ES2904286T3 - Métodos de tratamiento de cánceres que emplean antagonistas que se unen al eje PD-1 y anticuerpos anti-GPC3 - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o el retraso de la progresión del cáncer en un individuo, en donde la composición farmacéutica se usa en combinación con Atezolizumab, comprendiendo dicha composición un anticuerpo anti-GPC3 como ingrediente activo.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de tratamiento de cánceres que emplean antagonistas que se unen al eje PD-1 y anticuerpos anti-GPC3

Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos para tratar cánceres mediante la administración de un antagonista que se une al eje PD-1 y un anticuerpo anti-GPC3.

Antecedentes de la invención

El cáncer hepatocelular es, según se ha informado, la quinta causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo, y representa aproximadamente 600.000 muertes cada año (bibliografía de no patente 1). La mayoría de los pacientes con cáncer hepatocelular mueren dentro del transcurso de 1 año después de ser diagnosticados con la enfermedad. Desafortunadamente, los casos de cáncer hepatocelular se diagnostican con frecuencia en un estadio tardío que rara vez responde a terapias curativas. Aun así, los tratamientos médicos que incluyen quimioterapia, quimioembolización, ablación y terapia con haz de protones no son suficientemente efectivos para tales pacientes. Muchos pacientes presentan una recurrencia de la enfermedad con invasión vascular y múltiples metástasis intrahepáticas, que progresan rápidamente a un estadio avanzado. Sus tasas de supervivencia hasta 5 años son solo del 7% (bibliografía de no patente 2). Los pacientes con cáncer hepatocelular susceptibles de resección de focos locales tienen un pronóstico relativamente bueno, aunque sus tasas de supervivencia hasta 5 años aún se mantienen en un nivel del 15% y 39% (bibliografía de no patente 3). Por tanto, existe una demanda en la técnica de nuevas terapias para ese tipo de enfermedad maligna, el cáncer hepatocelular.

Según se ha informado, el cáncer hepatocelular es responsable de más del 90% de los casos de cáncer de hígado primario en Japón. Los métodos médicos para tratar ese cáncer hepatocelular incluyen, por ejemplo, la terapia de embolización arterial transcatéter (TAE) basada en quimioterapia, que implica inducir una necrosis selectiva del cáncer hepatocelular mediante la inyección de una mezcla de un medio de contraste a base de aceite (Lipiodol), un agente contra el cáncer y una sustancia obstructiva (Gelfoam) en la arteria hepática (la cual sirve como vía de suministro de nutrientes al tumor), lo que provoca la obstrucción de la arteria nutriente. Además, se utilizan enfoques invasivos, como la inyección percutánea de etanol, la terapia de coagulación con microondas percutánea y la ablación con radiofrecuencia. Además, se han realizado ensayos clínicos sobre quimioterapia sistémica con agentes quimioterapéuticos tales como fluorouracilo (5-FU), uracilo-tegafur (UFT), mitomicina C (MMC), mitoxantrona (DHAD), adriamicina (ADR), epirrubicina (EPI) y cisplatino (CDDP), ya sea solos o en combinación con interferón (IFN) (bibliografía de no patente 4).

Mientras tanto, se ha aprobado una forma oralmente activa de sorafenib (Nexavar, BAY43-9006), que es ventajosamente más eficaz que los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente, de tal manera que ese agente bloquea el crecimiento de las células cancerosas al inhibir la cinasa Raf en la transducción de la señal Raf/MEK/ERK, mientras el agente ejerce efectos antiangiogénicos al dirigirse a VEGFR-2, VEGFR-3 y PDGFR-beta tirosina cinasas. La eficacia de sorafenib se ha estudiado en dos ensayos multicéntricos controlados con placebo de fase III (ensayo del protocolo aleatorizado de evaluación de HCC de Sorafenib (SHARP) y ensayo de Asia-Pacífico) dirigidos al cáncer hepatocelular avanzado. Se ha confirmado que sorafenib prolonga la duración de la supervivencia, con una HR de 0,68, en ambos ensayos. En el ensayo SHARP, sorafenib prolongaba la duración de la supervivencia hasta 10,7 meses frente a los 7,9 meses con el placebo. En el ensayo asiático, este agente prolongaba la duración de la supervivencia hasta 6,5 meses frente a los 4,2 meses con el placebo. Sin embargo, el agente tenía una tasa de respuesta objetiva baja y no mostraba una prolongación del tiempo hasta la progresión sintomática, aunque el agente prolongaba el tiempo hasta la progresión del tumor (5,5 meses frente a 2,8 meses en el ensayo europeo y el americano y 2,8 meses frente a 1,4 meses en el ensayo asiático) en las imágenes. Las cohortes asiáticas mostraban una corta duración de la prolongación de la vida, lo que probablemente se debía a que sus tratamientos se iniciaron en un estadio ligeramente posterior durante el proceso de la enfermedad en la región asiática, en comparación con Europa y los Estados Unidos (bibliografías de no patente 5 y 6).

A medida que avanza el cáncer de hígado, generalmente se observan sus síntomas específicos asociados con una disfunción hepática, tales como anorexia, pérdida de peso, malestar general, masa hipocondrial derecha palpable, dolor hipocondrial derecho, sensación de plenitud abdominal, fiebre e ictericia. Los agentes quimioterapéuticos (p. ej., sorafenib), sin embargo, tienen que superar complicaciones, incluyendo sus reacciones adversas inherentes tales como diarrea o estreñimiento, anemia, supresión del sistema inmunológico que causa infección o sepsis (con gravedad letal), hemorragia, toxicidad cardíaca, toxicidad hepática, toxicidad renal, anorexia y pérdida de peso.

Aunque inicialmente no se observan síntomas particulares en un estadio temprano en el cáncer de hígado, sus síntomas específicos asociados con una disfunción hepática, tales como anorexia, pérdida de peso, malestar general, masa hipocondrial derecha palpable, dolor hipocondrial derecho, sensación de plenitud abdominal, fiebre e ictericia, se observan generalmente con la progresión del cáncer de hígado. Según la observación clínica, esos síntomas se potencian mediante el uso de agentes quimioterapéuticos. Por ejemplo, la anorexia en un paciente con células de cáncer de hígado detectables y síntomas tales como pérdida de peso asociada o independientemente de la anorexia, pueden potenciarse más mediante la administración de agentes quimioterapéuticos al paciente que sin el uso de agentes quimioterapéuticos. En algunos casos, se debe suspender el uso de agentes quimioterapéuticos en el paciente que presenta tales síntomas. Esos síntomas intensificados son impedimentos para los tratamientos con agentes quimioterapéuticos. Por tanto, existe una demanda para el establecimiento de una terapia excelente desde el punto de vista de, por ejemplo, mejorar los efectos terapéuticos o mejorar la calidad de vida de los pacientes que se van a tratar.

El glipicano 3 (GPC3) se expresa con frecuencia a un alto nivel en el cáncer de hígado y, como tal, parece ser útil en la identificación de sus funciones en el cáncer de hígado o como diana terapéutica o de diagnóstico del cáncer de hígado.

En las circunstancias descritas anteriormente, se están desarrollando fármacos con GPC3 como diana terapéutica del cáncer de hígado. Se ha desarrollado un fármaco contra el cáncer de hígado que comprende un anticuerpo anti-GPC3 como ingrediente activo, teniendo el anticuerpo una actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (en lo sucesivo, denominada "ADCC") y/o citotoxicidad dependiente del complemento (en lo sucesivo, denominada "CDC") contra las células que expresan GPC3 (bibliografía de patente 1). Además, se ha desarrollado como ingrediente activo un fármaco dirigido a GPC3 que comprende un anticuerpo anti-GPC3 humanizado que tiene actividad ADCC y actividad CDC (bibliografía de patente 2). Se han desarrollado más fármacos dirigidos a GPC3, que comprenden un anticuerpo anti-GPC3 humanizado con actividad ADCC mejorada (bibliografías de patentes 3 y 4) o un anticuerpo anti-GPC3 que tiene actividad ADCC y actividad CDC, así como una dinámica plasmática mejorada (bibliografía de patente 5). Se ha descubierto que esos anticuerpos anti-GPC3 en una terapia de combinación con agentes quimioterapéuticos tales como sorafenib, atenúan las reacciones adversas, por ejemplo, provocadas por la terapia única de los agentes quimioterapéuticos (p. ej., sorafenib) y también se ha encontrado que muestran efectos sinérgicos basados en esos agentes (bibliografía de patente 6). Por consiguiente, se están estableciendo métodos excelentes para tratar el cáncer de hígado utilizando fármacos dirigidos a GPC3 como núcleo desde el punto de vista de, por ejemplo, mejorar los efectos terapéuticos o mejorar la calidad de vida de los pacientes que se van a tratar.

Por otro lado, proporcionar dos señales distintas a los linfocitos T es un modelo ampliamente aceptado para la activación de linfocitos T en reposo a través de células presentadoras de antígeno (APCs). Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci 53: 27-42 (1975). Este modelo prevé además una discriminación entre propio y lo que no es propio y la tolerancia inmune. Bretscher et al, Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al, J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987). La señal primaria, o señal específica de un antígeno, se transduce a través del receptor de linfocitos T (TCR) después del reconocimiento de un péptido del antígeno extraño presentado en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). La segunda señal o coestimuladora se envía a los linfocitos T mediante moléculas coestimuladoras expresadas en células presentadoras de antígeno (APCs), que inducen a los linfocitos T a favorecer la expansión clonal, la secreción de citocinas y la función efectora. Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14:233 (1996). En ausencia de coestimulación, los linfocitos T pueden volverse refractarios frente a una estimulación antigénica, no generar una respuesta inmunitaria eficaz y, además, pueden dar lugar a un agotamiento o tolerancia frente a antígenos extraños.

En el modelo de dos señales, los linfocitos T reciben señales coestimuladoras secundarias tanto positivas como negativas. La regulación de tales señales positivas y negativas es fundamental para maximizar las respuestas inmunes protectoras del hospedador, a la vez que se mantiene la tolerancia inmunológica y se previene la autoinmunidad. Las señales secundarias negativas parecen necesarias para la inducción de tolerancia de los linfocitos T, mientras que las señales positivas favorecen la activación de los linfocitos T. Si bien el modelo simple de dos señales todavía proporciona una explicación válida para los linfocitos vírgenes, la respuesta inmune de un hospedador es un proceso dinámico y también se pueden proporcionar señales coestimuladoras a los linfocitos T expuestos al antígeno. El mecanismo de coestimulación es de interés terapéutico porque se ha mostrado que la manipulación de señales coestimuladoras proporciona un medio para mejorar o terminar la respuesta inmune basada en células. Recientemente, se ha descubierto que la disfunción o anergia de los linfocitos T ocurre simultáneamente con una expresión inducida y sostenida del receptor inhibidor, el polipéptido de muerte programada 1 (PD-1). Como resultado, el direccionamiento terapéutico de PD-1 y otras moléculas que señalizan a través de interacciones con PD-1, tales como el ligando de muerte programada 1 (PD-L1) y el ligando de muerte programada 2 (PD-L2), son un área de gran interés.

PD-L1 se sobreexpresa en muchos cánceres y a menudo se asocia con un pronóstico malo (Okazaki T et al., Intern. Immun. 2007 19(7):813) (Thompson RH et al., Cancer Res 2006, 66(7):3381). Curiosamente, la mayoría de los linfocitos T que se infiltran en un tumor expresan predominantemente PD-1, en contraste con los linfocitos T en los tejidos normales y los linfocitos T de la sangre periférica, lo que indica que la regulación al alza de PD-1 en los linfocitos T reactivos con un tumor, puede contribuir al deterioro de las respuestas inmunes antitumorales. (Blood 2009 114(8): 1537). Esto puede deberse al uso favorecido de la señalización de PD-L1 mediada por las células tumorales que expresan PD-L1 que interaccionan con los linfocitos T que expresan PD-1, para dar como resultado una atenuación de la activación de los linfocitos T y evasión de la vigilancia inmunitaria (Sharpe et al., Nat Rev 2002) (Keir ME et al., 2008 Annu. Rev. Immunol. 26:677). Por tanto, una inhibición de la interacción PD-L1/PD-1 puede potenciar la destrucción de tumores mediada por linfocitos T CD8+. El documento WO 2015/112805 describe anticuerpos biespecíficos que se unen a PD-L1 y a glipicano-3 para uso en el tratamiento de cánceres

La diana terapéutica PD-1 y otras moléculas que señalizan a través de interacciones con PD-1, como el ligando de muerte programada 1 (PD-L1) y el ligando de muerte programada 2 (PD-L2), son un área de gran interés. La inhibición de la señalización de PD-L1 se ha propuesto como un medio para mejorar la inmunidad de los linfocitos T para el tratamiento del cáncer (p. ej., inmunidad tumoral) y la infección, incluida la infección tanto aguda como crónica (p. ej., persistente). Un tratamiento terapéutico óptimo puede combinar el bloqueo de la interacción receptor/ligando de PD-1 con un agente que inhibe directamente el crecimiento tumoral. Sigue existiendo una necesidad de una terapia óptima para tratar, estabilizar, prevenir y/o retrasar el desarrollo de diversos cánceres.

Por consiguiente, la invención se refiere a una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o el retraso de la progresión de un cáncer en un individuo, en donde la composición farmacéutica se usa en combinación con atezolizumab, comprendiendo dicha composición un anticuerpo anti-GPC3 como ingrediente activo.

Compendio de la invención

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento, se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante una terapia (o para diagnóstico).

Los inventores han descubierto que mediante la combinación de un anticuerpo anti-GPC3 con un antagonista que se une al eje PD-1 humano, se pueden lograr mejores efectos terapéuticos en un paciente con cáncer que cuando se utiliza solo ese anticuerpo anti-GPC3 o un antagonista que se une al eje PD-1 humano.

Por tanto, también se describe un método para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista que se une al eje PD-1 humano y un anticuerpo anti-GPC3.

En el presente documento se describe además un método para mejorar las respuestas inmunes contra células tumorales en un individuo que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad eficaz de un antagonista que se une al eje PD-1 y un anticuerpo anti-GPC3. Por ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen la infiltración de células inmunes que incluyen macrófagos y células gigantes multinucleadas dentro de los tejidos tumorales. En otro ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen el aumento de linfocitos positivos para CD45, linfocitos positivos para CD3s y linfocitos T positivos para CD8 en los linfocitos infiltrados en tumores (TILs, por sus siglas en inglés).

Se describe adicionalmente en el presente documento el uso de un antagonista que se une al eje PD-1 humano en la preparación de un medicamento para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo, en donde el medicamento comprende el antagonista que se une al eje PD-1 humano y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable, y en donde el tratamiento comprende la administración del medicamento en combinación con una composición que comprende un anticuerpo anti-GPC3 y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable.

También se describe en el presente documento el uso de un anticuerpo anti-GPC3 en la preparación de un medicamento para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo, en donde el medicamento comprende el anticuerpo anti-GPC3 y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable, y en donde el tratamiento comprende la administración del medicamento en combinación con una composición que comprende un antagonista que se une al eje PD-1 humano y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento se describe además una composición que comprende un antagonista que se une al eje PD-1 humano y un vehículo opcional farmacéuticamente, aceptable para uso en el tratamiento o el retraso de la progresión de un cáncer en un individuo, en donde el tratamiento comprende la administración de dicha composición en combinación con una segunda composición, en donde la segunda composición comprende un anticuerpo anti-GPC3 y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable.

También se describe en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo anti-GPC3 y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable para uso en el tratamiento o el retraso de la progresión de un cáncer en un individuo, en donde el tratamiento comprende la administración de dicha composición en combinación con una segunda composición, en donde la segunda composición comprende un antagonista que se une al eje PD-1 humano y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable.

También se describe en el presente documento un kit que comprende un medicamento que comprende un antagonista que se une al eje PD-1 y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable, y un prospecto que comprende instrucciones para la administración del medicamento en combinación con una composición que comprende un anticuerpo anti-GPC3 y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo.

También se describe un kit que comprende un primer medicamento que comprende un antagonista que se une al eje PD-1 y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable, y un segundo medicamento que comprende un anticuerpo anti-GPC3 y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el kit comprende además un prospecto que comprende instrucciones para la administración del primer medicamento y del segundo medicamento para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo.

También se describe en el presente documento un kit que comprende un medicamento que comprende un anticuerpo anti-GPC3 y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable, y un prospecto que comprende instrucciones para la administración del medicamento en combinación con una composición que comprende un antagonista que se une al eje PD-1 y un vehículo opcional farmacéuticamente aceptable para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo.

El antagonista que se une al eje PD-1 puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en un antagonista que se une a PD-1, un antagonista que se une a PD-L1 y un antagonista que se une a PD-L2. En algunas realizaciones, el antagonista que se une al eje PD-1 es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento que se une a antígeno. En algunas realizaciones, el fragmento que se une al antígeno se selecciona a partir del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2, scFv y Fv.

El antagonista que se une al eje de PD-1 puede ser un antagonista que se une a PD-1. El antagonista que se une a PD-1 puede inhibir la unión de PD-1 a sus ligandos copartícipes de la unión. El antagonista que se une a PD-1 puede inhibir la unión de PD-1 a PD-L1. Además, el antagonista que se une a PD-1 puede inhibir la unión de PD-1 a PD-L2. El antagonista que se une a PD-1 también puede inhibir la unión de PD-1 tanto a PD-L1 como a PD-L2. El antagonista que se une a PD-1 puede ser un anticuerpo. El antagonista que se une a PD-1 puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en m DX-1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab, lambrolizumab), CT-011 (pidilizumab), PDR001, REGN2810, BGB A317, SHR-1210, AMP-514 (MEDI0680) y AMP-224.

El antagonista que se une al eje PD-1 es un antagonista que se une a PD-L1. En algunas realizaciones, el antagonista que se une a PD-L1 es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el antagonista que se une a PD-L1 es Atezolizumab.

En algunas realizaciones de los métodos, usos, composiciones y kits descritos anteriormente y en el presente documento, el anticuerpo anti-GPC3 es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento que se une a antígeno. En algunas realizaciones, el fragmento que se une al antígeno se selecciona a partir del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2, scFv y Fv.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GPC3 es GC33 o codrituzumab. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GPC3 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia HVR-H1 de SEQ ID NO: 42, la secuencia HVR-H2 de SEQ ID NO: 43 y la secuencia HVR-H3 de SEQ ID NO: 44; y/o una cadena ligera que comprende la secuencia HVR-L1 de SEQ iD NO: 45, la secuencia HVR-L2 de SEQ ID NO: 46 y la secuencia hVr-L3 de SEQ ID NO: 47. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GPC3 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GPC3 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52. En algunas realizaciones que se pueden combinar con cualquier otra realización, el anticuerpo anti-GPC3 no es GC33 ni codrituzumab.

En algunas realizaciones, el anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo de un antagonista que se une al eje PD-1 o un anticuerpo anti-GPC3) comprende una mutación de un sitio de aglicosilación. En algunas realizaciones, la mutación del sitio de aglicosilación es una mutación por sustitución. En algunas realizaciones, la mutación por sustitución está en el residuo de aminoácido N297, L234, L235 y/o D265 (numeración EU). En algunas realizaciones, la mutación por sustitución se selecciona a partir del grupo que consiste en N297G, N297A, L234A, L235A y D265A. En algunas realizaciones, la mutación por sustitución es una mutación D265A y una mutación N297G. En algunas realizaciones, la mutación del sitio de aglicosilación reduce la función efectora del anticuerpo. En algunas realizaciones, el antagonista que se une al eje PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1) es una IgG1 humana que tiene una sustitución de Ala por Asn en la posición 297 según la numeración de la UE.

En algunas realizaciones de los métodos, usos, composiciones y kits descritos anteriormente y en el presente documento, el cáncer es un cáncer positivo para GPC3. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de esófago, cáncer de próstata u otros cánceres descritos en este documento. En algunas realizaciones, el individuo tiene cáncer o se le ha diagnosticado cáncer. En algunas realizaciones, las células cancerosas del individuo expresan PD-L1.

El tratamiento o la administración del antagonista que se une al eje PD-1 humano y el anticuerpo anti-GPC3 pueden dar como resultado una respuesta sostenida en el individuo después de la interrupción del tratamiento. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GPC3 se administra antes del antagonista que se une al eje PD-1, simultáneamente con el antagonista que se une al eje PD-1 o después del antagonista que se une al eje PD-1. En algunas realizaciones, el antagonista que se une al eje PD-1 y el anticuerpo anti-GPC3 están en la misma composición. En algunas realizaciones, el antagonista que se une al eje PD-1 y el anticuerpo anti-GPC3 están en composiciones distintas.

El antagonista que se une al eje PD-1 y/o el anticuerpo anti-GPC3 pueden administrarse por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantación, por inhalación, intratecal, intraventricular o intranasal. El tratamiento puede comprender además administrar un agente quimioterapéutico para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo. En algunas realizaciones, el individuo ha sido tratado con un agente quimioterapéutico antes del tratamiento de combinación con el antagonista que se une al eje PD-1 y el anticuerpo anti-GPC3. En algunas realizaciones, el individuo tratado con la combinación del antagonista que se une al eje PD-1 y/o el anticuerpo anti-GPC3 es refractario al tratamiento con un agente quimioterapéutico. Los métodos, usos, composiciones y kits descritos a lo largo de la solicitud pueden comprender además la administración de un agente quimioterapéutico para tratar o retrasar la progresión de un cáncer.

En algunas realizaciones de los métodos, usos, composiciones y kits descritos anteriormente y en el presente documento, los linfocitos T CD8 en el individuo tienen una actividad de cebado, activación, proliferación y/o citolítica mejorada con respecto a antes de la administración de la combinación. En algunas realizaciones, el número de linfocitos T CD8 se eleva con respecto a antes de la administración de la combinación. En algunas realizaciones, el linfocito T CD8 es un linfocito T CD8 específico de antígeno.

Debe entenderse que una, algunas o todas las propiedades de las diversas realizaciones descritas en el presente documento pueden combinarse para formar otras realizaciones de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención resultarán evidentes para un experto en la técnica. Estas y otras realizaciones de la invención se describen con más detalle mediante la descripción detallada que sigue a continuación.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1

La Fig. 1 es un diagrama que muestra los cambios en el volumen del tumor de GPC3 humana que expresa Hepa1 -6 en cada ratón tratado tres veces a la semana con el control de vehículo, 1 mg/kg o 5 mg/kg de mGC33. La flecha indica la fecha de la inyección. Se trataron cinco ratones en cada grupo.

Fig. 2A

La Fig. 2A es un diagrama que muestra las imágenes de la tinción con hematoxilina y eosina (HE) o de la tinción inmunohistoquímica (IHC) de F4/80 en tejidos aislados a partir de ratones tratados o bien con control de vehículo o con 5 mg/kg de mGC33.

Fig. 2B

La Fig. 2B es un diagrama que muestra las imágenes de la tinción con hematoxilina y eosina (HE) o la tinción inmunohistoquímica (IHC) de PD-L1 en tejidos aislados de ratones tratados con control de vehículo o 5 mg/kg de mGC33. La flecha indica la inmunorreactividad de PD-L1 observada en las membranas celulares de las células inmunes infiltradas.

Fig. 3A

La Fig. 3A es un diagrama que muestra los cambios en el volumen tumoral de CT26 que expresa GPC3 humano en cada ratón tratado mediante monoterapia (mGC33 o 10F.9G2 (anti-PD-L1)) o una combinación (mGC33 10F.9G2). La flecha indica la fecha de la inyección. Se trataron cinco ratones en cada grupo. Se realizó un gráfico del promedio del volumen tumoral en cada grupo y la barra de SD.

Fig. 3B

La Fig. 3B es un diagrama que muestra la tasa de supervivencia sin progresión en ratones portadores de CT26/hGPC3 tratados con monoterapia (mGC33 o 10F.9G2 (anti-PD-L1)) o con una combinación (mGC33 10F.9G2). La progresión se definió cuando el tamaño del tumor alcanzaba más de 100 mm3.

Fig. 4A

La Fig. 4A es un diagrama que muestra los cambios en el volumen tumoral de CT26 que expresa GPC3 humano en cada ratón tratado con monoterapia o con una combinación. La flecha indica la fecha de la inyección. Se trataron cinco ratones en cada grupo. Se realizó un gráfico del promedio del volumen tumoral en cada grupo y la barra de SD. Los valores de inhibición del crecimiento tumoral de 5 mg/kg o 25 mg/kg de mGC33, 10F.9G2, 5 mg/kg o 25 mg/kg de mGC33 10F.9G2 eran 52%, 58%, 68%, 75% y 85%, respectivamente.

Fig. 4B

La Fig. 4B es un diagrama que muestra el volumen tumoral individual el día 29. También se representa el promedio (*) del volumen tumoral en cada grupo.

Fig. 5A

La Fig. 5A es un diagrama que muestra los cambios en el volumen tumoral de Hepa1-6 que expresa GPC3 humano en cada ratón tratado con control de vehículo, 1 mg/kg, 5 mg/kg o 25 mg/kg de mGC33, 10F.9G2 o una combinación de 5 mg/kg o 25 mg/kg de GC33 y 10F.9G2. La flecha indica la fecha de la inyección. Se trataron cinco ratones en cada grupo.

Fig. 5B

La Fig. 5B es un diagrama que muestra el área tumoral individual o la media DE de un área tumoral en cada grupo tratado, el día 34. El área tumoral (mm2) se calculó mediante (longitud (mm) del eje largo del tejido tumoral) x (longitud (mm) del eje corto del tejido tumoral) después de la tinción con HE de los tejidos tumorales aislados de cada ratón. Y los resultados de la evaluación patológica de cada tejido tumoral se añadieron en la parte inferior de los gráficos. Una progresión patológica de la enfermedad (pPD) se definió como "no se observaba regresión tumoral". La regresión parcial patológica (pPR) se definió como "se observaba degeneración y/o necrosis de las células tumorales con infiltración de células inmunes". La regresión patológica completa (pCR) se definió como "no se observaban células tumorales en el sitio de implantación del tumor".

Fig. 6A

La Fig. 6A es un diagrama que muestra los cambios en el volumen tumoral de Hepa1-6 que expresa GPC3 humano en cada ratón tratado con monoterapia o con una combinación de mGC33 y 6E11 (anti-PD-LI) con varios niveles de dosis y pautas indicadas. La flecha indica la fecha de la inyección. Se trataron cinco ratones en cada grupo.

Fig. 6B

La Fig. 6B es un diagrama que muestra los valores medios de los cambios de volumen tumoral de Hepa1-6 que expresa GPC3 en cada grupo de ratones tratados con monoterapia o con una combinación de mGC33 y 6E11. El crecimiento tumoral en el grupo de la combinación se inhibía significativamente en comparación con el de los grupos tratados con monoterapia de GC33 o 6E11. La flecha indica la fecha de la inyección. Se trataron cinco ratones en cada grupo. *: P <0,05 mediante Wilcoxon (SAS Institute Inc.)

Fig. 6C

La Fig. 6C es un diagrama que muestra los valores medios de los cambios de peso corporal en cada grupo de tratamiento de ratones que eran portadores de Hepa1 -6 que expresa GPC3 humano. Se añadieron barras de SD.

Fig. 7

La Fig. 7 es un diagrama que muestra microfotografías de tejidos tumorales en el tejido subcutáneo en cada grupo. El área gris indica el área del tumor o los tejidos linfoides/de granulación sin necrosis. El área azul indica el área del tumor o el tejido de granulación con necrosis. La línea de puntos indica el borde de la masa. L significa tejido linfoide, G significa tejido de granulación, pCR significa respuesta patológica completa (sin tejido tumoral en el portaobjetos de la histopatología) y MOR significa animal sacrificado moribundo debido a una progresión tumoral.

Fig. 8A

La Fig. 8A es un diagrama que muestra fotomicrografías representativas de tejidos tumorales teñidos con HE en la periferia de la masa que se ajusta al estroma en cada grupo tratado. En todos los grupos tratados se observa necrosis del tumor con infiltración de células inmunes que incluyen macrófagos/células gigantes multinucleadas. La gravedad de las lesiones sigue el orden siguiente: mGC33 5 mg/kg simple 6E11 q7d x 3 > mGC335 mg/kg simple o 6E11 q7d x 3. S significa masa tumoral de ajuste del estroma y P significa periferia de la masa tumoral.

Fig. 8B

La Fig. 8B es un diagrama que muestra fotomicrografías representativas de IHC F4/80 de tejidos tumorales en la periferia de la masa que se ajusta al estroma en cada grupo tratado. En el vehículo, las células positivas para F4/80 se observan principalmente en el estroma. Por otro lado, se observa una mayor gravedad de las células inmunes positivas para F4/80, incluidos los macrófagos/células gigantes multinucleadas, principalmente en la periferia de la masa tumoral en todos los grupos tratados. La gravedad de la infiltración de células positivas está en el siguiente orden: mGC33 5 mg/kg simple 6E11 q7d x 3 > mGC33 5 mg/kg simple o 6E11 q7d x 3. S significa masa tumoral que se ajusta al estroma y P significa periferia de la masa tumoral.

Fig. 8C

La Fig. 8C es un diagrama que muestra fotomicrografías representativas de IHC de PD-L1 de tejidos tumorales en la periferia de la masa que se ajusta al estroma en cada grupo tratado. En el vehículo, las reacciones positivas para PD-L1 se observan principalmente en el citoplasma de las células tumorales con intensidad débil. Por otro lado, se observa una mayor gravedad de las reacciones positivas para PD-L1 en las células inmunes, incluyendo los macrófagos/células gigantes multinucleadas, con una intensidad de débil a media en todos los grupos tratados. S significa masa tumoral que se ajusta al estroma y P significa periferia de la masa tumoral.

Fig. 9

La Fig. 9 es un diagrama que muestra el porcentaje de células marcadoras positivas observadas en tejidos tumorales en cada grupo tratado. Se representan gráficamente los valores individuales y el promedio de cada grupo y los valores promedio se indican en cada gráfico.

Descripción detallada

Los datos de la solicitud muestran que la combinación de un anticuerpo anti-GPC3 con una inmunoterapia anti-PD-LI daba como resultado una mayor inhibición del crecimiento tumoral, mayores tasas de respuesta y respuestas duraderas. Los inventores han demostrado el beneficio de combinar dos terapias: la actividad citotóxica contra células tumorales que expresan GPC3 junto con la inhibición de la señalización PD-1/PD-L1 supresora de los linfocitos T, da como resultado unos efectos terapéuticos mejorados y respuestas duraderas a largo plazo.

En el presente documento se describen métodos, composiciones y usos para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo, que comprenden administrar una cantidad eficaz de atezolizumab y un anticuerpo anti-GPC3.

También se describen en el presente documento métodos, composiciones y usos para potenciar las respuestas inmunes contra células tumorales en un individuo que tiene cáncer, que comprenden administrar una cantidad eficaz de atezolizumab y un anticuerpo anti-GPC3. Por ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen la infiltración de células inmunes que incluyen macrófagos y células gigantes multinucleadas en los tejidos tumorales. En otro ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen el aumento de linfocitos positivos para CD45, linfocitos positivos para CD3s y linfocitos T positivos para CD8 en los linfocitos infiltrados en tumores (TILs).

I. Definiciones

Antes de describir la invención más detalladamente, debe entenderse que esta invención no se limita a composiciones 0 sistemas biológicos particulares, que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene únicamente el fin de describir realizaciones particulares, y no pretende ser limitante.

Tal y como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una molécula" incluye opcionalmente una combinación de dos o más de tales moléculas y similares.

El término "aproximadamente" tal y como se usa en este documento, se refiere al rango de error habitual para el valor respectivo, fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento, incluye (y describe) realizaciones que están dirigidas a ese valor o ese parámetro per se.

Se entiende que los aspectos y las realizaciones de la invención descritos en este documento incluyen aspectos y realizaciones "que comprenden", "que consisten" y "que consisten esencialmente en" de aspectos y realizaciones.

La expresión "antagonista que se une al eje PD-1" se refiere a una molécula que inhibe la interacción de un ligando que se une al eje PD-1 con uno o varios de sus ligandos, para eliminar la disfunción de los linfocitos T resultante de la señalización en el eje de señalización de PD-1, en donde el resultado es restaurar o mejorar la función de los linfocitos T (p. ej., la proliferación, producción de citocinas, destrucción de células diana). Tal y como se usa en el presente documento, un antagonista que se une al eje PD-1 incluye un antagonista que se une a PD-1, un antagonista que se une a PD-L1 y un antagonista que se une a PD-L2.

La expresión "antagonista que se une a PD-1" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en una transducción de señales como resultado de la interacción de PD-1 con uno o varios de sus ligandos, tales como PD-L1, PD-L2. El antagonista que se une a PD-1 puede ser una molécula que inhibe la unión de PD-1 a uno o varios de sus ligandos. Específicamente, el antagonista que se une a PD-1 puede inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y/o a PD-L2. Por ejemplo, los antagonistas que se unen a PD-1 incluyen anticuerpos anti-PD-1, fragmentos de los mismos que se unen a antígeno, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales como resultado de la interacción de PD-1 con PD-L1 y/o PD-L2. Un antagonista que se une a PD-1 puede reducir la señal coestimuladora negativa mediada o a través de proteínas de la superficie celular expresada sobre linfocitos T en la señalización mediada a través de PD-1 para convertir un linfocito T disfuncional en menos disfuncional (p. ej., que mejora las respuestas efectoras frente al reconocimiento de antígenos). El antagonista que se une a PD-1 puede ser un anticuerpo anti-PD-1. Específicamente, un antagonista que se une a PD-1 puede ser m DX-1106 (nivolumab) descrito en el presente documento. Específicamente, un antagonista que se une a PD-1 puede ser MK-3475 (lambrolizumab) descrito en el presente documento. Más específicamente, un antagonista que se une a PD-1 puede ser CT-011 (pidilizumab) descrito en el presente documento. También específicamente, un antagonista que se une a PD-1 puede ser AMP-224 o AMP-514 (MEDI0680) descritos en el presente documento. Más específicamente, se puede seleccionar un antagonista de PD-1 a partir del grupo que consiste en PDR001, REGN2810, BGB A317 y SHR-1210, descritos en el presente documento.

La expresión "antagonista que se une a PD-L1" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales como resultado de la interacción de PD-L1 con uno o varios de sus ligandos, tales como PD-1, B7-1. En algunas realizaciones, un antagonista que se une a PD-L1 es una molécula que inhibe la unión de PD-L1 a sus ligandos. En un aspecto específico, el antagonista que se une a PD-L1 inhibe la unión de PDL1 con PD-1 y/o B7-1. En algunas realizaciones, los antagonistas que se une a PD-L1 incluyen anticuerpos anti-PD-L1, fragmentos de los mismos que se unen a antígeno, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales como resultado de la interacción de PD-L1 con uno o varios de sus ligandos, tales como PD-1, B7-1. En una realización, un antagonista que se une a PD-L1 reduce la señal coestimuladora negativa mediada o a través de proteínas de la superficie celular expresada sobre linfocitos T en la señalización mediada a través de PD-1 para convertir un linfocito T disfuncional en menos disfuncional (por ejemplo, que mejora las respuestas efectoras frente al reconocimiento de antígenos). En algunas realizaciones, un antagonista que se une a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1. En un aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es YW243.55.S70 o atezolizumab descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MDX-1105 descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es avelumab descrito en el presente documento. En otro aspecto específico más, un anticuerpo anti-PD-L1 es MPDL3280A descrito en el presente documento. En otro aspecto específico más, un anticuerpo anti-PD-L1 es MEDI4736 (durvalumab) descrito en el presente documento.

La expresión "antagonista que se une a PD-L2' se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la transducción de señales como resultado de la interacción de PD-L2 con uno o varios de sus ligandos, tales como PD-1. Un antagonista que se une a PD-L2 puede ser una molécula que inhibe la unión de PD-L2 con uno o varios de sus ligandos. Específicamente, el antagonista que se une a PD-L2 puede inhibir la unión de PD-L2 a PD-1. Los antagonistas de PD-L2 pueden incluir anticuerpos anti-PD-L2, fragmentos de los mismos que se unen a antígeno, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales como resultado de la interacción de PD-L2 con uno o varios de sus ligandos, tales como PD-1. Un antagonista que se une a PD-L2 puede reducir la señal coestimuladora negativa mediada o a través de proteínas de la superficie celular expresada sobre linfocitos T en la señalización mediada a través de PD-1 para convertir un linfocito T disfuncional en menos disfuncional (por ejemplo, que mejora las respuestas efectoras frente al reconocimiento de antígenos). Un antagonista que se une a PD-L2 puede ser una inmunoadhesina.

El término "disfunción" en el contexto de la disfunción inmune, se refiere a un estado de capacidad de respuesta inmune reducida frente a una estimulación antigénica. El término incluye los elementos comunes de agotamiento y/o anergia en los que puede tener lugar el reconocimiento de antígenos, pero la respuesta inmune resultante es ineficaz para controlar la infección o el crecimiento tumoral.

El término "disfuncional", tal y como se usa en este documento, también incluye refractario o que no tiene capacidad de respuesta inmune frente a un reconocimiento de antígenos, específicamente, una capacidad alterada para trasladar el reconocimiento de antígenos a funciones efectoras de linfocitos T aguas abajo, tales como proliferación, producción de citocinas (p. ej., IL-2) y/o destrucción de células diana.

El término "anergia" se refiere al estado de falta de respuesta frente a una estimulación antigénica que da como resultado señales incompletas o insuficientes entregadas a través del receptor de linfocitos T (por ejemplo, aumento del Ca+2 intracelular en ausencia de una activación de ras). La anergia de los linfocitos T también puede ser el resultado de una estimulación con antígeno en ausencia de coestimulación, lo que da lugar a que la célula se vuelva refractaria frente a una activación posterior a través del antígeno, incluso en el contexto de una coestimulación. El estado de falta de respuesta a menudo puede ser anulado por la presencia de interleucina-2. Los linfocitos T anérgicos no experimentan una expansión clonal y/o adquieren funciones efectoras.

El término "agotamiento" se refiere a un agotamiento de los linfocitos T como un estado de disfunción de los linfocitos T que surge de una señalización sostenida de los TCRs que ocurre durante muchas infecciones crónicas y el cáncer. Se distingue de la anergia en que no surge de una señalización incompleta o deficiente, sino de una señalización sostenida. Se define por una función efectora deficiente, una expresión sostenida de receptores inhibidores y un estado transcripcional distinto del de los linfocitos T efectores o de memoria funcionales. El agotamiento impide un control óptimo de las infecciones y los tumores. El agotamiento puede deberse tanto a vías reguladoras negativas extrínsecas (p. ej., citocinas inmunorreguladoras) como a vías reguladoras (coestimuladoras) negativas intrínsecas de la célula (PD-1, B7-H3, B7-H4, etc.).

"Mejora de la función de los linfocitos T significa inducir, provocar o estimular un linfocito T para que tenga una función biológica sostenida o amplificada, o renovar o reactivar los linfocitos T agotados o inactivos. Ejemplos de una mejora de la función de los linfocitos T incluyen: aumento de la secreción de interferón g de linfocitos T CD8+, aumento de la proliferación, aumento de la capacidad de respuesta frente al antígeno (por ejemplo, aclaramiento viral, de agentes patógenos o tumoral) en relación con los niveles antes de la intervención. En una realización, el nivel de mejora es de al menos un 50%, alternativamente un 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. Un experto en la técnica conoce la manera de medir esa mejora.

Un "trastorno disfuncional de los linfocitos T es un trastorno o afección de los linfocitos T que se caracteriza por una menor capacidad de respuesta frente a la estimulación antigénica. En una realización particular, un trastorno disfuncional de los linfocitos T es un trastorno que se asocia específicamente con una señalización incrementada, inapropiada a través de PD-1. En otra realización, un trastorno disfuncional de linfocitos T es aquel en el que los linfocitos T son anérgicos o tienen una capacidad disminuida para secretar citocinas, proliferar o ejecutar una actividad citolítica. En un aspecto específico, la capacidad de respuesta disminuida da como resultado un control ineficaz de un agente patógeno o tumor que expresa un inmunógeno. Ejemplos de trastornos disfuncionales de linfocitos T caracterizados por una disfunción de los linfocitos T, incluyen una infección aguda no resuelta, una infección crónica y una inmunidad tumoral.

"Inmunidad tumoral' se refiere al proceso en el que los tumores eluden el reconocimiento y el aclaramiento inmune. Por lo tanto, como concepto terapéutico, una inmunidad tumoral se "trata" cuando dicha evasión se atenúa y los tumores son reconocidos y atacados por el sistema inmune. Ejemplos de reconocimiento de tumores incluyen la unión al tumor, la contracción del tumor y el aclaramiento del tumor.

"Inmunogenicidad' se refiere a la capacidad de una sustancia particular para provocar una respuesta inmune. Los tumores son inmunogénicos y una inmunogenicidad tumoral incrementada ayuda al aclaramiento de las células tumorales a través de la respuesta inmune. Ejemplos de inmunogenicidad tumoral incrementada incluyen el tratamiento con un antagonista que se une al eje PD-1 y un anticuerpo anti-GPC3.

"Respuesta sostenida” se refiere al efecto sostenido sobre la reducción del crecimiento tumoral después de la interrupción de un tratamiento. Por ejemplo, el tamaño del tumor puede permanecer igual o menor en comparación con el tamaño al comienzo de la fase de administración. En algunas realizaciones, la respuesta sostenida tiene una duración que es al menos igual que la duración del tratamiento, al menos 1,5X, 2,0X, 2,5X o 3,0X la duración del tratamiento.

La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea eficaz y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administre la formulación. Esas formulaciones son estériles. Los excipientes "farmacéuticamente aceptables" (vehículos, aditivos) son aquellos que pueden administrarse razonablemente a un mamífero objeto, para proporcionar una dosis eficaz del ingrediente activo empleado.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere a una intervención clínica diseñada para alterar el curso natural del individuo o la célula que se está tratando durante el curso de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y la remisión o mejora del pronóstico. Por ejemplo, un individuo es "tratado" con éxito si uno o varios síntomas asociados con el cáncer se mitigan o eliminan, incluyendo, pero sin estar limitados a, reducir la proliferación de (o destruir) células cancerosas, reducir el crecimiento tumoral, disminuir los síntomas resultantes de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de quienes lo padecen, disminuir la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad y/o prolongar la supervivencia de los individuos.

Tal y como se usa en el presente documento, "retrasar la progresión de una enfermedad" significa aplazar, obstaculizar, ralentizar, retrasar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (tal como el cáncer). Ese retraso puede ser de diferentes períodos de tiempo, dependiendo del historial médico y/o del individuo que está siendo tratado. Como es evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, incluir una prevención, ya que el individuo no desarrolla la enfermedad. Por ejemplo, un cáncer en un estadio tardío, tal como el desarrollo de metástasis, puede retrasarse.

Una "cantidad eficaz" es al menos la cantidad mínima requerida para efectuar una mejora o prevención medible de un trastorno particular. Una cantidad eficaz en la presente memoria puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del paciente, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz es también aquella en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan los efectos tóxicos o perjudiciales del tratamiento. Para un uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados como eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar la aparición de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para un uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como disminuir uno o varios síntomas resultantes de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de quienes padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otras medicaciones requeridas para tratar la enfermedad, mejorar el efecto de otra medicación, por ejemplo, a través de un direccionamiento, retrasando la progresión de la enfermedad y/o prolongando la supervivencia. En el caso de cáncer o tumor, una cantidad eficaz del fármaco puede tener el efecto de reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto o detener de forma desea) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y de forma deseable detener) una metástasis tumoral; inhibir hasta cierto punto el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o varios de los síntomas asociados con el trastorno. Se puede administrar una cantidad eficaz en una o varias administraciones. Para los fines de esta invención, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para llevar a cabo un tratamiento profiláctico o terapéutico, ya sea directa o indirectamente. Tal y como se entiende en el contexto clínico, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede tener éxito o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto, se puede considerar una "cantidad eficaz" en el contexto de la administración de uno o varios agentes terapéuticos, y se puede considerar que un solo agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o varios otros agentes, puede obtenerse o se logra un resultado deseable.

Tal y como se usa en el presente documento, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. Como tal, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento al individuo.

Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiará del tratamiento, incluyendo, pero sin limitarse a, trastornos o enfermedades crónicas y agudos que incluyen aquellas afecciones patológicas que predisponen a un mamífero al trastorno en cuestión.

Las expresiones "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que están asociados con algún grado de proliferación celular anormal. En una realización, el trastorno de proliferación celular es cáncer. En una realización, el trastorno de proliferación celular es un tumor.

"Tumor", tal y como se usa en este documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno de proliferación celular", "trastorno de proliferación" y "tumor" no son mutuamente excluyentes, tal y como se hace referencia en este documento.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o neoplasias malignas linfoides. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer de estroma gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, melanoma, melanoma de extensión superficial, melanoma lentigo maligno, melanomas lentiginosos acrales, melanomas nodulares, mieloma múltiple y linfoma de linfocitos B (incluido el linfoma no Hodgkin (LNH) de bajo grado/folicular; LNH de linfocitos pequeños (SL); LNH de grado intermedio/folicular; LNH difuso de grado intermedio; LNH inmunoblástico de alto grado; LNH linfoblástico de alto grado; LNH de células pequeñas no escindidas de alto grado; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD), así como una proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (como el asociado con tumores cerebrales), síndrome de Meigs, cáncer de cerebro, así como de cabeza y cuello, y metástasis asociadas. En determinadas realizaciones, los cánceres que son susceptibles de tratamiento con los anticuerpos de la invención incluyen cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de recto, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioblastoma, linfoma no Hodgkin (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, mesotelioma y mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre: cáncer de pulmón de células pequeñas, glioblastoma, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CCR) y carcinoma hepatocelular. Además, en algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre: cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, glioblastoma, carcinoma de mama y carcinoma hepatocelular, incluidas las formas metastásicas de esos cánceres.

La expresión "agente citotóxico", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente que es perjudicial para las células (p. ej., que causa la muerte celular, inhibe la proliferación o dificulta de otro modo una función celular). Los agentes citotóxicos incluyen, entre otros, isótopos radiactivos (p. ej., At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, PAGS32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu); agentes quimioterapéuticos; agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas; y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. Los agentes citotóxicos ejemplares pueden seleccionarse a partir de agentes anti-microtúbulos, complejos de coordinación de platino, agentes alquilantes, agentes antibióticos, inhibidores de la topoisomerasa II, antimetabolitos, inhibidores de la topoisomerasa I, hormonas y análogos hormonales, inhibidores de una vía de transducción de señales, inhibidores de la angiogénesis de tirosina cinasa no receptores, agentes inmunoterapéuticos, agentes proapoptóticos, inhibidores de LDH-A, inhibidores de la biosíntesis de ácidos grasos, inhibidores de la señalización del ciclo celular, inhibidores de HDAC, inhibidores del proteasoma e inhibidores del metabolismo del cáncer. En una realización, el agente citotóxico es un taxano. En una realización, el taxano es paclitaxel o docetaxel. En una realización, el agente citotóxico es un agente de platino. En una realización, el agente citotóxico es un antagonista de EGFR. En una realización, el antagonista de EGFR es N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (por ejemplo, erlotinib). En una realización, el agente citotóxico es un inhibidor de RAF. En una realización, el inhibidor de RAF es un inhibidor de BRAF y/o CRAF. En una realización, el inhibidor de RAF es vemurafenib. En una realización, el agente citotóxico es un inhibidor de PI3K.

"Agente quimioterapéutico" incluye, entre otros, análogos de mostaza nitrogenada, alquilsulfonatos, etileniminas, nitrosoureas, epóxidos, otros agentes alquilantes, análogos de ácido fólico, análogos de purina, análogos de pirimidina, otros agentes antimetabólicos, alcaloides o análogos de vinca, derivados de podofilotoxina, análogos de camptotecán, derivados de colchicina, taxanos, otros alcaloides vegetales o productos naturales, actinomicinas, antraciclinas o sustancias relacionadas, otros antibióticos citotóxicos, compuestos de platino, metilhidrazinas, inhibidores de cinasa, enzimas, inhibidores de histona desacetilasa, retinoides, inhibidores de puntos de control inmunológico, anticuerpos y otros fármacos de dianas moleculares.

"Agente quimioterapéutico" también incluye compuestos útiles en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen erlotinib (TARCEVA (registrado), Genentech/OSI Pharm.), bortezomib (VELCADE (registrado), Millennium Pharm.), disulfiram, galato de epigalocatequina, salinosporamida A, carfilzomib, 17-AAG (geldanamicina), radicicol, lactato deshidrogenasa A (LDH-A), fulvestrant (FASLODEX (registrado), AstraZeneca), sunitib (SUTENt (registrado), Pfizer/Sugen), letrozol (FEMARA (registrado), Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC (registrado), Novartis), finasunato (VATa La NIB (registrado), Novartis), oxaliplatino (ELOXATIN (registrado), Sanofi), 5-FU (5-fluorouracilo), leucovorina, rapamicina (Sirolimus, RAPAMUNE (registrado), Wyeth), lapatinib (Ty KERB (registrado), GSK572016, Glaxo SmithKline), lonafamib (Sc H 66336), sorafenib (NexAv a R (registrado), Bayer Labs), gefitinib (IRESSA (registrado), AstraZeneca), AG1478, agentes alquilantes como tiotepa y CYTOXAN (registrado) ciclosfosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (que incluye topotecán e irinotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); adrenocorticosteroides (incluidas prednisona y prednisolona); acetato de ciproterona; 5a-reductasas que incluyen finasterida y dutasterida); vorinostat, romidepsina, panobinostat, ácido valproico, mocetinostat dolastatina; aldesleucina, talco duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatin; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clomafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina y1I y caliqueamicina w1I (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 1994 33: 183-186); dinemicina, incluida dinemicina A; bisfosfonatos, como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzino estatina y cromóforos relacionados de antibiótico cromoproteína enediina), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinis, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN (registrada) (doxorrubicina), morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina D, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; agentes anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinán; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamnol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK (registrado) (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ej., TAXOL (paclitaxel; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANE (registrado) (exento de cremóforo), formulaciones de nanopartículas de paclitaxel modificadas con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, l11.) y TAXOTERE (registrado) (docetaxel, doxetaxel; Sanofi-Aventis); clorambucil; GEMZAR (registrado) (gemcitabina); 6-tioguanina: mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE (registrado) (vinorrelbina); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA (registrado)); ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

El agente quimioterapéutico también incluye anticuerpos tales como alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN (registrado), Genentech); cetuximab (ErBiTUX (registrado), Imclone); panitumumab (VECTIBIX (registrado), Amgen), rituximab (RITUXAN (registrado), Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (OMNITARG (registrado), 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN (registrado), Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia) y el conjugado de anticuerpo y fármaco, gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG (registrado), Wyeth). Anticuerpos monoclonales humanizados adicionales con potencial terapéutico como agentes en combinación con los compuestos de la invención incluyen: apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bivatuzumab mertansina, cantuzumab mertansina, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicin, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, pascolizumab, pecfusituzumab, pectuzumab, pexelizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resyvizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tacatuzumab tetraxetan, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, tucotuzumab celmoleukin, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab, ustekinumab, visilizumab, y el anticuerpo anti-interleucina 12 (ABT-874/J695, Wyeth Research y Abbott Laboratories) que es un anticuerpo de IgG1 A de longitud completa y secuencia exclusivamente humana, recombinante, modificado genéticamente para reconocer la proteína p40 de interleucina-12.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en este documento, se refiere a un compuesto o una composición que inhibe el crecimiento de una célula in vitro o in vivo. En una realización, el agente inhibidor del crecimiento es un anticuerpo inhibidor del crecimiento que previene o reduce la proliferación de una célula que expresa un antígeno al que se une el anticuerpo. En otra realización, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células en la fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la detención en G1 y la detención en la fase M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de la topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que detienen en G1 también se extienden a la detención en la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Se puede encontrar más información en Mendelsohn e Israel, compiladores, The Molecular Basis of Cancer, capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami et al. (W.B. Saunders, Filadelfia, 1995), p. ej., p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos contra el cáncer, ambos obtenidos a partir del tejo. Docetaxel (TAXOTERE (registrado), Rhone-Poulenc Rorer), obtenido a partir del tejo europeo, es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL (registrado), Bristol-Myers Squibb). El paclitaxel y el docetaxel favorecen el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al evitar la despolimerización, lo que da como resultado una inhibición de la mitosis en las células.

Por "radioterapia" se entiende el uso de rayos gamma o rayos beta dirigidos, para inducir un daño suficiente a una célula como para limitar su capacidad para funcionar normalmente o para destruir la célula por completo. Se apreciará que se conocen muchas formas en la técnica para determinar la dosificación y la duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se administran una sola vez y las dosificaciones típicas oscilan entre 10 y 200 unidades (Grays) por día.

Un "sujeto" o un "individuo" para los fines de un tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos los seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, de deportes o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

El término "anticuerpo" en este documento se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad biológica deseada.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con usos en investigación, diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica (1) hasta más del 95% en peso de anticuerpo según se determina, por ejemplo, mediante el método de Lowry, y en algunas realizaciones, hasta más del 99% en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso, por ejemplo, de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta tener homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando, por ejemplo, azul de Coomassie o tinción con plata. Un anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, normalmente, el anticuerpo aislado se preparará con al menos una etapa de purificación.

Los "anticuerpos naturales" son normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas con diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^h) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V^l) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que determinados residuos de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada.

La expresión "dominio constante" se refiere a la porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos más conservada con respecto a la otra parte de la inmunoglobulina, el dominio variable, que contiene el sitio de unión al antígeno. El dominio constante contiene los dominios C^h1, C^h2 y C^h3 (colectivamente, CH) de la cadena pesada y el dominio CHL (o CL) de la cadena ligera.

La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede denominarse "V^h". El dominio variable de la cadena ligera puede denominarse" V^l". Estos dominios son generalmente las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión al antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables (HVRs), tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se denominan regiones estructurales (FRs). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada uno cuatro regiones FRs, que adoptan en gran medida una configuración de hoja beta, conectadas por tres HVRs, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja beta. Las HVRs en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FRs y, con las HVRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Maryland (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de mamífero se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa ("k") y lambda ("A"), según las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

El término "isotipo" o "subclase" de IgG, tal y como se usa en este documento, significa cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes.

Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, y, £, Y y M, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen generalmente, por ejemplo, en Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4a ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede formar parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o varias otras proteínas o péptidos.

Las expresiones "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en este documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Las expresiones se refieren particularmente a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fc.

Un "anticuerpo desnudo" para los fines de este documento es un anticuerpo que no está conjugado con un resto citotóxico o radiomarcador.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que preferiblemente comprende la región de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo descrito en este documento es un fragmento que se une a antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2, fragmentos scFv y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos idénticos que se unen al antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con antígeno y todavía es capaz de reticular el antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión al antígeno completo. En una realización, una especie de Fv de dos cadenas consiste en un dímero con un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. En una especie de Fv monocatenario (scFv), un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera se pueden unir covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible, de modo que las cadenas ligeras y pesadas se pueden asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv de dos cadenas. Es en esa configuración en donde las tres HVRs de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis HVRs confieren al anticuerpo una especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVRs específicas de un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi-terminal del dominio CH1 de la cadena pesada, que incluyen una o varias cisteínas procedentes de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en este documento para Fab' en donde el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes son portadores de un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como parejas de fragmentos Fab' que tenían cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde esos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que scFv forme la estructura deseada para unirse al antígeno. Para una revisión de scFv, véase, por ejemplo, Pluckthuen, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore compiladores, (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), págs. 269-315.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen con más detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal y como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones de origen natural, que pueden estar presentes en menor cantidad. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos discretos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo monoclonal de ese tipo normalmente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en donde la secuencia polipeptídica que se une a la diana se ha obtenido mediante un procedimiento que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica que se une a la diana a partir de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser la selección de un clon único entre una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fagos o clones de ADN recombinante. Debe entenderse que una secuencia que se une a la diana seleccionada se puede alterar aún más, por ejemplo, para mejorar la afinidad hacia la diana, para humanizar la secuencia que se une a la diana, para mejorar su producción en un cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear una anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia alterada que se une a la diana también es un anticuerpo monoclonal de esta invención. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante de un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas porque normalmente no están contaminadas con otras inmunoglobulinas.

El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como que requiere una producción del anticuerpo a través de ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de acuerdo con la invención pueden prepararse mediante una variedad de técnicas, que incluyen, por ejemplo, el método del hibridoma (p. ej., Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, el documento de patente de EE.UU. n° 4.816.567), tecnologías de presentación en fagos (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a los humanos en animales que tienen partes de los loci o todos los loci de una inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); los documentos de patente de EE.UU. n° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)); Neuberger, Nature Biotechnol.

14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)).

Los anticuerpos monoclonales de este documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o de la ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos obtenidos a partir de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos obtenidos a partir de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (véanse, p. ej., el documento de patente de EE.UU. n° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATTZED (registrados) en los que la región que se une al antígeno del anticuerpo se obtiene a partir de un anticuerpo producido, por ejemplo, inmunizando monos macacos con el antígeno de interés.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima obtenida a partir de una inmunoglobulina no humana. En una realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una HVR del receptor se reemplazan por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Esas modificaciones pueden realizarse para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos entre al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden con los de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las FRs son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para obtener más detalles, véase, por ejemplo, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)). Véanse también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma e Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994)); y los documentos de patente de EE.UU. n° 6.982.321 y 7.087.409.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o ha sido elaborado usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos, tal y como se describe en este documento. Esta definición de anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos que se unen a antígenos no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo los bancos de presentación de fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los métodos descritos en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991). Vésae también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir tales anticuerpos como respuesta a una exposición a antígenos, pero cuyos loci endógenos se han desactivado, por ejemplo, xeno-ratones inmunizados (véanse, por ejemplo, los documentos de patente de EE.UU. n° 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a la tecnología XENOMOUSE (marca comercial)). Véase también, por ejemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006) con respecto a los anticuerpos humanos generados mediante una tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos.

Un "anticuerpo dependiente de especie" es uno que tiene una afinidad de unión más fuerte hacia un antígeno procedente de una primera especie de mamífero, que hacia un homólogo de ese antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de una especie "se une específicamente" a un antígeno humano (por ejemplo, tiene un valor de la afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10-7 M, preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10-8 M y preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10-9 M) pero tiene una afinidad de unión hacia un homólogo del antígeno de una segunda especie de mamífero no humano que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión hacia el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos definidos anteriormente, pero preferiblemente es un anticuerpo humanizado o humano.

La expresión "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando se usa en este documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de un anticuerpo que son hipervariables en su secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis HVRs; tres en VH (H1, H2, H3) y tres en VL (L1, L2, L3). En los anticuerpos naturales, H3 y L3 muestran la mayor diversidad de las seis HVRs, y se cree que H3 en particular tiene un papel único en conferir una especificidad adecuada a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, compilador, Human Press, Totowa, N.J., 2003). De hecho, los anticuerpos de camélidos de origen natural que consisten en una cadena pesada, únicamente son funcionales y estables en ausencia de la cadena ligera. Véanse, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996).

Se utilizan varias delimitaciones de HVRs y se incluyen en este documento. Las regiones determinantes de complementariedad de Kabat (CDRs) se basan en la variabilidad de la secuencia y son las más comúnmente utilizadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia se refiere en cambio a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Las HVRs de AbM representan un compromiso entre las HVRs de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son utilizados por el programa informático para el diseño de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVRs de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVRs se indican a continuación.

Bucle Kabat AbM Chothia Contacto

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeración de Kabat)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeración de Chothia)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

Las HVRs pueden comprender "HVRs extendidas" de la siguiente manera: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en VH. Los residuos del dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones.

Los residuos "estructurales" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de HVRs como se ha definido en el presente documento.

La expresión "numeración de residuos del dominio variable como en Kabat" o "numeración de la posición de los aminoácidos como en Kabat", y variaciones de las mismas, se refieren al sistema de numeración utilizado para dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando ese sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o más, correspondiendo a un acortamiento o una inserción en una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una inserción de un solo aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, los residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo 82 de la FR de la cadena pesada. La numeración de residuos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado mediante una alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar".

El sistema de numeración de Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (p. Ej., Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland (1991)). El "sistema de numeración de EU" o "índice de EU" se utiliza generalmente cuando se hace referencia a un residuo en una región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU indicado en Kabat et al., supra). El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de tipo EU de residuos del anticuerpo de IgG1 humana.

La expresión "anticuerpos lineales" se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10): 1057-1062). Brevemente, esos anticuerpos comprenden una pareja de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de la cadena ligera complementarios, forman una pareja de regiones que se une al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "se une", "se une específicamente a" o es "específico de" se refiere a interacciones mensurables y reproducibles, tales como la unión entre una diana y un anticuerpo, que es determinante de la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas que incluyen moléculas biológicas. Por ejemplo, un anticuerpo que se une o se une específicamente a una diana (que puede ser un epítopo) es un anticuerpo que se une a esa diana con mayor afinidad, avidez más fácilmente y/o con mayor duración que con la que se une a otras dianas. En una realización, el grado de unión de un anticuerpo a una diana no relacionada es menos de aproximadamente el 10% de la unión del anticuerpo a la diana según se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une específicamente a una diana tiene una constante de disociación (Kd) de ^ 1 uM, ^ 100 nM, ^ 10 nM, ^ 1 nM o ^ 0,1 nM. En determinadas realizaciones, un anticuerpo se une específicamente a un epítopo de una proteína que se conserva entre la proteína procedente de diferentes especies. En otra realización, la unión específica puede incluir, pero no es necesaria, una unión exclusiva.

II. Antagonistas de la unión al eje PD-1

En el presente documento se proporciona un método para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista que se une al eje PD-1 y un anticuerpo anti-GPC3. También se proporciona en el presente documento un método para potenciar las respuestas inmunes contra células tumorales en un individuo que tiene cáncer, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista que se une al eje PD-1 y un anticuerpo anti-GPC3. Por ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen la infiltración de células inmunes, incluidos macrófagos y células gigantes multinucleadas, en los tejidos tumorales. En otro ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen el aumento de linfocitos positivos para CD45, linfocitos positivos para CD3s y linfocitos T positivos para CD8 en los linfocitos infiltrados en tumores (TILs). Por ejemplo, un antagonista que se une al eje PD-1 incluye un antagonista que se une a PD-1, un antagonista que se une a PD-L1 y un antagonista que se une a PD-L2. PD-1 (muerte programada 1) también se denomina en la técnica "muerte celular programada 1", PDCD1, CD279 y SLEB2. PD-L1 (ligando 1 de muerte programada) también se denomina en la técnica "ligando 1 de muerte celular programada 1", PDCD1LG1, CD274, B7-H y PD-L1. PD-L2 (ligando 2 de muerte programada) también se denomina en la técnica "ligando 2 de muerte celular programada 1", PDCD1LG2, CD273, B7-DC, Btdc y PDL2. PD-1, PD-L1 y PD-L2 pueden ser PD-1, PD-L1 y PD-L2 humanos.

El antagonista que se une a PD-1 puede ser una molécula que inhibe la unión de PD-1 a sus ligandos copartícipes en la unión. Específicamente, los ligandos copartícipes en la unión de PD-1 pueden ser PD-L1 y/o PD-L2. En otra realización, un antagonista que se une a PD-L1 es una molécula que inhibe la unión de PD-L1 a sus ligandos. En un aspecto específico, los ligandos de PD-L1 son PD-1 y/o B7-1. Además, el antagonista que se une a PD-L2 puede ser una molécula que inhibe la unión de PD-L2 a sus ligandos. Específicamente, un ligando de PD-L2 puede ser PD-1. El antagonista puede ser un anticuerpo, un fragmento del mismo que se une a antígeno, una inmunoadhesina, una proteína de fusión o un oligopéptido.

El antagonista que se une a PD-1 puede ser un anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico). El anticuerpo anti-PD-1 puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en MDX-1106 (nivolumab), MK-3475 (lambrolizumab) y CT-011 (pidilizumab). El antagonista que se une a PD-1 puede ser una inmunoadhesina (por ejemplo, una inmunoadhesina que comprende una porción extracelular o que se une a PD-1 de PD-L1 o PD-L2, fusionada con una región constante (por ejemplo, una región Fc de una secuencia de inmunoglobulina)). El antagonista que se une a PD-1 puede ser AMP-224 o AMP-514 (MEDI0680). El antagonista que se une a PD-1 puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en PDR001, REGN2810, BGB A317 y SHR-1210. En algunas realizaciones, el antagonista que se une a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el antagonista que se une anti-PD-L1 se selecciona a partir del grupo que consiste en YW243.55.S70, Atezolizumab, MPDL3280A, MDX-1105, avelumab y MEDI4736 (durvalumab). El anticuerpo YW243.55.S70 es un anticuerpo anti-PD-L1 descrito en el documento WO2010/077634. MDX-1105, también conocido como BMS-936559, es un anticuerpo anti-PD-L1 descrito en el documento WO2007/005874. Avelumab es un anticuerpo anti-PDL1 descrito en el documento WO2013079174. MEDI4736 (durvalumab), es un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 descrito en los documentos WO2011/066389 y US2013/034559. Nivolumab, también conocido como MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 y OPDIVO (registrado), es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2006/121168. Pembrolizumab, también conocido como m K-3475, Merck 3475, lambrolizumab, KEYTRUDA (registrado) y SCH-900475, es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2009/114335. CT-011, también conocido como hBAT, hBAT-1 o pidilizumab, es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2009/101611. AMP-224, también conocido como B7-DCIg, es un receptor soluble de fusión PD-L2-Fc descrito en los documentos WO2010/027827 y WO2011/066342.

En algunas realizaciones, el antagonista que se une al eje PD-1 es un anticuerpo anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es capaz de inhibir la unión entre PD-L1 y PD-1 y/o entre PD-L1 y B7-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un fragmento de anticuerpo seleccionado a partir del grupo que consiste en los fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo humano.

Ejemplos de anticuerpos anti-PD-L1 útiles para los métodos para prepararlos se describen en los documentos de solicitud de patente PCT WO2010/077634, WO2007/005874, WO2011/066389 y US2013/034559. Los anticuerpos anti-PD-L1 útiles en esta invención, incluidas las composiciones que contienen tales anticuerpos, pueden usarse en combinación con un anticuerpo anti-GPC3 para tratar el cáncer.

Anticuerpos anti-PD1

El anticuerpo anti-PD-1 puede ser MDX-1106. Los nombres alternativos para "MDX-1106" incluyen MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 o Nivolumab. El anticuerpo anti-PD-1 puede ser Nivolumab (número de registro CAS: 946414-94-4). Se proporciona además un anticuerpo anti-PD-1 aislado que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 2. También se proporciona un anticuerpo anti-PD-1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y/o de la cadena ligera, en donde:

(a) la secuencia de la cadena pesada tiene al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena pesada indicada en SEQ ID NO: 1, y

(b) las secuencias de las cadenas ligeras tienen al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 2.

Anticuerpos anti-PD-L1

En algunas realizaciones, el anticuerpo en la formulación comprende al menos un triptófano (por ejemplo, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro) en la secuencia de la cadena pesada y/o de la ligera. En algunas realizaciones, el aminoácido triptófano se encuentra en las regiones CDRs, regiones estructurales y/o regiones constantes del anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende dos o tres residuos de triptófano en las regiones CDRs. En algunas realizaciones, el anticuerpo en la formulación es un anticuerpo anti-PD-L1. PD-L1 (ligando 1 de muerte programada), también conocido como PD-L1, B7-H1, B7-4, CD274 y B7-H, es una proteína transmembranal y su interacción con PD-1 inhibe la activación de linfocitos T y la producción de citocinas. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 descrito en el presente documento se une a PD-L1 humano. Ejemplos de anticuerpos anti-PD-L1 que se pueden usar en los métodos descritos en este documento, son Atezolizumab, o anticuerpos anti-PD-L1 descritos en el documento de solicitud de patente PCT WO 2010/077634 A1 y US 8.217.149.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es capaz de inhibir la unión entre PD-L1 y PD-1 y/o entre PD-L1 y B7-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un fragmento de anticuerpo seleccionado a partir del grupo que consiste en los fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2 . En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo humano.

Los anticuerpos anti-PD-L1 descritos en los documentos WO 2010/077634 A1 y US 8.217.149 pueden usarse en los métodos descritos en este documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 3 y/o una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 4. En otra realización adicional, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y/o de la cadena ligera, en la que:

(a) la secuencia de la cadena pesada tiene al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena pesada indicada en SEQ ID NO: 3, y

(b) las secuencias de las cadenas ligeras tienen al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 4.

En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende un polipéptido de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en donde:

(a) la secuencia de HVR-H1 es GFTFSX1SWIH (SEQ ID NO: 5);

(b) la secuencia de HVR-H2 es AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (SEQ ID NO: 6);

(c) la secuencia de HVR-H3 es RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 7);

además en donde: X1 es D o G; X2 es S o L; X3 es T o S. En un aspecto específico, X1 es D; X2 es S y X3 es T.

En otro aspecto, el polipéptido comprende además secuencias estructurales de la cadena pesada de la región variable yuxtapuestas entre las HVRs de acuerdo con la fórmula: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4). En otro aspecto más, las secuencias estructurales se obtienen a partir de secuencias estructurales de consenso humanas. En un aspecto adicional, las secuencias estructurales son la estructura de consenso del subgrupo III de VH. En otro aspecto más, al menos una de las secuencias estructurales es la siguiente:

HC-FR1 es EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 8)

HC-FR2 es WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 9)

HC-FR3 es RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 10)

HC-FR4 es WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 11).

En otro aspecto más, el polipéptido de la cadena pesada se combina además con una cadena ligera de la región variable que comprende una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en donde:

(a) la secuencia de HVR-L1 es RASQX4X5X6TX7X8A (SEQ ID NO: 12);

(b) la secuencia de HVR-L2 es SASX9LX10S (SEQ ID NO: 13);

(c) la secuencia de HVR-L3 es QQX11X12X13X14PX15T (SEQ ID NO: 14);

en donde: X4 es D o V; X5 es V o I; X6 es S o N; X7 es A o F; X8 es V o L; X9 es F o T; X10 es Y o A; X11 es Y, G, F o S;

X12 es L, Y, F o W; X13 es Y, N, A, T, G, F o I; X14 es H, V, P, T o I; X15 es A, W, R, P o T. En todavía un aspecto más,

X4 es D; X5 es V; X6 es S; X7 es A; X8 es V; X9 es F; X 10 es Y; X11 es Y; X12 es L; X13 es Y; X14 es H; X15 es A.

En otro aspecto más, la cadena ligera comprende además secuencias estructurales de la cadena ligera de la región variable yuxtapuestas entre las HVRs de acuerdo con la fórmula: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). En otro aspecto más, las secuencias estructurales se obtienen a partir de secuencias estructurales de consenso humanas. En otro aspecto más, las secuencias estructurales son la estructura de consenso kappa I de VL. En otro aspecto más, al menos una de las secuencias estructurales es la siguiente:

LC-FR1 es DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 15)

LC-FR2 es WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 16)

LC-FR3 es GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 17)

LC-FR4 es FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 18).

En otra realización, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado o un fragmento que se une a antígeno que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde:

(a) la cadena pesada comprende una HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en donde además:

(i) la secuencia de HVR-H1 es GFTFSX1SWIH: (SEQ ID NO: 5)

(ii) la secuencia de HVR-H2 es AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (SEQ ID NO: 6)

(iii) la secuencia de HVR-H3 es RHWPGGFDY y (SEQ ID NO: 7)

(b) la cadena ligera comprende una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en donde además:

(i) la secuencia de HVR-L1 es RASQX4X5X6TX7X8 A (SEQ ID NO: 12)

(ii) la secuencia de HVR-L2 es SASX9LX10S; y (SEQ ID NO: 13)

(iii) la secuencia de HVR-L3 es QQX11X12X13X14PX15T; (SEQ ID NO: 14)

en donde: X1 es D o G; X2 es S o L; X3 es T o S; X4 es D o V; X5 es V o I; X6 es S o N; X7 es A o F; X8 es V o L; X9 es

F o T; X10 es Y o A; X11 es Y, G, F o S; X12 es L, Y, F o W; X13 es Y, N, A, T, G, F o I; X14 es H, V, P, T o I; X15 es A,

W, R, P o T. En un aspecto específico, X1 es D; X2 es S y X3 es T. En otro aspecto, X4 es D; X5 es V; X6 es S; X7 e A; X8 es V; X9 es F; X10 es Y; X11 es Y; X12 es L; X13 es Y; X14 es H; X15 es A. En otro aspecto, X1 es D; X2 es S y X3 es

T, X4 es D; X5 es V; X6 es S; X7 es A; X8 es V; X9 es F; X10 es Y; X11 es Y; X12 es L; X13 es Y; X14 es H y X15 es A.

En un aspecto adicional, la región variable de la cadena pesada comprende una o varias secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVRs, tal como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o varias secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVRs, tal como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). En otro aspecto más, las secuencias estructurales se obtienen a partir de secuencias estructurales de consenso humanas. En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena pesada se obtienen a partir de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. En otro aspecto más, la secuencia estructural de la cadena pesada es una estructural de consenso del subgrupo III de VH. En otro aspecto más, una o varias de las secuencias estructurales de la cadena pesada se indican como SEQ ID NO: 8, 9, 10 y 11. En un aspecto más adicional, las secuencias estructurales de la cadena ligera se obtienen a partir de una secuencia del subgrupo II, III o IV de Kabat. En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena ligera son la estructural de consenso kappa I de VL. En otro aspecto más, una o varias de las secuencias estructurales de la cadena ligera se indican como SEQ ID NO: 15, 16, 17 y 18.

En otro aspecto específico más, el anticuerpo comprende además una región constante humana o de múrido. En otro aspecto más, la región constante humana se selecciona a partir del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3,

IgG4. En un aspecto aún más específico, la región constante humana es IgG1. En otro aspecto más, la región constante murina se selecciona a partir del grupo que consiste en IgG 1, IgG2A, IgG2B, IgG3. En otro aspecto más, la región constante murina es IgG2A. En otro aspecto específico más, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. En otro aspecto específico más, la función efectora mínima es el resultado de una "mutación de Fc menos efectora" o aglicosilación. En otra realización más, la mutación de Fc menos efectora es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.

En otra realización más, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 que comprende una secuencia de la región variable

de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde:

(a) la cadena pesada comprende además una secuencia HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 19), AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 20) y RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 21), respectivamente, o

(b) la cadena ligera comprende además una secuencia HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 22), SASFLYS (SEQ ID NO: 23) y QQYLYHPAT (SEQ ID NO: 24), respectivamente.

En un aspecto específico, la identidad de secuencia es del 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.

En otro aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o varias secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVRs, tal como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o varias secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVRs, tal como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). En otro aspecto más, las secuencias estructurales se obtienen a partir de secuencias estructurales de consenso humanas. En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena pesada se obtienen a partir de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. En otro aspecto más, la secuencia estructural de la cadena pesada es una estructural de consenso del subgrupo III de VH. En otro aspecto más, una o varias de las secuencias estructurales de la cadena pesada se indican como SEQ ID NO: 8, 9, 10 y 11. En un aspecto adicional más, las secuencias estructurales de la cadena ligera se obtienen a partir de una secuencia del subgrupo I, II, III o IV de Kabat. En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena ligera son la estructural de consenso kappa I de VL. En otro aspecto más, una o varias de las secuencias estructurales de la cadena ligera se indican como SEQ ID NO: 15, 16, 17 y 18.

En otro aspecto específico más, el anticuerpo comprende además una región constante humana o de múrido. En otro aspecto más, la región constante humana se selecciona a partir del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4. En un aspecto aún más específico, la región constante humana es IgG1. En otro aspecto más, la región constante murina se selecciona a partir del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. En otro aspecto más, la región constante murina es IgG2A. En otro aspecto específico más, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. En otro aspecto específico más, la función efectora mínima es el resultado de una "mutación de Fc menos efectora" o aglicosilación. En otra realización más, la mutación de Fc menos efectora es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.

En otra realización adicional, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde:

(a) la secuencia de la cadena pesada tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena pesada indicada en SEQ ID NO: 25, y/o

(b) las secuencias de la cadena ligera tienen al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 4.

En un aspecto específico, la identidad de secuencia es de un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. En otro aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o varias secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVRs, tal como: (HC-FR1 )-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o varias secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVRs, tal como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). En otro aspecto más, las secuencias estructurales se obtienen a partir de secuencias estructurales de consenso humanas. En un aspecto adicional, las secuencias estructurales de la cadena pesada se obtienen a partir de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. En otro aspecto más, la secuencia estructural de la cadena pesada es una estructural de consenso del subgrupo III de VH. En otro aspecto más, una o varias de las secuencias estructurales de la cadena pesada se indican como SEQ ID NO: 8, 9, 10 y WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27).

En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena ligera se obtienen a partir de una secuencia del subgrupo I, II, III o IV de Kabat. En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena ligera son la estructural de consenso kappa I de VL. En otro aspecto más, una o varias de las secuencias estructurales de la cadena ligera se indican como SEQ ID NO: 15, 16, 17 y 18.

En otro aspecto específico más, el anticuerpo comprende además una región constante humana o de múrido. En otro aspecto más, la región constante humana se selecciona a partir del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4. En un aspecto aún más específico, la región constante humana es IgG1. En otro aspecto más, la región constante murina se selecciona a partir del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. En otro aspecto más, la región constante murina es IgG2A. En otro aspecto específico más, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. En un aspecto aún más específico, la función efectora mínima es el resultado de la producción en células procariotas. En otro aspecto específico más, la función efectora mínima es el resultado de una "mutación de Fc menos efectora" o aglicosilación. En otra realización más, la mutación de Fc menos efectora es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.

En un aspecto adicional, la región variable de la cadena pesada comprende una o varias secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVRs, tal como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o varias secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVRs, tal como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). En otro aspecto más, las secuencias estructurales se obtienen a partir de secuencias estructurales de consenso humanas. En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena pesada se obtienen a partir de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. En otro aspecto más, la secuencia estructural de la cadena pesada es una estructural de consenso del subgrupo III de VH. En otro aspecto más, una o varias de las secuencias estructurales de la cadena pesada es la siguiente:

HC-FR1 es EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 29)

HC-FR2 es WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 30)

HC-FR3 es RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 10)

HC-FR4 es WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27).

En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena ligera se obtienen a partir de una secuencia del subgrupo I, II, III o IV de Kabat. En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena ligera son la estructura de consenso kappa I de VL. En otro aspecto más, una o varias de las secuencias estructurales de la cadena ligera es la siguiente:

LC-FR1 es DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 15)

LC-FR2 es WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 16)

LC-FR3 es GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 17)

LC-FR4 es FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 28).

En otro aspecto específico más, el anticuerpo comprende además una región constante humana o de múrido. En otro aspecto más, la región constante humana se selecciona a partir del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4. En un aspecto aún más específico, la región constante humana es IgG1. En otro aspecto más, la región constante murina se selecciona a partir del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. En otro aspecto más, la región constante murina es IgG2A. En otro aspecto específico más, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. En otro aspecto específico más, la función efectora mínima resulta de una "mutación Fc menos efectora" o aglicosilación. En otra realización más, la mutación de Fc menos efectora es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.

En otra realización más, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde:

(c) la cadena pesada comprende además una secuencia HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 19), AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 20) y RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 21), respectivamente, y/o

(d) la cadena ligera comprende además una secuencia HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 22), SASFLYS (SEQ ID NO: 23) y QQYLYHPAT (SEQ ID NO: 24), respectivamente.

En un aspecto específico, la identidad de secuencia es del 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.

En otro aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o varias secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVRs, tal como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o varias secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVRs, tal como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). En otro aspecto más, las secuencias estructurales se obtienen a partir de secuencias estructurales de consenso humanas. En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena pesada se obtienen a partir de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. En otro aspecto más, la secuencia estructural de la cadena pesada es una estructura de consenso del subgrupo III de VH. En otro aspecto más, una o varias de las secuencias estructurales de cadena pesada se indican como SEQ ID NO: 8, 9, 10 y WGQGTLVTVSSASTK (SEQ ID NO: 31).

En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena ligera se obtienen a partir de una secuencia del subgrupo Kabat kappa I, II, III o IV. En otro aspecto más, las secuencias estructurales de la cadena ligera son la estructura de consenso kappa I de VL. En otro aspecto más, una o varias de las secuencias estructurales de la cadena ligera se indican como SEQ ID NO: 15, 16, 17 y 18. En otro aspecto específico adicional, el anticuerpo comprende además una región constante humana o de múrido. En otro aspecto más, la región constante humana se selecciona a partir del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4. En un aspecto aún más específico, la región constante humana es IgG1. En otro aspecto más, la región constante murina se selecciona a partir del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. En otro aspecto más, la región constante murina es IgG2A. En otro aspecto específico más, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. En otro aspecto específico más, la función efectora mínima resulta de una "mutación de Fc menos efectora" o aglicosilación. En otra realización más, la mutación de Fc menos efectora es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.

En otra realización más, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde:

(a) la secuencia de la cadena pesada tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena pesada indicada en SEQ ID NO: 26, o

(b) las secuencias de la cadena ligera tienen al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 4.

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde la secuencia de la región variable de la cadena ligera tiene al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde la secuencia de la región variable de la cadena pesada tiene al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde la secuencia de la región variable de la cadena ligera tiene al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada tiene al menos al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal de la cadena pesada y/o ligera se pueden delecionar, sustituir o modificar.

En otra realización más, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde:

(a) la secuencia de la cadena pesada tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena pesada indicada en SEQ ID NO: 32, y/o

(b) las secuencias de la cadena ligera tienen al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 33.

En otra realización más, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de cadena la pesada y de la cadena ligera, en donde:

(a) la secuencia de la cadena pesada tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena pesada indicada en SEQ ID NO: 55, y/o

(b) las secuencias de la cadena ligera tienen al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 33.

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde la secuencia de la cadena ligera tiene al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde la secuencia de la cadena pesada tiene al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 55. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y una secuencia de la cadena ligera, en donde la secuencia de la cadena ligera tiene al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y la secuencia de la cadena pesada tiene al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 32 o 55.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 aislado está aglicosilado. La glicosilación de anticuerpos suele estar ligada a N o a O. Ligada a N se refiere a la fijación del resto carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de esas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la fijación de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La eliminación de los sitios de glicosilación de un anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que se elimina una de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación ligados a N). La alteración puede realizarse mediante la sustitución de un residuo de asparagina, serina o treonina dentro del sitio de glicosilación por otro residuo de aminoácido (por ejemplo, glicina, alanina o una sustitución conservadora).

En cualquiera de las realizaciones de este documento, el anticuerpo anti-PD-L1 aislado puede unirse a un PD-L1 humano, por ejemplo, un PD-L1 humano como se muestra en UniProtKB/Swiss-Prot, número de orden Q9NZQ7.1, o una variante del mismo.

En otra realización más, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende además un vector adecuado para la expresión del ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 descritos anteriormente. En otro aspecto específico más, el vector está en una célula hospedadora adecuada para la expresión del ácido nucleico. En un aspecto aún más específico, la célula hospedadora es una célula eucariota o una célula procariota. En un aspecto aún más específico, la célula eucariota es una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO).

El anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno se puede preparar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante un procedimiento que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 descritos anteriormente o un fragmento que se une a antígeno en una forma adecuada para la expresión, en condiciones adecuadas para producir ese anticuerpo o fragmento, y recuperar el anticuerpo o fragmento.

III. Anticuerpos anti-GPC3

En el presente documento se proporciona un método para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista que se une al eje PD-1 y un anticuerpo anti-GPC3. También se proporciona en el presente documento un método para potenciar las respuestas inmunes contra las células tumorales en un individuo que tiene cáncer, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista que se une al eje PD-1 y un anticuerpo anti-GPC3. Por ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen la infiltración de células inmunes, incluidos macrófagos y células gigantes multinucleadas, en los tejidos tumorales. En otro ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen el aumento de linfocitos positivos para CD45, linfocitos positivos para CD3s y linfocitos T positivos para CD8 en los linfocitos infiltrados en tumores (TILs).

En el presente documento se proporcionan anticuerpos que se unen a un glipicano 3 humano (GPC3). Los nombres alternativos para "GPC3" incluyen SGB, DGSX, MXR7, SDYS, SGBS, OCI-5, SGBS1 y GTR2-2. El término "GPC3", tal y como se usa en este documento, se refiere a cualquier GPC3 natural de cualquier fuente humana. El término incluye GPC3 "de longitud completa" y sin procesar, así como cualquier forma de GPC3 que sea el resultado de un procesamiento en la célula (por ejemplo, proteína madura), que incluye, pero no se limita a, un péptido C-terminal de GPC3. El término también incluye variantes e isoformas de origen natural de GPC3, por ejemplo, variantes por corte y empalme o variantes alélicas. Por ejemplo, se proporcionan descripciones de GPC3 y secuencias en UniProtKB/Swiss-Prot, n° de orden P51654.1.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GPC3 se une a GPC3 e inhibe la proliferación celular o el crecimiento de células cancerosas. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GPC3 es codrituzumab.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-GPC3 puede incluir un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) (documento WO2007/137170) que comprende un anticuerpo 1G12 (documento WO2003/100429) (comercializado con el número de catálogo B0134R por BioMosaics Inc.) conjugado con una sustancia citotóxica.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-GPC3 es un anticuerpo anti-GPC3 humanizado descrito en los documentos WO2006/006693 o WO2007/047291.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-GPC3 incluye un anticuerpo anti-GPC3 humanizado descrito en los documentos WO2006/006693 o WO2009/041062. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-GPC3 humanizado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde: (a) la cadena pesada comprende HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en donde además:

(i) la secuencia de HVR-H1 es DYSMH (SEQ ID NO: 34)

(ii) la secuencia de HVR-H2 es WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 35)

(iii) la secuencia de HVR-H3 es LY (SEQ ID NO: 36)

(b) la cadena ligera comprende HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en donde además:

(i) la secuencia de HVR-L1 es KSSQSLLHSDGKTFLN (SEQ ID NO: 37)

(ii) la secuencia de HVR-L2 es LVSRLDS (SEQ ID NO: 38)

(iii) la secuencia de HVR-L3 es CQGTHFPRT (SEQ ID NO: 39).

En un aspecto específico, el anticuerpo anti-GPC3 está humanizado. El anticuerpo anti-GPC3 humanizado se puede preparar usando, como moldes para la humanización, secuencias estructurales humanas seleccionadas apropiadamente que tienen una identidad de secuencia elevada con una secuencia estructural de la cadena pesada representada por SEQ ID NO: 40 o una secuencia estructural de la cadena ligera representada por SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, en este documento se proporciona un anticuerpo quimérico anti-GPC3 o un anticuerpo anti-GPC3 humanizado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera, en donde:

(a) la cadena pesada comprende HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en donde además:

(i) la secuencia de HVR-H1 es DYEMH (SEQ ID NO: 42)

(ii) la secuencia de HVR-H2 es ALDPKTGDTAYSQKFKG (SEQ ID NO: 43)

(iii) la secuencia de HVR-H3 es FYSYTY (SEQ ID NO: 44)

(b) la cadena ligera comprende HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en donde además:

(i) la secuencia HVR-L1 es RSSQSLVHSNRNTYLH (SEQ ID NO: 45)

(ii) la secuencia de HVR-L2 es KVSNRFS (SEQ ID NO: 46)

(iii) la secuencia de HVR-L3 es SQNTHVPPT (SEQ ID NO: 47).

El anticuerpo anti-GPC3 humanizado se puede preparar usando, como moldes para la humanización, secuencias estructurales humanas seleccionadas apropiadamente que tienen una identidad de secuencia elevada con una secuencia estructural de la cadena pesada representada por SEQ ID NO: 48 o una secuencia estructural de la cadena ligera representada por SEQ ID NO: 49.

En una realización adicional, en este documento se proporciona un anticuerpo anti-GPC3 humanizado capaz de unirse a un epítopo al que se puede unir un segundo anticuerpo, en donde dicho segundo anticuerpo comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, en donde:

(a) la cadena pesada comprende HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en donde además:

(i) la secuencia de HVR-H1 es DYEMH (SEQ ID NO: 42)

(ii) la secuencia de HVR-H2 es ALDPKTGDTAYSQKFKG (SEQ ID NO: 43)

(iii) la secuencia de HVR-H3 es FYSYTY (SEQ ID NO: 44)

(b) la cadena ligera comprende HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en donde además:

(i) la secuencia de HVR-L1 es RSSQSLVHSNRNTYLH (SEQ ID NO: 45)

(ii) la secuencia de HVR-L2 es KVSNRFS (SEQ ID NO: 46)

(iii) la secuencia de HVR-L3 es SQNTHVPPT (SEQ ID NO: 47).

En una realización adicional, se proporciona un anticuerpo anti-GPC3 humanizado que comprende una región variable de la cadena pesada seleccionada a partir del grupo de regiones variables de la cadena pesada representadas por SEQ ID NO: 50 y una región variable de la cadena ligera representada por SEQ ID NO: 51. En un aspecto alternativo no limitante adicional, se proporciona un anticuerpo anti-GPC3 humanizado que comprende una región variable de la cadena pesada seleccionada a partir del grupo de regiones variables de la cadena pesada representadas por SEQ ID NO: 50 y una región variable de la cadena ligera seleccionada a partir del grupo de regiones variables de la cadena ligera representadas por SEQ ID NO: 52.

En otra realización más, se proporciona un anticuerpo anti-GPC3 humanizado que comprende una región variable de la cadena pesada representada por SEQ ID NO: 53 y una región variable de la cadena ligera representada por SEQ ID NO: 54.

Ejemplos alternativos del anticuerpo anti-GPC3 de la presente invención incluyen un anticuerpo anti-GPC3 que tiene actividad citotóxica. En la presente invención, ejemplos no limitantes de la actividad citotóxica incluyen citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos o actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos (ADCC), actividad citotóxica dependiente del complemento (CDC) y actividad citotóxica basada en linfocitos T. En la presente invención, la actividad CDC significa actividad citotóxica provocada por el sistema del complemento. Por otro lado, la actividad ADCC significa la actividad de destruir las células diana, por ejemplo, mediante inmunocitos, a través de la unión de los inmunocitos vía receptores de Fcy expresados en los inmunocitos, con las regiones Fc de las moléculas que se unen a antígeno que comprenden dominios de unión a antígeno capaces de unirse a moléculas de la membrana expresadas en las membranas celulares de las células diana. Si la molécula que se une a antígeno de interés tiene o no actividad ADCC o tiene actividad CDC, se puede determinar mediante un método conocido en la técnica (p. ej., Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Coligan et al., ed. (1993)).

En algunas realizaciones, unos ejemplos alternativos del anticuerpo anti-GPC3 de la presente invención incluyen un anticuerpo anti-GPC3 conjugado con una sustancia citotóxica. Ese conjugado de anticuerpo anti-GPC3-fármaco (ADC) se describe específicamente en, por ejemplo, el documento WO2007/137170, aunque el conjugado de la presente invención no se limita a los descritos en el mismo. Específicamente, la sustancia citotóxica puede ser cualquiera de los agentes quimioterapéuticos enumerados a continuación o puede ser un compuesto descrito en Alley et al. (Curr. Opin. Chem. Biol. (2010) 14, 529-537) o el documento WO2009/140242. Las moléculas que se unen a antígenos se conjugan con esos compuestos a través de enlazadores apropiados o similares.

En algunas realizaciones, unos ejemplos alternativos del anticuerpo anti-GPC3 de la presente invención incluyen un anticuerpo anti-GPC3 que comprende una región Fc modificada que se une a FcyR que tiene una actividad de unión mayor con los receptores de Fcy que la región Fc de la IgG humana natural con los receptores de Fcy. La modificación puede incluir una modificación de aminoácidos en cualquier posición, siempre que la región Fc resultante tenga una mayor actividad de unión con los receptores de Fcy que la de la región Fc de la IgG humana natural con los receptores de Fcy. Cuando la molécula que se une al antígeno contiene una región Fc de IgG1 humana como región Fc humana, la modificación preferiblemente permite que la región Fc contenga una cadena de azúcar que contiene fucosa como cadena de azúcar unida a la posición 297 (numeración EU) y es eficaz para producir una mayor actividad de unión con los receptores de Fcy que la de la región Fc de IgG humana natural con los receptores de Fcy. Esa modificación de aminoácidos se ha descrito, por ejemplo, en los documentos de publicaciones internacionales n° WO2007/024249, WO2007/021841, WO2006/031370, WO2000/042072, WO2004/029207, WO2004/099249, WO2006/105338, WO2007/041635, WO2008/092117, WO2005/070963, WO2006/020114, WO2006/116260, WO2006/023403 y WO2014/097648.

En algunas realizaciones, la región Fc contenida en el anticuerpo anti-GPC3 proporcionado por la presente invención, también puede incluir una región Fc modificada de modo que una mayor proporción de cadenas de azúcar carentes de fucosa se unan a la región Fc o una mayor proporción de N-acetilglucosamina bisectante se añade a la región Fc en la composición de cadenas de azúcar unidas a la región Fc. Los documentos WO2006/046751 y WO2009/041062 describen ejemplos específicos del anticuerpo anti-GPC3 que comprenden la región Fc modificada de manera que una mayor proporción de cadenas de azúcar carentes de fucosa se unen a la región Fc o se añade una mayor proporción de N-acetilglucosamina bisectante a la región Fc en la composición de cadenas de azúcar unidas a la región Fc.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GPC3 que puede usarse en la presente invención incluye un anticuerpo anti-GPC3 que tiene un residuo de aminoácido modificado para alterar su punto isoeléctrico (pI). Ejemplos preferidos de la "alteración de la carga eléctrica de un residuo de aminoácido" en el anticuerpo anti-GPC3 se describen en el documento WO2009/041062.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GPC3 incluye una forma modificada del anticuerpo que ha recibido una modificación postraduccional del polipéptido que constituye la estructura primaria del anticuerpo anti-GPC3. La modificación postraduccional de un polipéptido se refiere a una modificación química realizada en el polipéptido traducido durante la biosíntesis del polipéptido. Por ejemplo, un anticuerpo anti-GPC3 que ha recibido la modificación de glutamina N-terminal a ácido piroglutámico mediante una piroglutamilación, también se incluye en el anticuerpo anti-GPC3 de la presente invención, como regla general. Además, por ejemplo, un anticuerpo anti-GPC3 modificado postraduccionalmente que comprende cadenas pesadas y ligeras o cadenas pesadas unidas mediante un "enlace disulfuro", lo que significa que un enlace covalente formado entre dos átomos de azufre se incluye en el anticuerpo anti-GPC3 de la presente invención. Un grupo tiol contenido en un aminoácido cisteína puede formar un enlace disulfuro o reticularse con un segundo grupo tiol. En general, en las moléculas de IgG, las regiones CH1 y CL están unidas mediante un enlace disulfuro, y dos polipéptidos que constituyen las cadenas pesadas se unen mediante un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína en las posiciones 226 y 229, según la numeración EU. En el anticuerpo anti-GPC3 de la presente invención también se incluye un anticuerpo anti-GPC3 modificado postraduccionalmente que tiene un enlace de ese tipo a través de un enlace disulfuro.

En otra realización más, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende además un vector adecuado para la expresión del ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-GPC3 descritos anteriormente. En otro aspecto específico más, el vector está en una célula hospedadora adecuada para la expresión del ácido nucleico. En un aspecto aún más específico, la célula hospedadora es una célula eucariota o una célula procariota. En un aspecto aún más específico, la célula eucariota es una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO).

El anticuerpo o el fragmento que se une a antígeno del mismo se puede preparar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante un procedimiento que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-GPC3 descritos anteriormente o un fragmento que se une a antígeno en una forma adecuada para la expresión, en condiciones adecuadas para producir ese anticuerpo o fragmento, y recuperar el anticuerpo o el fragmento.

IV. Preparación de anticuerpos

El anticuerpo descrito en el presente documento se prepara usando tecnologías disponibles en la técnica para generar anticuerpos, cuyos métodos ejemplares se describen con más detalle en las siguientes secciones.

El anticuerpo se dirige contra un antígeno de interés (es decir, PD-L1 (tal como un PD-L1 humano) o GPC3 (tal como un glipicano 3 humano). Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece un trastorno puede dar lugar a un beneficio terapéutico en ese mamífero.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de ^ 1pM, ^ 150 nM, ^ 100 nM, ^ 50 nM, ^ 10 nM, ^ 1 nM, ^ 0,1 nM, ^ 0,01 nM o ^ 0,001 nM (p. ej., 10^-8 M o menos, por ejemplo, de 10^-8 M a 10^-13 M, por ejemplo, de 10^-9 M a 10^-13 M).

En una realización, la Kd se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno, tal y como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión de los Fab en solución hacia el antígeno se mide equilibrando el Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (¹²⁵I) en presencia de una serie de titulaciones de antígeno sin marcar, luego capturando el antígeno unido con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab (véase, p. ej., Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas MICROTITER (registradas) de múltiples pocillos (Thermo Scientific) se recubren durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquean con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc n° 269620), el antígeno ¹²⁵I 100 pM o 26 pM se mezcla con diluciones seriadas de un Fab de interés. A continuación, se incuba el Fab de interés durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, alrededor de 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 al 0,1% (TWEEN-20 (registrado)) en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 pl/pocillo de agente de centelleo (MICROSCINT-20 (marca comercial); Packard) y las placas se cuentan con un contador gamma TOPCOUNT (marca comercial) (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que proporcionan menos de o igual al 20% de unión máxima, se eligen para uso en ensayos de unión competitiva.

Según otra realización, la Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón de superficie usando un BIACORE (registrado) -2000 o un BIACORE (registrado) -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado con ~10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de la inyección con un caudal de 5 pl/minuto, para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con polisorbato 20 al 0,05% (TWEEN-20 (marca comercial)) tensioactivo (PBST) a 25°C con un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Las tasas de asociación (k^asoc) y las tasas de disociación (k^disoc) se calculan utilizando un modelo simple de unión de Langmuir uno a uno (programa informático de evaluación de BIACORE (registrado) versión 3.2), ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación k^asoc/k^disoc. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Si la tasa de activación excede 10⁶ M^-1 s^-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces la tasa de activación se puede determinar utilizando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro de la serie 8000 de SLM-AMINCO (marca comercial) (ThermoSpectronic) con cubeta agitada.

(i) Preparación de antígenos

Los antígenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados con otras moléculas, pueden usarse como inmunógenos para generar anticuerpos. Para moléculas transmembranales, tales como los receptores, se pueden usar fragmentos de éstos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunógeno. Alternativamente, las células que expresan la molécula transmembranal pueden usarse como inmunógeno. Estas células se pueden obtener a partir de una fuente natural (por ejemplo, líneas de células cancerosas) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembranal. Otros antígenos y formas útiles de los mismos para preparar anticuerpos, resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

(ii) Ciertos métodos basados en anticuerpos

Los anticuerpos policlonales se generan preferiblemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que sea inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2 o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, los conjugados inmunogénicos o los derivados, combinando, por ejemplo, 100 gg o 5 gg de la proteína o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund, mediante una inyección subcutánea en múltiples sitios. Después de siete a 14 días, se extrae sangre a los animales y se analiza el título de anticuerpos en el suero. Los animales se refuerzan hasta que el título se estabiliza. Preferiblemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o mediante un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se pueden preparar en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además, agentes coagulantes como el alumbre se usan de manera adecuada para mejorar la respuesta inmune.

Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden preparar usando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), y se describe con más detalle, por ejemplo, en Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed.

1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4): 265-268 (2006) con respecto a los hibridomas humano-humano. Métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en el documento de patente de EE.UU. n° 7.189.826 con respecto a la producción de anticuerpos de IgM naturales humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma. La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Para varias otras técnicas de hibridoma, véanse, p. ej., los documentos de patente de EE.UU. n° US2006/258841; US2006/183887 (anticuerpos completamente humanos), US2006/059575; US2005/287149; US2005/100546; US2005/026229; y los documentos de patente de EE.UU. n° 7.078.492 y 7.153.507. Un protocolo ejemplar para producir anticuerpos monoclonales usando el método de hibridoma se describe a continuación. En una realización, se inmuniza un ratón u otro animal hospedador apropiado, tal como un hámster, para provocar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Los anticuerpos se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de un polipéptido de la invención o un fragmento del mismo, y un adyuvante, tal como monofosforil lípido A (MPL)/dicrinomicolato de trehalosa (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.). Se puede preparar un polipéptido de la invención (por ejemplo, un antígeno) o un fragmento del mismo usando métodos bien conocidos en la técnica, tales como métodos recombinantes, algunos de los cuales se describen con más detalle en el presente documento. El suero de animales inmunizados se analiza para detectar anticuerpos anti-antígeno, y opcionalmente se administran inmunizaciones de refuerzo. Se aíslan los linfocitos de los animales que producen anticuerpos anti-antígeno. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

A continuación, los linfocitos se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Véase, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p. 59-103 (Academic Press, 1986). Se pueden usar células de mieloma que se fusionan de manera eficaz, favorecen una producción estable de un nivel elevado de anticuerpos a través de las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las células de mieloma ejemplares incluyen, pero no se limitan a, líneas de mieloma murino, tales como las obtenidas a partir de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. EE.UU. y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-ser humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo, un medio que contiene una o varias sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias impiden el crecimiento de células que carecen de HGPRT. Preferiblemente, los métodos de cultivo de células de hibridoma sin suero se utilizan para reducir el uso de suero de origen animal, tal como suero bovino fetal, como se describe, por ejemplo, en Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).

Los oligopéptidos como herramientas para mejorar la productividad de los cultivos de células de hibridoma se describen en Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005). Específicamente, los medios de cultivo estándar están enriquecidos con ciertos aminoácidos (alanina, serina, asparagina, prolina) o con fracciones de hidrolizado de proteínas, y la apoptosis puede ser suprimida significativamente por oligopéptidos sintéticos, constituidos por tres a seis residuos de aminoácidos. Los péptidos están presentes en concentraciones milimolares o superiores.

El medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se puede someter a ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales que se unen a un anticuerpo de la invención. La especificidad de la unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma puede determinarse mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA). La afinidad de la unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante un análisis de Scatchard. Véase, por ejemplo, Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980).

Una vez identificadas las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitantes y cultivar mediante métodos estándar. Véase, por ejemplo, Goding, supra. Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía por afinidad. Un procedimiento para el aislamiento de proteínas desde células de hibridoma se describe en los documentos US2005/176122 y patente de EE.UU. n° 6.919.436. El método incluye el uso de sales mínimas, tales como sales liotrópicas, en el proceso de unión y preferiblemente también el uso de pequeñas cantidades de disolventes orgánicos en el proceso de elución.

(iii) Anticuerpos derivados de bancos

Los anticuerpos de la invención pueden aislarse rastreando bancos combinatorias en busca de anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen en la técnica una variedad de métodos para generar bancos de presentación de fagos y rastrear dichas bancos en busca de anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Se revisan métodos adicionales, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178: 1­ 37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describe con más detalle, por ejemplo, en el McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, compilador, Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).

En ciertos métodos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bancos de fagos, que luego pueden cribarse para detectar fagos que se unen a antígenos, como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433­ 455 (1994).). Los fagos suelen mostrar fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos Fv de cadena única (scFv) o como fragmentos Fab. Los bancos procedentes de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad hacia el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio virgen se puede clonar (por ejemplo, procedente de seres humanos) para proporcionar una única fuente de anticuerpos contra una amplia gama de antígenos no propios y también autoantígenos, sin ninguna inmunización tal y como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725­ 734 (1993). Finalmente, los bancos vírgenes también se pueden preparar sintéticamente, clonando segmentos del gen V no reordenados procedentes de células madre y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y lograr un reordenamiento in vitro, tal y como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992). Los documentos de publicaciones de patentes que describen bancos de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: el documento de patente de EE.UU. n° 5.750.373 y los documentos de publicación de patente de EE.UU. n22005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados de bancos de anticuerpos humanos, se consideran en este documento anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos.

(iv) Anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en el documento de patente de EE.UU. n° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable obtenida a partir de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo con la "clase cambiada" en donde la clase o subclase se ha cambiado con respecto a la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de los mismos que se unen a antígenos.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en humanos, a la vez que se conserva la especificidad y la afinidad del anticuerpo no humano original. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o varios dominios variables en los que las HVRs, por ejemplo, las CDRs, (o porciones de las mismas) se obtienen a partir de un anticuerpo no humano, y las FRs (o porciones de las mismas) se obtienen a partir de secuencias de anticuerpos humanos. Opcionalmente, un anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos residuos de FRs en un anticuerpo humanizado se sustituyen con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo a partir del cual se obtienen los residuos de HVRs), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o la afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los métodos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), y se describen con más detalle, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 10029-10033 (1989); los documentos de patente de EE.UU. n° 5.821.337, 7.527.791,6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36 : 25-34 (2005) (que describen el injerto de SDR (a-cDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (que describen "reparación"); Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (que describen la "reproducción aleatoria de Fr"); y Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" para mezclar al azar las FRs).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el método de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)); regiones estructurales obtenidas a partir de la secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol, 151: 2623 (1993)); regiones estructurales humanas maduras (mutadas somáticamente) o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); y regiones estructurales obtenidas a partir del cribado de bancos de FRs (véase, p. ej., Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)).

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en este documento es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversos métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen generalmente en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).

Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando un inmunógeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas, como respuesta a una exposición a antígenos. Esos animales contienen típicamente todos o una porción de los loci de inmunoglobulina humana, que reemplazan los loci de inmunoglobulina endógenos, o que están presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos, los loci de inmunoglobulina endógenos generalmente se han inactivado. Para revisar los métodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, los documentos de patente de EE.UU. n° 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE (marca comercial); documento de patente de EE.UU. n° 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB (registrada); documento de patente de EE.UU. n° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE (registrada) y el documento de publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° US2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE (registrada). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por tales animales pueden modificarse adicionalmente, por ejemplo, combinándolas con una región constante humana diferente.

Los anticuerpos humanos también se pueden preparar mediante métodos basados en hibridomas. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-ser humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). Los anticuerpos humanos generados a través de la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006). Métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en el documento de patente de EE.UU. n° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006) (que describe hibridomas ser humano-se humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Los anticuerpos humanos también pueden generarse aislando secuencias del dominio variable de clones de Fv, seleccionadas a partir de bancos de presentación en fagos obtenidas a partir de seres humanos. A continuación, esas secuencias del dominio variable pueden combinarse con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos a partir de bancos de anticuerpos se describen a continuación.

(v) Fragmentos de anticuerpos

Los fragmentos de anticuerpos se pueden generar por medios tradicionales, tales como la digestión enzimática, o por técnicas recombinantes. En determinadas circunstancias, existen ventajas por utilizar fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite una eliminación rápida y puede conducir a un mejor acceso a los tumores sólidos. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpos, véase Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9: 129-134.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, esos fragmentos se obtenían mediante una digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, p. ej., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Sin embargo, esos fragmentos ahora pueden ser producidos directamente por células hospedadoras recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv se pueden expresar y secretar a partir de E. coli, lo que permite una producción simplificada de grandes cantidades de esos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse a partir de los bancos de fagos de anticuerpos descritos anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente a partir de un cultivo de células hospedadoras recombinantes. El fragmento Fab y F(ab')2 con una semivida in vivo aumentada que comprende residuos del epítopo que se une al receptor de rescate, se describen en el documento de patente de EE.UU. n° 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para un experto en la técnica. En determinadas realizaciones, un anticuerpo es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). Véanse el documento WO93/16185; patentes de EE.UU. n° 5.571.894; y 5.587.458. Fv y scFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; por tanto, pueden ser adecuadas para una unión inespecífica reducida durante el uso in vivo. Se pueden construir proteínas de fusión de scFv para producir la fusión de una proteína efectora en el extremo amino o carboxi terminal de un scFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal y como se describe en el documento de patente de EE.UU. n° 5.641.870, por ejemplo. Esos anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

(vi) Anticuerpos de dominio único

En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo de dominio único. Un anticuerpo de dominio único es una cadena polipeptídica simple que comprende todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; Véase, por ejemplo, el documento de patente de EE.UU. n° 6.248.516). En una realización, un anticuerpo de dominio único consiste en todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo.

(vii) Variantes de anticuerpos

En algunas realizaciones, se contemplan modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de la unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se pueden preparar introduciendo cambios apropiados en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede realizarse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la estructura artificial final, siempre que la estructura artificial final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo objeto en el momento en que se prepara la secuencia.

(viii) Variantes por sustitución, inserción y deleción

En determinadas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una o varias sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para una mutagénesis por sustitución incluyen las HVRs y FRs. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el título de "Sustituciones preferidas". Se proporcionan cambios más sustanciales en la Tabla 1 bajo el título de "Sustituciones ejemplares" y como se describe adicionalmente a continuación haciendo referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y los productos se pueden cribar en busca de una actividad deseada, por ejemplo, unión al antígeno conservada/mejorada, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC mejorada.

Tabla 1

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con las propiedades comunes de la cadena lateral:

a. hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

b. hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

c. ácidos: Asp, Glu;

d. básicos: His, Lys, Arg;

e. residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

f. aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Un tipo de variante de sustitución implica la sustitución de uno o varios residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, las variantes resultantes seleccionadas para estudios adicionales tendrán modificaciones (p. ej., mejoras) en ciertas propiedades biológicas (p. ej., afinidad aumentada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo original y/o habrán retenido sustancialmente ciertas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante por sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede generarse convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración por afinidad basadas en la presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. Brevemente, uno o varios residuos de HVR se mutan y los anticuerpos variantes se muestran en el fago y se seleccionan para una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de la unión).

Pueden realizarse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVRs, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Tales alteraciones pueden realizarse en "focos" de HVRs, es decir, residuos codificados por codones que experimentan una mutación con una alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)) y/o SDRs (a-CDRs), con la variante resultante VH o VL sometida a ensayo para determinar la afinidad de la unión. La maduración por afinidad mediante la construcción y selección repetida de bancos secundarios se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., compiladores, Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunas realizaciones de maduración por afinidad, la diversidad se introduce en los genes variables elegidos para la maduración mediante cualquiera entre una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a errores, mezcla al azar de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación se crea un banco secundario. Después, se analiza el banco para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos por HVRs, en los que se aleatorizan varios residuos de HVRs (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Los residuos de HVRs implicados en la unión de antígenos pueden identificarse específicamente, por ejemplo, usando mutagénesis por barrido de alanina o creando modelos. CDR-H3 y CDR-L3 en particular son frecuentemente la diana.

En determinadas realizaciones, pueden producirse sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o varias HVRs, siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden realizarse alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras tal y como se proporcionan en el presente documento) que no reducen sustancialmente la afinidad de la unión en la HVR. Tales alteraciones pueden estar fuera de los "focos" de HVR o SDR. En determinadas realizaciones de las secuencias variantes de VH y VL proporcionadas anteriormente, cada HVR no está alterada o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Un método útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que pueden ser la diana de una mutagénesis, se denomina "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244: 1081 -1085. En ese método, un residuo o grupo de residuos diana (p. ej., residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) se identifican y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (p. ej., alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones de los aminoácidos que muestren una sensibilidad funcional con las sustituciones iniciales. Alternativa o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígenoanticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Esos residuos de contacto y residuos vecinos pueden seleccionarse o eliminarse como candidatos para la sustitución. Las variantes pueden seleccionarse para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de extremos amino-terminales y/o carboxiloterminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal. Otras variantes por inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión con el extremo N-terminal o C-terminal del anticuerpo con una enzima (por ejemplo, ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

(ix) Variantes por glicosilación

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se modifica para aumentar o disminuir el grado en el que el anticuerpo está glicosilado. La adición o deleción de sitios de glicosilación en un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos, de manera que se creen o se eliminen uno o varios sitios de glicosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el carbohidrato fijado al mismo se puede alterar. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamíferos comprenden típicamente un oligosacárido biantenario ramificado que generalmente está fijado por un enlace de N con Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15: 26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunas realizaciones, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpos con ciertas propiedades mejoradas.

En una realización, se proporcionan variantes de anticuerpos que comprenden una región Fc en la que una estructura de carbohidrato fijada a la región Fc tiene fucosa reducida o carece de fucosa, lo que puede mejorar la función ADCC. Específicamente, se contemplan en el presente documento anticuerpos que tienen fucosa reducida en relación con la cantidad de fucosa en el mismo anticuerpo producido en una célula CHO de tipo silvestre. Es decir, se caracterizan por tener una cantidad menor de fucosa de la que tendrían si fueran producidos por células CHO naturales (por ejemplo, una célula CHO que produce un patrón de glicosilación natural, tal como una célula CHO que contiene un gen FUT8 natural). En determinadas realizaciones, el anticuerpo es uno en el que menos de aproximadamente el 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5% de los glicanos unidos a N en el mismo, comprenden fucosa. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en ese anticuerpo puede ser del 1% al 80%, del 1% al 65%, del 5% al 65% o del 20% al 40%. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es uno en el que ninguno de los glicanos unidos a N del mismo contiene fucosa, es decir, en donde el anticuerpo está completamente exento de fucosa, o no tiene fucosa o está afucosilado. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, en relación con la suma de todas las glicoestructuras fijadas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras de un complejo, híbridas y con alto contenido en manosa) medidas por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina ubicado aproximadamente en la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también puede ubicarse aproximadamente ± 3 aminoácidos cadena arriba o cadena abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones menores en la secuencia de los anticuerpos. Tales variantes de fucosilación pueden tener una función ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, los documentos de publicaciones de patente de EE.UU. n° US2003/0157108 (Presta, L.); US2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos "desfucosilados" o "carentes de fucosa" incluyen: US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140: Okazaki et al. J. Mol. Biol.

336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lecl3 carentes de una fucosilación de las proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); documento de publicación de patente de EE.UU. n° US2003/0157108, Presta, L; y documento WO2004/056312, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11), y líneas celulares desactivadas, tales como células CHO con el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, desactivado (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).

Las variantes de anticuerpos se proporcionan además con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en los que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fc del anticuerpo, se bisecciona con GlcNAc. Tales variantes de anticuerpos pueden tener una fucosilación reducida y/o una función ADCC mejorada. Se describen ejemplos de tales variantes de anticuerpos, por ejemplo, en los documentos WO2003/011878 (Jean-Mairetet al.); patente de EE.UU. n° 6.602.684 (Umana et al.); US2005/0123546 (Umana et al.) y Ferrara et al., Biotech. Bioeng. 93(5): 851-861 (2006). También se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido fijado a la región Fc. Tales variantes de anticuerpos pueden tener una función CDC mejorada. Tales variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en los documentos WO1997/30087 (Patel et al.); WO1998/58964 (Raju, S.); y WO1999/22764 (Raju, S.).

En determinadas realizaciones, las variantes de anticuerpos que comprenden una región Fc, descritas en el presente documento, son capaces de unirse a un FcyRIII. En ciertas realizaciones, las variantes de anticuerpos que comprenden una región Fc, descritas en el presente documento tienen actividad ADCC en presencia de células efectoras humanas o tienen una actividad ADCC aumentada en presencia de células efectoras humanas en comparación con el mismo anticuerpo que comprende una región Fc de IgG1 de tipo silvestre humano.

(x) Variantes de la región Fc

En determinadas realizaciones, se pueden introducir una o varias modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando así una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o varias posiciones de aminoácidos.

En determinadas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, aunque determinadas funciones efectoras (como el complemento y la ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/agotamiento de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por lo tanto, probablemente carece de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión de FcRn. Las células primarias para mediar en ADCC, las células NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en el documento de patente de EE.UU. n° 5.500.362 (véase, p. ej. Hellstrom, I. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985); documento 5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351 -1361 (1987)). Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayos no radiactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI (marca comercial) para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96 (registrado) (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el descrito en Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a C1q y, por tanto, carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO2006/029879 y WO2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Métodos 202: 163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). Las determinaciones de unión de FcRn y aclaramiento/semivida in vivo también se pueden realizar usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18 (12): 1759-1769 (2006)).

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con la sustitución de uno o varios de los residuos de la región Fc, 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (documento de patente de EE.UU. n° 6.737.056). Esos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluido el mutante de Fc denominado "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (documento de patente de EE.UU. n° 7.332.581).

Se describen ciertas variantes de anticuerpos con unión mejorada o disminuida a FcR. (Véanse, por ejemplo, documento de patente de EE.UU. n° 6.737.056; WO2004/056312 y Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2): 6591 -6604 (2001)).

En determinadas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o varias sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de los residuos). En una realización ejemplar, el anticuerpo comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos en su región Fc: S298A, E333A y K334A.

En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región Fc que dan como resultado una unión de C1q alterada (es decir, mejorada o disminuida) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, tal y como se describe en el documento de patente de EE.UU. n° 6.194.551, WO99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Anticuerpos con semivida aumentada y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934 (Hinton et al.). Esos anticuerpos comprenden una región Fc con una o varias sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Tales variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o varios de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, p. ej., una sustitución del residuo 434 de la región Fc (documento de patente de EE.UU. n° 7.371.826). Véanse también Duncan y Winter, Nature 322: 738-40 (1988).); documento de patente de EE.UU. n° 5.648.260; documento de patente de EE.UU. n° 5.624.821; y WO94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

(xi) Derivados de anticuerpos

Los anticuerpos de la invención se pueden modificar adicionalmente para que contengan restos no proteicos adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. En determinadas realizaciones, los restos adecuados para una derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o el tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar basándose en consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se va a mejorar, si el derivado del anticuerpo se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.

(xii) Vectores, células hospedadoras y métodos recombinantes

También se pueden producir anticuerpos usando métodos recombinantes. Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-antígeno, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se aísla y se inserta en un vector replicable para una clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o varios de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o varios genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

(a) Componente de secuencias señal

Un anticuerpo de la invención puede producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína o el polipéptido maduros. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que es reconocida y procesada (por ejemplo, escindida por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. Para las células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan una secuencia señal de un anticuerpo natural, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de líderes de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o enterotoxina II termoestable. Para la secreción de levadura, la secuencia señal natural puede ser sustituida, por ejemplo, por el líder de la invertasa de levadura, un líder de un factor (incluidos los líderes del factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces) o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en el documento WO90/13646. En la expresión de células de mamíferos, se encuentran disponibles secuencias señal de mamíferos así como líderes secretores víricos, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

(b) Origen de replicación

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o varias células hospedadoras seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esa secuencia permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedador, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2p es adecuado para levaduras, y varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el origen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos (el origen de SV40 puede usarse típicamente solo porque contiene el promotor temprano).

(c) Componente del gen de selección

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia frente a antibióticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes decisivos no disponibles en medios complejos, p. ej., el gen que codifica la D-alanina racemasa para los Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Aquellas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y, por tanto, sobreviven con el régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante se emplean con los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar un ácido nucleico que codifica anticuerpos, como DHFR, glutamina sintetasa (GS), timidina cinasa, metalotioneína-I y -II, preferiblemente genes de metalotioneína de primates, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen DHFR se identifican cultivando los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. En esas condiciones, el gen DHFR se amplifica junto con cualquier otro ácido nucleico cotransformado. Puede usarse una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) que carece de la actividad DHFR endógena (por ejemplo, ATCC CRL-9096).

Alternativamente, las células transformadas con el gen GS se identifican cultivando los transformantes en un medio de cultivo que contiene L-metionina sulfoximina (Msx), un inhibidor de GS. En estas condiciones, el gen GS se amplifica junto con cualquier otro ácido nucleico cotransformado. El sistema de selección/amplificación de GS puede usarse en combinación con el sistema de selección/amplificación de DHFR descrito anteriormente.

Alternativamente, las células hospedadoras (particularmente hospedadoras de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de interés, gen DHFR de tipo silvestre y otro marcador seleccionable como la aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH), pueden ser seleccionadas por crecimiento celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Véase el documento de patente de EE.UU. n° 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para uso en levaduras es el gen trp 1, presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). El gen trp 1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC n° 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión de trp 1 en el genoma de la célula hospedadora de levadura, proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De manera similar, las cepas de levadura que carecen de Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan con plásmidos conocidos que son portadores del gen Leu2.

Además, los vectores obtenidos a partir del plásmido circular pKD1 de 1,6 pm, pueden usarse para la transformación de las levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, se ha descrito un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). También se han descrito vectores de expresión con copias múltiples estables para la secreción de albúmina sérica humana recombinante madura, a través de cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).

(d) Componente de promotor

Los vectores de expresión y clonación contienen generalmente un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está ligado funcionalmente al ácido nucleico que codifica un anticuerpo. Los promotores adecuados para uso con hospedadores procarióticos incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa, el promotor de fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada funcionalmente al ADN que codifica un anticuerpo.

Las secuencias promotoras son conocidas para los eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases aguas arriba del sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra de 70 a 80 bases aguas arriba desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas esas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucariotas.

Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para un uso con levaduras hospedadoras incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas de degradación asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para un uso en la expresión de levaduras se describen con más detalle en el documento EP73.657. Los potenciadores de levaduras también se utilizan ventajosamente con promotores de levaduras.

La transcripción de anticuerpos a partir de vectores en células hospedadoras de mamíferos se puede controlar, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de los genomas de virus, tal como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el adenovirus (como el adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B, el virus de los simios 40 (SV40), o a partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, siempre que esos promotores sean compatibles con los sistemas de las células hospedadoras.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar ADN en hospedadores mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como vector se describe en el documento de patente de EE.UU. n° 4.419.446. Una modificación de ese sistema se describe en el documento de patente de EE.UU. n° 4.601.978. Véase también Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) sobre la expresión de un ADNc del interferón p humano en células de ratón, bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous se puede utilizar como promotor.

(e) Componente de elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica un anticuerpo de esta invención mediante eucariotas superiores, a menudo aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Sin embargo, normalmente se utilizará un potenciador procedente de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) para elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador se puede unir en el vector en una posición 5' o 3' de la secuencia que codifica el anticuerpo, pero preferiblemente está ubicado en un sitio 5' del promotor.

(f) Componente de terminación de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos o células con núcleo de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles en las regiones 5' y, ocasionalmente 3', no traducidas de un ADN o ADNc eucariota o vírico. Esas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del anticuerpo que codifica el ARNm. Un componente de la terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión descrito en el mismo.

(g) Selección y transformación de células hospedadoras

Las células hospedadoras adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados para ese fin incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, p. ej., Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (p. ej., B. licheniformis 41P descrito en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Un hospedador de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Esos ejemplos son ilustrativos más que limitantes.

Se pueden producir anticuerpos de longitud completa, proteínas de fusión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en bacterias, en particular cuando la glicosilación y la función efectora de Fc no son necesarias, como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) que por sí mismo muestra eficacia en la destrucción de células tumorales. Los anticuerpos de longitud completa tienen una semivida mayor en la circulación. La producción en E. coli es más rápida y rentable. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias, véanse, p. ej., el documento de patente de EE.UU. n° 5.648.237 (Carter et al.), el documento de patente de EE.UU. n° 5.789.199 (Joly et al.), el documento de patente de EE.UU. n° 5.840.523 (Simmons et al.), que describe la región de inicio de la traducción (TIR) y secuencias señal para optimizar la expresión y la secreción. Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K. C. Lo, compilador, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 2003), p. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpos en E. coli. Después de la expresión, el anticuerpo puede aislarse de la pasta celular de E. coli en una fracción soluble y puede purificarse, por ejemplo, a través de una columna de proteína A o G, dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al procedimiento para purificar el anticuerpo expresado, por ejemplo, en células CHO.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o las levaduras son hospedadores adecuados para la clonación o expresión, para vectores que codifican anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae o levadura de panadería común, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos hospedadores eucariotas inferiores. Sin embargo, varios otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en este documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; hospedadores de Kluyveromyces como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (At CC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (documento EP402.226); Pichia pastoris (documento EP183.070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, hospedadores de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Para una revisión que describe el uso de levaduras y hongos filamentosos para la producción de proteínas terapéuticas, Véase, por ejemplo, Gerngross, Nat. Biotecnología. 22: 1409-1414 (2004).

Se pueden seleccionar ciertas cepas de hongos y levaduras en las que se han "humanizado" las rutas de glicosilación, lo que da como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o totalmente humano. Véase, por ejemplo, Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006) (que describe la humanización de la vía de glicosilación en Pichia pastoris); y Gerngross et al., supra.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpos glicosilados también se obtienen a partir de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos y plantas. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y las células hospedadoras de insectos, permisivas correspondientes, procedentes de hospedadores tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Una variedad de cepas víricas para la transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y esos virus pueden usarse como el virus de la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar como hospedadores, cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, lenteja de agua (Leninaceae), alfalfa (M. truncatula) y tabaco. Véanse, por ejemplo, los documentos de patente de EE.UU. n25.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describe la tecnología PLANTIBODIES (marca comercial) para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

Las células de vertebrados se pueden utilizar como hospedadores, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos útiles, son la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en un cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); las células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); las células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); las células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); las células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); las células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); las células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células de pulmón humano (W138, ATCC Cc L 75); las células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); el tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); las células TRI (Mather et al., Annals NY. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); las células MRC 5; las células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Otras líneas de células hospedadoras de mamíferos útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluidas células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como NS0 y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas de células hospedadoras de mamíferos adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, p. ej., Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K. C. Lo, compilador, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 2003), p. 255-268.

Las células hospedadoras se transforman con los vectores de clonación o expresión descritos anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

(h) Cultivo de células hospedadoras

Las células hospedadoras utilizadas para producir un anticuerpo de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente como Ham's F10 (Sigma), medio mínimo esencial (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), (Sigma) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), los documentos de patente de EE.UU. n° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; WO90/03430; WO87/00195; o de patente de EE.UU. Re.

30.985, puede usarse como medio de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como fármaco GENTAMYCIN (marca comercial)), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente con concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro complemento necesario en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para el experto en la materia.

(xiii) Purificación del anticuerpo

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico o secretar directamente al medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primer paso, los restos de partículas, ya sean células hospedadoras o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, el material sobrenadante de tales sistemas de expresión generalmente se concentra primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa tal como PMSF en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía por afinidad, siendo la cromatografía por afinidad una de las etapas de purificación típicamente preferidas. La idoneidad de la proteína A como ligando de la afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de la inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad suele ser agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables como el vidrio con poro controlado o el poli(estirendivinil)benceno permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX (marca comercial) (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE (marca comercial) cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (como una columna de poli(ácido aspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio, también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

En general, diversas metodologías para preparar anticuerpos para uso en investigación, ensayos y análisis clínicos están bien establecidas en la técnica, de acuerdo con las metodologías descritas anteriormente y/o según lo considere apropiado un experto en la técnica para un anticuerpo particular de interés.

C. Selección de anticuerpos biológicamente activos

Los anticuerpos producidos tal y como se ha descrito anteriormente pueden someterse a uno o varios ensayos de la "actividad biológica" para seleccionar un anticuerpo con propiedades beneficiosas desde una perspectiva terapéutica o seleccionar formulaciones y condiciones que conservan la actividad biológica del anticuerpo. El anticuerpo puede someterse a ensayo para determinar su capacidad para unirse al antígeno contra el que se ha generado. Por ejemplo, pueden usarse métodos conocidos en la técnica (tales como ELISA, transferencia Western, etc.).

Por ejemplo, para un anticuerpo anti-PD-L1, las propiedades de unión al antígeno del anticuerpo pueden evaluarse en un ensayo que detecta la capacidad para unirse a PD-L1. En algunas realizaciones, la unión del anticuerpo puede determinarse mediante unión por saturación; ELISA; y/o ensayos de competición (por ejemplo, RIA), por ejemplo. Además, el anticuerpo puede someterse a otros ensayos de la actividad biológica, por ejemplo, para evaluar su eficacia como agente terapéutico. Esos ensayos son conocidos en la técnica y dependen del antígeno diana y del uso previsto para el anticuerpo. Por ejemplo, los efectos biológicos del bloqueo de PD-L1 a través del anticuerpo pueden evaluarse en linfocitos T CD8+, un modelo de ratón del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) y/o un modelo de tumor singénico, por ejemplo, como se describe en el documento de patente de EE.UU. n° 8.217.149.

Para seleccionar anticuerpos que se unen a un epítopo particular en el antígeno de interés (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión del anticuerpo anti-PD-L1 del ejemplo a PD-L1), un ensayo de bloqueo cruzado rutinario, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), puede ser llevado a cabo. Alternativamente, el cartografiado de epítopos, como se describe por ejemplo en Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995), se puede realizar para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.

D. Composiciones y formulaciones farmacéuticas

También se proporcionan en el presente documento composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden un antagonista que se une al eje PD-1 y/o un anticuerpo descrito en el presente documento (tal como un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo anti-GPC3) como ingrediente activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

"Combinación", tal y como se describe en el presente documento, se refiere a una combinación de ingredientes activos para uso combinado, e incluye ambos modos en los que se usan sustancias distintas en combinación después de la administración o cuando se proporcionan como una mezcla (preparación combinada).

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas tal y como se describen en el presente documento, se pueden preparar mezclando ingredientes activos (como un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-GPC3) que tienen el grado de pureza deseado, con uno o varios vehículos opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. compilador (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecil dimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Znproteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en la presente incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glicoproteínas de hialuronidasas activas neutras solubles (sHASEGP), por ejemplo, glicoproteínas de hialuronidasas PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX (registrado), Baxter International, Inc.). Ciertos ejemplos de sHASEGPs y métodos de uso, incluida rHuPH20, se describen en los documentos de publicación de patente de EE.UU. n° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o varias glicosaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas.

Las formulaciones de anticuerpos liofilizados ejemplares se describen en el documento de patente de EE.UU. n° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosos incluyen las descritas en los documentos de patente de EE.UU. n° 6.171.586 y WO2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón acetato de histidina. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 descrito en este documento está en una formulación que comprende el anticuerpo en una concentración de aproximadamente 60 mg/ml, acetato de histidina en una concentración de aproximadamente 20 mM, sacarosa en una concentración de aproximadamente 120 mM y polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20) en una concentración de 0,04% (p/v), y la formulación tiene un pH de aproximadamente 5,8. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 descrito en el presente documento está en una formulación que comprende el anticuerpo en una concentración de aproximadamente 125 mg/ml, acetato de histidina en una concentración de aproximadamente 20 mM, sacarosa en una concentración de aproximadamente 240 mM, y polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20) en una concentración de 0,02% (p/v), y la formulación tiene un pH de aproximadamente 5,5.

La composición y la formulación de la presente invención también pueden contener más de un ingrediente activo, según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sí. Esos ingredientes activos están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para los fines pretendidos.

Los ingredientes activos pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Esas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. compilador (1980).

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos moldeados, p. ej., películas o microcápsulas. Las formulaciones que se utilizarán para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

IV. Métodos de tratamiento

En el presente documento se proporcionan métodos para tratar, prevenir o retrasar la progresión del cáncer en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista que se une al eje PD-1 y un anticuerpo anti-GPC3. En algunas realizaciones, el tratamiento da como resultado una respuesta sostenida en el individuo después de la interrupción del tratamiento. Los métodos descritos en el presente documento pueden encontrar uso en el tratamiento de afecciones en las que se desea una mayor inmunogenicidad, tal como aumentar la inmunogenicidad tumoral para el tratamiento del cáncer. También se proporcionan en este documento métodos para potenciar las respuestas inmunes contra las células tumorales en un individuo que tiene cáncer, que comprenden administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista que se une al eje PD-1 y un anticuerpo anti-GPC3. Por ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen la infiltración de células inmunes, incluidos macrófagos y células gigantes multinucleadas, en los tejidos tumorales. En otro ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen el aumento de linfocitos positivos para CD45, linfocitos positivos para CD3s y linfocitos T positivos para CD8 en los linfocitos infiltrados en tumores (TlLs). Cualquiera de los antagonistas que se unen al eje PD-1 y los anticuerpos anti-GPC3 conocidos en la técnica o descritos en este documento, pueden usarse en los métodos.

En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano. En algunas realizaciones, el individuo tiene un cáncer positivo para GPC3. En algunas realizaciones, el cáncer positivo para GPC3 es cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de esófago o cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer de hígado es un carcinoma hepatocelular. En algunas realizaciones, el cáncer de mama es un carcinoma de mama o un adenocarcinoma de mama. En algunas realizaciones, el carcinoma de mama es un carcinoma ductal invasivo. En algunas realizaciones, el cáncer de pulmón es un adenocarcinoma de pulmón. En algunas realizaciones, el cáncer de colon es un adenocarcinoma colorrectal. En algunas realizaciones, las células cancerosas del individuo expresan PD-L1. En algunas realizaciones, las células cancerosas del individuo expresan la proteína GPC3 a un nivel que es detectable (por ejemplo, detectable usando métodos conocidos en la técnica).

En algunas realizaciones, el individuo ha sido tratado con una terapia dirigida a GPC3 antes del tratamiento de combinación con un antagonista que se une al eje PD-1 y un anticuerpo anti-GPC3. En algunas realizaciones, la terapia dirigida a GPC3 incluye el tratamiento con una o varias moléculas pequeñas, por ejemplo, sorafenib.

La terapia de combinación de la invención puede comprender la administración de un antagonista que se une al eje PD-1 y un anticuerpo anti-GPC3. El antagonista que se une al eje PD-1 y el anticuerpo anti-GPC3 pueden administrarse de cualquier manera adecuada conocida en la técnica. Por ejemplo, el antagonista que se une al eje PD-1 y el anticuerpo anti-GPC3 pueden administrarse secuencialmente (en diferentes momentos) o simultáneamente (al mismo tiempo). En algunas realizaciones, el antagonista que se une al eje PD-1 está en una composición distinta a la del anticuerpo anti-GPC3. En algunas realizaciones, el antagonista que se une al eje PD-1 está en la misma composición que el anticuerpo anti-GPC3.

El antagonista que se une al eje PD-1 y el anticuerpo anti-GPC3 pueden administrarse a través de la misma vía de administración o mediante diferentes vías de administración. El antagonista que se une al eje PD-1 puede administrarse por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantación, por inhalación, intratecal, intraventricular o intranasal. El anticuerpo anti-GPC3 puede administrarse por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantación, por inhalación, intratecal, intraventricular o intranasal. Se puede administrar una cantidad eficaz del antagonista que se une al eje PD-1 y del anticuerpo anti-GPC3 para la prevención o el tratamiento de una enfermedad. La dosificación apropiada del antagonista que se une al eje PD-1 y/o del anticuerpo anti-GPC3 puede determinarse en función del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de antagonista que se une al eje PD-1 y el anticuerpo anti-GPC3, la gravedad y el curso de la enfermedad, la afección clínica del individuo, la historia clínica del individuo y la respuesta al tratamiento, y la discreción del médico tratante.

Como propuesta general, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo administrado a seres humanos estará en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente, ya sea mediante una o varias administraciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo utilizado es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 15 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 mg/kg, administrados diariamente, por ejemplo. En algunas realizaciones, se administran 15 mg/kg de anticuerpo. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. En una realización, un anticuerpo anti-PD-L1 descrito en el presente documento se administra a un ser humano en una dosis de aproximadamente 100 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 400 mg, aproximadamente 500 mg, aproximadamente 600 mg, aproximadamente 700 mg, aproximadamente 800 mg, aproximadamente 900 mg, aproximadamente 1000 mg, aproximadamente 1100 mg, aproximadamente 1200 mg, aproximadamente 1300 mg o aproximadamente 1400 mg el día 1 de los ciclos de 21 días. La dosis se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples (por ejemplo, 2 o 3 dosis), tal como infusiones. La dosis del anticuerpo administrada en un tratamiento de combinación puede reducirse en comparación con un tratamiento único. El progreso de esa terapia se controla fácilmente mediante técnicas convencionales.

Los métodos pueden comprender además una terapia adicional. La terapia adicional puede ser radioterapia, cirugía (p. ej., tumorectomía y mastectomía), quimioterapia, terapia génica, terapia con ADN, terapia viral, terapia con ARN, inmunoterapia, trasplante de médula ósea, nanoterapia, terapia con anticuerpos monoclonales o una combinación de las anteriores. La terapia adicional puede ser en forma de terapia con adyuvante o neoadyuvante. La terapia adicional puede ser la administración de un inhibidor enzimático de molécula pequeña o un agente antimetastásico. La terapia adicional puede ser la administración de agentes limitantes de los efectos secundarios (por ejemplo, agentes destinados a disminuir la aparición y/o la gravedad de los efectos secundarios del tratamiento, tales como agentes contra la náusea, etc.). La terapia adicional puede ser radioterapia. La terapia adicional puede ser cirugía. La terapia adicional puede ser una combinación de radioterapia y cirugía. La terapia adicional puede ser una radiación gamma. La terapia adicional puede ser una terapia que se dirige a la vía PI3K/AKT/mTOR, al inhibidor de HSP90, al inhibidor de tubulina, al inhibidor de la apoptosis y/o agente quimiopreventivo. La terapia adicional puede ser uno o varios de los agentes quimioterapéuticos descritos en este documento.

V. Artículos de fabricación o kits

Además, se proporciona un artículo de fabricación o un kit que comprende un antagonista que se une al eje PD-1 y/o un anticuerpo anti-GPC3. El artículo de fabricación o kit puede comprender además un prospecto que comprende instrucciones para la administración del antagonista que se une al eje PD-1 junto con un anticuerpo anti-GPC3 para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo o para mejorar las respuestas inmunes contra las células tumorales de un individuo que tiene cáncer. Por ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen la infiltración de células inmunes, incluidos macrófagos y células gigantes multinucleadas, en los tejidos tumorales. En otro ejemplo, las respuestas inmunes mejoradas contra las células tumorales incluyen el aumento de linfocitos positivos para CD45, linfocitos positivos para CD3s y linfocitos T positivos para CD8 en los linfocitos infiltrados en tumores (TILs). Cualquiera de los antagonistas que se unen al eje PD-1 y/o los anticuerpos anti-GPC3 descritos en el presente documento, pueden incluirse en el artículo de fabricación o en los kits.

El antagonista que se une al eje PD-1 y el anticuerpo anti-GPC3 pueden estar en el mismo recipiente o en recipientes distintos. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, bolsas y jeringas. El recipiente puede estar formado por una variedad de materiales tales como vidrio, plástico (como poli(cloruro de vinilo) o poliolefina) o una aleación de metal (como acero inoxidable o hastelloy). El recipiente puede contener la formulación y la etiqueta sobre el mismo, o asociada con, el recipiente puede indicar las instrucciones de uso. El artículo de fabricación o kit puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso. El artículo de fabricación puede incluir además uno o varios otros agentes (por ejemplo, un agente quimioterapéutico y un agente antineoplásico). Los recipientes adecuados para uno o varios agentes incluyen, por ejemplo, botellas, viales, bolsas y jeringas.

Se considera que la memoria descriptiva es suficiente para permitir que un experto en la técnica ponga en práctica la invención. Varias modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en el presente documento resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y entran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1

Líneas de células de ratón que expresan Glipicano-3 humano (GPC3)

Las líneas celulares de cáncer de ratón, Hepa1 -6 (ATCC n° CRL-1830) y CT26 (ATCC n° CRL-2638) se transfectaron con el vector de expresión de GPC3 humano, pCXND2/hGPC3(FL) [Ishiguro T. et al., Cancer Res. 2008; 68: 9832­ 9838] utilizando FuGENE6 (Roche Diagnostics Corp) y se seleccionaron con 1 mg/ml de G418 (Invitrogen). Se recogieron las células que crecían incluso en presencia de G418 y las colonias se aislaron mediante dilución limitante. La expresión de GPC3 humano fue confirmada por FACS usando anticuerpos anti-GPC3 humano, GC33 [Ishiguro T. et al., Cancer Res. 2008; 68: 9832-9838]. Se seleccionaron y se usaron clones representativos para los experimentos.

Ejemplo 2

Actividad antitumoral del anticuerpo anti-GPC3 en un modelo de ratón singénico utilizando la línea celular Hepa1-6 que expresa GPC3 humano

Se cultivaron células Hepa1-6/hGPC3 usando matraces de cultivo celular en una incubadora (ajustada a 37°C y 5% de CO2). Las células se separaron de los matraces con tripsina y se lavaron con D-MEM que contenía FBS al 10% (v/v), 0,6 mg/ml de G418. A continuación, las células se resuspendieron en D-MEM (2 x 108 células/mL) y se añadió un volumen igual de Matrigel. Las concentraciones de células para la implantación eran 1 x 108 células/mL. Las células se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón C57BL/6J (Charles River Laboratories Japan) (1 x 107 células/ratón). Una vez que se establecieron tumores palpables, los animales se asignaron al azar a grupos de ensayo, para que cada grupo tuviera volúmenes tumorales medios similares al comienzo del estudio. Se inyectó 1 o 5 mg/kg de anticuerpo monoclonal GC33 anti-GPC3 humano de ratón [documento WO2006/006693] diluido en PBS, o PBS como vehículo de control, los días 14, 21 y 28 por vía intravenosa después de la inoculación del tumor. GC33 de ratón mostraba inhibición del crecimiento tumoral con dependencia de la dosis en comparación con el control de vehículo (Figura 1).

Ejemplo 3

Cambios patológicos inducidos por el anticuerpo anti-GPC3 en un modelo de ratón singénico utilizando la línea celular Hepa1-6 que expresa GPC3 humano

Para evaluar los cambios en el tejido tumoral Hepa1-6 mediante el tratamiento con GC33 de ratón, se usó tejido tumoral aislado, 3 o 7 días después de la inyección única de anticuerpo GC33 de ratón o de control de vehículo para el examen patológico. Los tejidos tumorales se fijaron con parafolmaldehído (PFA) al 4% y se incluyeron en parafina mediante el método AMeX [Suzuki et al., J Toxicol Sci. 2002; 27: 165-172, Watanabe et al., J Toxicol Pathol. 2015; 28: 43-49]. Se tiñeron secciones de parafina de tres micrómetros con hematoxilina y eosina (HE) o inmunohistoquímicamente (IHC). La tinción IHC se realizó de acuerdo con el método de estreptavidina-biotina marcada (LSAB) (RTU peroxidasa de rábano picante estreptavidina). Se utilizaron anticuerpos contra F4/80 (antígeno marcador de macrófagos murinos; A3-1, BioLegend), PD-L1 (antígeno marcador de ratón B7-H1/PD-L1; AF1019, R&D systems) como anticuerpos primarios. Las señales positivas se visualizaron mediante la reacción de peroxidasadiaminobencidina, y las secciones se contratiñeron con hematoxilina.

Mediante una inyección de GC33 de ratón, se observaron infiltraciones de células inmunes y muerte de las células tumorales en las regiones periféricas de los tejidos tumorales. También se observó un aumento de la infiltración de las células de macrófagos positivas para F4/80 en el área en la que se había observado la muerte de células tumorales en los tejidos tumorales tratados con GC33 de ratón, mientras que las células positivas para F4/80 se observaron principalmente en las regiones del estroma del tejido tumoral con el control del vehículo (Figura 2A). Posteriormente, la expresión de PD-L1 se incrementó con GC33 de ratón, especialmente en las células inmunes infiltradas, en comparación con el control del vehículo, lo que sugería que PD-L1 se puede inducir para suprimir la actividad antitumoral a través de GC33 de ratón (Figura 2B).

Ejemplo 4

Actividad antitumoral en combinación con los anticuerpos anti-GPC3 (GC33) y anti-PD-L1 (10F.9G2) en un modelo de ratón singénico utilizando la línea celular CT26 que expresa GPC3 humano

Para evaluar las actividades antitumorales de las monoterapias anti-GPC3 o anti-PD-L1 o de una combinación en el modelo CT26/hGPC3 de ratón, se inyectó o bien anticuerpo GC33 de ratón y/o 500 pg de anticuerpo de rata anti-PD-L1 de ratón, 10F.9G2 (obtenido en BioXCell) desde el día 3 (modelo de tratamiento temprano) o el día 15 (modelo establecido) después de una inoculación subcutánea de 1 x 106 de células CT26/hGPC3. En el modelo de tratamiento temprano, se inyectaron 5 o 25 mg/kg de GC33 de ratón los días 3, 6, 10 y 13 por vía intravenosa, y se inyectaron 500 pg de anticuerpo anti-PD-L1, 10F.9G2, en la misma pauta como agente único o una combinación. En el modelo establecido, se inyectaron 5 o 25 mg/kg de GC33 de ratón los días 15 y 18 por vía intravenosa, y se inyectaron 500 pg de anticuerpo anti-PD-L1, 10F.9G2, en la misma pauta como agente único o una combinación.

En ambos modelos, la combinación de 25 mg/kg de GC33 y 10F.9G2 mostraba la actividad antitumoral más potente en comparación con las de cada una de las monoterapias (Figura 3 y 4).

Ejemplo 5

Actividad antitumoral en combinación con los anticuerpos anti-GPC3 (GC33) y anti-PD-L1 (10F.9G2) en un modelo de ratón singénico utilizando la línea celular Hepa1 -6 que expresa GPC3 humano.

Se inyectaron 1, 5 o 25 mg/kg de anticuerpo GC33 de ratón una vez a la semana durante 3 semanas o 200 pg de anticuerpo de rata anti-PD-L1 de ratón, 10F.9G2, seguido de 100 pg semanalmente durante 2 semanas como agente único o una combinación, por vía intravenosa a ratones que eran portadores de Hepa1-6 como anteriormente. El examen patológico se realizó con secciones de tinción He que se prepararon con los métodos convencionales descritos anteriormente. En cuanto a la IHC, se utilizaron los primeros anticuerpos indicados en la Tabla 2 para cada marcador y se visualizaron mediante los métodos LSAB descritos anteriormente o el método ENV+. Se realizó la IHC para 3 animales representativos de cada grupo.

Tabla 2

Mientras que el ratón GC33 o 10F.9G2 mostraba una inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el control de vehículo, la combinación de ratón GC33 y 10F.9G2 mostraba una actividad antitumoral más fuerte (Figura 5A). Cinco días después de la 3a inyección, se realizó una necropsia de todos los ratones y se evaluaron patológicamente los tejidos tumorales. En los tejidos tumorales examinados, no se observaron células tumorales viables en ninguno de los ratones tratados con 25 mg/kg de GC33 de ratón en combinación con anticuerpo PD-L1 y en 4 de cada 5 ratones tratados con 5 mg/kg de GC33 de ratón en combinación con anticuerpo de PD-L1 (Figura 5B).

El examen patológico de cada tejido tumoral tratado reveló un aumento en el número de células positivas para F4/80, expresión de PD-L1 en las células gigantes multinucleadas (MNGC) y células positivas para CD3 infiltradas en los tejidos tumorales y una disminución en el número de CD206, CD163, y células positivas para CD11 b y expresión de PD-L1 en las células mononucleares (MNC) en cada tratamiento, en comparación con el control de vehículo. Con la combinación, la infiltración de linfocitos T CD3 positivos aumentaba más que cada monoterapia lo que tendía a estar relacionado con actividades antitumorales (Tabla 3).

Tabla 3: Evaluaciones patológicas de los tumores tratados

Ejemplo 6

Actividad antitumoral en combinación con los anticuerpos anti-GPC3 (GC33) y anti-PD-L1 (6E11) en un modelo de ratón singénico utilizando la línea celular Hepa1 -6 que expresa GPC3 humano

Se administró 1 mg/kg o 5 mg/kg de GC33 de ratón por vía intravenosa, una o tres veces por semana (q7d x 3) a ratones C57BL/6J con tumores Hepa1-6/hGPC3 establecidos. Se administraron 10 mg/kg de AcMo anti-PD-L1 de ratón (clon 6E11, mIgG2A, D265A y N297A; Genentech documento WO2015/095418) por vía intravenosa, una vez seguidos de 5 mg/kg por vía intraperitoneal dos veces por semana (q7d x 3).

La terapia de combinación aumentaba la inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el tratamiento con cualquier monoterapia (Figura 6A, B). Las mediciones finales de los valores de inhibición del crecimiento tumoral de 1 mg/kg de solo mGC33, 5 mg/kg de solo mGC33, 1 mg/kg de mGC33 q7d x 3, 5 mg/kg de mGC33 q7d x 3, 6E11 q7d x 3, 6E11 q7d x 3 1 mg/kg de solo mGC33, 6 E11 q7d x 3 5 mg/kg de solo mGC33 y 6E11 q7d x 3 1 mg/kg de mGC33 q7d x 3, 6E11 q7d x 3 5 mg/kg de mGC33 q7d x 3, eran respectivamente 73%, 84%, 73%, 80%, 88%, 85%, 95%, 88% y 104%. Un ratón en el grupo de 5 mg/kg de mGC33 q7d x 3, un ratón en el grupo de 1 mg/kg de mGC33 q7d x 3, un ratón en el grupo de solo 5 mg/kg de mGC33, dos ratones en el grupo de solo 1 mg/kg de mGC33 fueron sacrificados por la progresión del tumor. Ninguno de los ratones murió y no se observó ninguna pérdida de peso grave durante el período de administración (Figura 6C).

A partir del resultado de la histopatología, mediante la administración de mGC33, 6E11 y la combinación se observó una disminución del área tumoral que estaba acompañada o no por un aumento de la gravedad de la necrosis (Figura 7). En los grupos 6E11 q7d x 3 5 mg/kg de solo mGC33 o q7d x 3, se observaron respuestas patológicas completas (pCR; sin tejidos tumorales en el portaobjetos de la histopatología) en uno o dos de cada cinco ratones. Además, se observó una necrosis tumoral con infiltración de células inmunes que incluían macrófagos/células gigantes multinucleadas en todos los grupos tratados; la gravedad de las lesiones era la siguiente: 5 mg/kg de solo mGC33 o q7d x 3, 6E11 q7d x 3 < 5 mg/kg de solo mGC33 o q7d x 3 6E11 q7d x 3 (Figura 8A). Como se muestra en la figura 8B, las células positivas para F4/80 observadas en la periferia de la masa tumoral eran más abundantes en los casos de una combinación, después mGC33 o 6E11 q7d x 3 y el vehículo en ese orden (Figura 8B). En el vehículo, las reacciones positivas para PD-L1 se observaron principalmente en el citoplasma de las células tumorales con intensidad débil. Por otro lado, se observó una mayor intensidad (de débil a media) y una frecuencia de reacciones positivas para PD-L1 en las células inmunes, incluyendo macrófagos/células gigantes multinucleadas, en todos los grupos tratados (Figura 8C).

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o el retraso de la progresión del cáncer en un individuo, en donde la composición farmacéutica se usa en combinación con Atezolizumab, comprendiendo dicha composición un anticuerpo anti-GPC3 como ingrediente activo.

2. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-GPC3 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia HVR-H1 de SEQ ID NO: 34, la secuencia HVR-H2 de SEQ ID NO: 35 y la secuencia HVR-H3 de SEQ ID NO: 36; y una cadena ligera que comprende la secuencia HVR-L1 de SEQ ID NO: 37, la secuencia HVR-L2 de SEQ ID NO: 38 y la secuencia HVR-L3 de SEQ ID NO: 39.

3. La composición farmacéutica para uso según las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo anti-GPC3 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia HVR-H1 de SEQ ID NO: 42, la secuencia HVR-H2 de SEQ ID NO: 43 y la secuencia HVR-H3 de SEQ ID NO: 44; y una cadena ligera que comprende la secuencia HVR-L1 de SEQ ID NO: 45, la secuencia HVR-L2 de SEQ ID NO: 46 y la secuencia HVR-L3 de SEQ ID NO: 47.

4. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo anti-GPC3 es un anticuerpo humanizado.

5. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 4, en donde el anticuerpo anti-GPC3 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

6. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de esófago y cáncer de próstata.