 종양 진행에 의해 안락사되었다. 투여 기간 동안 사망한 마우스들이 전혀 관찰되지 않았고 심각한 체중 감소도 관찰되지 않았다(도 6c).

조직병리학의 결과로부터, 증가된 심각한 괴사를 동반하거나 동반하지 않는 종양 면적의 감소가 mGC33, 6E11 및 조합물의 투여에 관찰되었다(도 7). 6E11 q7d x 3 + 5 mg/kg mGC33 단회 또는 q7d x 3 군에서, 병리학적 완전 반응(pCR; 조직병리학 슬라이드 상의 종양 조직 부재)은 5마리의 마우스들 중 1마리 또는 2마리의 마우스에서 관찰되었다. 나아가, 대식세포/다핵 거대세포를 비롯한 면역세포의 침윤을 가진 종양의 괴사는 모든 치료군들에서 인지되었고; 병변의 중증도는 하기 순서와 같았다: mGC33 5 mg/kg 단회 또는 q7d x 3, 6E11 q7d x 3 < mGC33 5 mg/kg 단회 또는 q7d x 3 + 6E11 q7d x 3(도 8a). 도 8b에 제시된 바와 같이, 종양 덩어리의 주변부에서 관찰된 F4/80-양성 세포는 병용 사례에서 가장 풍부하였고, 그 다음 mGC33 또는 6E11 q7d x 3 및 비히클에서 이 순서로 풍부하였다(도 8b). 비히클에서, PD-L1-양성 반응은 약한 강도로 종양 세포의 세포질에서 주로 인지되었다. 다른 한편으로, 대식세포/다핵 거대세포를 비롯한 면역세포에서 PD-L1-양성 반응의 증가된 강도(약한 내지 중간) 및 빈도가 모든 치료군들에서 인지되었다(도 8c).

[실시예 7]

인간 GPC3을 발현하는 Hepa1-6 세포주를 사용하는 동계 마우스 모델에서 세포독성 T 세포의 유도

NK 세포 및 대식세포에 의한 선천성 면역 이외에, 세포독성 T 세포에 의한 후천성 면역의 유도는 종양 세포를 사멸시키는 데 중요하다. 치료받은 마우스들에서 후천성 면역의 유도를 평가하기 위해, 종양 조직 내로 침윤된 T 세포를 평가하였다. 인간 GPC3을 발현하는 Hepa1-6 세포를 C57BL/6J 마우스 내로 피하 접종하였다. 일단 촉진가능한 종양이 확립되면, 마우스들을 12개의 군들로 배정하였는데; 3개의 군들은 대조군으로서 사용되었고, 3개의 군들은 종양 접종 후 13일째 날 및 20일째 날에 5 mg/kg의 마우스 GC33으로 2회 치료받았고, 3개의 군들은 종양 접종 후 13일째 날에 10 mg/kg의 6E11로 치료받았고 20일째 날에 5 mg/kg의 6E11로 치료받았고, 3개의 군들은 마우스 GC33(종양 접종 후 13일째 날 및 20일째 날 2회)과 6E11(종양 접종 후 13일째 날 10 mg/kg의 6E11 및 20일째 날 5 mg/kg의 6E11)의 병용으로 치료받았다. 2차 투여로부터 1일, 3일 및 8일 후, 종양 조직을 단리하고 분쇄하였다. 잰틀맥스(gentleMACS)(상표명) 옥토 해리기(Octo Dissociator)로 분해한 후, 세포를 세척하고 유세포측정에 사용하여 CD45-양성, CD3ε-양성, CD4-양성 또는 CD8-양성 종양 침윤된 림프구(TIL)를 정량하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 마우스 GC33 또는 6E11로 치료받은 마우스들에서 CD45-양성 림프구, CD3ε-양성 T 림프구 및 CD8-양성 T 림프구의 증가가 관찰되었으나, CD4-양성 림프구의 증가는 관찰되지 않았다. 전술된 항-종양 활성과 마찬가지로, 마우스 GC33과 6E11의 병용 시, CD8-양성 TIL을 포함하는 림프구의 유도는 각각의 단일요법보다 더 강하게 관찰되었다.

본 발명은 병용에 의한 PD-1 축 결합 길항제 또는 항-GPC3 항체의 효능 개선 및 치료되는 환자의 QOL의 개선에 기여하고, 간암을 비롯한 암의 치료에 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha GENENTECH, INC. <120> METHODS OF TREATING CANCERS USING PD-1 AXIS BINDING ANTAGONISTS AND ANTI-GPC3 ANTIBODIES <130> PCG-9046WO <150> JP2016-051424 <151> 2016-03-15 <160> 55 <210> 1 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 115 120 125 Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys 180 185 190 Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 210 215 220 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 305 310 315 320 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 340 345 350 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 355 360 365 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Asp or Gly <400> 5 Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Ser Trp Ile His 1 5 10 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Ser or Leu <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = Thr or Ser <400> 6 Ala Trp Ile Xaa Pro Tyr Gly Gly Ser Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10 <210> 10 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial 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Claims

PD-1 축 결합 길항제와 병용되는, 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 약학 조성물로서, 활성 성분으로서 항-GPC3 항체를 포함하는 약학 조성물.
제1항에 있어서,
항-GPC3 항체가 PD-1 축 결합 길항제의 투여 전에, PD-1 축 결합 길항제의 투여와 동시에, 또는 PD-1 축 결합 길항제의 투여 후에 투여되는, 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
제3항에 있어서,
PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 PD-1의 결합을 억제하는, 약학 조성물.
제3항에 있어서,
PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 B7-1의 결합을 억제하는, 약학 조성물.
제3항에 있어서,
PD-L1 결합 길항제가 PD-L1과 PD-1 및 B7-1 둘 다의 결합을 억제하는, 약학 조성물.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
PD-L1 결합 길항제가 항-PD-L1 항체인, 약학 조성물.
제3항에 있어서,
PD-L1 결합 길항제가 YW243.55.S70, 아테졸리주맙(Atezolizumab), MPDL3280A, MDX-1105 및 MEDI4736으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
제7항에 있어서,
항-PD-L1 항체가 서열번호 19의 HVR-H1 서열, 서열번호 20의 HVR-H2 서열 및 서열번호 21의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 22의 HVR-L1 서열, 서열번호 23의 HVR-L2 서열 및 서열번호 24의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.
제7항에 있어서,
항-PD-L1 항체가 서열번호 25 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
항-GPC3 항체가 서열번호 34의 HVR-H1 서열, 서열번호 35의 HVR-H2 서열 및 서열번호 36의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 37의 HVR-L1 서열, 서열번호 38의 HVR-L2 서열 및 서열번호 39의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
항-GPC3 항체가, 제2 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 상기 제2 항체가 서열번호 42의 HVR-H1 서열, 서열번호 43의 HVR-H2 서열 및 서열번호 44의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 45의 HVR-L1 서열, 서열번호 46의 HVR-L2 서열 및 서열번호 47의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
항-GPC3 항체가 인간화된 항체인, 약학 조성물
제13항에 있어서,
항-GPC3 항체가 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
암이 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 결장암, 신장암, 식도암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.