CN112236446A - Lfa3变体及其组合物与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供LFA3多肽分子，例如变体LFA3融合多肽分子。本发明包括使用所述LFA3多肽分子的相关方法和用途。

Description

LFA3变体及其组合物与用途
相关申请
本申请要求2018年3月29日提交的美国申请第62/650,022号和2018年12月21日提交的美国申请第62/783,986号的优先权，以上两申请的内容通过引用全部纳入本申请。
关于序列表
本申请为电子提交申请，包括电子提交的txt格式序列表。该txt文件包含名为“PC72432A_Seq_Listing_ST25.txt”的序列表，该序列表生成于2019年3月21日，大小为127,715字节。该txt文件中的序列表是说明书的一部分，通过引用全部纳入本申请。
联合研究声明的当事方
在此要求保护的发明是由联合研究协议的下列当事方完成的或是代表联合研究协议的下列当事方完成。该联合研究协议在要求保护的发明完成之日当时或之前是有效的，并且要求保护的发明是由该联合研究协议范围内开展的活动所得出的。该联合研究协议的当事方是代表其旧金山分校的加利福尼亚大学董事会和弗埃塞股份有限公司。
技术领域
本发明涉及含有淋巴细胞功能相关抗原3(LFA3)结构域的多肽分子，及其组合物、方法和用途。
背景技术
淋巴细胞功能相关抗原3(LFA3)亦称CD58，是CD2的配体，在多种类型细胞上有表达，包括抗原呈递细胞(APC)(Miller等，J.Exp.Med.1993 178(1):211-22；Krueger等，Expert Opin.Biol.Ther.2002 2(4):431-41；Haider等，J.Immunol.2007 393:411-20；Punch等，Transplantation 1999 67(5):741-8；Leitner等，J.Immunol.2015 195(2):477-87)。CD2在所有T细胞上都有表达，但相比初始T细胞和调节T细胞在记忆T细胞上表达更高(Chamian等，Proc.Natl.Acad.Sci.2005 102(6):2075-80；Rigby等，J.Clin.Invest.2015125(8):3285-96)。人类中，CD2还在NK细胞和一些树突细胞群上表达。T细胞或NK细胞上CD2与辅佐细胞上LFA3的相互作用会向初始淋巴细胞和先前活化或记忆淋巴细胞传递共刺激信号。该共刺激信号可能涉及提高细胞-细胞相互作用的亲合力和/或通过CD2传递直接共刺激信号(Kaizuka等，J.Cell Biol.2009 185(3):521-34；Skanland等，Biochem.J.2014460(3):399-410)。因此，靶向CD2，例如用可溶性LFA3分子靶向CD2，或许具有治疗例如1型糖尿病(T1D)和/或银屑病性关节炎等自身免疫性疾病的有益治疗效果。所以，鉴于CD2与LFA3在介导免疫反应中的重要作用，需要开发调节CD2的活性以及消减CD2表达性免疫效应细胞的策略。
发明内容
本公开在一部分内容中提供了以下发现：某些LFA3-Fc融合多肽调节CD2活性，并且消减CD2表达性细胞。CD2表达性细胞的调节有益于例如糖尿病和/或银屑病性关节炎等自身免疫疾病的治疗。本申请记载了LFA3多肽分子，例如变体LFA3多肽分子，例如变体LFA3融合多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子。某些方面，所述LFA3多肽分子结合CD2，调节CD2-LFA3相互作用，并选择性消减CD2表达性记忆T细胞。
不希望受理论束缚，本文记载的LFA3多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子，例如M1d1(本文中亦称M1-d1、LFA3-Fc M1d1和LFA3-Fc M1-d1)，调节CD2+ TEM细胞的功能和选择性消减CD2+ TEM细胞由此实现调节性细胞/TEM细胞数量的再平衡。一些实施方式中，本文记载的LFA3多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子(例如M1d1)，促进病原性T效应细胞的消除和/或抑制。一些实施方式中，本文记载的LFA3多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子(例如M1d1)，调节CD2与LFA3之间的相互作用，由此破坏CD2介导的T细胞共刺激。一些实施方式中，本文记载的LFA3多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子(例如M1d1)，通过FcR-介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)消减CD2+ T细胞。一些实施方式中，本文记载的LFA3多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子(例如M1d1)，通过细胞凋亡消减CD2+ T细胞。一些实施方式中，本文记载的LFA3多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子(例如M1d1)，降低CD2高T记忆细胞(Tmem)(例如中央记忆(TCM)和效应记忆(TEM)T细胞)的数量，同时保持调节T细胞(Treg)的数量。一些实施方式中，本文记载的LFA3多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子(例如M1d1)，降低CD2高T记忆细胞(Tmem)(例如中央记忆(TCM)和效应记忆(TEM)T细胞)的数量，同时保持初始调节T细胞的数量。一些实施方式中，例如在CD4+和/或CD8+T细胞中，本文记载的LFA3多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子(例如M1d1)，提高Treg/TEM比或Treg/TCM比。一些实施方式中，本文记载的LFA3多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子(例如M1d1)，提高PD-1和/或TIGIT-表达性TEM细胞的比例。
不希望受理论束缚，本文记载的LFA3多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子(例如M1d1)，结合CD2，这是一种主要在CD4+和CD8+ TEM(T效应记忆)细胞上表达的细胞表面蛋白，这些是1型糖尿病(T1D)中导致β细胞破坏的主要细胞。本文记载的LFA3多肽分子例如变体LFA3-Fc融合多肽分子(例如M1d1)给药能引起内源性胰岛素生产留存的延长，胰岛素需求减少，严重低血糖症发生率降低，以及T1D患者的β细胞恢复。
一些实施方式中，本发明的LFA3多肽分子例如变体LFA3多肽分子经工程改造相比野生型LFA3序列改善了稳定性和可制造性。一些实施方式中，本发明的LFA3多肽分子例如变体LFA3多肽分子经工程改造相比野生型LFA3序列改善了CD2结合亲和力。
一方面，本文提供LFA3融合多肽分子，其包含与第二结构域融合的LFA3结构域。不希望受理论束缚，在LFA3融合多肽分子中扩展LFA3结构域的C-末端边界改善LFA3融合多肽分子的一种或多种活性。例如，扩展LFA3结构域的C-末端边界从而包括对应于野生型LFA3第93位(例如SEQ ID NO:2第93位)的氨基酸残基Leu或应于野生型LFA3第93-98位(例如SEQID NO:2第93位-98位)的氨基酸序列LESLPS(SEQ ID NO:118)改善LFA3融合多肽分子的一种或多种活性，例如提高热稳定性和/或减少聚集，例如图6B-6D中所示。
本领域技术人员会明白或能够确定采用常规实验即可获得的本文所述本发明具体实施方式的众多等同形式。这些等同形式应包含在以下实施方式(E)中。
E1.特异性结合CD2的分离的多肽分子(例如融合多肽分子)，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域(例如本文所述变体LFA3-Fc融合)并具有一项或多项以下特征：
i.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子增强的单体表达，例如表现为用尺寸排阻色谱(SEC)和/或实施例1中就图3A所述方法测定的单体百分比高于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，
ii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的单体表达和降低的多聚体表达，例如表现为，据SEC和/或实施例1中就图6C所述方法测定，单体百分比高于约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，低分子量物质(LMWS)百分比低于约10％、8％、6％、4％或2％，和/或高分子量物质(HMWS)百分比低于约5％、2％或1％，
iii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子降低的热应激聚集倾向，例如表现为据SEC和/或实施例1中就图3D所述方法测定，37.4℃孵育24小时后单体百分比高于约90％、92％或95％和/或40℃孵育24小时后单体百分比高于约75％、80％或85％，
iv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子降低的热应激聚集倾向，例如表现为据SEC和/或实施例1中就表4所述方法测定，40℃时的HMWS增加不超过约5％、10％、15％或20％和/或50℃时的HMWS增加不超过约5％、10％、15％、20％或25％，
v.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子降低的低pH聚集倾向，例如表现为据SEC和/或实施例1中就表4所述方法测定，低pH下5小时HMWS增加不超过约6％、7％、8％或9％，
vi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性，例如表现为40℃存放2或4周后用毛细管凝胶电泳(CGE)、尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)和/或实施例4中就图30A-30C或图31A-31D所述方法测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％、1.5％或2％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％、2％、3％、4％或5％，
vii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性，例如表现为25℃存放2、4或6周后用SE-HPLC和/或实施例4中就图32A-32D所述方法测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％、1.5％或2％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％，
viii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性，例如表现为5℃存放2、4或6周后用SE-HPLC和/或实施例4中就图33A-33D所述方法测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％，
ix.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的冻融稳定性，例如表现为5轮冻融后用SEC和/或实施例1中就表4所述方法测定的HMWS增加不超过约0.5％、1％或1.5％，
x.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子提高的产率，例如表现为用实施例1中就图3B所述方法测定的产率高于每20mL Expi293培养物约5.5、6、6.5或7mg，
xi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子提高的Tm，例如差示扫描荧光测定法(DSF)和/或实施例1中就图3C所述方法测定的Tm高于约38、40、42或45℃，
xii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如DSF和/或实施例1中就图5B所述方法测定的Tm高于约40、45、50、55或60℃，
xiii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子提高的Tm，例如DSF和/或实施例1中就图6D所述方法测定的Tm高于约40、45或50℃，
xiv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如DSF和/或实施例1中就图7D所述方法测定的Tm高于约45、50或55℃，
xv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如差示扫描量热法(DSC)和/或实施例1中就表4所述方法测定的Tm高于约50或60℃，
xvi.据DSC和/或实施例4中就表13所述方法测定，pH 7.5时Tm1高于约55、58、60、62、64或66℃且Tm2高于约75、78、80或82℃；pH 5.8时Tm1高于约55、58、60、62或64℃且Tm2高于约75、78、80或82℃；或pH 4.5时Tm1高于约55、58或60℃且Tm2高于约75、78或80℃，
xvii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如据DSC和/或实施例4中就表14所述方法测定，pH 7.5或pH 4.5时Tm高于约50或60℃，pH 5.8时Tm高于约50或62℃，
xviii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如用DSC和FabRICATOR IdeS和/或实施例4中就表15所述方法测定的Tm高于约50或60℃，
xix.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2结合亲和力，例如用SPR和/或实施例1中就图5A所述方法测定的对人CD2的KD低于约1.2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1或0.08μM，
xx.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2结合亲和力，例如据SPR和/或用实施例1中就图7C所述方法测定，对人CD2的KD低于约1.3、1.2、1.1或1μM，且/或对猕猴CD2的KD低于约1.4、1.3、1.2、1.1或1μM，
xxi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，例如用实施例2中就表6所述方法测定的结合CD4 T记忆(Tmem)细胞的Kd不超过约100、200、300或400pM，
xxii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，例如，据SPR和/或实施例2中就表10和图11所述的方法测定，结合CD4记忆T细胞的算得IC50不超过约300、400、500、600、700、800、1000、1200或1500pM；结合CD4+ TEM细胞的算得IC50不超过约150、300、400、500、600、700、800、1000或1200pM；结合CD4+ TCM细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400、500、600、700或800pM；结合CD4初始T细胞的算得IC50不超过约200、300、400、500、600、700、800、1000或1200pM；结合扩增CD4 Treg细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD8记忆T细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400、500或600pM；和/或结合CD8初始T细胞的算得IC50不超过约300、400、500、600、700、800、1000、1200、1500、1600或1700pM，
xxiii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，例如，据SPR和/或实施例2中就表10和图11所述的方法测定，结合CD4记忆T细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD4+ TEM细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400、500或600pM；结合CD4+ TCM细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD4初始T细胞的算得Kd不超过约100、200、300或400pM；结合扩增CD4 Treg细胞的算得Kd不超过约100、200或300pM；结合CD8记忆T细胞的算得Kd不超过约50、100或150pM；结合CD8初始T细胞的算得Kd不超过约50、100、200、300、400或500pM，
xxiv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，例如相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子，用SPR和/或实施例3中就图18A和18B所述方法测定的结合猕猴CD4+ TEM细胞EC50降低，
xxv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的对CD2表达细胞的细胞毒性，例如，用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)检测和/或实施例5中就表17和图12A和12B所述方法测定的杀伤CD4 Tmem细胞的EC50不超过约400、600、800、1000、1200、1400pM或1500pM，
xxvi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的对CD2表达细胞的细胞毒性，例如，用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)检测和/或实施例5中就表17和图12D所述方法测定的杀伤CD8 Tmem细胞的EC50不超过约1、5、10、20、30、40或50nM，
xxvii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的同种异体T细胞反应(例如T细胞增殖和细胞因子产生)抑制，例如，用混合淋巴细胞反应(MLR)检测和/或实施例2中就表6和图14A和14B所述方法测定的IC50不超过约400、800、1200、1600、2000或2400pM，
xxviii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的同种异体T细胞反应(例如T细胞增殖和细胞因子产生)抑制，例如，用混合淋巴细胞反应(MLR)检测和/或实施例2中就图15B和15C所述方法测定，无NK细胞混合淋巴细胞反应(MLR)检测的IC50不超过约300、400、500、600、800、1000、1500或2000pM，
xxix.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的破伤风类毒素回忆反应抑制，例如，破伤风类毒素回忆(TTR)检测和/或实施例2中就表6和图16A和16B所述方法测定的对CD4 Tmem IFNγ产生的IC50不超过约1、2、5、10、15、20或25nM，
xxx.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子减缓的体内清除，例如，用实施例2中就表11所述方法测定的中心清除率不超过约0.14、0.16、0.18、0.2或0.22mL/hr/kg，
xxxi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的纯度，例如用毛细管凝胶电泳和/或实施例1或4中所述方法测得至少约98％或99％的纯度，或者
xxxii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子降低的唾液酸修饰，例如，用毛细管凝胶电泳和/或实施例1或4中所述方法测定不超过约20、18、16、14、12、10、9、8或7nmol唾液酸/nmol多肽的纯度。
E2.E1所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ IDNO:120的多肽分子增强的单体表达，例如表现为用SEC和/或实施例1中就图3A所述方法测定的单体百分比高于约70％、75％、80％、85％、90％或95％。
E3.E1或E2所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQID NO:4的多肽分子增强的单体表达和降低的多聚体表达，例如表现为，据SEC和/或实施例1中就图6C所述方法测定，单体百分比高于约75％、80％、85％、90％或95％，低分子量物质(LMWS)百分比低于约10％、8％、6％、4％或2％，和/或高分子量物质(HMWS)百分比低于约5％、2％或1％。
E4.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子降低的热应激聚集倾向，例如表现为据SEC和/或实施例1中就图3D所述方法测定，37.4℃孵育24小时后单体百分比高于约90％、92％或95％和/或40℃孵育24小时后单体百分比高于约75％、80％或85％。
E5.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子降低的热应激聚集倾向，例如表现为据SEC和/或实施例1中就表4所述方法测定，40℃时的HMWS增加不超过约5％、10％、15％或20％和/或50℃时的HMWS增加不超过约5％、10％、15％、20％或25％。
E6.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子降低的低pH聚集倾向，例如表现为据SEC和/或实施例1中就表4所述方法测定，低pH下5小时HMWS增加不超过约6％、7％、8％或9％。
E7.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的冻融稳定性，例如表现为5轮冻融后用SEC和/或实施例1中就表4所述方法测定的HMWS增加不超过约0.5％、1％或1.5％。
E8.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性，例如表现为40℃存放2或4周后用毛细管凝胶电泳(CGE)、尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)和/或实施例4中就图30A-30C或图31A-31D所述方法测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％、1.5％或2％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。
E9.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性，例如表现为25℃存放2、4或6周后用SE-HPLC和/或实施例4中就图32A-32D所述方法测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％、1.5％或2％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％。
E10.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性，例如表现为5℃存放2、4或6周后用SE-HPLC和/或实施例4中就图33A-33D所述方法测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％。
E11.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子提高的产率，例如表现为用实施例1中就图3B所述方法测定的产率高于每20mL Expi293培养物约5.5、6、6.5或7mg。
E12.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子提高的Tm，例如Tm高于约38、40、42或45℃。E13.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如Tm高于约40、45、50、55或60℃。
E14.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子提高的Tm，例如DSF和/或实施例1中就图6D所述方法测定的Tm高于约40、45或50℃。
E15.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如DSF和/或实施例1中就图7D所述方法测定的Tm高于约45、50或55℃。
E16.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如差示扫描量热法(DSC)和/或实施例1中就表4所述方法测定的Tm高于约50或60℃。
E17.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子据DSC和/或实施例4中就表13所述方法测定pH 7.5时Tm1高于约55、58、60、62、64或66℃且Tm2高于约75、78、80或82℃；pH 5.8时Tm1高于约55、58、60、62或64℃且Tm2高于约75、78、80或82℃；或pH 4.5时Tm1高于约55、58或60℃且Tm2高于约75、78或80℃。
E18.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如据DSC和/或实施例4中就表14所述方法测定，pH 7.5或pH 4.5时Tm高于约50或60℃，pH 5.8时Tm高于约50或62℃。
E19.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如用DSC和FabRICATOR IdeS和/或实施例4中就表15所述方法测定的Tm高于约50或60℃。
E20.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2结合亲和力，例如用SPR和/或实施例1中就图5A所述方法测定的对人CD2的KD低于约1.2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1或0.08μM。
E21.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子具有增强的CD2结合亲和力，例如据SPR和/或用施例1中就图7C所述方法测定，对人CD2的KD低于约1.3、1.2、1.1或1μM，且/或对猕猴CD2的KD低于约1.4、1.3、1.2、1.1或1μM。
E22.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，例如用实施例2中就表6所述方法测定的结合CD4 Tmem细胞的Kd不超过约100、200、300或400pM。E23.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，例如，据SPR和/或实施例2中就表10和图11所述的方法测定，结合CD4记忆T细胞的算得IC50不超过约300、400、500、600、700、800、1000、1200或1500pM；结合CD4+ TEM细胞的算得IC50不超过约150、300、400、500、600、700、800、1000或1200pM；结合CD4+ TCM细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400、500、600、700或800pM；结合CD4初始T细胞的算得IC50不超过约200、300、400、500、600、700、800、1000或1200pM；结合扩增CD4 Treg细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD8记忆T细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400、500或600pM；和/或结合CD8初始T细胞的算得IC50不超过约300、400、500、600、700、800、1000、1200、1500、1600或1700pM。
E24.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，例如，据SPR和/或实施例2中就表10和图11所述的方法测定，结合CD4记忆T细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD4+ TEM细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400、500或600pM；结合CD4+ TCM细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD4初始T细胞的算得Kd不超过约100、200、300或400pM；结合扩增CD4 Treg细胞的算得Kd不超过约100、200或300pM；结合CD8记忆T细胞的算得Kd不超过约50、100或150pM；结合CD8初始T细胞的算得Kd不超过约50、100、200、300、400或500pM。
E25.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，例如相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子，用SPR和/或实施例3中就图18A和18B所述方法测定的结合猕猴CD4+ TEM细胞EC50降低。
E26.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的对CD2表达细胞的细胞毒性，例如，用ADCC检测和/或实施例5中就表17和图12A和12B所述方法测定的杀伤CD4 Tmem细胞的EC50不超过约400、600、800、1000、1200或1400pM。
E27.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的对CD2表达细胞的细胞毒性，例如，用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)检测和/或实施例5中就表17和图12D所述方法测定的杀伤CD8 Tmem细胞的EC50不超过约1、5、10、20、30、40或50nM。
E28.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的同种异体T细胞反应(例如T细胞增殖和细胞因子产生)抑制，例如，用MLR检测和/或实施例2中就表6和图14A和14B所述方法测定的IC50不超过约400、800、1200、1600、2000或2400pM。
E29.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的同种异体T细胞反应(例如T细胞增殖和细胞因子产生)抑制，例如，用MLR检测和/或实施例2中就图15B和15C所述方法测定，无NK细胞的IC50不超过约300、400、500、600、800、1000、1500或2000pM。
E30.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的破伤风类毒素回忆反应抑制，例如，用TTR检测和/或实施例2中就表6和图16A和16B所述方法测定的对CD4 Tmem IFNγ产生的IC50不超过约1、2、5、10、15、20或25nM。
E31.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子减缓的体内清除，例如，用实施例2中就表11所述方法测定的中心清除率不超过约0.14、0.16、0.18、0.2或0.22mL/hr/kg。
E32.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的纯度，例如用毛细管凝胶电泳和/或实施例1或4中所述方法测得至少约98％或99％的纯度。
E33.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子降低的唾液酸修饰，例如，用毛细管凝胶电泳和/或实施例1或4中所述方法测定不超过约20、18、16、14、12、10、9、8或7nmol唾液酸/nmol多肽的纯度。
E34.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子还具有一项或多项以下特征：
i.例如在体内，优势性结合CD2高TEM细胞，例如CD4+和/或CD8+ TEM细胞，
ii.在NK细胞存在下杀伤CD2表达细胞(例如CD4+或CD8+ TCM细胞，或CD4+或CD8+ TEM细胞)，例如用实施例2中就图13A所述方法测得，
iii.体内减少CD4+和/或CD8+ TEM细胞，例如外周CD4+ TEM细胞，例如用实施例2中就图20A所述方法测得，
iv.体内提高Treg/TEM比，例如CD4+T细胞中的Treg/TEM比，例如用实施例2中就图20B所述方法测得，或者
v.提高Treg/TCM比，例如在CD4+和/或CD8+ T细胞中。
E35.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子例如在体内优势性结合CD2高TEM细胞，例如CD4+和/或CD8+ TEM细胞。
E36.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子在NK细胞存在下杀伤CD2表达细胞(例如CD4+或CD8+ TCM细胞，或CD4+或CD8+ TEM细胞)，例如用实施例2中就图13A所述方法测得。
E37.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子减少CD4+和/或CD8+ TEM细胞，例如外周CD4+ TEM细胞，例如用实施例2中就图20A所述方法测得。
E38.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子体内提高Treg/TEM比，例如CD4+T细胞中的Treg/TEM比，例如用实施例2中就图20B所述方法测得。
E39.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子提高Treg/TCM比，例如在CD4+和/或CD8+ T细胞中。
或者，或联合本文中任意实施方式(例如E1-E39)，所述多肽分子具有一项或多项以下特征和实施方式。
E40.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:73的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQID NO:3。
E41.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTX1HX2PSNVPX3KEX4LX5KKQKDKX6X7EX8ENSEX9RX10FSSFKNRVYX11DTVSX12SX13TIYNLTSSDEDEYEX14ESPNITDTX15KX16FLYVX17，其中：
X1是F、I、L、V、A或Y，
X2是F、I、L、V、M、A或Nle，
X3是F、I、L、V、Nle、M或A，
X4是F、I、L、V、M、A或Nle，
X5是W、F、L、C或Y，
X6是F、I、L、V、M、A或Nle，
X7是A、V、S、L或I，
X8是F、I、L、V、Nle、M或A,
X9是F、I、L、V、A或Y,
X10是A、V、S、L或I,
X11是F、I、L、V、Nle、M或A，
X12是S、T、A或G，
X13是F、I、L、V、Nle、M或A，
X14是M、L、I或F，
X15是M、L、I或F，
X16是F、I、L、V、A或Y，且
X17为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:74)，
或SEQ ID NO:74的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E42.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTX1HX2PSNVPX3KEX4LX5KKQKDKX6X7EX8ENSEX9RX10FSSFKNRVYX11DTVSX12SX13TIYNLTSSDEDEYEX14ESPNITDTX15KX16FLYVX17，其中：
X1是F、I、L或V，
X2是F、I、L或V，
X3是F、I、L或V，
X4是F、I、L或V，
X5是W、F、L或C，
X6是F、I、L或V，
X7是A、V、S或L，
X8是F、I、L或V，
X9是F、I、L或V，
X10是A、V、S或L，
X11是F、I、L或V，
X12是S、T、A或G，
X13是F、I、L或V，
X14是M、L、I或F，
X15是M、L、I或F，
X16是F、I、L或V，且
X17为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:75)，
或SEQ ID NO:75的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E43.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域相对于SEQ ID NO:3具有位于残基15、17、23、26、28、35、36、38、43、45、55、60、62、77、86或88的一处或多处突变(例如取代、缺失或增加)。
E44.E43所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.选自F15I、F15L、F15V、F15A或F15Y的取代，
ii.选自V17F、V17I、V17L、V17M、V17A或V17Nle的取代，
iii.选自L23F、L23I、L23V、L23Nle、L23M或L23A的取代，
iv.选自V26F、V26I、V26L、V26M、V26A或V26Nle的取代，
v.选自W28F、W28L、W28C或W28Y的取代，
vi.选自V35F、V35I、V35L、V35M、V35A或V35Nle的取代，
vii.选自A36V、A36S、A36L或A36I的取代，
viii.选自L38F、L38I、L38V、L38Nle、L38M或L38A的取代，
ix.选自F43I、F43L、F43V、F43A或F43Y的取代，
x.选自A45V、A45S、A45L或A45I的取代，
xi.选自L55F、L55I、L55V、L55Nle、L55M或L55A的取代，
xii.选自G60S、G60T或G60A的取代，
xiii.选自L62F、L62I、L62V、L62Nle、L62M或L62A的取代，
xiv.选自M77L、M77I或M77F的取代，
xv.选自M86L、M86I或M86F的取代，或
xvi.选自F88I、F88L、F88V、F88A或F88Y的取代。
E45.E43所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.选自F15I、F15L或F15V的取代，
ii.选自V17F、V17I或V17L的取代，
iii.选自L23F、L23I或L23V的取代，
iv.选自V26F、V26I或V26L的取代，
v.选自W28F、W28L或W28C的取代，
vi.选自V35F、V35I或V35L的取代，
vii.选自A36V、A36S或A36L的取代，
viii.选自L38F、L38I或L38V的取代，
ix.选自F43I、F43L或F43V的取代，
x.选自A45V、A45S或A45L的取代，
xi.选自L55F、L55I或L55V的取代，
xii.选自G60S、G60T或G60A的取代，
xiii.选自L62F、L62I、L62V的取代，
xiv.选自M77L、M77I或M77F的取代，
xv.选自M86L、M86I或M86F的取代，或
xvi.选自F88I、F88L或F88V的取代。
E46.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:76的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQID NO:3。
E47.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5ESPNITDTX6KFFLYVX7，其中：
X1是A、V、S、L或I，
X2是F、I、L、V、Nle、M或A，
X3是F、I、L、V、A或Y，
X4是A、V、S、L或I，
X5是M、L、I或F，
X6是M、L、I或F，且
X7为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:77)，
或SEQ ID NO:77的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E48.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5ESPNITDTX6KFFLYVX7，其中：
X1是A、V、S或L，
X2是F、I、L或V，
X3是F、I、L或V，
X4是A、V、S或L，
X5是M、L、I或F，
X6是M、L、I或F，且
X7为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:78)，
或SEQ ID NO:78的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E49.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5ESPNITDTX6KFFLYVX7，其中：
X1是V、L或A，
X2是F或L，
X3是V、I、L或F，
X4是A、V或S，
X5是M、F、I或L，
X6是F、M、I或L，且
X7为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:79)，
或SEQ ID NO:79的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E50.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EFENSEX2RX3FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX4ESPNITDTX5KFFLYVX6，其中：
X1是V或L，
X2是V、I或L，
X3是A或V，
X4是M或F，
X5是F或M，且
X6为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:80)，
或SEQ ID NO:80的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E51.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EFENSEX2RX3FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX4ESPNITDTX5KFFLYVX6，其中：
X1是V或L，
X2是V、I或L，
X3是A或V，
X4是M或F，
X5是F或M，且
X6为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:80)。
E52.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EFENSEX2RX3FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX4ESPNITDTFKFFLYVX5，其中：
X1是V或L，
X2是V、I或L，
X3是A或V，
X4是M或F，且
X5为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:81)，
或SEQ ID NO:81的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E53.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EFENSEX2RX3FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX4ESPNITDTFKFFLYVX5，其中：
X1是V或L，
X2是V、I或L，
X3是A或V，
X4是M或F，且
X5为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:81)。
E54.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEX1RX2FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX3ESPNITDTFKFFLYVX4，其中：
X1是V或I，
X2是A或V，
X3是M或F，且
X4为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:82)，
或SEQ ID NO:82的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E55.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEX1RX2FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX3ESPNITDTFKFFLYVX4，其中：
X1是V或I，
X2是A或V，
X3是M或F，且
X4为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:82).
E56.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含选自SEQ ID NO:17-23的氨基酸序列或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQID NO:3。
E57.E56所述分离的多肽分子，还包含氨基酸残基Leu或氨基酸序列LESLPS(SEQ IDNO:118)。
E58.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含选自SEQ ID NO:26-29的氨基酸序列或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQID NO:3。
E59.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:17或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E60.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:17。
E61.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:18或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E62.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:18。
E63.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:19或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E64.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:19。
E65.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:20或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E66.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:20。
E67.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:21或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E68.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:21。
E69.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:22或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E70.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:22。
E71.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:23或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E72.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
E73.E59-E72所述分离的多肽分子，还包含氨基酸残基Leu或氨基酸序列LESLPS(SEQID NO:118)。
E74.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:26或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E75.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:26。
E76.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:27或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E77.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:27。
E78.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:28或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E79.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:28。
E80.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E81.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:29。
E82.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含选自SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQID NO:3。
E83.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:24或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E84.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。
E85.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:25或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E86.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:25。
E87.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含选自SEQ ID NO:30-41的氨基酸序列或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQID NO:3。
E88.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含选自SEQ ID NO:30-41的氨基酸序列。
E89.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域具有按照SEQ ID NO:3编号位于残基36、38、43、45、77或86的一处或多处突变(例如取代、缺失或增加)。
E90.E89所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.选自A36V、A36S、A36L或A36I的取代，
ii.选自L38F、L38I、L38V、L38Nle、L38M或L38A的取代，
iii.选自F43I、F43L、F43V、F43A或F43Y的取代，
iv.选自A45V、A45S、A45L或A45I的取代，
v.选自M77L、M77I或M77F的取代，或
vi.选自M86L、M86I或M86F的取代。
E91.E89所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.选自A36V、A36S或A36L的取代，
ii.选自L38F、L38I或L38V的取代，
iii.选自F43I、F43L或F43V的取代，
iv.选自A45V、A45S或A45L的取代，
v.选自M77L、M77I或M77F的取代，或
vi.选自M86L、M86I或M86F的取代。
E92.E89所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.选自A36V或A36L的取代，
ii.L38F取代，
iii.选自F43V、F43I或F43L的取代，
iv.选自A45V或A45S的取代，
v.选自M77L、M77I或M77F的取代，或
vi.选自M86L、M86I或M86F的取代。
E93.E89所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.选自A36V或A36L的取代，
ii.L38F取代，
iii.选自F43V、F43I或F43L的取代，
iv.A45V取代，
v.M77F取代，或
vi.M86F取代。
E94.E89所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.A36V取代，
ii.L38F取代，
iii.选自F43V或F43I的取代，
iv.A45V取代，
v.M77F取代，或
vi.M86F取代。
E95.E89所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.A36V取代，
ii.L38F取代，
iii.F43V取代，或
iv.M86F取代。
E96.E89所述的分离的多肽分子，其中，所述突变包括以下取代：A36V、L38F、F43V和M86F。
E97.E89所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.A36V取代，
ii.L38F取代，
iii.F43V取代，
iv.A45V取代，
v.M77F取代，或
vi.M86F取代。
E98.E89所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.A36V取代，
ii.L38F取代，
iii.F43I取代，
iv.A45V取代，
v.M77F取代，或
vi.M86F取代。
E99.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子还包含1至10个(例如1至6个)SEQ ID NO:2中胞外结构域(例如SEQ ID NO:2的氨基酸残基93-187)的氨基酸残基。
E100.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子还包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LESLPSPTLTCALTNGSIEV(SEQ ID NO:119)中的氨基酸残基。
E101.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子还包含1、2、3、4、5个或全部的LESLPS(SEQ ID NO:118)中的氨基酸残基。
E102.前述实施方式中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子还包含第二结构域，例如，所述多肽分子是融合蛋白分子。
E103.E102所述的分离的多肽分子，其中，LFA3结构域与第二结构域相连，例如通过接头相连或无接头相连，例如，LFA3结构域的C末端与第二结构域的N末端相连，或者LFA3结构域的N末端与第二结构域的C末端相连，可选性地，LFA3结构域的C末端与第二结构域的N末端无接头相连。
E104.E102或E103所述的分离的多肽分子，其中，所述第二结构域能够与另一第二结构域形成二聚体，例如通过分子间二硫键来形成。
E105.E102-E104中任一项所述的分离的多肽分子，其中：
i.所述第二结构域能够介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，或者
ii.所述第二结构域能够结合并激活CD16表达细胞，例如CD16表达性NK细胞或CD16表达性巨噬细胞。
E106.E102-E105中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述第二结构域是免疫球蛋白，例如重链恒定区，例如人重链恒定区，或其功能性变体。
E107.E102-E106中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述第二结构域包含重链(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链，例如人IgG1重链)的Fc区或其功能性变体，例如，所述第二结构域包含铰链区、CH2区和CH3区、或它们的功能性变体。
E108.E102-E107中任一项所述的分离的多肽分子，其中，所述第二结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，例如，所述第二结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16。
E109.特异性结合CD2的分离的多肽或其片段，包含第一结构域和第二结构域
其中，所述第一结构域包含与SEQ ID NO:26有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的氨基酸序列，且所述多肽不含氨基酸序列SEQ ID NO:3；并且
其中，所述第二结构域包含与SEQ ID NO:16有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的氨基酸序列。
E110.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含氨基酸序列SEQ IDNO:69或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述多肽分子不含氨基酸序列SEQ ID NO:4。
E111.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含氨基酸序列SEQ IDNO:69。
E112.分离的多聚体(例如二聚体)蛋白分子，其包含两个或更多个前述实施方式中任一项所述的多肽分子。
E113.分离的多聚体(例如二聚体)蛋白分子，其包含两个或更多个包含氨基酸序列SEQID NO:26或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)的多肽分子，所述多肽分子不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E114.分离的多聚体(例如二聚体)蛋白分子，其包含两个或更多个包含氨基酸序列SEQID NO:26的多肽分子。
E115.分离的多聚体(例如二聚体)蛋白分子，其包含两个或更多个包含氨基酸序列SEQID NO:69或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)的多肽分子，所述多肽分子不含氨基酸序列SEQ ID NO:4。
E116.分离的多聚体(例如二聚体)蛋白分子，其包含两个或更多个包含氨基酸序列SEQID NO:69的多肽分子。
E117.编码E1-E111中任一项所述多肽分子或E112-E116中任一项所述多聚体蛋白分子的核酸分子。
E118.一种核酸分子，其包含选自SEQ ID NO:44-50、53-56、122或123的核苷酸序列或与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的核苷酸序列，所述核酸分子不含编码氨基酸序列SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
E119.一种核酸分子，其包含选自SEQ ID NO:44-50、53-56、122或123的核苷酸序列。E120.一种核酸分子，其包含核苷酸序列SEQ ID NO:53或与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的核苷酸序列，所述核酸分子不含编码氨基酸序列SEQ ID NO:3的核苷酸序列，可选性地，所述核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO:53。
E121.一种核酸分子，其包含核苷酸序列SEQ ID NO:123或与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的核苷酸序列，所述核酸分子不含编码氨基酸序列SEQ IDNO:4的核苷酸序列，可选性地，所述核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO:123。
E122.一种载体，其包含E117-E121中任一项所述的核酸分子。
E123.一种宿主细胞，其包含E117-E121中任一项所述的核酸分子或E122所述的载体。E124.E123所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
E125.124所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是CHO细胞、COS细胞、HEK-293细胞、NS0细胞、
Figure BDA0002804257820000291
细胞或Sp2.0细胞。
E126.药物组合物，其包含E1-E111中任一项所述的多肽分子或E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子和药学上可接受的运载体或赋形剂。
E127.E126所述的药物组合物，还包含HEPES缓冲盐溶液。
E128.E126所述的药物组合物，其中，E1-E111中任一项所述的多肽分子或E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子配制为约0.015、约0.15或约1.5mg/mL的浓度。
E129.制造特异性结合CD20的分离的多肽分子的方法，包括培养权利要求E123-E125中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞在培养条件下表达所述多肽分子。
E130.E129所述的方法，还包括分离所述多肽分子。
E131.用E129或E130所述方法生产的多肽分子。
E132.一种降低有需要的对象中CD2活性的方法，例如降低CD2信号传导，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物。
E133.一种降低有需要的对象中CD2表达细胞(例如CD2表达性记忆T细胞，例如CD2表达性TEM细胞，例如CD2表达性CD4+ TEM细胞或CD8+ TEM细胞)数量的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物。
E134.一种提高有需要的对象中例如CD4+和/或CD8+T细胞中Treg/TEM比或Treg/TCM比的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物。
E135.一种破坏有需要的对象中CD2与天然LFA3分子间相互作用的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物。
E136.一种治疗有需要的对象中炎性疾病、紊乱或状况的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物。
E137.一种治疗有需要的对象中自身免疫疾病、紊乱或状况的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物。
E138.一种处置需要免疫抑制的对象的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物。
E139.一种治疗有需要的对象中异常记忆T细胞反应相关或介导的疾病、紊乱或状况的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物。
E140.E132-E139中任一项所述的方法，其中，所述对象是人。
E141.E132-E140中任一项所述的方法，包括所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物的皮下、肌内或静脉内给药。
E142.E141所述的方法，包括所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物的皮下给药。
E143.E141所述的方法，包括所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物的肌内给药。
E144.E141所述的方法，包括所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物的静脉内给药。
E145.E132-E144中任一项所述的方法，其中，包括所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物的给药具有一项或多项以下特征：
i.所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物每周两次、每周一次、每两周一次或每三周一次给药，例如每周一次，
ii.所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物按照约5-20mg/周(例如5、6、7、8、9、10、12、15、17或20mg/周)的剂量给药，例如约7.5mg/周，
iii.所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物按照每次注射约0.2-8mg(例如每次注射0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8mg)的剂量给药，例如每次注射0.22-7.5mg或每次注射7.5mg，
iv.所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物按照每次注射约0.5-2.0ml溶液(例如每次注射0.5、1或1.5ml溶液)给药，例如每次注射约1ml溶液，或者
v.所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物进行一个或多个疗程的给药，例如，每个疗程由10-14周(例如10、11、12、13或14周)组成，例如12周，例如，其中两个相邻疗程之间相隔10至14周的间期(例如10、11、12、13或14周的间期)，例如12周的间期，
可选地，其中：所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物按照每周一次、约15mg/周的剂量皮下给药，例如，所述多聚体蛋白分子或药物组合物进行一个或多个疗程的给药，其中，每个疗程由12周组成且两个相邻疗程之间相隔12周的间期。
E146.E132-E144中任一项所述的方法，其中，所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物按照约0.03、约0.3、约3或约100mg/kg的剂量给药。
E147.E132-E144中任一项所述的方法，其中，所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物按照约2mL/kg的剂量体积给药。
E148.E132-E144中任一项所述的方法，其中，所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物按照约7.5mg/周的剂量皮下给药。
E149.E132-E144中任一项所述的方法，其中，所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物每周给药。
E150.E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物用作药物。
E151.E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物用于降低对象中CD2活性。
E152.E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物用于处置需要免疫抑制的对象。
E153.E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物用于治疗对象中自身免疫疾病、紊乱或状况。
E154.E132-E153中任一项所述的方法或用途，其中，所述对象存在一种或多种以下疾病、紊乱或状况：1型糖尿病，银屑病，斑块状银屑病，掌跖脓疱病(palmoplantarispustulosis)，手足心脓疱型银屑病，掌跖脓疱症(pustulosis palmaris et plantaris)，手足心脓疱病，特应性皮炎，扁平苔藓，移植物抗宿主病(GVHD)，白癜风，毛发红糠疹，移植(例如器官移植，例如肾脏移植)，银屑病性关节炎，需要同种异体造血干细胞移植的疾病、紊乱或状况，地中海贫血，镰状细胞病，血小板无力症(Glanzmann thrombasthenia)，维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)，慢性肉芽肿性疾病，严重先天性中性粒细胞减少症，白细胞黏附缺乏症，施瓦曼-戴蒙德综合征(Schwachman-Diamondsyndrome)，戴蒙德-布莱克范贫血(Diamond-Blackfan anemia)，范科尼贫血(Fanconianemia)，先天性角化不良，薛迪克-东氏症候群(Chediak-Higashi syndrome)，再生障碍性贫血，斑秃和T细胞淋巴瘤(例如皮肤T细胞淋巴瘤或外周T细胞非霍奇金淋巴瘤)。
E155.E132-E153中任一项所述的方法或用途，其中，所述对象存在一种或多种以下疾病、紊乱或状况：糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)；青少年型糖尿病；炎性反应，例如银屑病和皮炎(例如特应性皮炎)等炎性皮肤疾病；皮肌炎；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠病(例如克罗恩病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎)相关的反应；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征，ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；胃炎；肾小球性肾炎；变应性状况如湿疹和哮喘以及其他涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的状况；动脉粥样硬化；白细胞黏附缺乏症；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；多发性硬化症；雷诺氏综合症(Reynaud's syndrome)；自身免疫性甲状腺炎；变应性脑脊髓炎；干燥综合征(Sjogren's syndrome)；以及常见于结核病、结节病、多发性肌炎，肉芽肿病和血管炎的细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相隔免疫应答；韦格纳氏病(Wegener’sdisease)；恶性贫血(爱迪生氏病(Addison's disease))；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性疾病；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷沉球蛋白血症或库姆斯积极贫血(Coombs positive anemia))，重症肌无力，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜疾病，抗磷脂综合征，反应性神经炎，格雷夫斯氏病(Graves'disease)，Lambert-Eaton肌无力综合征，大疱性类天疱疮，天疱疮，自身免疫性多内分泌腺疾病，白癜风，莱特尔氏病(Reiter's disease)，僵人综合征，白塞病(Bechet disease)，巨细胞动脉炎，免疫复合物性肾炎，IgA肾病，IgM多发性神经病变，免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症和自身免疫性溶血病，桥本甲状腺炎，自身免疫性肝炎，自身免疫性血友病，自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)，古德帕斯彻氏综合症(Goodpasture's syndrome)，混合性结蒂组织病，自身免疫相关性不育症，结节性多动脉炎，斑秃，特发性粘液性水肿，移植物抗宿主病，肌肉萎缩症(杜兴氏型(Duchenne)，贝克型(Becker)，强直性，肢带型，面肩肱型(Facioscapulohumeral)，先天型，眼咽型，远端型，埃-德型(Emery-Dreifuss))和炎性非免疫疾病，例如心脏疾病或脑科疾病。
E156.E132-E153任一项所述的方法或用途，其中：
i.对象有糖尿病，
ii.对象有1型糖尿病(T1D)，
iii.对象有新发T1D，
iv.对象有带残留β细胞功能的新发T1D，
v.对象被确诊新发T1D不到100天的，
vi.对象是糖尿病前期阶段T1D患者，
vii.对象有第二阶段T1D，例如患者表现出血糖代谢障碍，有症状前疾病，和/或至少两项T1D相关自身抗体阳性，
viii.对象有第三阶段T1D，例如患者表现出高血糖症，有症状性疾病，和/或至少两项T1D相关自身抗体阳性，或者
ix.对象一项或多项T1D相关自身抗体阳性。
E157.E132-E156中任一项所述的方法或用途，还包括给予对象第二疗法，可选地，所述第二疗法促进Treg活性或增加Treg数量，可选地，所述第二疗法包括IL-2。
E158.E156所述的方法或用途，其中，所述对象有糖尿病，例如1型糖尿病，例如新发1糖尿病，且所述第二疗法包括胰岛素。
E159.用E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物检测样品、组织或细胞中CD2的方法，包括令所述样品、组织或细胞接触所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物，以及检测所述多肽分子、多聚体蛋白分子或药物组合物。
E160.包含E1-E111中任一项所述的多肽分子、E112-E116中任一项所述的多聚体蛋白分子或E126-E128中任一项所述的药物组合物的试剂盒。
E161.特异性结合CD2的分离的多肽分子或其功能变体，
其中，所述多肽分子包含与氨基酸序列SEQ ID NO:69有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同度的氨基酸序列，并且
其中，所述多肽分子不含氨基酸序列SEQ ID NO:4。
E162.E161所述的分离的多肽分子或其功能性变体，
其中，所述多肽分子包含与氨基酸序列SEQ ID NO:69有至少90％相同度的氨基酸序列，并且
其中，所述多肽分子不含氨基酸序列SEQ ID NO:4。
E163.E161或E162所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含氨基酸序列SEQ IDNO:69。
E164.特异性结合CD2的分离的多肽或其功能性变体，其包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含与选自SEQ ID NO:17-41的氨基酸序列有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同度的氨基酸序列，并且所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E165.E164所述的分离的多肽或其功能性变体，其中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22或23，并且，所述LFA3结构域还包含氨基酸残基Leu或氨基酸序列LESLPS(SEQ ID NO:118)。
E166.E164所述的分离的多肽或其功能性变体，其中，所述LFA3结构域包含与SEQ IDNO:26有至少90％相同度的氨基酸序列，并且所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E167.E164或E166所述的分离的多肽，其中，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ IDNO:26。
E168.包含LFA3结构域的分离的多肽或其功能性变体，
其中，所述LFA3结构域包含按照SEQ ID NO:3编号在残基36、38、43和86有一处或多处突变的氨基酸序列SEQ ID NO:3。
E169.E168所述的分离的多肽或其功能性变体，其中，所述LFA3结构域还包含氨基酸残基Leu或氨基酸序列LESLPS(SEQ ID NO:118)。
E170.E168或E169所述的分离的多肽或其功能性变体，其中，所述按照SEQ ID NO:3编号位于残基36、38、43和86的一处或多处突变是A36V、L38F、F43V和M86F。
E171.E164-E170中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体，还包含第二结构域，
其中，所述第二结构域包含免疫球蛋白，例如重链恒定区，例如人重链恒定区，或其功能变体；
其中，所述第二结构域包含重链(例如人IgG1重链)的Fc区或其功能性变体；或者
其中，所述第二结构域包含铰链区、CH2区和CH3区、或其功能性变体。
E172.E164-E171中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体，还包含第二结构域，其中，所述第二结构域包含Fc结构域，所述Fc结构域包含与SEQ ID NO:16有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的氨基酸序列。
E173.E172所述的分离的多肽或其功能性变体，其中，所述第二结构域包含Fc结构域，所述Fc结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16。
E174.E171-E173中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体，还包含接头，所述接头将所述第二结构域的N末端与所述LFA3结构域的C末端相连。
E175.E171-E174中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体，其中：
i.所述第二结构域能够与另一第二结构域形成二聚体，例如通过分子间二硫键，和/或
ii.所述第二结构域能够介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
E176.E171-E175中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体，
其中，所述LFA3结构域包含含有与SEQ ID NO:26有至少90％相同度的氨基酸序列的多肽，且所述多肽不含氨基酸序列SEQ ID NO:3；并且
其中，所述Fc结构域包含含有与SEQ ID NO:16有至少90％相同度的氨基酸序列的多肽。
E177.E171-E175中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体，
其中，所述多肽或其功能性变体包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，并且
其中，所述氨基酸序列包含按照SEQ ID NO:4编号位于残基36、38、43、86、92、228和230的一处或多处突变。
E178.E177所述的分离的多肽或其片段，其中，所述按照SEQ ID NO:4编号位于残基36、38、43、86、92、228和230的一处或多处突变是A36V、L38F、F43V、M86F、V92_D93insL、D228E和L230M。
E179.结合例如特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域并具有一项或多项以下特征：
i.增强的单体表达，该特征是由以下情形展现的：用尺寸排阻色谱测定的单体百分比相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子高约70％、75％、80％、85％、90％或95％，
ii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的单体表达和降低的多聚体表达，该特征是由以下情形展现的：据尺寸排阻色谱测定，单体百分比高于约75％、80％、85％、90％或95％，低分子量物质(LMWS)百分比低于约10％、8％、6％、4％或2％，和/或高分子量物质(HMWS)百分比低于约5％、2％或1％，
iii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子降低的热应激聚集倾向，该特征是由以下情形展现的：据尺寸排阻色谱测定，37.4℃孵育24小时后单体百分比高于约90％、92％或95％和/或40℃孵育24小时后单体百分比高于约75％、80％或85％，
iv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子降低的热应激聚集倾向，该特征是由以下情形展现的：据尺寸排阻色谱测定，40℃时的HMWS增加不超过约5％、10％、15％或20％和/或50℃时的HMWS增加不超过约5％、10％、15％、20％或25％，
v.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子降低的低pH聚集倾向，该特征是由以下情形展现的：用尺寸排阻色谱测定的低pH下5小时HMWS增加不超过约6％、7％、8％或9％，
vi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性，该特征是由以下情形展现的：40℃存放2或4周后用毛细管凝胶电泳(CGE)或尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％、1.5％或2％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％、2％、3％、4％或5％，
vii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性：例如25℃存放2、4或6周后用SE-HPLC测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％、1.5％或2％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％，
viii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性：例如5℃存放2、4或6周后用SE-HPLC测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％，
ix.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的冻融稳定性，该特征是由以下情形展现的：5轮冻融后为用尺寸排阻色谱测定的HMWS增加不超过约0.5％、1％或1.5％，
x.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子提高的产率，该特征是由以下情形展现的：产率高于每20mL Expi293培养物约5.5、6、6.5或7mg，
xi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子提高的Tm，该特征是由以下情形展现的：差示扫描荧光测定法(DSF)测定的Tm高于约38、40、42、45或50℃，
xii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，该特征是由以下情形展现的：为DSF测定的Tm高于约40、45、50、55或60℃，
xiii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，该特征是由以下情形展现的：据差示扫描量热法(DSC)测定的Tm高于约50或60℃，
xiv.据DSC测定，pH 7.5时Tm1高于约55、58、60、62、64或66℃且Tm2高于约75、78、80或82℃；pH 5.8时Tm1高于约55、58、60、62或64℃且Tm2高于约75、78、80或82℃；或pH 4.5时Tm1高于约55、58或60℃且Tm2高于约75、78或80℃，
xv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，该特征是由以下情形展现的：据DSC测定，pH 7.5或pH 4.5时Tm高于约50或60℃，或者pH 5.8时Tm高于约50或62℃；
xvi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，该特征是由以下情形展现的：DSC和FabRICATOR IdeS测定的Tm高于约50或60℃，
xvii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2结合亲和力，该特征是由以下情形展现的：SPR测定的对人CD2的KD低于约1.2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1或0.08μM，
xviii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2结合亲和力，该特征是由以下情形展现的：据SPR测定，对人CD2的KD低于约1.3、1.2、1.1或1μM，且/或对猕猴CD2的KD低于约1.4、1.3、1.2、1.1或1μM，
xix.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，该特征是由以下情形展现的：SPR测定的结合CD4 Tmem细胞的Kd不超过约100、200、300或400pM，
xx.据SPR测定，相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，该特征是由以下情形展现的：例如用SPR和/或实施例2中就表10和图11所述的方法测定，结合CD4记忆T细胞的算得IC50不超过约300、400、500、600、700、800、1000、1200或1500pM；结合CD4+ TEM细胞的算得IC50不超过约150、300、400、500、600、700、800、1000或1200pM；结合CD4+ TCM细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400、500、600、700或800pM；结合CD4初始T细胞的算得IC50不超过约200、300、400、500、600、700、800、1000或1200pM；结合扩增CD4 Treg细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD8记忆T细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400、500或600pM；和/或结合CD8初始T细胞的算得IC50不超过约300、400、500、600、700、800、1000、1200、1500、1600或1700pM，
xxi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，该特征是由以下情形展现的：据SPR测定，结合CD4记忆T细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD4+ TEM细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400、500或600pM；结合CD4+TCM细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD4初始T细胞的算得Kd不超过约100、200、300或400pM；结合扩增CD4 Treg细胞的算得Kd不超过约100、200或300pM；结合CD8记忆T细胞的算得Kd不超过约50、100或150pM；结合CD8初始T细胞的算得Kd不超过约50、100、200、300、400或500pM，
xxii.增强的CD2表达细胞结合亲和力，该特征是由以下情形展现的：相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子，SPR测定的结合猕猴CD4+ TEM细胞EC50降低，
xxiii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的对CD2表达细胞的细胞毒性，该特征是由以下情形展现的：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)检测测定的杀伤CD4 Tmem细胞的EC50不超过约400、600、800、1000、1200或1400pM，
xxiv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的对CD2表达细胞的细胞毒性，该特征是由以下情形展现的：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)检测测定的杀伤CD8 Tmem细胞的EC50不超过约1、5、10、20、30、40或50nM，
xxv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的同种异体T细胞反应抑制，其中，所述同种异体T细胞反应是T细胞增殖和/或细胞因子产生，该特征是由以下情形展现的：混合淋巴细胞反应(MLR)检测的IC50不超过约400、800、1200、1600、2000或2400pM，
xxvi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的同种异体T细胞反应抑制，其中，所述同种异体T细胞反应是T细胞增殖和/或细胞因子产生，该特征是由以下情形展现的：无NK细胞混合淋巴细胞反应(MLR)检测的IC50不超过约330、400、500、600、800、1000、1500或2000pM，
xxvii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的破伤风类毒素回忆反应抑制，该特征是由以下情形展现的：破伤风类毒素回忆(TTR)检测测定的对CD4Tmem IFNγ产生的IC50不超过约1、2、5、10、15、20或25nM，
xxviii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子减缓的体内清除，该特征是由以下情形展现的：PK/PD研究测定的中心清除率不超过约0.14、0.16、0.18、0.2或0.22mL/hr/kg，和/或
xxix.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的纯度，即毛细管凝胶电泳测定的纯度至少约98％或99％。
E180.一种分离的核酸，其编码E161-E179中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体。
E181.E180所述的分离的核酸，包含与SEQ ID NO:43、53和/或123有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％相同度的核酸序列。
E182.E180或E181所述的分离的核酸，包含核酸序列SEQ ID NO:43、53和/或123。
E183.一种载体，其包含E180-E182中任一项所述的核酸。
E184.一种宿主细胞，其包含E180-E182中任一项所述的核酸或E183所述的载体。
E185.E184所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是选自Expi293细胞、ExpiCHO细胞、CHO细胞、COS细胞、HEL-293细胞、NSO细胞、PER.C6细胞或SP2.0细胞的哺乳动物细胞。
E186.E184或E185所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是Expi293细胞或ExpiCHO细胞。
E187.一种药物组合物，其包含E161-E179中任一项所述的多肽分子和药学上可接受的运载体或赋形剂。
E188.E187所述的药物组合物，包含7.5mg权利要求E161-E179中任一项所述的多肽分子和HEPES缓冲盐溶液。
E189.制造特异性结合CD20的分离的多肽分子的方法，包括培养权利要求E184-E186中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞在培养条件下表达所述多肽分子。
E190.E189所述的方法，还包括分离所述多肽分子。
E191.E161-E179中任一项所述的分离的多肽或权利要求E187或E188所述的药物组合物，用于处置需要免疫抑制的对象。
E192.E161-E179中任一项所述的分离的多肽或权利要求E187或E188所述的药物组合物用于治疗免疫疾病、紊乱或状况的用途。
E193.一种治疗或预防人对象中CD2介导的免疫疾病、紊乱或状况的方法，所述人对象需要所述的治疗或预防，所述方法包括给予所述对象有效量的E187或E188所述的药物组合物，其中，所述疾病、紊乱或状况选自：1型糖尿病，银屑病，斑块状银屑病，掌跖脓疱病(palmoplantaris pustulosis)，手足心脓疱型银屑病，掌跖脓疱症(pustulosis palmariset plantaris)，手足心脓疱病，特应性皮炎，扁平苔藓，移植物抗宿主病(GVHD)，白癜风，毛发红糠疹，移植(例如器官移植，例如肾脏移植)，银屑病性关节炎，需要同种异体造血干细胞移植的疾病、紊乱或状况，地中海贫血，镰状细胞病，血小板无力症(Glanzmannthrombasthenia)，维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)，慢性肉芽肿性疾病，严重先天性中性粒细胞减少症，白细胞黏附缺乏症，施瓦曼-戴蒙德综合征(Schwachman-Diamond syndrome)，戴蒙德-布莱克范贫血(Diamond-Blackfan anemia)，范科尼贫血(Fanconi anemia)，先天性角化不良，薛迪克-东氏症候群(Chediak-Higashisyndrome)，再生障碍性贫血，斑秃和T细胞淋巴瘤(例如皮肤T细胞淋巴瘤或外周T细胞非霍奇金淋巴瘤)。
E194.E193所述的方法，其中，所述疾病是糖尿病，例如1型糖尿病(T1D)，例如新发T1D，例如有残留β细胞功能的新发T1D(例如对象确诊不到100天)，例如2阶段或3阶段T1D。
E195.E161-E179中任一项所述分离的多肽用于制造用于治疗免疫疾病、紊乱或状况的药物的用途。
E196.一种用E161-E179中任一项所述分离的多肽或其功能性变体检测样品、组织或细胞中CD2的方法，包括将所述样品、组织或细胞与所述多肽或其功能性变体接触和检测所述多肽或其功能性变体。
E197.E132-E153所述方法或用途，其中，所述对象有银屑病性关节炎。
附图说明
结合附图进行阅读时将更好地理解以上概述以及后文的发明详述。为了说明本发明，附图中展示了一个或多个实施方式。然而，应理解的是本发明不局限于图示的具体设置和构架。
图1：基于结构的文库设计，用于第一代稳定性(S)和亲和力+稳定性(AS)酵母展示库。16个核心残基(S和AS库)和15个接触残基(AS库)突变成4-6个化学类似残基。图1中残基按照SEQ ID NO:2编号。
图2A-2D：酵母展示库鉴定的克隆中的氨基酸变化频率鉴定到6个热点位置。图2A是鉴定到的6个热点残基的图示。这6个残基按照SEQ ID NO:2编号。图2B中，文库中靶向的LFA3残基以粗体显示，6个热点残基以粗体加下划线显示。图2C显示6个热点位置的氨基酸变化频率。图2D的表格显示6个重组变体M1-M6的设计。对各个变体的热点位置氨基酸残基进行了说明。
图3A-3D：野生型LFA3(LFA3 WT)和M1-M6变体Fc融合蛋白分子评估示范图。“LFA3WT-Pfe”和“WT-Pfe”指WT LFA3-Pfe。
图4：基于结构的FG环库设计，用来鉴定高结合亲和力的克隆。图4表中所示为二代库中的诱变靶向残基。残基位置按照SEQ ID NO:2编号。
图5A和5B：高亲和力LFA3变体表征示例。以Biacore检测(SPR)评估克隆的重组CD2结合亲和力(图5A)和并以DSF评估热稳定性(图5B)。“LFA3-WT”指LFA3-Fc WT。“LFA3-Pfe”指WT LFA3-Pfe。
图6A-6D：结构域边界变体d1的理性设计。含有额外内源性亮氨酸残基(d1)的LFA3-Fc蛋白的表征示例，表征的是野生型LFA3序列(LFA3-Fc d1)或稳定性M变体(M1-d1(亦称“M1d1”)和M4-d1(亦称“M4d1”))的单体表达和热稳定性。图6C中“WT”指LFA3-Fc WT。图6D中“Pfe”指WT LFA3-Pfe。
图7A-7D：结构域边界变体M1-d1(亦称“M1d1”)和M1-d3(亦称“M1d3”)对人和猕猴CD2的亲和力以及热稳定性(DSF)。
图8A-8D：M7-d1的设计与表征。图8B、8C和8D所示分别是例举的SEC分析、热稳定性分析和亲和力分析的结果。图8C中的“LFA3-WT”和图8D中的“WT”指LFA3-Fc WT。图8C中的“LFA3-Pfe”指WT LFA3-Pfe。
图9和图10：显示静息态(图9)和用抗CD3/CD28珠进行TCR活化后(图10)人PBMC上的CD2水平示例。图9显示4个供体的均值±SEM，图10显示一个供体。数据表示为每细胞分子均数(+/-SD)。NK＝自然杀伤细胞；eff mem＝效应记忆；cen mem＝中央记忆；Treg＝调节性T细胞。
图11：抗CD2抗体竞争结合检测测定的LFA3-Fc与原代人T细胞群结合例。检测进行一式三份，以均值±标准差绘制曲线。“WT”指LFA3-Fc WT。
图12A-12E：人PBMC ADCC检测例。PBMC与递增量的LFA3-Fc蛋白(LFA3-Fc M1d1或LFA3-Fc WT)共培养，图12A为记忆CD4(如CD4 CD45RO+)细胞的细胞毒性曲线。图12B所示为跨供体EC50。图12C-12E显示LFA3-Fc蛋白介导的CD4非记忆细胞(如CD4 CD45RO-)、CD8记忆细胞(如CD8 CD45 RO+)和CD8非记忆细胞(如CD8 CD45RO-)的浓度依赖性细胞毒性。数据点代表平均值(n＝5)+/-SEM。
图13A-13C：细胞毒性检测例，其中，纯化的NK细胞与靶细胞在固定量LFA3-FcM1d1或LFA3-Fc WT存在下共培养。图13A：以250nM蛋白孵育靶细胞(CD4记忆细胞)。显示5个供体中1个供体的三孔均值±标准差。靶细胞(CD4初始细胞、CD4记忆细胞或B细胞)与100nMLFA3-Fc WT(图13B)或LFA3-Fc M1d1(图13C)和NK细胞(效应细胞)按多个效应细胞与靶细胞之比进行孵育。显示1个供体的三孔均值±标准差。“WT”指LFA3-Fc WT。
图14A和14B：LFA3-Fc M1d1(“M1d1”)完全抑制响应同种异体刺激的CD4+T细胞扩增(MLR)例图。图14A显示1个供体的三孔均值±标准差。图14B所示为跨多供体的IC50。“WT”指LFA3-Fc WT。
图15A-15C：LFA3-Fc M1d1(“M1d1”)的无NK细胞MLR抑制例。不碰NK细胞(图15A)或用磁珠消减NK细胞(图15B)。图15A和15B显示1个供体的三孔均值±标准差。图15C所示为跨重复试验的IC50。“WT”指LFA3-Fc WT。
图16A和16B：LFA3-Fc M1d1(“M1-d1”)抑制破伤风类毒素(TT)抗原的CD4记忆细胞回忆反应的例子。图16A显示1个供体的三孔均值±标准差。图16B所示为跨多供体的IC50。“WT”指LFA3-Fc WT。
图17：猕猴PBMC上CD2表达例。N＝6；数据表示为每细胞分子均数(+/-SD)。NK＝自然杀伤细胞；eff mem＝效应记忆；cen mem＝中央记忆；Tregs＝调节性T细胞。
图18A和18B：猕猴PBMC ADCC检测例。猕猴PBMC与递增量的LFA3-Fc多肽(M1d1或WT)共孵育，绘制CD4+ TEM细胞的细胞毒性曲线。图18A显示1个供体的三孔均值±标准差。图18B所示为3个供体的EC50。“WT”指LFA3-Fc WT。
图19：猕猴重复给药PK/PD研究17MA057设计例。
图20A和20B：重复给药(黑色箭头)后，LFA3-Fc M1d1降低CD4+ TEM，提高Treg/CD4+TEM比。数据例绘制成与给药前细胞数相比的改变倍数。显示4个动物的均值+/-SEM。
图21：LFA3-Fc M1d1处理对记忆T细胞影响较大。数据例绘制成与给药前细胞数相比的改变倍数。显示4个动物的均值+/-SEM。
图22A和22B：重复给药后，LFA3-Fc WT降低CD4+ TEM，提高Treg/CD4+ TEM比。数据例绘制成与给药前细胞数相比的改变倍数。显示4个动物的均值+/-SEM。“WT”指LFA3-FcWT。
图23A和23B：研究17MA057得到的M1d1和LFA3-Fc WT在猕猴中的PK表现例。剂量在0.03-3mg/kg之间按比例计。
图24：拟定的LFA3-Fc作用机制。
图25A-25B：用Quantibrite珠和流式细胞术进行的人KLRG1+与KLRG1-TIGIT+PD1+T辅助细胞上CD2表达定量的例子。图25A绘制的是CD4效应记忆(“EM”)细胞中的CD2表达。图25B绘制的是CD4中央记忆(“CM”)细胞中的CD2表达。数据表示为n为2个供体的几何平均荧光强度(gMFI)+/-SD。KLRG1＝杀伤细胞凝集素样受体G1；TIGIT＝含Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体。
图26A-26B：用Quantibrite珠和流式细胞术进行的人T辅助细胞亚群上CD2表达定量的例子。图26A和图26B：代表在不同的两天对两个供体的分析。数据表示为几何平均荧光强度(gMFI)+/-SD。CCR7＝7型C-C趋化因子受体；PD1＝程序性细胞死亡蛋白1；TH＝T辅助细胞；Tfh＝滤泡辅助T细胞；Tregs＝调节性T细胞。
图27：LFA3-Fc M1d1在pH 7.5的Tris缓冲液、pH 5.8的组氨酸缓冲液或pH 4.5的谷氨酸盐缓冲液中的差示扫描量热法(DSC)结果例。
图28：LFA3-Fc M1d1经Fabricator-IdeS消化后的差示扫描量热法(DSC)结果例。
图29A-29C：LFA3-Fc M1-d1(亦称LFA3-Fc M1d1)和WT LFA3-Fc(亦称LFA3-Fc WT)在pH 7.5的20mM Tris缓冲液中(图29A)、pH 5.8的20mM组氨酸缓冲液(图29B)或pH 4.5的20mM谷氨酸盐缓冲液(图29C)中的电荷异质性分析例。
图30A-30C：LFA3-Fc M1d1和LFA3-Fc WT在pH 7.5的Tris缓冲液(图30A)、pH 5.8的组氨酸缓冲液(图30B)或pH 4.5的谷氨酸盐缓冲液(图30C)中在0时刻和40℃存放2或4周后的非还原(NR)毛细管凝胶电泳(CGE)分析例。定量了低分子量物质(LMMS)的百分比。
图31A-31D：LFA3-Fc M1d1和LFA3-Fc WT在pH 7.5的Tris缓冲液(图31A)、pH 5.8的组氨酸缓冲液(图31B)或pH 4.5的谷氨酸盐缓冲液(图31C)中在0时刻和40℃存放2或4周后的尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)分析例。定量了低分子量物质(LMMS)的百分比(图31D)和高分子量物质(HMMS)的百分比(图31A-31C)。
图32A-32D：LFA3-Fc M1d1和LFA3-Fc WT在pH 7.5的Tris缓冲液(图32A)、pH 5.8的组氨酸缓冲液(图32B)或pH 4.5的谷氨酸盐缓冲液(图32C)中在0时刻和25℃存放2、4或6周后的尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)分析例。定量了低分子量物质(LMMS)的百分比(图32D)和高分子量物质(HMMS)的百分比(图32A-32C)。
图33A-33D：LFA3-Fc M1d1和LFA3-Fc WT在pH 7.5的Tris/蔗糖缓冲液(图33A)、pH5.8的组氨酸/蔗糖缓冲液(图33B)或pH 4.5的谷氨酸盐/海藻糖缓冲液(图33C)中在0时刻和5℃存放2、4或6周后的尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)分析例。定量了低分子量物质(LMMS)的百分比(图33D)和高分子量物质(HMMS)的百分比(图33A-33C)。
图34A-34B：重复给药后，LFA3-Fc M1d1降低CD4+ TEM，提高Treg/CD4+ TEM比。数据例绘制成与给药前细胞数相比的改变倍数。显示4个动物的均值+/-SEM。
图35A-35B：重复给药后，LFA3-Fc WT降低CD4+ TEM，提高Treg/CD4+ TEM比。数据例绘制成与给药前细胞数相比的改变倍数。显示4个动物的均值+/-SEM。
具体实施方式
本文记载了结合CD2、抑制CD2活性和/或消减CD2表达细胞的LFA3多肽分子，例如变体LFA3多肽分子，例如变体LFA3融合多肽分子，例如变体LFA3-Fc融合多肽分子。提供了制备LFA3多肽分子的方法，包含这些LFA3多肽分子的组合物以及使用这些LFA3多肽分子的方法。
一些实施方式中，相比野生型LFA3多肽分子，本发明的LFA3多肽分子稳定性和可制造性增强。一些实施方式中，相比野生型LFA3多肽分子(例如野生型LFA3-Fc融合蛋白)，本发明的LFA3多肽分子(例如变体LFA3-Fc融合蛋白)的CD2结合亲和力提高。一些实施方式中，相比野生型LFA3多肽分子(例如野生型LFA3-Fc融合蛋白)，本发明的LFA3多肽分子(例如变体LFA3-Fc融合蛋白)对CD2表达细胞的细胞毒性增强。一些实施方式中，相比野生型LFA3多肽分子(例如野生型LFA3-Fc融合蛋白)，本发明的LFA3多肽分子(例如变体LFA3-Fc融合蛋白)表现出增强的同种异体T细胞反应抑制。一些实施方式中，相比野生型LFA3多肽分子(例如野生型LFA3-Fc融合蛋白)，本发明的LFA3多肽分子(例如变体LFA3-Fc融合蛋白)表现出减缓的体内清除。
提供了编码LFA3多肽分子的多核苷酸。提供了表达LFA3多肽分子的宿主细胞。提供了使用LFA3多肽分子的治疗方法。实施方式之一中，此类方法包括治疗炎性疾病、紊乱或状况的方法。实施方式之一中，此类方法包括治疗需要免疫抑制的疾病、包括但不限于自身免疫病的方法。实施方式之一中，此类方法包括治疗炎性非免疫疾病例如心脏病或脑科疾病的方法。
本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为对记述的主题构成限制。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利出版物和Genbank登录号均通过引用整体纳入本文，就如同每一篇参考文献均各自明确地通过引用整体纳入。
本文描述或援引的技术和方法是本领域技术人员公知和采用常规方法经常实施的，例如以下文献中描述的被广泛采用的方法：Sambrook等在《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第3版(2001)，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)(纽约州冷泉港)，《新编分子生物学实验指南》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.Ausubel等编，(2003))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版社有限公司)：《PCR 2:实践方法》(PCR 2:APRACTICAL APPROACH)(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))，Harlow和Lane编(1988)《抗体，实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)和《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.Freshney编(1987))；《寡核苷酸合成》(OligonucleotideSynthesis)(M.J.Gait编，1984)；《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，Humana出版社；《细胞生物学：实验室手册》(Cell Biology:A Laboratory Notebook)(J.E.Cellis编，1998)学术出版社；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney编(1987))；《细胞和组织培养入门》(Introduction to Cell and TissueCulture)(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum出版社；《细胞和组织培养实验室方法》(Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures)(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编，1993-8)J.Wiley和Sons出版社；《实验免疫学手册》(Handbook ofExperimental Immunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞基因传递载体》(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction)，(Mullis等编，1994)；《新编免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)(J.E.Coligan等编，1991)；《简明分子生物学方法》(Short Protocols in Molecular Biology)(Wiley and Sons出版社，1999)；《免疫学》(Immunobiology)(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；《抗体》(Antibodies)(P.Finch，1997)；《抗体：实践方法》(Antibodies:A Practical Approach)(D.Catty编，IRL出版社，1988-1989)；《单克隆抗体：实践方法》(Monoclonal Antibodies:A PracticalApproach)(P.Shepherd和C.Dean编，牛津大学出版社，2000)；《抗体应用：实验室手册》(Using Antibodies:A Laboratory Manual)(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社，1999))；《抗体》(The Antibodies)(M.Zanetti和J.D.Capra编，Harwood学术出版社，1995)；和《癌症：肿瘤学原理与实践》(Cancer:Principles and Practice of Oncology)(V.T.DeVita等编，J.B.Lippincott公司，1993)；及其更新版本。
LFA3多肽分子(例如变体LFA3融合多肽分子)可用于预防、治疗和/或缓解包括但不限于以下所述的疾病、紊乱或状况：1型糖尿病，银屑病，斑块状银屑病，掌跖脓疱病(palmoplantaris pustulosis)，手足心脓疱型银屑病，掌跖脓疱症(pustulosis palmariset plantaris)，手足心脓疱病，特应性皮炎，扁平苔藓，移植物抗宿主病(GVHD)，白癜风，毛发红糠疹，移植(例如器官移植，例如肾脏移植)，银屑病性关节炎，需要同种异体造血干细胞移植的疾病、紊乱或状况，地中海贫血，镰状细胞病，血小板无力症(Glanzmannthrombasthenia)，维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)，慢性肉芽肿性疾病，严重先天性中性粒细胞减少症，白细胞黏附缺乏症，施瓦曼-戴蒙德综合征(Schwachman-Diamond syndrome)，戴蒙德-布莱克范贫血(Diamond-Blackfan anemia)，范科尼贫血(Fanconi anemia)，先天性角化不良，薛迪克-东氏症候群(Chediak-Higashisyndrome)，再生障碍性贫血，斑秃和T细胞淋巴瘤(例如皮肤T细胞淋巴瘤或外周T细胞非霍奇金淋巴瘤)。其他疾病、紊乱或状况的例子有：糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)；青少年型糖尿病；炎性反应，例如银屑病和皮炎(例如特应性皮炎)等炎性皮肤疾病；皮肌炎；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠病(例如克罗恩病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎)相关的反应；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征，ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；胃炎；肾小球性肾炎；变应性状况如湿疹和哮喘以及其他涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的状况；动脉粥样硬化；白细胞黏附缺乏症；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；多发性硬化症；雷诺氏综合症(Reynaud's syndrome)；自身免疫性甲状腺炎；变应性脑脊髓炎；干燥综合征(Sjogren's syndrome)；以及常见于结核病、结节病、多发性肌炎，肉芽肿病和血管炎的细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相隔免疫应答；韦格纳氏病(Wegener’s disease)；恶性贫血(爱迪生氏病(Addison's disease))；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性疾病；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷沉球蛋白血症或库姆斯积极贫血(Coombs positive anemia))，重症肌无力，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜疾病，抗磷脂综合征，反应性神经炎，格雷夫斯氏病(Graves'disease)，Lambert-Eaton肌无力综合征，大疱性类天疱疮，天疱疮，自身免疫性多内分泌腺疾病，白癜风，莱特尔氏病(Reiter's disease)，僵人综合征，白塞病(Bechet disease)，巨细胞动脉炎，免疫复合物性肾炎，IgA肾病，IgM多发性神经病变，免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症和自身免疫性溶血病，桥本甲状腺炎，自身免疫性肝炎，自身免疫性血友病，自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)，古德帕斯彻氏综合症(Goodpasture's syndrome)，混合性结蒂组织病，自身免疫相关性不育症，结节性多动脉炎，斑秃，特发性粘液性水肿，移植物抗宿主病，肌肉萎缩症(杜兴氏型(Duchenne)，贝克型(Becker)，强直性，肢带型，面肩肱型(Facioscapulohumeral)，先天型，眼咽型，远端型，埃-德型(Emery-Dreifuss))和炎性非免疫疾病，例如心脏疾病或脑科疾病。
I.定义
结合本文以下对本发明实施方式例的详细描述和实施例可更容易地理解本发明。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语为本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。若有抵触，以本包括定义在内的本申请说明书为准。
此外，除非应上下文所需或明确说明，单数术语应包括复数含意，复数术语应包括单数含意。
应理解，本文描述的本发明的内容和实施方式包括由所述内容和实施方式组成或构成(即以“由……组成/构成”表示)和/或基本上所述内容和实施方式组成或构成(即以“基本上由……组成/构成”表示)的情形。本文中，除非另作说明，“一”、“所述”、“该”等包括复数含意。
本申请中，除非另作说明或按照本领域技术人员的理解，“或”表示“和/或”。多项从属权利要求中，采用“或”来援引多项在前的独立或从属权利要求。
“约”或“左右”与可测量数值变量联用时表示该变量的明示数值以及该明示数值在该变量实验误差范围内(例如均值的95％置信区间内)或该明示数值正负10％范围内的所有值，以范围大者为准。数值范围包括限定该范围的端值。
虽然表示本发明广义范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中给出的数值是尽可能准确的。然而，任何数值不可避免因各自相应实验测量的标准偏差而有一定误差。此外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和全部子范围。例如，表述的“1至10”范围应理解为包括最小值1和最大值10之间(包括这两个极值)的任意和所有子范围；即以1或更大数值(例如1至6.1)为最小值开始至以10或更小数值(例如5.5至10)为最大值结束的所有子范围。
在本申请说明书和权利要求书中，“包含”或其变体形式如“包括”或“含有”等应理解为表示包括列明的整数或整数组，但不排除其他整数或整数组。除非另作说明，单数术语应包括复数含意，复数术语应包括单数含意。“如”或“例如”之后的举例既非穷举亦非限定。
应当理解，凡以“包含”来描述实施方式的情形中既为同时提供以“由……组成/构成”和/或“基本上由……组成/构成”描述的类似实施方式。
对于以马库什集合或其他集合方式表述的多项本发明内容或实施方式，本发明不仅包括所述集合整体并且包括各个单独的集合内成员和主集所有可能的子集以及缺省一项或多项组合内成员后的主集。本发明还包括在权利要求要求保护的发明中明确排除一项或多项集合成员的情形。
应当理解，本文所有术语只是为描述具体实施方式，不起限制作用。本申请说明书和权利要求书中将提到许多术语，这些术语具有以下含意：
术语“分离的分子”(其中，所述分子例如多肽或多核苷酸)是如下所述的分子：根据其来源(1)不附带伴随其原生状态的天然关联成分，(2)基本上不含同一物种的其他分子，(3)由不同物种的细胞表达，或(4)自然界中不存在。因此，化学合成的分子或由非其天然来源细胞的细胞系统表达的分子是与其天然关联成分“分离”的。可采用本领域所知的纯化技术进行分离来使分子基本不含天然关联成分。可用多种本领域所知的手段来检测分子的纯度或均质性。例如，多肽样品的纯度可用本领域公知的方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶染色令多肽可视化来测定。为了某些目的，用HPLC或本领域公知的其他纯化方法可提供更高的分离度。
本文中，“基本纯”表示目标物质是存在的主要物质(即按照摩尔计，它与组合物中所有其他物质单独相比都更多)，并且，优选地，一份基本纯化的物质是如下所述的组合物：组合物中存在的所有大分子物质中，目标物质(例如糖蛋白)占至少约50％(按摩尔计)。通常，基本纯的组合物包含组合物中存在的所有大分子物质的约80％以上，约85％、90％、95％和99％以上更好。最好的是，目标物质被纯化成基本均质(常规检测方法无法测出组合物中有杂质)，其中，所述组合物基本上由单种大分子物质组成。一些实施方式中，基本纯的材料至少50％纯(即不含杂质)，至少90％纯更好、至少95％纯更好、至少98％纯还要好、最好至少99％纯。
术语“相同度”指两条或更多条多肽分子序列或两条或更多条核酸分子序列之间通过序列比较确定的关系。本领域中，“相同度”还表示多肽或核酸分子序列之间的相关性程度，视情况而定，这取决于核苷酸或氨基酸序列串之间的匹配。“相同度”测定两条或更多条序列之间的相同匹配百分比，其中，由计算机程序的特定数学模型(即“算法”)分配空位。
“相似度”是与“相同度”不同的一个相关概念，指相似性指标，即包括相同匹配也包括保守性取代匹配。因为保守性取代适用于多肽但不适用于核酸分子，相似度仅用于多肽序列比较。如果两条多肽序列在20个氨基酸中有10个相同其余都是非保守性取代，则相似度和相同度百分比都是50％。这同一个例子中，如果另有5个位置是保守性取代，则相同度百分比仍然是50％，相似度百分比变成75％(20个中的15个)。所以，如果有保守性取代，两多肽序列间的相似度会高于它们之间的相同度百分比。
多肽“片段”或“部分”，按照本发明，可通过截断来制造，例如从多肽N和/或C-末端去除一个或多个氨基酸。可如此从N和/或C-末端去除多达10、多达20、多达30、多达40或更多氨基酸。还可以由一处或多处内部缺失来形成片段。
变体分子可包含前文所述具体序列和片段的1、2、3、4、5、至10、至20、至30或更多个氨基酸取代和/或缺失和/或插入。“缺失”变体可包含单个氨基酸缺失，小组氨基酸(例如2、3、4或5个氨基酸)缺失，或大氨基酸区域的缺失，例如特定氨基酸结构域或其他特征的缺失。“插入”变体可包含单个氨基酸插入，小组氨基酸(例如2、3、4或5个氨基酸)插入，或大氨基酸区域的插入，例如特定氨基酸结构域或其他特征的插入。“取代”变体优选包含一个或多个氨基酸被相同数目氨基酸替换并造成保守性氨基酸取代。例如，氨基酸可用具有相似特性的其他氨基酸取代，例如，其他碱性氨基酸、其他酸性氨基酸、其他中性氨基酸、其他带电荷氨基酸、其他亲水氨基酸、其他疏水氨基酸、其他极性氨基酸、其他芳族氨基酸或其他脂族氨基酸。可用于选择适宜取代基的20个主要氨基酸的一些性质如下所述。
取代变体的分子中至少有一个氨基酸残基被去除并在其原位插入了不同的残基。表1中的“保守性取代”列显示了保守性取代的例子。可以引入以下“示例性取代”表示的或后文就氨基酸分类所述的其他取代，并对产物进行筛选。
表1.氨基酸与取代
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通过选择就维持以下性质而言效应显著不同的取代来对分子的生物学性能进行实质改变：(a)取代区域的多肽骨架结构，例如β折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或者(c)侧链体积。基于共同的侧链特性将天然残基分组如下：
i.非极性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
ii.极性不带电：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
iii.酸性(负电)：Asp，Glu；
iv.碱性(正电)：Lys，Arg；
v.残基影响链取向：Gly，Pro；和
vi.芳族：Trp，Tyr，Phe，His。
非保守性氨基酸取代可通过将一组的成员换成其他组的成员来产生。
例如，一种可产生的取代类型是将分子中一个或多个可能为化学反应性的半胱氨酸换成其他残基，例如但不限于换成丙氨酸或丝氨酸。例如，可带有非典型半胱氨酸取代。一些实施方式中是典型半胱氨酸。也可对不参与维持分子正确构象的任何半胱氨酸残基进行取代，通常用丝氨酸取代，由此改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。反过来，可以给分子添加一个或多个半胱氨酸键来改善稳定性。
“抗体”是能够通过至少一个免疫球蛋白分子可变区内的抗原识别位点来特异性结合例如碳水化合物、多核苷酸、脂类、多肽等靶标的免疫球蛋白分子。本文中，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且，除非另作说明，还包括与完整抗体竞争特异性结合的任何抗原结合部分，包含抗原结合部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的任何其他免疫球蛋白分子修饰构型。抗原结合部分包括，例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、结构域抗体(dAb，例如鲨鱼和骆驼科动物的抗体)，包括互补决定区(CDR)的片段，单链可变区片段抗体(scFv)，大型抗体(maxibodies)，迷你抗体(minibodies)，胞内抗体(intrabodies)，双抗体，三抗体，四抗体，v-NAR和bis-scFv，以及包含足以赋予多肽特异性抗原结合性的至少免疫球蛋白一部分的多肽。双抗体可包括单链Fv(scFv)片段的非共价二聚体，单链Fv(scFv)片段由重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)通过小肽接头相连构成。另一实施方式中，双抗体是单链(Fv)2，其中，两个scFv片段彼此共价相连。
例如，三抗体是三个scFv片段彼此共价相连的单链(Fv)2。抗体包括任何类别的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且所述抗体不必限于任何特定类别。根据其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。有五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中数类还可进一步分成多个亚类(亚型，亦称同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类别免疫球蛋白对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
与靶标“优势性结合”或“特异性结合”(本文可互换使用)的分子是本领域众所周知的表述，测定这种特异性或优势性结合的方法也是本领域众所周知的。如果，相比与其他细胞或其他物质反应或结合，分子更频繁、更快速、更持久和/或以更高亲和力与特定细胞或物质反应或结合，则称该分子表现出“特异性结合”或“优势性结合”。如果，相比结合其他物质，分子以更高亲和力、亲合力、更容易和/或更持久地结合靶标，则该分子“特异性结合”或“优势性结合”该靶标。并且，相比结合样品中的其他物质，分子以更高亲和力、亲合力、更容易和/或更持久地结合样品中的靶标，则该分子“特异性结合”或“优势性结合”该靶标。例如，特异性或优势性结合CD2的分子是与结合非CD2蛋白相比以更高亲和力、亲合力、更容易和/或更持久地结合CD2的分子。由此定义还可以知道，例如，特异性或优势性结合第一靶标的分子或可特异性或优势性结合第二靶标或者不会特异性或优势性结合第二靶标。因此，“特异性结合”或“优势性结合”不一定排除其他结合(尽管包含排除其他结合的情形)。一般来说，但非绝对，结合指优势性结合。“特异性结合”或“优势性结合”包括识别并结合样品中特定分子但不实质性识别或结合样品中其他分子的化合物(例如蛋白质、核酸等等)。举例来说，分子识别并结合样品中相关配体或结合伴侣(例如结合CD2的LFA3多肽分子)但不实质性识别或结合样品中其他分子，这样的分子即特异性结合所述相关配体或结合伴侣。因此，在指定检测条件下，指定结合部分优势性结合某特定靶分子但不以显著量结合试验样品中的其他组分。
可用多种检测方式来选择特异性结合感兴趣靶标的分子。例如，可用固相ELISA免疫检测、免疫沉淀、BiacoreTM(GE Healthcare公司，新泽西州皮斯卡特维)、KinExA、荧光活化细胞分选(FACS)、OctetTM(FortéBio有限公司，加利福尼亚门洛帕克)和Western印迹分析等许多检测方法来鉴定如下所述的分子，所述分子与抗原或受体或它们的配体结合部分特异性反应，特异性结合对应的配体或结合伴侣。通常，特异性或选择性反应是背景信号或噪音的至少两倍，例如背景的10倍以上、例如背景的50倍以上、例如背景的100倍以上、例如背景的500倍以上、例如背景的1000倍以上、例如背景的10,000倍以上。
本文中，“结合亲和力”用作两分子例如多肽分子与其靶标之间非共价相互作用强度的指标。术语“结合亲和力”用来描述单价相互作用(固有活性)。
另外，为了确定LFA3多肽分子与CD2表达细胞的结合亲和力，可进行细胞结合实验来确定表观亲和力。多肽分子结合靶标表达细胞的表观亲和力可以计算为平衡结合滴定曲线的EC50，其中，通过流式细胞术定量靶标结合群体的几何平均荧光强度(gMFI)。
两分子例如多肽分子与其靶标之间的单价相互作用结合亲和力可通过测定解离常数(KD)来定量。KD则可通过用表面等离子共振(SPR)法(Biacore)测量复合物形成和解离的动力学来确定。对应于单价复合物缔合和解离的速率常数分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过方程KD＝kd/ka与ka和kd相关。解离常数(Kd)的值可以通过熟知的方法直接测定并可采用例如Caceci等(1984,Byte 9:340-362)中所述的那些方法计算得出，甚至对复杂混合物亦是如此。例如，可采用例如Wong与Lohman(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5428-5432)记载的双滤膜硝酸纤维素滤膜结合检测来确定KD。评估配体对靶抗原结合能力的其他标准测定法是本领域公知的，包括例如ELISA、Western印迹、RIA和流式细胞分析，以及本文别处例举的其他检测方法。分子的结合动力学和结合亲和力还可以通过本领域所知的标准检测方法来评估，例如表面等离子共振(SPR)、例如采用使用BiacoreTM系统或KinExA。
可进行竞争性结合检测，其中，将分子与靶标的结合与靶标被该靶标另一配体(例如其他情形中会结合所述靶标的抗体或可溶性受体)的结合进行比较。发生50％抑制的浓度称为Ki。理想条件下，Ki等于KD。Ki值永远不会小于KD，所以Ki测定可方便地代为KD提供上限值。
按照以上定义，与不同分子相互作用关联的结合亲和力，例如不同分子对给定靶标结合亲和力的比较，可通过比较单个分子/靶标复合物的KD值来比较。可用本领域公知的方法来测定对结合伴侣的KD值。KD测定方法之一是采用表面等离子共振，通常采用生物感测系统例如
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系统进行。
类似地，可以通过对感兴趣相互作用(例如分子与靶标之间的特异性相互作用)的KD值和非感兴趣相互作用(例如已知不结合靶标的对照分子)的KD值进行测定和比较来评估相互作用的特异性。
如本文前文所述，特异性结合可参比该分子与非靶标对照分子的结合来评估。这一比较可通过比较该分子结合靶标的能力与结合对照分子的能力来进行。该比较可如同前文就KD或Ki评估所述进行。此类比较所用对照分子可以是除靶标之外的任何分子。优先地，对照分子与靶标不相同。优先地，对照分子不是靶标的片段。用来测定特异性结合的对照分子可以是在结构或功能上与靶标不相关的。例如，对照分子可以是无关物质或环境中的伴随物质。用来测定特异性结合的对照分子可以是与靶标即CD2参与同一体内通路的分子。通过确保本发明分子具有高于其他分子的CD2特异性可避免不想要的体内交叉反应性。
本发明分子可留有结合某些靶标相关分子的能力。
或者，本发明分子可具有对特定靶分子的特异性。例如，它可如本文所述结合一靶分子但如本文所述不结合或以显著低的亲和力结合另一不同的靶分子。例如，可将成熟人CD2用作靶标，但与该靶标结合的分子可能无法结合或以更低亲和力结合例如其他物种的其他CD2蛋白，例如其他哺乳动物CD2。一些实施方式中，所述分子既结合人CD2也结合猕猴CD2。
“融合”蛋白或“融合”分子是其中一第一多肽与一第二多肽操作性相连(例如直接或间接相连)的蛋白质。一些实施方式中，本文所述LFA3多肽分子是融合蛋白，其中包含与一第二多肽操作性相连的LFA3结构域。
“Fc融合”蛋白或“Fc融合”分子是其中一个或多个多肽与Fc多肽操作性相连(例如直接或间接相连)的蛋白质。Fc融合体包含带有融合伴侣的免疫球蛋白的Fc区。一些实施方式中，本文所述LFA3多肽分子是Fc融合蛋白，其中包含与Fc多肽操作性相连的LFA3结构域。
“原生序列Fc区”包含与天然Fc区氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含因至少一处氨基酸修饰而与原生序列Fc区的氨基酸序列不同，但保留原生Fc区的至少一项效应子功能的氨基酸序列。优选地，变体Fc区相比原生序列Fc区或相比亲本多肽的Fc区有至少一处氨基酸取代，例如原生序列Fc区或亲本多肽Fc区中约1至约10处氨基酸取代，和优选约1至约5处氨基酸取代。本文中的变体Fc区优选与原生序列Fc区和/或亲本多肽Fc区有至少约80％序列相同度，最好至少约90％序列相同度，至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列相同度更好。
如本领域所知，抗体“恒定区”指抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区，或单指或合称。
术语“IgG Fc区”、“Fc区”、“Fc结构域”和“Fc”在本文中互换使用，指与IgG分子经木瓜蛋白酶消化所得可结晶片段相关的IgG分子部分。本文中，这些术语涉及除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区，并且还涉及该区域的部分。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域N末端的柔性铰链，或它们的部分。IgA和IgM的Fc可包含J链。IgG的Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(C伽马2和C伽马3)以及Cγ1(C伽马1)与Cγ2(C伽马2)之间的铰链。尽管Fc区边界不确定，人IgG重链Fc区通常定义为包含残基C226或P230至其羧基末端，其中编号按照Edelman等的EU index，1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1):78-85，如Kabat等,1991中所述。通常，Fc结构域包含人IgG1恒定结构域的约氨基酸残基236至约447。SEQ ID NO:31为一示例性人野生型IgG1 Fc结构域氨基酸序列。Fc多肽可以指单独的该区域，或是抗体或其抗原结合部分或Fc融合蛋白中的该区域。
重链恒定结构域包含Fc区，还包含IgG重链的CH1结构域和铰链区以及CH2和CH3(以及，可选地，IgA和IgE的CH4)结构域。
“功能性Fc区”具有至少一项原生序列Fc区的效应子功能。“效应子功能”的例子包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调等。这些效应子功能通常需要Fc区与结合结构域联合，并可用本领域所知的用于评估这些效应子功能的各种检测方法来评估。
“原生序列Fc区”包含与天然Fc区氨基酸序列相同的氨基酸序列。原生序列人Fc区包括原生序列人IgG1 Fc区(非-A和A同种异型)；原生序列人IgG2 Fc区；原生序列人IgG3Fc区；和原生序列人IgG4 Fc区，以及它们的天然变体。
“变体Fc区”包含因至少一处氨基酸修饰而与原生序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
“Fc受体”或“FcR”表示与抗体Fc区结合的受体。一些实施方式中，FcγR是原生人FcR。一些实施方式中，FcR结合IgG抗体(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和不同的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，差异主要在胞质结构域内。激活受体FcγRIIA的胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB的胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见例如Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcRs的综述可见例如Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等，Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文术语“FcR”包括其他FcR，包括将来发现的那些。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体“FcRn”，其负责母体IgG向胎儿的传递(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等，J.Immunol.24:249(1994))以及免疫球蛋白的体内平衡调节。测定FcRn结合的方法是公知的(见例如Ghetie和Ward.，Immunol.Today18(12):592-598(1997)；Ghetie等，Nature Biotechnology，15(7):637-640(1997)；Hinton等，J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)，WO 2004/92219(Hinton等)。
“效应子功能”指抗体Fc区引起的生物活性，随抗体同种型而异。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调等；和B细胞活化。
“人类效应细胞”是表达一种或多种FcR并发挥效应子功能的白细胞。某些实施方式中，这些细胞至少表达FcγRIII并发挥ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。可自原生来源例如血液分离效应细胞。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指细胞毒性的一种形式，其中，某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上与Fc受体(FcR)结合的分泌Ig令这些细胞毒性效应细胞特异性结合带有抗原的靶细胞，随后以细胞毒素杀死靶细胞。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页表3。可进行体外ADCC检测来评估感兴趣分子的ADCC活性，例如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号或美国专利第6,737,056号(Presta)中所述。可用于此类检测的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者，或此外，可在动物模型中对感兴趣的分子进行ADCC活性体内评估，例如在如Clynes等.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中所述。Fc区氨基酸序列改变和ADCC活性升高或降低的其他抗体可见例如美国专利7,923,538和美国专利7,994,290。
具有“增强的ADCC活性”的分子(例如Fc融合体)指，检测中该分子与参比分子的用量基本相同时，体外或体内介导ADCC比参比分子更有效的分子，其中，该分子与参比分子至少存在一项结构差异。一些实施方式中，用本文所述的体外ADCC检测来测定ADCC活性，但用于测定ADCC活性的其他检测或方法也可使用，例如动物模型中的测定等。一些实施方式中，ADCC活性增强的分子具有增强的FcγRIIIA亲和力。一些实施方式中，ADCC活性增强的分子具有增强的FcγRIIIA(V158)亲和力。一些实施方式中，ADCC活性增强的分子具有增强的FcγRIIIA(F158)亲和力。
FcR结合亲和力或ADCC活性“改变”的分子(例如Fc融合体)是与参比分子相比具有增强或降低的FcR结合活性和/或ADCC活性的分子，其中，该分子与参比分子至少存在一项结构差异。对FcR“显示增强结合”的分子以高于参比分子的亲和力结合至少一FcR。对FcR“显示降低结合”的分子以低于参比分子的亲和力结合至少一FcR。显示FcR结合降低的分子可以与FcR极少或没有明显结合，例如与原生序列IgG Fc区相比，与FcR的结合为0-20％。
“增强的FcγRIIIA亲和力”指对FcγRIIIA(本文有时亦称CD 16a)的亲和力高于参比分子的分子(例如Fc融合体)，其中，该分子与参比分子至少存在一项结构差异。各种合适的FcγRIIIA亲和力测定方法均可使用。一些实施方式中，用本文中所述的方法来测定FcγRIIIA亲和力。一些实施方式中，FcγRIIIA亲和力增强的分子具有增强的ADCC活性。一些实施方式中，FcγRIIIA亲和力增强的分子具有增强的FcγRIIIA(V158)亲和力。一些实施方式中，FcγRIIIA亲和力增强的分子具有增强的FcγRIIIA(F158)亲和力。
L-岩藻糖(亦称6-脱氧-L-半乳糖)是一种单糖，它是动物中一些N-和O-连接聚糖和糖脂的组分。见Becker和Lowe,Glycobiology 13:41R-51R(2003)。岩藻糖通常加在聚糖上作为末端修饰，包括与血型抗原、选择素和抗体附接的聚糖。岩藻糖可由特定的岩藻糖基转移酶通过α(1,2)-、α(1,3)-、α(1,4)-和α(1,6)-连接与聚糖相接。α(1,2)-岩藻糖连接通常与H-血型抗原相关。α(1,3)-和α(1,4)-岩藻糖连接与LewisX抗原修饰相关。α(1,6)-岩藻糖连接与N-连接GlcNAc(例如抗体上那些)相关。
将参考用于寡糖描述的常用命名法来描述本发明的碳水化合物部分。采用这一命名法的碳水化合物化学综述可见Hubbard和Ivatt(1981)Ann.Rev.Biochem.50:555-583。该命名法包括例如：Man代表甘露糖；GIcNAc，代表2-N-乙酰氨基葡糖；Gal代表半乳糖；Fuc代表岩藻糖；Glc代表葡萄糖。唾液酸用以下缩写表述：NeuNAc表示5-N-乙酰神经氨酸，NeuNGc表示5-糖基神经氨酸(IUB-IUPAC联合生物化学命名委员会(IUB-IUPAC Joint Commissionon Biochemical Nomenclature)，1982，J.Biol.Chem.257：3347-3351；(1982)J.Biol.Chem.257：3352)。
本发明的碳水化合物结构出现在以N-连接寡糖描述的蛋白质上。“N-连接糖基化”指碳水化合物部分通过GlcNAc与多肽链中的天冬酰胺残基相接。N-连接碳水化合物都含有共同的Man 1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R核心结构。所以，在所述核心结构中，R代表产出糖蛋白的天冬酰胺残基。产出蛋白的序列含有天冬酰胺-X-丝氨酸，天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X是除脯氨酸之外的任意氨基酸(Asn-Xaa-Ser/Thr)。与之不同的是，“O-连接”碳水化合物的特征在于共同的核心结构是与苏氨酸或丝氨酸的羟基相接的GalNAc，但共有序列不是必需的。对N-连接碳水化合来说最重要的是“复合”N-连接碳水化合，例如本文中所述的“双触角”结构。
本领域技术人员会明白，糖蛋白免疫球蛋白G(IgG)与包含零个，一个或两个半乳糖残基的三种类型的复杂双触角结构相关联(Wormland等，1997,Biochemistry36:1370-1380)，分别称为G0、G1和G2。每个IgG类人抗体分子在Fc区的CH2结构域内表面β-4弯曲的Asn 297酰胺侧链上接有N-连接的寡糖(Beale和Feinstein，1976,Q.Rev.Biophys.9:253-259；Jefferis等，1995,Immunol.Letts.44:111-117)。IgG CH2结构域Asn 297处的该寡糖部分是复合双触角型的，具有明确的己糖核心结构和可变的外部糖残基(见Jefferis等，1997，同上；Wyss和Wagner,1996,Current Opinions in Biotech.7:409-416)。核心结构(GIcNAc2Man3GIcNAc)是双触角寡糖的典型特征，可见图1中的示意性表示。
由于每个核心结构可具有两分的N-乙酰氨基葡糖胺、核心岩藻糖和半乳糖或唾液酸外部糖，总共有36个结构独特的寡糖可占据Asn 297位点(Jefferis和Lund，同上)。可以看出，在具体的CH2结构域中，Asn297处的糖基化可能因双链Fc结构域内Asn 297残基上各自连接的寡糖链不同而不对称。例如，尽管单抗体分泌细胞内合成的重链在氨基酸序列上可能是均质的，但糖基化通常是差异性的，由此形成大量结构独特的Ig糖型。
IgG CH2域中复杂寡糖结构的主要类型(亦称“糖型”)可参见国际专利公开第WO99/22764号第7页的描述。
按照本发明，G0指没有末端唾液酸或Gal的双触角结构，G1指有一个Gal且没有NeuAcs的双触角结构，G2指有两个Gals且没有NeuAcs的双触角结构。见例如图2，显示了G0、G1、G-1和G2的示例性结构。
“去岩藻糖基化”的分子(例如Fc融合体)或“缺乏岩藻糖”的分子(例如Fc融合体)指在恒定区糖基化中缺乏岩藻糖的IgG1或IgG3同种型分子(例如Fc融合体)。人IgG1或IgG3的糖基化发生在Asn297处，其为末端有多达2个Gal残基的核心岩藻糖基化双触角复合寡糖糖基化。一些实施方式中，去岩藻糖基化的抗体在Asn297处没有岩藻糖。这些结构按照末端Gal残基的数量表示为G0、G1(a 1,6或a 1,3)或G2聚糖残基。见例如Raju,T.S.,BioProcessInt.1:44-53(2003)。抗体Fc的CHO型糖基化可见例如Routier,F.FL,GlycoconjugateJ.14:201-207(1997)的记载。
一些实施方式中，“岩藻糖基”或“去岩藻糖基化”(如本文中互换使用的那样)的分子(例如Fc融合体)是指经糖工程化而缺乏核心岩藻糖的分子(例如Fc融合体)。聚糖部分中岩藻糖含量降低的分子(例如Fc融合体)对FcγRIIIa(CD16)的亲和力提高，结果，具有增强的活性依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。可用
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CHOK1SV(隆萨生物(Lonza Biologics))细胞系来生产去岩藻糖基化分子(例如Fc融合体)，该细胞系缺乏负责添加岩藻糖(α1,6-岩藻糖基转移酶)的两个等位基因。还可以通过以各种方式调整寡糖的生物合成活性来产生去岩藻糖基化或减岩藻糖分子(例如Fc融合体)。例如，生产细胞系高尔基体中N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII)过表达产生与分子Fc恒定区结合的两分的寡糖结构并抑制岩藻糖基化。这样的表达系统中，GnTIII表达水平与去岩藻糖基化IgG1糖型的产生以及由此增强的ADCC活性相关。也可以用糖类似物(例如但不限于岩藻糖类似物)降低细胞培养中的岩藻糖基化，如WO 2012/019165中所述。因此，可用本领域公知的多种方法来产生去岩藻糖基化或减岩藻糖分子(例如Fc融合体)。
一些实施方式中，去岩藻糖基化分子(例如Fc融合体)具有增强的FcγRIIIA亲和力。一些实施方式中，去岩藻糖基化分子(例如Fc融合体)具有增强的FcγRIIIA(V158)亲和力。一些实施方式中，去岩藻糖基化分子(例如Fc融合体)具有增强的FcγRIIIA(F158)亲和力。
“糖型”指包含各种碳水化合物单元连接的复杂聚糖结构。此类结构的记载可见例如《糖生物学要点》(Essentials of Glycobiology)，Varki等编，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州纽约(1999)，其中还有标准糖生物学术语的综述。这些糖型包括但不限于G2、G1、G0、G-1和G-2(例如，见国际专利申请公开第WO 99/22764号)。
“糖基化样式”定义为共价连接蛋白质(例如糖型)的碳水化合物单元的样式以及糖型与蛋白质(更具体地说是免疫球蛋白)的肽骨架共价连接的位点。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指补体存在下的靶细胞裂解。经典补体途径的激活是自补体系统第一组分(C1q)与结合了对应抗原的抗体(相应亚类)结合开始的。评估补体活化可采用CDC检测，可见例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)。Fc区氨基酸序列改变和Clq结合活性升高或降低的抗体可见例如美国专利6,194,551Bl、美国专利7,923,538、美国专利7,994,290和WO 1999/51642。另可见例如Idusogie等，J.。
本文中，术语“野生型氨基酸”和“野生型序列”指某群体(例人、小鼠、大鼠、细胞等)中天然存在的氨基酸序列或核酸序列。
“淋巴细胞功能相关抗原3”或“LFA3”在本文中可互换使用，本领域中亦称“CD58”，是免疫球蛋白超家族的成员。术语LFA3包括LFA3同源物和直系同源物，包括人、猕猴、大鼠、兔和小鼠等。本文中，“LFA3”指哺乳动物LFA3，例如人、大鼠或小鼠、以及非人灵长类动物、牛、羊或猪的LFA3。LFA3的非限定性例子是人LFA3(见，例如UniProtKB登录号P19256，SEQID NO:2)。术语“LFA3”还包括这些LFA3分子的片段、变体、同种型(isoform)及其他同源物。变体LFA3分子的特征通常在于与天然LFA3具有同类活性，例如结合CD2的能力。
“LFA3结构域”指LFA3片段、或其变体。一些实施方式中，LFA3结构域的长度不超过100、110、120、130、140、150、160、170或180个氨基酸。一些实施方式中，LFA3结构域衍生自LFA3的第一胞外结构域。一些实施方式中，LFA3结构域与野生型LFA3序列相比包含不超过6、10、15、20或30处氨基酸突变(例如取代，添加或缺失)。
“CD2”，本领域亦称“红细胞受体”、“LFA-3受体”、“玫瑰红受体(rosettereceptor)”或“T细胞表面抗原T11/Leu-5”，是细胞(例如T细胞和NK细胞)上表达的分子。术语CD2包括CD2同源物和直系同源物，包括人、猕猴、大鼠、兔和小鼠等。本文中，“CD2”指哺乳动物CD2，例如人、大鼠或小鼠、以及非人灵长类动物、牛、羊或猪的CD2。CD2的非限定性例子是人CD2(见，例如UniProtKB登录号P06729，SEQ ID NO:121)。术语“CD2”还包括这些CD2分子的片段、变体、同种型(isoform)及其他同源物。变体CD2分子的特征通常在于与天然CD2具有同类活性。
KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLDIYLIIGICGGGSLLMVFVALLVFYITKRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSN(SEQ ID NO:121).
如本文别处所述，可对多肽分子的某些位置进行改变。本文中，“位置”表述蛋白质序列内的定位。可对位置依序编号，或按照既定的格式编号，例如可用EU索引和Kabat索引对抗体的氨基酸残基进行编号。
如同本领域所知，“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任意长度的核苷酸链，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰核苷酸或碱基、和/或它们的类似物，或是可由DNA或RNA聚合酶纳入链中的任何底物。多核苷酸可包括修饰核苷酸，如甲基化的核苷酸和其类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在链组装之前或之后添加。核苷酸序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸聚合后可被进一步修饰，如通过与标记组分偶联。其他类型的修饰包括，例如，“帽”，以类似物取代一个或多个天然核苷酸，核苷内修饰，例如，不带电连接(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和带电连接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)修饰，含侧接部分的修饰，例如，蛋白质(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)，嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)修饰，含螯合剂(如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)修饰，含烷基化剂的修饰，修饰连接(如α异头核酸等)修饰，以及多核苷酸的非修饰形式。此外，糖中常有的羟基中任一个都可以被例如膦酸酯基、磷酸基取代，被标准保护基保护，或者被活化以制备连到其他核苷酸的其他连接，或者可与固体支持物偶联。5′和3′末端OH可被1至20个碳原子的有机加帽基团或胺取代或磷酸化。其他羟基也可以衍生化为标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域所熟知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括例如2′-O-甲基，2′-O-烯丙基，2′-氟代-或2′-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-或β-异头糖，差向异构糖，如阿拉伯糖，木糖或来苏糖(lyxose)，吡喃糖，呋喃糖，七庚二糖，无环类似物和无碱基核苷类似物如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯连接可代之以其他连接基团。这些其他连接基团包括但不限于这样的实施方式，其中，磷酸根被P(O)S(“硫代根(thioate)”)、P(S)S(“二硫代根(dithioate)”)、“(O)NR2(“酰胺根(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“缩甲醛(formacetal)”)取代，其中各R或R′各自为H或取代的或非取代的获选性包含醚(-O-)键的烷基(1-20C)，芳基，烯基，环烷基，环烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中的连接不需要全部相同。前述描述适用于本文所提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
本文，术语“载体”指能够向宿主细胞递送且优选能够在宿主细胞中表达感兴趣的一种或多种基因或序列的构建体。载体的例子包括但不限于，病毒载体，裸DNA或RNA表达载体，质粒，粘粒或噬菌体载体，与阳离子凝聚剂联合的DNA或RNA表达载体，包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，如生产细胞。
“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是载体的接受者从而纳入多核苷酸嵌插。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，而所述后代可能由于自然、偶然或特意突变不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态上或在基因组DNA互补体上)。宿主细胞包括以本发明多核苷酸体内转染和/或转化的细胞。
宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。真核细胞的例子包括哺乳动物细胞，例如灵长类或非灵长类动物细胞；真菌细胞，例如酵母；植物细胞；以及昆虫细胞。
所有适宜细胞培养且容易表达蛋白质或多肽的宿主细胞都可用于本发明。某些实施方式中，宿主细胞的哺乳动物的。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，包括众多可向美国典型培养物保藏中心(ATCC)获取的固定化细胞系。哺乳动物细胞的非限定性例子包括但不限于：NS0细胞，HEK 293和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，以及它们的衍生物，例如293-6E和CHO DG44细胞，CHO DXB11，以及
Figure BDA0002804257820000641
CHOK1SV细胞(BioWa/Lonza，新泽西州阿伦代尔)。哺乳动物宿主细胞还包括但不限于人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)，小仓鼠肾(BHK，ATCC CCL 10)细胞，猴肾细胞(COS)和人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)。可用于本发明的哺乳动物细胞的其他非限定性例子包括人成视网膜细胞(
Figure BDA0002804257820000642
库赛尔(CruCell)，荷兰莱顿)；SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；为悬浮培养而亚克隆的人胚胎肾细胞系293(HEK293)或293细胞(Graham等，1977，J.Gen Virol.36:59)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.23:243-251)；猴肾细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；狗肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等，1982，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；人肝癌细胞系(Hep G2)；和各种骨髓瘤细胞系，包括但不限于BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NS0/1，ECACC No:85110503)，NS0细胞和Sp2/0细胞。
此外，本发明可采用任意数量的市售可得或非市售可得的表达多肽或蛋白质的细胞系。本领域技术人员会明白，不同的细胞系可能具有不同的营养需求和/或可能需要不同的培养条件以实现最佳生长和多肽或蛋白质表达，本领域技术人员能够根据需要来调节条件。
本发明包括本领域所知或本文所述用于生产目标蛋白的任何真核表达系统，例如昆虫细胞系统、酵母表达系统或哺乳动物细胞(例如但不限于CHO细胞)系统中的表达。
本文中，“表达调控序列”指指导核酸转录的核酸序列。表达调控序列可以是启动子(例如组成型或诱导型启动子)或增强子。表达调控序列与要转录的核酸序列操作性相连。
术语“前导肽”或“前导序列”或“前导信号序列”，在本文中可互换使用，指可能存在于核酸分子5'末端和/或多肽N-末端处或附近的任意核酸序列或由其编码的氨基酸序列，其存在时可介导多肽向目的细胞器转运，包括但不限于多肽从细胞中分泌。此类前导序列包括但不限于包含例如
ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTCTTTCTGGTGGCCACAGCTACCGGAGTGCATAGC(SEQ ID NO:42)和
ATGGTTGCTGGGAGCGACGCGGGGCGGGCCCTGGGGGTCCTCAGCGTGGTCTGCCTGCTGCACTGCTTTGGTTTCATCAGCTGT(SEQ ID NO:130)的核酸序列，以及由其编码的氨基酸序列，例如但不限于：mgwsciilflvatatgvhs(SEQ ID NO:15)和
mvagsdagralgvlsvvcllhcfgfisc(SEQ ID NO:129)。本发明包括能够引起多肽向靶细胞器(例如内质网)转运和/或从细胞中分泌的以上所述以及本领域所知或将会知道的其他前导信号(核酸序列和氨基酸序列)。通常，信号肽会从成熟多肽上去除。
本文中，“治疗(或处理或处置)”是用于获得有益效果或期望的临床效果的方法。就本发明而言，有益效果或期望的临床效果包括但不限于：存活率提高(死亡率降低)，对疾病的炎性反应降低，组织纤维化减少，疾病病变外观改善，病理性病变局限于病灶部位，疾病所致损伤程度降低，疾病持续时间缩短，和/或疾病相关症状数量、程度或持续时间缩减。该术语包括以本发明化合物或药剂给药来预防或延缓疾病的症状、并发症或生化指征的发作，减轻疾病、状况或紊乱的症状或阻断或抑制疾病、状况或紊乱的进一步发展。治疗(或处理或处置)可以是预防性的(为了阻止或延缓疾病的发作或阻止其临床或亚临床症状的显现)或是在疾病显现后对症状的治疗性抑制或缓解。
“缓解”表述与没有LFA3多肽分子给药相比减轻或改善一项或多项症状。“缓解”还包括缩短或减少症状持续时间。
本文中，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以达成任何一种或多种有益效果或期望效果的量。更具体地说，有效量预防、减轻或缓解疾病或感染的症状，和/或延长接受治疗对象的生存期。就预防性应用而言，有益或期望的效果包括消除或降低风险，降低严重性或延缓疾病的发作，包括疾病的生化、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病发展过程中出现的中间病理表型。就治疗性应用而言，有益或期望的效果包括临床效果，例如减轻或减少一种或多种疾病、紊乱或状况的症状，降低疾病治疗所需其他药物的剂量，增强其他药物的效果和/或延缓患者的疾病进展。有效量可一次或分多次给药。就本发明而言，药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接达成预防性或治疗性处置的量。就临床而言可以理解的是，药物、化合物或药物组合物的有效量是可以与其他种药物、化合物或药物组合物联用也可以不联用。因此，“有效量”可以是一种或多种治疗药给药情形下的“有效量”，并且，与一种或多种其他药剂联用的情形下，如果能够达到或达到了预期的效果，可以认为一种单独的药剂是按照有效量给药的。
“个体”或“对象”是哺乳动物，优选人。哺乳动物还包括但不限于农场动物(例如牛、猪、马、鸡等)，运动动物，宠物，灵长类动物，马，狗，猫，小鼠和大鼠。某些实施方式中，对象患有自身免疫性疾病、紊乱或状况，例如1型糖尿病或银屑病性关节炎。某些实施方式中，对象需要免疫抑制治疗。
本文中，“药学上可接受的运载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括所有与活性成分组合时使得活性成分保有生物活性并且与对象的免疫系统不反应的物质。例子包括但不限于所有标准药物运载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液，水，乳剂(例如油/水乳剂)和各种类型的润湿剂。气雾剂或肠胃外给药的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)或普通(0.9％)生理盐水。可用众所周知的常规方法配制包含运载体的组合物(例如可见《雷明顿药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版，A.Gennaro编，麦克出版公司(MackPublishing Co.)，宾夕法尼亚州伊斯顿，1990；《雷明顿：药学的科学和实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，麦克出版公司(Mack Publishing)，2000)。
本文描述了示例性的方法和材料，但是，与之类似或等同的方法和材料同样可用于本发明的实施或试验。所述材料、方法和实施例都仅是说明性的，不构成限制。
II.LFA3变体
本发明涉及LFA3变体，例如结合人CD2的人LFA3变体。一些实施方式中，LFA3变体具有一处或多处增强其稳定性和可制造性特征的突变。一些实施方式中，LFA3变体具有一处或多处提高其CD2结合亲和力的突变。一些实施方式中，LFA3变体(例如变体LFA3-Fc融合蛋白)具有一处或多处增强对CD2表达细胞细胞毒性的突变。一些实施方式中，LFA3变体(例如变体LFA3-Fc融合蛋白)具有一处或多处增强同种异体T细胞反应抑制的突变。一些实施方式中，LFA3变体具有一处或多处减缓分子体内清除的突变。野生型LFA3和LFA3变体(包括LFA3-Fc融合蛋白)的示例性序列见表2和表3。
其他实施方式中，当工程化Fc多肽包含C末端赖氨酸(K)残基(例如人IgG1重链包含末端赖氨酸)时，本领域技术人员知道，该赖氨酸残基可切除，由此得到没有C末端赖氨酸残基的融合蛋白。因此，一些实施方式中，包含工程化Fc多肽的Fc融合蛋白含有原有末端赖氨酸缺失的多肽。
表2.野生型LFA3和LFA3变体的示例性氨基酸序列。
Figure BDA0002804257820000671
Figure BDA0002804257820000681
Figure BDA0002804257820000691
Figure BDA0002804257820000701
Figure BDA0002804257820000711
Figure BDA0002804257820000721
Figure BDA0002804257820000731
Figure BDA0002804257820000741
Figure BDA0002804257820000751
Figure BDA0002804257820000761
Figure BDA0002804257820000771
Figure BDA0002804257820000781
表3.野生型LFA3和LFA3变体的示例性核苷酸序列。
Figure BDA0002804257820000782
Figure BDA0002804257820000791
Figure BDA0002804257820000801
Figure BDA0002804257820000811
Figure BDA0002804257820000821
Figure BDA0002804257820000831
Figure BDA0002804257820000841
Figure BDA0002804257820000851
M1d1 LFA3-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示。4个非原生氨基酸取代(A36V、L38F、F43V和M86F)以粗体和下划线标示。LFA3结构域的C末端残基(L93)以双下划线标示。4个预测N连接糖基化位点(N12、N66、N81和N170)以虚线下划线标示。
Figure BDA0002804257820000852
一方面，其他多肽分子包括一个或多个以下实施方式。
A1.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:70的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQID NO:3。
A2.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKX1VX2WX3KQX4X5X6VAX7LX8NSX9FX10AX11X12SFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX13NX14TX15TMKFFLYVX16，其中：
X1是D、E、N、K、Q或H，
X2是F、I、L、V、Nle、M或A，
X3是K、R、M、T、Q或N，
X4是K、R、M、T、Q或N，
X5是D、E、N、K、Q或H，
X6是K、R、M、T、Q或N，
X7是D、E、N、K、Q或H，
X8是D、E、N、K、Q或H，
X9是D、E、N、K、Q或H，
X10是K、R、M、T、Q或N，
X11是F、Y、L、H、I、N、V、D、A或Y，
X12是S、T、A或G，
X13是P、L、H、R或A，
X14是F、I、L、V、M、A或Nle，
X15是D、E、N、K、Q或H，且
X16为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:71)，
或SEQ ID NO:71的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A3.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKX1VX2WX3KQX4X5X6VAX7LX8NSX9FX10AX11X12SFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX13NX14TX15TMKFFLYVX16，其中：
X1是D、E、N、K、Q或H，
X2是F、I、L或V，
X3是K、R、M或T，
X4是K、R、M或T，
X5是D、E、N、K、Q或H，
X6是K、R、M或T，
X7是D、E、N、K、Q或H，
X8是D、E、N、K、Q或H，
X9是D、E、N、K、Q或H，
X10是K、R、M或T，
X11是F、Y、L、H、I、N、V或D，
X12是S、T、A或G，
X13是P、L、H或R，
X14是F、I、L或V，
X15是D、E、N、K、Q或H，且
X16为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:72)，
或SEQ ID NO:72的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A4.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域相对于SEQ ID NO:3具有按照SEQ ID NO:3编号位于残基25、27、29、32、33、34、37、39、42、44、46、47、80、82或84的一处或多处突变(例如取代、缺失或增加)，例如，所述LFA3结构域含有相比SEQ ID NO:3在残基25、27、29、32、33、34、37、39、42、44、46、47、80、82或84有一处或多处突变(例如取代、缺失或增加)的SEQ ID NO:3。
A5.A4所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.选自E25D、E25N、E25K、E25Q或E25H的取代，
ii.选自L27F、L27I、L27V、L27Nle、L27M或L27A的取代，
iii.选自K29R、K29M、K29T、K29Q或K29N的取代，
iv.选自K32R、K32M、K32T、K32Q或K32N的取代，
v.选自D33E、D33N、D33K、D33Q或D33H的取代，
vi.选自K34R、K34M、K34T、K34Q或K34N的取代，
vii.选自E37D、E37N、E37K、E37Q或E37H的取代，
viii.选自E39D、E39N、E39K、E39Q或E39H的取代，
ix.选自E42D、E42N、E42K、E42Q或E42H的取代，
x.选自R44K、R44M、R44T、R44Q或R44N的取代，
xi.选自F46Y、F46L、F46H、F46I、F46N、F46V、F46D、F46A或F46Y的取代，
xii.选自S47T、S47A或S47G的取代，
xiii.选自P80L、P80H、P80R或P80A的取代，
xiv.选自I82F、I82L、I82V、I82M、I82A或I82Nle的取代，或者
xv.选自D84E、D84N、D84K、D84Q或D84H的取代。
A6.A4所述的分离的多肽分子，其中，所述一处或多处突变包括一项或多项以下取代：
i.选自E25D、E25N、E25K、E25Q或E25H的取代，
ii.选自L27F、L27I或L27V的取代，
iii.选自K29R、K29M或K29T的取代，
iv.选自K32R、K32M或K32T的取代，
v.选自D33E、D33N、D33K、D33Q或D33H的取代，
vi.选自K34R、K34M或K34T的取代，
vii.选自E37D、E37N、E37K、E37Q或E37H的取代，
viii.选自E39D、E39N、E39K、E39Q或E39H的取代，
ix.选自E42D、E42N、E42K、E42Q或E42H的取代，
x.选自R44K、R44M或R44T的取代，
xi.选自F46Y、F46L、F46H、F46I、F46N、F46V或F46D的取代，
xii.选自S47T、S47A或S47G的取代，
xiii.选自P80L、P80H或P80R的取代，
xiv.选自I82F、I82L或I82V的取代，或者
xv.选自D84E、D84N、D84K、D84Q或D84H的取代。
A7.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7，其中：
X1是S、G、A、M或T，
X2是R、W、P或A，
X3是N、Y、S、E、D、Q、H、K或R
X4是P、G、I、L、V、M、A、F或Nle，
X5是Y、G、T或S，
X6是R、E、K、P、D或N，且
X7是R、D、S、Q、A、E、T或S(SEQ ID NO:84)，
或SEQ ID NO:84的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SPNITDT(SEQ ID NO:83)。
A8.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7，其中：
X1是S、G、A或M，
X2是R、W或P，
X3是N、Y、S、E或D，
X4是P、G或I，
X5是Y、G或T，
X6是R、E、K、P或D，且
X7是R、D、S、Q、A、E或T(SEQ ID NO:85)，
或SEQ ID NO:85的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A9.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7，其中：
X1是S、G、A或M，
X2是R或W，
X3是N、Y、S、E或D，
X4是P或G，
X5是Y或G，
X6是R、E、K或P，且
X7是R、D、S、Q、A或E(SEQ ID NO:86)，
或SEQ ID NO:86的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A10.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7，其中：
X1是S、G、A或M，
X2是R或W，
X3是N、Y、S、E或D，
X4是P或G，
X5是Y或G，
X6是R、E、K或P，且
X7是R、D、S、Q、A或E(SEQ ID NO:86)。
A11.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：SX1NX2X3X4X5，其中：
X1是R、W、P或A，
X2是P、G、I、L、V、M、A、F或Nle，
X3是Y、G、T或S，
X4是R、P、D或N，且
X5是R、D、T或S(SEQ ID NO:87)，
或SEQ ID NO:87的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A12.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：SX1NX2X3X4X5，其中：
X1是R、W或P，
X2是P、G或I，
X3是Y、G或T，
X4是R、P或D，且
X5是R、D或T(SEQ ID NO:88)，
或SEQ ID NO:88的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A13.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：SX1NX2X3X4X5，其中：
X1是R或W，
X2是P或G，
X3是Y或G，
X4是R或P，且
X5是R或D(SEQ ID NO:89)，
或SEQ ID NO:89的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A14.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：SX1NX2X3X4X5，其中：
X1是R或W，
X2是P或G，
X3是Y或G，
X4是R或P，且
X5是R或D(SEQ ID NO:89)。
A15.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7，其中：
X1是S、G、A、M或T，
X2是R、W、P或A，
X3是N、Y、S、E、D、Q、H、K或R
X4是P、G、I、L、V、M、A、F或Nle，
X5是Y、G、T或S，
X6是R、E、K、P、D或N，且
X7是D、S、Q、A、E、T或S(SEQ ID NO:90)，
或SEQ ID NO:90的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A16.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7，其中：
X1是S、G、A或M，
X2是R、W或P，
X3是N、Y、S、E或D，
X4是P、G或I，
X5是Y、G或T，
X6是R、E、K、P或D，且
X7是D、S、Q、A、E或T(SEQ ID NO:91)，
或SEQ ID NO:91的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A17.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7，其中：
X1是S、G、A或M，
X2是R或W，
X3是N、Y、S、E或D，
X4是P或G，
X5是Y或G，
X6是R、E、K或P，且
X7是D、S、Q、A或E(SEQ ID NO:92)，
或SEQ ID NO:92的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A18.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7，其中：
X1是S、G、A或M，
X2是R或W，
X3是N、Y、S、E或D，
X4是P或G，
X5是Y或G，
X6是R、E、K或P，且
X7是D、S、Q、A或E(SEQ ID NO:92)。
A19.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5EX6X7X8X9X10X11X12X13KFFLYVX14，其中：
X1是V、L或A，
X2是F或，
X3是V、I、L或F，
X4是A、V或S，
X5是M、F、I或L，
X6是S、G、A或M，
X7是R或W，
X8是N、Y、S、E或D，
X9是P或G，
X10是Y或G，
X11是R、E、K或P，
X12是R、D、S、Q、A或E，
X13是F、M、I或L，且
X14为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:93)，
或SEQ ID NO:93的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A20.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5EX6X7X8X9X10X11X12X13KFFLYVX14，其中：
X1是V、L或A，
X2是F或L，
X3是V、I、L或F，
X4是A、V或S，
X5是M、F、I或L，
X6是S、G、A或M，,
X7是R或W，
X8是N、Y、S、E或D，
X9是P或G，
X10是Y或G，
X11是R、E、K或P，
X12是R、D、S、Q、A或E，
X13是F、M、I或L，且
X14为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:93)。
A21.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5EX6X7X8X9X10X11X12X13KFFLYVX14，其中：
X1是V或A，
X2是F或L，
X3是V、I或F，
X4是A或V，
X5是M或F，
X6是S、G、A或M，
X7是R或W，
X8是N、Y、S、E或D，
X9是P或G，
X10是Y或G，
X11是R、E、K或P，
X12是R、D、S、Q、A或E，
X13是F或M，且
X14为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:94)，
或SEQ ID NO:94的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A22.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5EX6X7X8X9X10X11X12X13KFFLYVX14，其中：
X1是V或A,
X2是F或L,
X3是V、I或F，
X4是A或V，
X5是M或F，
X6是S、G、A或M，
X7是R或W，
X8是N、Y、S、E或D，
X9是P或G，
X10是Y或G，
X11是R、E、K或P，
X12是R、D、S、Q、A或E，
X13是F或M，且
X14为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:94)。
A23.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:95的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQID NO:3。
A24.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10，其中：
X1是A、V、L或I，
X2是M、F、L或I，
X3是S、G、A、M或T，
X4是R、W、P或A，
X5是N、Y、S、E、D、Q、H、K或R，
X6是P、G、I、L、V、M、A、F或Nle，
X7是Y、G、T或S，
X8是R、E、K、P、D或N，
X9是R、D、S、Q、A、E、T或S
X10为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:96)，
或SEQ ID NO:96的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A25.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10，其中：
X1是A或V，
X2是M或F，
X3是S、G、A或M，
X4是R、W或P，
X5是N、Y、S、E或D，
X6是P、G或I，
X7是Y、G或T，
X8是R、E、K、P或D，
X9是R、D、S、Q、A、E或T，且
X10为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:97)，
或SEQ ID NO:97的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A26.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10，其中：
X1是A或V，
X2是M或F，
X3是S、G、A或M，
X4是R或W，
X5是N、Y、S、E或D，
X6是P或G，
X7是Y或G，
X8是R、E、K或P，
X9是R、D、S、Q、A或E，且
X10为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:98)，
或SEQ ID NO:98的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A27.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10，其中：
X1是A或V，
X2是M或F，
X3是S、G、A或M，
X4是R或W，
X5是N、Y、S、E或D，
X6是P或G，
X7是Y或G，
X8是R、E、K或P，
X9是R、D、S、Q、A或E，且
X10为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:98)。
A28.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRAFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5FKFFLYVX6，其中：
X1是任意氨基酸，
X2是任意氨基酸，
X3是任意氨基酸，
X4是任意氨基酸，
X5是任意氨基酸，且
X6为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:99)，
或SEQ ID NO:99的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A29.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRAFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5FKFFLYVX6，其中：
X1是R、W、P或A，
X2是P、G、I、L、V、M、A、F或Nle，
X3是Y、G、T或S，
X4是R、P、D或N，
X5是R、D、T或S，且
X6为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:100)，
或SEQ ID NO:100的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A30.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRAFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5FKFFLYVX6，其中：
X1是R、W或P，
X2是P、G或I，
X3是Y、G或T，
X4是R、P或D，
X5是R、D或T，且
X6为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:101)，
或SEQ ID NO:101的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A31.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRAFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5FKFFLYVX6，其中：
X1是R或W，
X2是P或G，
X3是Y或G，
X4是R或P，
X5是R或D，且
X6为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:102)，
或SEQ ID NO:102的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A32.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRAFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5FKFFLYVX6，其中：
X1是R或W，
X2是P或G，
X3是Y或G，
X4是R或P，
X5是R或D，且
X6为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:102)。
A33.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10，其中：
X1是A、V、L或I，
X2是M、F、L或I，
X3是S、G、A、M或T，
X4是R、W、P或A，
X5是N、Y、S、E、D、Q、H、K或R，
X6是P、G、I、L、V、M、A、F或Nle，
X7是Y、G、T或S，
X8是R、E、K、P、D或N，
X9是D、S、Q、A、E、T或S，且
X10为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:103)，
或SEQ ID NO:103的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A34.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10，其中：
X1是A或V，
X2是M或F，
X3是S、G、A或M，
X4是R、W或P，
X5是N、Y、S、E或D，
X6是P、G或I，
X7是Y、G或T，
X8是R、E、K、P或D，
X9是D、S、Q、A、E或T，且
X10为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:104)，
或SEQ ID NO:104的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A35.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10，其中：
X1是A或V，
X2是M或F，
X3是S、G、A或M，
X4是R或W，
X5是N、Y、S、E或D，
X6是P或G，
X7是Y或G，
X8是R、E、K或P，
X9是D、S、Q、A或E，且
X10为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:105)，
或SEQ ID NO:104的功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
A36.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列：
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10，其中：
X1是A或V，
X2是M或F，
X3是S、G、A或M，
X4是R或W，
X5是N、Y、S、E或D，
X6是P或G，
X7是Y或G，
X8是R、E、K或P，
X9是D、S、Q、A或E，且
X10为缺失、L或LESLPS(SEQ ID NO:105)。
A37.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含选自SEQ ID NO:106-117的氨基酸序列或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQID NO:83。
A38.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:106或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A39.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:106。
A40.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:107或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A41.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:107。
A42.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:108或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A43.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:108。
A44.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:109或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A45.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:109。
A46.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:110或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A47.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:110。
A48.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:111或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A49.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:111。
A50.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:112或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A51.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:112。
A52.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:113或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A53.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:113。
A54.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:114或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A55.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:114。
A56.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:115或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A57.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:115。
A58.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:116或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A59.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:116。
A60.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:117或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A61.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:117。
A62.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含选自SEQ ID NO:30-41的氨基酸序列或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQID NO:3。
A63.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:30或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A64.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:30。
A65.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:31或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A66.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:31。
A67.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:32或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A68.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:32。
A69.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:33或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A70.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:33。
A71.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:34或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A72.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:34。
A73.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:35或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A74.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:35。
A75.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:36或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A76.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:36。
A77.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:37或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A78.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:37。
A79.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:38或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A80.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:38。
A81.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:39或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A82.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:39。
A83.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:40或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A84.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:40。
A85.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:41或其功能性变体(例如与之有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的序列)，所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:83。
A86.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子含有LFA3结构域，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:41。
A87.特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域，所述LFA3结构域相对于SEQ ID NO:3具有按照SEQ ID NO:3编号位于残基79、80、81、82、83、84或85的一处或多处突变(例如取代、缺失或增加)，例如，所述LFA3结构域含有相比SEQ ID NO:3在按照SEQ ID NO:3编号的残基79、80、81、82、83、84或85有一处或多处突变(例如取代、缺失或增加)的SEQ ID NO:3。
一些实施方式中，本发明的LFA3多肽分子包含LFA3结构域，其中LFA3结构域是任何本文公开的LFA3变体序列(例如任何表2公开的LFA3变体序列)。一些实施方式中，LFA3结构域的长度不超过100、110、120、130、140、150、160、170或180个氨基酸。一些实施方式中，LFA3结构域的长度为92个氨基酸。一些实施方式中，LFA3结构域的长度为93个氨基酸。一些实施方式中，LFA3结构域的长度为98个氨基酸。一些实施方式中，LFA3结构域衍生自LFA3的第一胞外结构域。一些实施方式中，LFA3结构域与野生型LFA3序列相比包含不超过6、10、15、20或30处氨基酸突变(例如取代，添加或缺失)。一些实施方式中，LFA3结构域与野生型LFA3序列相比有5处氨基酸取代。
本发明的LFA3多肽分子可用任意本领域所知的方法来制造。生产重组蛋白的通用技术是本领域所知的和/或记载于本文中。
在初步鉴定之后，候选LFA3多肽分子的活性可进一步通过已知用于测试目标生物活性的生物检测来确认和细化。一些实施方式中，用体外(in vitro)细胞试验来进一步表征候选LFA3多肽分子。例如，可用生物检测直接筛选候选分子。鉴定和表征LFA3多肽分子的一些方法在实施例中有详细描述。
某些实施方式中，本文所述的LFA3多肽分子包含Fc结构域。Fc结构域可衍生自IgA(如IgA1或IgA2)、IgG、IgE或IgG(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。一些实施方式中，Fc结构域是IgG1的Fc结构域。一些实施方式中，IgG1 Fc结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16。
一方面，本发明记载了具有一项或多项以下特征的LFA3多肽分子(例如变体LFA3融合多肽分子)：(a)相比野生型LFA3序列增强的单体表达，(b)相比野生型LFA3序列降低的多聚体表达，(c)相比野生型LFA3序列降低的热应激聚集倾向，(d)相比野生型LFA3序列降低的低pH聚集倾向，(e)相比野生型LFA3序列提高的冻融稳定性，(f)相比野生型LFA3序列提高的产率，(g)相比野生型LFA3序列提高的解链温度(Tm)。
一些实施方式中，例如用尺寸排阻色谱(SEC)和/或实施例1中就图3A所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)显示单体百分比高于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。一些实施方式中，例如用SEC和/或实施例1中就图6C所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)显示单体百分比高于约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，低分子量物质(LMWS)百分比低于约10％、8％、6％、4％或2％，和/或高分子量物质(HMWS)百分比低于约5％、2％或1％。
一些实施方式中，例如用SEC和/或实施例1中就图3D所述的方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)显示37.4℃孵育24小时后单体百分比高于约90％、92％或95％，和/或40℃孵育24小时后单体百分比高于约75％、80％或85％。一些实施方式中，例如用SEC和/或实施例1中就表4所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)显示40℃时的HMWS增加不超过约5％、10％、15％或20％和/或50℃时的HMWS增加不超过约5％、10％、15％、20％或25％。
一些实施方式中，例如用SEC和/或实施例1中就表4所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)显示低pH下5小时的HMWS增加不超过约6％、7％、8％或9％。
一些实施方式中，例如用SEC和/或实施例1中就表4所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)显示5轮冻融循环后的HMWS增加不超过约0.5％、1％或1.5％。
一些实施方式中，例如用毛细管凝胶电泳(CGE)、尺寸排阻高效液相色谱(SE_HPLC)和/或实施例3中就图30A-30C和/或图31A-31D所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)显示40℃存放2或4周后HMMS增加不超过约0.5％、1％、1.5％或2％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。
一些实施方式中，例如用实施例3中就图32A-32D所述的SE-HPLC方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)显示25℃存放2、4或6周后HMMS增加不超过约0.5％、1％、1.5％或2％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％。
一些实施方式中，例如用实施例3中就图33A-33D所述的SE-HPLC方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)显示5℃存放2、4或6周后HMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％。
一些实施方式中，例如用实施例1中就图3B所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)的产率高于每20mL Expi293培养物约5.5、6、6.5或7mg。
一些实施方式中，例如用差示扫描荧光测定法(DSF)和/或实施例1中就图3C所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)的Tm高于约38、40、42或45℃。一些实施方式中，例如用DSF和/或实施例1中就图5B所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)的Tm高于约40、45、50、55或60℃。一些实施方式中，例如用DSF和/或实施例1中就图6D所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)的Tm高于约40、45或50℃。一些实施方式中，例如用DSF和/或实施例1中就图7D所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)的Tm高于约45、50或55℃。一些实施方式中，例如用差示扫描量热法(DSC)和/或实施例1中就表4所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)的Tm高于约50或60℃。
一些实施方式中，例如用DSC和/或实施例4中就表13所述方法测定，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)pH 7.5时Tm1高于约55、58、60、62、64或66℃且Tm2高于约75、78、80或82℃；pH 5.8时Tm1高于约55、58、60、62或64℃且Tm2高于约75、78、80或82℃；或pH 4.5时Tm1高于约55、58或60℃且Tm2高于约75、78或80℃。
一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如用DSC和/或实施例4中就表14所述方法测定，pH 7.5或pH 4.5的Tm高于约50或60℃；pH 5.8的Tm高于约50或62℃。
一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)的LFA3结构域具有相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，例如用DSC和FabRICATORIdeS和/或实施例4中就表15所述方法测定，Tm高于约50或60℃。
本发明记载了结合CD2并介导至少一项选自以下所述可检测活性的LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)：(a)结合CD2+细胞，例如CD2-表达性CD4 Tmem细胞或CD2-表达性CD8 Tmem细胞，(b)降低CD2与天然LFA3之间的相互作用，(c)例如在NK细胞存在下介导对CD2-表达性细胞(例如CD2-表达性CD4 Tmem细胞或CD2-表达性CD8 Tmem细胞)的细胞毒性，(d)减少CD4+和/或CD8+ TEM细胞，(e)提高例如CD4+和/或CD8+ T细胞中的Treg/TEM比，(f)提高例如CD4+和/或CD8+ T细胞中的Treg/TCM比，(g)抑制同种异体T细胞反应(例如T细胞增殖和/或细胞因子产生)，和(h)抑制破伤风类毒素回忆反应。Tmem细胞包括，例如，中央记忆(TCM)和效应记忆(TEM)T细胞。
一方面，本发明包括以高表观亲和力结合表达人或猕猴CD2的细胞但不结合表达啮齿动物CD2的细胞的LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)。表观亲和力结合可用流式细胞术检测与表达靶蛋白(如CD2)的细胞的结合来评估。细胞可用编码CD2的核酸瞬时或稳定转染。或者，细胞可以是在其表面天然表达CD2的细胞。不论CD2+细胞是何来源，可用众多本领域所知的方法方便地评估LFA3多肽分子与所述细胞的结合。LFA3多肽分子结合人或猕猴CD2，但与啮齿动物CD2无可测结合或结合程度低得多。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以低于1.3、1.2、1.1或1μM的亲和力(例如用实施例中所述SPR测定)结合重组人CD2。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约1.08μM的亲和力结合重组人CD2。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以低于1.4、1.3、1.2、1.1或1μM的亲和力(例如用实施例中所述SPR测定)结合重组猕猴CD2。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约1.06μM的亲和力结合重组猕猴CD2。
一方面，LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于100、200、300或400pM的Kd结合CD2-表达细胞(如CD4 Tmem细胞)。一些实施方式中，LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约94pM的Kd结合CD2-表达细胞(如CD4 Tmem细胞)。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约300、400、500、500、700、800、1000、1200或1500pM的算得IC50结合CD4记忆T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约1.18E-10M的算得IC50结合CD4记忆T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约307pM的平均算得IC50结合CD4记忆T细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约150、300、400、500、600、700、800、1000或1200pM的算得IC50结合CD4+ TEM细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约150pM的算得IC50结合CD4+ TEM细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约100、200、300、400、500、600、700或800pM的算得IC50结合CD4+ TCM细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约110pM的算得IC50结合CD4+ TCM细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约200、300、400、500、600、700、800、1000或1200pM的算得IC50结合CD4初始T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约1.44E-10M的算得IC50结合CD4初始T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约180pM的平均算得IC50结合CD4初始T细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约100、200、300、400或500pM的算得IC50结合扩增CD4 Treg细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约8.54E-11M的算得IC50结合扩增CD4 Treg细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约90pM的算得IC50结合扩增CD4 Treg细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约100、200、300、400、500或600pM的算得IC50结合CD8记忆T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约120pM的算得IC50结合CD8记忆T细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约300、400、500、600、700、800、1000、1200、1500、1600或1700pM的算得IC50结合CD8初始T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约9.49E-11M的算得IC50结合CD8初始T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约300pM的平均算得IC50结合CD8初始T细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约100、200、300、400或500pM的算得Kd结合CD4记忆T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约67pM的算得Kd结合CD4记忆T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约94pM的平均算得Kd结合CD4记忆T细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约100、200、300、400、500或600pM的算得Kd结合CD4+ TEM细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约79pM的算得Kd结合CD4+ TEM细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约100、200、300、400或500pM的算得Kd结合CD4+ TCM细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约64pM的算得Kd结合CD4+ TCM细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约100、200、300或400pM的算得Kd结合CD4初始T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约61pM的算得Kd结合CD4初始T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约54pM的平均算得Kd结合CD4初始T细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约100、200或300pM的算得Kd结合扩增CD4 Treg细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约58pM的算得Kd结合扩增CD4 Treg细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约50、100或150pM的算得Kd结合扩增CD8记忆T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约31pM的算得Kd结合CD8记忆T细胞。
一方面，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以不高于约50、100、200、300、400或500pM的算得Kd结合CD8初始T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约30pM的算得Kd结合CD8初始T细胞。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约98pM的算得Kd结合CD8初始T细胞。
一方面，本发明提供以不高于约400、600、800、1000、1200、1400或1500pM的EC50介导对CD2-表达细胞(如CD4 Tmem细胞)的细胞毒性的LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约348pM的EC50介导对CD2-表达细胞(如CD4 Tmem细胞)的细胞毒性。
一方面，本发明提供以不高于约1、5、10、20、30、40或50nM的EC50介导对CD2-表达细胞(如CD8 Tmem细胞)的细胞毒性的LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约0.716nM的EC50介导对CD2-表达细胞(如CD8 Tmem细胞)的细胞毒性。
一方面，本发明提供以不高于约1200、1500、1800、2000、2500、3000、3500、4000pM的EC50介导对CD2-表达细胞(如CD4 T非mem细胞)的细胞毒性的LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约1256pM的EC50介导对CD2-表达细胞(如CD4 T非mem细胞)的细胞毒性。
一方面，本发明提供以不高于约1、5、10、20、30、40或50nM的EC50介导对CD2-表达细胞(如CD8 T非mem细胞)的细胞毒性的LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)以约0.787nM的EC50介导对CD2-表达细胞(如CD8 T非mem细胞)的细胞毒性。
本发明包括结合CD2并抑制免疫反应(例如T细胞介导的免疫反应)的LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)。本领域有许多测定免疫反应(例如T细胞介导的免疫反应)抑制的检测。此类检测之一是实施例中所述的混合淋巴细胞反应(MLR)检测。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)能够以不高于约400、800、1200、1600、2000或2400pM的IC50抑制同种异体反应。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)能够以约302pM的IC50抑制同种异体反应。另一种检测是实施例中所述的破伤风类毒素回忆反应检测。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)能够以不高于约5、10、15、20或25nM的IC50抑制破伤风类毒素回忆反应中CD4记忆T细胞的IFNγ产生。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)能够以约1.342nM的IC50抑制破伤风类毒素回忆反应中CD4记忆T细胞的IFNγ产生。
一方面本发明提供用例如实施例2中就表11所述方法测得的中心清除率不超过0.14、0.16、0.18、0.2或0.22mL/hr/kg的LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)。一些实施方式中，LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)的中心清除率为约0.11mL/hr/kg。
一方面，本发明提供相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子纯度增强的LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)，例如毛细管凝胶电泳测定的纯度至少约98％或99％。一些实施方式中，LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)约99％纯。
一方面，本发明提供相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子唾液酸修饰降低的LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)，例如用毛细管凝胶电泳测定不超过约20、18、16、14、12、10、9、8或7nmol唾液酸/nmol多肽的纯度。一些实施方式中，LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)含有约14nmol唾液酸/nmol多肽。一些实施方式中，LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)含有约9nmol唾液酸/nmol多肽。
本发明包括表现出至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多项例如全部以上所述生物活性的LFA3多肽分子(如变体LFA3融合多肽分子)。
III.LFA3多肽分子的表达和生产
编码LFA3多肽分子的核酸
本发明还提供编码本文所述任一多肽分子的多核苷酸。本发明还提供制造本文所述任一多核苷酸的方法。多核苷酸可用本领域所知的方法来制造和表达。
所需多肽分子、编码这些多肽分子的核酸、或其部分的序列可用标准测序技术来确定。可将编码所需多肽分子的核酸序列插入各种载体(例如克隆载体和表达载体)用于重组生产和表征。
一方面，本发明提供编码任意以下所述多肽的多核苷酸：人LFA3同种型1、人LFA3同种型1结构域1、LFA3-Fc WT、LFA3-Pfe WT、人IgG2 Fc、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、d1、d3、M1d1、M1d3、M4d1、M7d1、CM1d1、CM2d1、CM3d1、CM4d1、CM5d1、CM6d1、ML1d1、ML2d1、ML3d1、ML4d1、ML5d1、ML6d1和LFA3-Fc M1d1。一些实施方式中，编码上述氨基酸序列的多核苷酸编码与本文所述多肽分子的氨基酸序列有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同度、更好的是完全相同的氨基酸序列。
本发明提供编码一种或多种包含选自SEQ ID NO:15-41、69、120和128的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。一些实施方式中，编码氨基酸序列的多核苷酸编码与氨基酸序列SEQ ID NO:26或SEQ ID No:16和69有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同度、更好的是完全相同的氨基酸序列。
本发明提供包含选自SEQ ID NO:42-68和122-127的核酸序列的多核苷酸。本发明提供包含SEQ ID NO:44中所示核酸序列的多核苷酸。本发明提供包含SEQ ID NO:53中所示核酸序列的多核苷酸。本发明提供包含SEQ ID NO:122中所示核酸序列的多核苷酸。本发明提供包含SEQ ID NO:123中所示核酸序列的多核苷酸。本发明提供包含SEQ ID NO:43中所示核酸序列的多核苷酸。本发明提供包含SEQ ID NO:43和53中所示核酸序列的多核苷酸。
本发明提供包含一个或多个选自SEQ ID NO:42-68和122-127的核酸分子的细胞。本发明提供包含多核苷酸的细胞，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:44中所示的核酸序列。本发明提供包含多核苷酸的细胞，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:53中所示的核酸序列。本发明提供包含多核苷酸的细胞，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:122中所示的核酸序列。本发明提供包含多核苷酸的细胞，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:123中所示的核酸序列。本发明提供包含多核苷酸的细胞，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:43中所示的核酸序列。本发明提供包含多核苷酸的细胞，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:43和53中所示的核酸序列。
另一方面，本发明提供编码LFA3多肽分子的多核苷酸及其变体，其中，所述变体多核苷酸与本文所述具体核酸序列中任一项具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同度。另一方面，本发明提供编码LFA3多肽分子的多核苷酸及其变体，其中，所述变体多核苷酸与SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:43和53具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同度。这些量值没有限定意义，所列百分比之间的递进值也视为本具体公开的内容。
本发明提供由本文所述核酸分子编码的多肽。
与任意此类序列互补的多核苷酸也是本文公开的内容。多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链的，可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子和mRNA分子，HnRNA分子含有内含子且与DNA分子一一对应，mRNA分子不含内含子。其他编码或非编码序列可以但非必须存在于本文所述的多核苷酸内，并且，多核苷酸可以但非必需连接其他分子和/或支持材料。
多核苷酸可包含原生序列(即编码多肽分子的内源序列)或其变体。多核苷酸变体包含一处或多处取代、添加、缺失和/或插入以使编码的多肽免疫反应性不低于原生免疫反应性分子。对所编码多肽免疫反应性的影响一般可如本文所述来评估。一些实施方式中，变体与编码原生多肽分子的多核苷酸序列有至少约70％相同度，一些实施方式中有至少约80％相同度，一些实施方式中有至少约90％相同度，一些实施方式中有至少约95％相同度。这些量值没有限定意义，所列百分比之间的递进值也视为本具体公开的内容。
如后文所述按照最大对应性排列比对时两条序列中的核苷酸序列或氨基酸序列相同，则称这两条多核苷酸序列或多肽序列“相同”。两序列之间的比较通常通过在比较窗口中对序列进行比较以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域来进行。本文中，“比较窗口”指至少约20个(通常约30至约75个、或约40至约50个)连续位置的节段，在其中，一序列与相同数量连续位置的参比序列经最优排比后与该参比序列进行比较。
为了序列比较的最优排比可用生物信息学软件
Figure BDA0002804257820001171
套件(
Figure BDA0002804257820001172
公司，威斯康星州麦迪逊)中的
Figure BDA0002804257820001173
程序用默认参数进行。该程序允许数个以下参考文献中所述的几种排比方案：Dayhoff,M.O.,1978，蛋白质进化演变模型-用于检测远距离关系的矩阵(A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detectingdistant relationships)。参见Dayhoff,M.O.(编)，蛋白质序列和结构图册(Atlas ofProtein Sequenceand Structure),国家生物医学研究基金会，华盛顿DC，卷5，增刊3，第345-358页；Hein J.,1990，比对的统一方法和系统发育(Unified Approach to Alignmentand Phylogenes)，第626-645页，Methods in Enzymology，卷183，学术出版公司(AcademicPress,Inc.)，加利福尼亚圣地亚哥；Higgins,D.G.和Sharp，P.M.，1989，CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.，1988，CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.，1971，Comb.Theor.，11:105；Santou,N.，Nes,M.，1987，Mol.Biol.Evol.，4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.，1973，数值分类学，数值分类学原理与实践(Numerical Taxonomy the Principlesand Practice of Numerical Taxonomy)，弗里曼出版社(Freeman Press)，加利福尼亚州旧金山；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80:726-730。
一些实施方式中，“序列相同度百分比”通过两条最优排比的序列在至少20个位置的比较窗口中进行比较来确定，其中，就两序列的最优排比而言，多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分相比参比序列(不含添加或缺失)可包含20％或更少(通常5％至15％或10％至12％)的添加或缺失(空位)。该百分比如下计算：测定两序列中核酸碱基或氨基酸残基相同位置的数目得出匹配位数，将匹配位数除以参比序列中的总位数(即窗口大小)再乘以100得出序列相同度百分比。
另外或是或者，变体可以与原生基因或其部分或其互补体基本同源。此类多核苷酸变体能够在中度严谨条件下与编码原生多肽分子的天然DNA序列杂交。
合适的“中度严谨条件”包括5X SSC,0.5％SDS,1.0mM EDTA(pH 8.0)溶液中预洗；50℃-65℃,5X SSC杂交过夜；然后两次65℃、20分钟清洗，分别采用2X、0.5X和0.2X含0.1％SDS的SSC。
本文中，“高度严谨条件”或“高严谨性条件”如下所述：(1)采用低离子强度和高温进行清洗，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠和50℃；(2)杂交期间采用变性剂，例如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠、pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液，42℃；或者(3)42℃，采用50％甲酰胺、5X SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5X Denhardt溶液、经超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃于0.2X SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中清洗并55℃于50％甲酰胺中清洗，然后在55℃用0.1X含EDTA的SSC进行高严谨性清洗。本领域技术人员知道如何根据探针长度等因素按需调整温度、离子强度等等。
本领域技术人员将会明白，由于遗传密码的简并性，存在许多编码本文所述多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中有些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。尽管如此，本文特别包括由于密码子使用差异而不同的多核苷酸。并且，包含本文中多核苷酸序列的基因的等位基因属于本文公开范围之内。等位基因是因一处或多处突变(例如核苷酸缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。所得mRNA和蛋白质可以但非必需具有被改变的结构或功能。等位基因可以用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定。
本文所述多核苷酸可用化学合成、重组法或PCR来获取。化学多核苷酸合成法是本领域熟知的，本文无需赘述。本领域技术人员能够用本文所述的序列和商品化DNA合成仪来生产需要的DNA序列。
为了用重组法制备多核苷酸，可将包含所需序列的多核苷酸插入合适的载体，然后可将该载体导入合适的宿主细胞进行复制和扩增，如后文所述。可用任意本领域所知的方法将多核苷酸引入宿主细胞。通过直接摄取、内吞作用、转染、F-配对或电穿孔引入外源多核苷酸来转化细胞。引入后，外源多核苷酸可以非整合载体(例如质粒)的形式留存在细胞中或整合到宿主细胞基因组中。可用本领域熟知的方法(参见例如Sambrook等，1989)从宿主细胞中分离如此扩增的多核苷酸。
或者，可用PCR来复制DNA序列。PCR技术是本领域所熟知的，其记载可见美国专利第4,683,195号、第4,800,159号、第4,754,065号和第4,683,202号，以及《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction)，Mullis等编，Birkauswer出版社，波士顿，1994。
可用合适载体内的分离DNA并将其引入合适的宿主细胞来获取RNA。细胞复制时所述DNA转录成RNA，然后用本领域技术人员所知的方法(例如Sambrook等，1989中所述)分离RNA。
一些实施方式中，第一载体包含编码LFA3多肽(例如M1d1)的多核苷酸，第二载体包含编码重链Fc区(例如IgG1的Fc区)的多核苷酸。一些实施方式中，将相近量(例如摩尔量或质量相近)的第一载体和第二载体转入宿主细胞。一些实施方式中，第一载体和第二载体按照5:1与1:5之间的摩尔比或质量比转入宿主细胞。一些实施方式中，LFA3多肽(例如M1d1)编码载体与重链Fc结构域(例如IgG1的Fc结构域)编码载体采用1:1与1:5之间的质量比。一些实施方式中，LFA3多肽(例如M1d1)编码载体与重链Fc(例如IgG1的Fc)编码载体采用1:2的质量比。
载体
一些实施方式中，选择优化了CHO或CHO衍生细胞或NSO细胞中多肽表达的载体。此类载体的例子可见例如Running Deer等，Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)。
合适的克隆载体和表达载体包含众多组件，例如启动子、增强子以及其他转录调控序列。还可构建载体用于将抗体可变结构域再克隆到不同的载体中。合适的克隆载体可按照标准技术来构建，或可从本领域现有的大量克隆载体中选取。尽管选取的克隆载体可根据想用的宿主细胞而不同，有用的克隆载体通常能够自我复制，可具有特定限制性核酸内切酶的单独靶标，和/或带有可用于选取含载体克隆的标记物的基因。合适的例子包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA，以及穿梭载体，例如pSA3和pAT28。这些及许多其他克隆载体可从商业供应商处获得，例如BioRad、Strategene和Invitrogen。另外，还提供了表达载体。表达载体一般为可复制的多核苷酸构建体，其中含有本文所述的多核苷酸。由此暗示，表达载体或者作为游离体或作为染色体DNA的组成部分必须是在宿主细胞中可复制的。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆病毒)、粘粒和PCT公开WO 87/04462中记载的表达载体。载体组件一般包括但不限于下述的一项或多项：信号序列；复制起点；一个或多个标记物基因；合适的转录控制元件(例如启动子、增强子和终止子)。就表达(即翻译)而言，通常还需要一个或多个翻译控制元件，例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
含目标多核苷酸的载体和/或所述多核苷酸本身可用任何合适的手段引入宿主细胞，这些手段包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂质转染；和感染(例如载体是感染性物质例如牛痘病毒的情形)。引入载体还是多核苷酸的选择一般取决于宿主细胞的特征。
宿主细胞
LFA3多肽分子可用合适的宿主细胞来重组制造。可将编码LFA3多肽分子的核酸克隆到表达载体中，然后将所述载体引入宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，所述细胞原本不会生产免疫球蛋白，由此在重组宿主细胞中合成LFA3多肽分子。优选的宿主细胞包括CHO细胞、人胚肾HEK-293细胞或Sp2.0细胞，以及其他本领域熟知的细胞。化学合成蛋白质和肽的方法是本领域所知的，并可通过商业途径获得。
各种实施方式中，LFA3多肽分子可在原核细胞或真核细胞中表达，原核细胞例如细菌细胞，真菌细胞例如真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。可以按照例如本领域所知的程序来进行所述表达。可用于表达多肽的真核细胞的例子包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E和Expi293细胞；CHO细胞，包括CHO-S，DG44.Lecl3 CHO细胞，ExpiCHO和FUT8 CHO细胞；
Figure BDA0002804257820001201
细胞(Crucell)和NSO细胞。一些实施方式中，LFA3多肽分子可在酵母中表达。参见例如美国公开第US 2006/0270045 Al号。一些实施方式中，基于宿主细胞对LFA3多肽分子进行所需翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，一些实施方式中，CHO细胞生产的多肽相比293细胞所产相同多肽具有更高的唾液酸化水平。
可用任意方法将一种或多种核酸引入所需的宿主细胞，这些方法包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例方法可见例如Sambrook等的《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)，第3版，冷泉港实验室出版社(2001)。按照任何合适的方法，核酸可瞬时或稳定转染到所需宿主细胞中。
可用任意合适的方法纯化LFA3多肽分子。这些方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用色谱法，例如蛋白A、蛋白G或蛋白A/G。疏水相互作用色谱，例如丁基或苯基柱，也可能适用于纯化某些多肽。本领域知道许多纯化多肽的方法。
一些实施方式中，在无细胞系统中生产LFA3多肽分子。无细胞系统的非限定性例子可见Sitaraman等，Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,TrendsBiotechnol.22:538-45(2004)；Endo等，Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。
IV.用途与治疗
有些方面，本发明提供采用LFA3多肽分子的治疗方法，其中，所述治疗方法包括治疗有效量的含LFA3多肽分子药物组合物给药。
适用的疾病、紊乱或状况包括但不限于：1型糖尿病，银屑病，斑块状银屑病，掌跖脓疱病(palmoplantaris pustulosis)，手足心脓疱型银屑病，掌跖脓疱症(pustulosispalmaris et plantaris)，手足心脓疱病，特应性皮炎，扁平苔藓，移植物抗宿主病(GVHD)，白癜风，毛发红糠疹，移植(例如器官移植，例如肾脏移植)，银屑病性关节炎，需要同种异体造血干细胞移植的疾病、紊乱或状况，地中海贫血，镰状细胞病，血小板无力症(Glanzmannthrombasthenia)，维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)，慢性肉芽肿性疾病，严重先天性中性粒细胞减少症，白细胞黏附缺乏症，施瓦曼-戴蒙德综合征(Schwachman-Diamond syndrome)，戴蒙德-布莱克范贫血(Diamond-Blackfan anemia)，范科尼贫血(Fanconi anemia)，先天性角化不良，薛迪克-东氏症候群(Chediak-Higashisyndrome)，再生障碍性贫血，斑秃和T细胞淋巴瘤(例如皮肤T细胞淋巴瘤或外周T细胞非霍奇金淋巴瘤)。
其他疾病、紊乱或状况包括但不限于：糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)；青少年型糖尿病；炎性反应，例如银屑病和皮炎(例如特应性皮炎)等炎性皮肤疾病；皮肌炎；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠病(例如克罗恩病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎)相关的反应；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征，ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；胃炎；肾小球性肾炎；变应性状况如湿疹和哮喘以及其他涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的状况；动脉粥样硬化；白细胞黏附缺乏症；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；多发性硬化症；雷诺氏综合症(Reynaud's syndrome)；自身免疫性甲状腺炎；变应性脑脊髓炎；干燥综合征(Sjogren's syndrome)；以及常见于结核病、结节病、多发性肌炎，肉芽肿病和血管炎的细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相隔免疫应答；韦格纳氏病(Wegener’s disease)；恶性贫血(爱迪生氏病(Addison's disease))；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性疾病；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷沉球蛋白血症或库姆斯积极贫血(Coombs positive anemia))，重症肌无力，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜疾病，抗磷脂综合征，反应性神经炎，格雷夫斯氏病(Graves'disease)，Lambert-Eaton肌无力综合征，大疱性类天疱疮，天疱疮，自身免疫性多内分泌腺疾病，白癜风，莱特尔氏病(Reiter's disease)，僵人综合征，白塞病(Bechet disease)，巨细胞动脉炎，免疫复合物性肾炎，IgA肾病，IgM多发性神经病变，免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症和自身免疫性溶血病，桥本甲状腺炎，自身免疫性肝炎，自身免疫性血友病，自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)，古德帕斯彻氏综合症(Goodpasture's syndrome)，混合性结蒂组织病，自身免疫相关性不育症，结节性多动脉炎，斑秃，特发性粘液性水肿，移植物抗宿主病，肌肉萎缩症(杜兴氏型(Duchenne)，贝克型(Becker)，强直性，肢带型，面肩肱型(Facioscapulohumeral)，先天型，眼咽型，远端型，埃-德型(Emery-Dreifuss))和炎性非免疫疾病，例如心脏疾病或脑科疾病。
本发明的LFA3多肽分子还可用于检测和/或测量样品中的CD2或CD2表达细胞，例如用于诊断目的。例如，LFA3多肽分子可用来诊断以CD2表达异常(例如过量表达、表达不足或缺乏表达)为特征的状况或疾病。示例性CD2诊断检测可包括例如患者样品与本发明的LFA3多肽分子接触，所述LFA3多肽分子以可检测标识或报道分子标记。
本文中，“药学上可接受的运载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括所有与活性成分组合时使得活性成分保有生物活性并且与对象的免疫系统不反应的物质。例子包括但不限于所有标准药物运载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液，HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲盐溶液，水，乳剂(例如油/水乳剂)和各种类型的润湿剂。气雾剂或肠胃外给药的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)或普通(0.9％)生理盐水。可用众所周知的常规方法配制包含运载体的组合物(例如可见《雷明顿药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版，A.Gennaro编，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，宾夕法尼亚州伊斯顿，1990；《雷明顿：药学的科学和实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，麦克出版公司(Mack Publishing)，2000)。
V.组合物
本文还提供包含有效量本文所述LFA3多肽分子的药物组合物。本文记载了此类组合物的例子及其配制方法。一些实施方式中，组合物包含一种或多种LFA3多肽分子。
本文中所用的组合物还可包含药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(《雷明顿：药学的科学和实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，2000，Lippincott Williams和Wilkins编，K.E.Hoover)，形式为冻干制剂或水溶液。可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度对受主无毒，并且可包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES和其他有机酸。一些实施方式中，包含本文所述LFA3多肽(例如LFA3-FcM1d1)的组合物包含HEPES缓冲盐溶液。一些实施方式中，HEPES缓冲液的浓度为约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM。一些实施方式中，HEPES缓冲液的浓度为20mM。其他可接受的运载体、赋形剂或稳定剂包括：抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如，TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文还记载了药学上可接受的赋形剂。
LFA3多肽分子及其组合物还可与其他增强和/或补充药剂效果的其他药剂联用。
本文还提供组合物，包括包含任意本文所述多核苷酸的药物组合物。一些实施方式中，组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码本文所述LFA3多肽分子的多核苷酸。一些实施方式中，组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码任意本文所述LFA3多肽分子的多核苷酸。
本文所述药物组合物也可以在联合治疗中给药，例如与其他药剂联合。例如，联合治疗可包括本文所述LFA3多肽分子与至少一种其他治疗的组合，其中，所述治疗可以是手术、免疫疗法或药物治疗。
本文所述药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。这种盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸的那些，例如盐酸，硝酸，磷酸，硫酸，氢溴酸，氢碘酸，亚磷酸等，以及衍生自无毒有机酸的那些，例如脂族一元和二元羧酸，苯基取代的链烷酸，羟基链烷酸，芳族酸，脂族和芳族磺酸等。碱加成盐包括衍生自碱土金属的盐，例如钠，钾，镁，钙等，以及衍生自无毒有机胺的盐，例如N,N'二苄基乙二胺，N-甲基葡糖胺，氯普鲁卡因，胆碱，二乙醇胺，乙二胺，普鲁卡因等。
本文所述药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸，盐酸半胱氨酸，硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯，丁基羟基茴香醚(BHA)，丁基羟基甲苯(BHT)，卵磷脂，没食子酸丙酯，α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸等。
可用于本文所述药物组合物中的合适的水性和非水性运载体的例子包括水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油，例如橄榄油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料(例如卵磷脂)，通过在分散系的情况保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。
这些组合物还可包含佐剂，例如防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。可通过灭菌步骤和加入各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止微生物的出现。组合物中也可能需要包含等张剂，如糖、氯化钠等。此外，可通过加入能延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
在制备和储存条件下，药物组合物通常必须是无菌且稳定的。可将组合物配制成溶液、微乳剂、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。运载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂料、分散系情况下保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。许多情形中，组合物中宜包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。组合物中包含延迟吸收的物质如单硬脂酸盐和明胶可延长可注射组合物的吸收。
无菌注射液可通过将所需量的活性化合物和上述组分之一或其组合根据需要加入合适的溶剂然后过滤灭菌来制备。
通常，分散系可通过将活性活化物加入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中来制备。在制备无菌注射液的无菌粉剂时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由之前已经无菌过滤的活性组分和任意其它所需组分的溶液得到活性组分和任意其它所需组分的粉末。
本文所述药物组合物可按照适合对眼给药的制剂来制备、包装或销售。例如，这样的制剂可以是滴眼液的形式，例如所述滴眼液包含活性成分在水性或油性液体运载体中的0.1％-1.0％(w/w)溶液或悬浮液。此类滴眼液还可包含缓冲剂、盐或一种或多种本文所述其他添加成分。其他有用的眼用制剂包括以微晶形式或以脂质体制剂形式包含活性成分的那些。
本文中，“添加成分”包括但不限于以下所述的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；可生理降解的组合物，例如明胶；水性载剂和溶剂；油性载剂和溶剂；悬浮剂；分散剂或湿润剂；乳化剂，缓和剂(demulcent)；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合或疏水材料。可包含在本文所述药物组合物中的其他“添加成分”是本领域所知的，例如可见《雷明顿药学》(Remington's PharmaceuticalSciences)，Gennaro编，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，宾夕法尼亚州伊斯顿(1985)，该书通过引用纳入本文。
一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子可配制成用于皮下注射。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子可配制成用于肌内注射。
一些实施方式中，LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)按约0.01–2.0mg/mL的浓度配制。一些实施方式中，LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)按约0.01、约0.02、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.2、约1.5、约1.8或约2.0mg/mL的浓度配制。一些实施方式中，LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)按约0.015mg/mL的浓度配制。一些实施方式中，LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)按约0.15mg/mL的浓度配制。一些实施方式中，LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)按约1.5mg/mL的浓度配制。一些实施方式中，LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)按约10、约20、约30、约40或约50mg/mL的浓度配制。
一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子可配制成每次注射约0.2-8mg(例如每次注射0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8mg)的剂量，例如每次注射0.22-7.5mg。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子可配制在每次注射约0.5-1.5ml的溶液中(例如每次注射0.5、1或1.5ml溶液)，例如每次注射约1ml溶液。
本文所述药物组合物的制剂可用药学领域已知或将来开发的任何方法来制备。通常，这些制备方法包括将活性成分与运载体或一种或多种其他辅料成分联合，然后，如有必要或需要，将产物成形或包装成合适的单剂量单位或多剂量单位。
一些实施方式中，本文所述组合物是无热原制剂，基本上不含内毒素和/或相关热原性物质。内毒素包括包涵在微生物内部并在微生物分解或死亡时释放的毒素。热原性物质还包括来自细菌和其他微生物外膜的诱发高热的热稳定物质(糖蛋白)。这两种物质如果对人给药都会引起高热、低血压和休克。鉴于其潜在的有危害，最好从静脉给药的药物溶液中去除哪怕是少量的内毒素。食品和药物管理局(“FDA”)对静脉给药制定的上限是一小时内每千克体重每剂5内毒素单位(EU)(美国药典公约，药典论坛26(1):223(2000))。当按照每公斤体重几百或几千毫克的量进行治疗性蛋白质给药时，最好去除哪怕痕量的内毒素。实施方式之一中，组合物中内毒素和热原的水平低于10EU/mg、或低于5EU/mg、或低于1EU/mg、或低于0.1EU/mg、或低于0.01EU/mg、或低于0.001EU/mg。另一实施方式中，组合物中内毒素和热原的水平低于约10EU/mg、或低于约5EU/mg、或低于约1EU/mg、或低于约0.1EU/mg、或低于约0.01EU/mg、或低于约0.001EU/mg。
实施方式之一中，本文包括组合物给药，所述给药为口服、肠胃外、肌内、鼻内、阴道、直肠、舌、舌下、颊、颊内、静脉内、皮肤、皮下或经皮给药。一些实施方式中，含LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)的组合物静脉内给药。另一实施方式中，本文还包括组合物与其他治疗联合给药，所述其他治疗例如手术、化疗、激素疗法、生物疗法、免疫疗法或放疗。一些实施方式中，其他治疗是造血干细胞移植，例如同种异体造血干细胞移植。
VI.剂量/给药
为了制备包含本文所述LFA3多肽分子的药物或无菌组合物，将LFA3多肽分子与药学上可接受的运载体或赋形剂混合。治疗剂和诊断剂的制剂可通过与例如冻干粉剂、浆剂、水溶液、洗剂(lotion)或混悬剂形式的生理上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(参见例如Hardman等(2001)《哥德曼和基尔曼的治疗的药理学基础》(Goodman andGilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics)，McGraw-Hill，纽约州纽约；Gennaro(2000)，《雷明顿：药学的科学和实践》(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)，Lippincott,Williams和Wilkins，纽约州纽约；Avis等(eds.)(1993)，《药物剂型：胃肠外药物》(Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications)，MarcelDekker，纽约州纽约；Lieberman等(eds.)(1990)，《药物剂型：片剂》(PharmaceuticalDosage Forms:Tablets)，Marcel Dekker，纽约州纽约；Lieberman等(编)(1990)，《药物剂型：分散系》(Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems)，Marcel Dekker，纽约州纽约；Weiner和Kotkoskie(2000)，《赋形剂的毒性与安全性》(Excipient Toxicity andSafety)，Marcel Dekker公司，纽约州纽约)。
选择治疗剂的给药方案取决于多个因素，包括物质的血清或组织更新率，症状程度，物质的免疫原性以及生物基质中靶细胞的可及性。某些实施方式中，给药方案将给到患者的治疗剂的量最大化，同时副作用为可接受的水平。因此，生物递送量部分取决于具体的物质和所治状况的严重程度。已有选择合适剂量抗体、细胞因子和小分子的指南(参见例如Wawrzynczak，1996，《抗体疗法》(Antibody Therapy)，生物科学出版社有限公司(BiosScientific Pub.Ltd)，英国牛津郡；Kresina(编)，1991，《单克隆抗体，细胞因子与关节炎》(Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis)，Marcel Dekker，纽约州纽约；Bach(编)，1993，《自身免疫病的单克隆抗体与肽疗法》(Monoclonal Antibodies and PeptideTherapy in Autoimmune Diseases)，Marcel Dekker，纽约州纽约；Baert等，2003，NewEngl.J.Med.348:601-608；Milgrom等，1999，New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等；2001，New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等，2000，New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等，2003，New Engl.J.Med.348:24-32；Lipsky等，2000，New Engl.J.Med.343:1594-1602)。
合适的剂量由临床医生来确定，例如采用本领域已知或猜测会影响治疗或预计会影响治疗的参数或因素来确定。通常，剂量从低于最佳剂量的量开始，小幅提高，直到相对于任何不良副作用达到期望的或最佳效果为止。重要的诊断指标包括那些症状指标，例如炎症或产生炎性因子的水平。
本文所述药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以各不相同，从而获得就具体患者、组合物与给药方式而言能够有效获得所需治疗反应且对患者无毒的活性成分的量。所选剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用本文所述特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所用具体化合物的排出速率，治疗时长，与所用特定组合物联用的其它药物、化合物和/或物质，受治患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康状况和既往医疗史等医药领域众所周知的因素。
包含本文所述LFA3多肽分子的组合物可每周两次、每周一次、每两周一次或每三周一次给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子或其药物组合物每周一次给药。
一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子或其药物组合物按照约5-20mg/周(例如5、6、7、8、9、10、12、15、17或20mg/周)的剂量给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子或其药物组合物按照约15mg/周的剂量给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子或其药物组合物按照约7.5mg/周的剂量给药。
一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子或其药物组合物按照每次注射约0.2-8mg(例如每次注射0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8mg)的剂量给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子或其药物组合物按照每次注射约0.22-7.5mg的剂量给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(例如LFA3-Fc M1d1)或其药物组合物按照每次注射约7.5mg的剂量给药。
一些实施方式中，本发明LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)或其药物组合物按照约0.01至10mg/kg的剂量给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)或其药物组合物按照约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约2.0、约3.0、约4.0、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0或约10.0mg/kg的剂量给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)或其药物组合物按照约0.03mg/kg的剂量给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)或其药物组合物按照约0.3mg/kg的剂量给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)或其药物组合物按照约3.0mg/kg的剂量给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽(例如LFA3-Fc M1d1)或其药物组合物按照约25、约50、约75或约100mg/kg的剂量给药。
一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子或其药物组合物包含于每次注射约0.5-1.5ml溶液(例如每次注射0.5、1或1.5ml溶液)中给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子或其药物组合物包含于每次注射约1mL溶液中给药。
一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(例如LFA3-Fc M1d1)或其药物组合物按照约0.5至5mL/kg的剂量体积给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(例如LFA3-FcM1d1)或其药物组合物按照约0.5、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5或约5.0mL/kg的剂量体积给药。一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子(例如LFA3-FcM1d1)或其药物组合物按照约2.0mL/kg的剂量体积给药。
一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子或其药物组合物进行一个或多个疗程的给药，例如，每个疗程由10-14周(例如10、11、12、13或14周)组成、例如由12周组成，例如，两个相邻疗程之间相隔10至14周的间期(例如10、11、12、13或14周的间期)，例如12周的间期。
一些实施方式中，本发明LFA3多肽分子或其药物组合物按照每周一次约15mg/周的剂量皮下给药，例如，本发明LFA3多肽分子或其药物组合物进行一个或多个(例如1、2、3、4或更多)疗程的给药，其中，每个疗程由12周组成且两个相邻疗程之间相隔12周的间期。
对具体患者而言的有效量可根据所治状况、患者总体健康状况、给药方法、途径和剂量以及副作用严重程度等因素而不同(参见例如Maynard等，1996，《良好临床实践SOP手册》(A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice)，Interpharm出版社，福罗里达州波卡拉顿；Dent,2001,《良好实验室实践和良好临床实践》(Good Laboratory and GoodClinical Practice)，Urch Publ，英国伦敦)。
给药途径可以是例如静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊髓内、病灶内的局部或经皮、注射或输注给药，或采用缓释系统或植入物给药(参见例如Sidman等，1983，Biopolymers 22:547-556；Langer等，1981，J.Biomed.Mater.Res.15:167-277；Langer,1982,Chem.Tech.12:98-105；Epstein等，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-3692；Hwang等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034；美国专利第6,350466号和第6,316,024号)。需要时，组合物可以包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。此外，可以采用肺部给药，例如使用吸入器或喷雾器，并用雾化剂来配制。参见例如，美国专利第6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078号；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，以上文献均通过引用全部纳入本文。一些实施方式中，本文所述LFA3多肽分子或其药物组合物用Alkermes AIRTM肺部药物递送技术(Alkermes公司，马萨诸塞州剑桥市)给药。
本文所述的组合物可以采用本领域所知多种方法中的一种或多种通过一种或多种给药途径来给药。本领域技术人员会明白，给药途径和/或方式根据所需结果而有所不同。为本发明多肽分子选择的给药途径包括静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。胃肠外给药可表示除肠道和局部给药外的给药形式，通常是通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下(subcapsular)、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注给药。或者，本文所述组合物可通过非肠胃外途径给药，例如局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、口腔、阴道、直肠、舌下或局部给药。
如果本文所述LFA3多肽分子包含于控释或缓释系统中给药，可用泵来实现控释或缓释(参见例如，Langer(出处同上)；Sefton，1987，Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40；Buchwald等，1980，Surgery 88:501-16；和Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321:514-74)。
可用聚合物材料来实现本文所述治疗的控释或缓释。(参见例如：《控释的医疗应用》(Medical Applications of Controlled Release)，Langer和Wise(编)，CRC出版社，福罗里达州波卡拉顿，(1974)；《控释药物的生物利用度，药物产品的设计与性能》(Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance)，Smolen和Ball(编)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.,Macromol.ScLRev.Macromol.Chem.23:61；另见Levy等，1985，Science 11 225:190；During等，19Z9，Ann.Neurol.25:351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71:105)；美国专利第5,679,377号、美国专利第5,916,597号、美国专利第5,912,015号、美国专利第5,989,463号、美国专利第5,128,326；PCT专利申请公开WO 99/15154；PCT专利申请公开WO 99/20253。用于缓释制剂的聚合物的例子包括但不限于，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)，聚(甲基丙烯酸)，聚乙交酯(PLG)，聚酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺，聚(乙二醇)，聚交酯(PLA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。一实施方式中，用于缓释制剂中的聚合物是惰性的，无可浸出杂质，储存稳定，无菌且可生物降解。可将控释或缓释系统靠近预防或治疗靶标安置，由此仅需系统性剂量之部分(参见例如Goodson于《控释的医疗应用》(Medical Applications of ControlledRelease),(出处同上)，第2卷，115-138(1984))。
控释系统的综述可见Langer，1990，Science 249:1527-1533。可用任意本领域普通技术人员所知的技术来生产含有一种或多种本文所述多肽分子或其偶联物的缓释制剂。参见例如美国专利第4,526,938号，国际专利申请公开WO 91/05548、WO 96/20698，Ning等，1996，“采用缓释凝胶的人类结肠癌异植体瘤内放射免疫治疗”("IntratumoralRadioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel")，Radiotherapy and Oncology 59:179-189，Song等，1995，“抗体介导长循环乳剂肺靶向”("Antibody Mediated Lung Targeting of Long-CirculatingEmulsions"，PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 50:372-397，Cleek等，1997，“用于心血管应用的bFGF抗体的可生物降解聚合物运载体”("Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for CardiovascularApplication")，Pro.Ml.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854，和Lam等，1997，“用于局部递送的重组人源化单克隆抗体的微囊化”("Microencapsulation ofRecombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery")，Proc.Ml.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-160，以上文献均通过引用前文纳入本文。
如果本发明的LFA3多肽分子局部给药，则可配制成软膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、洗剂(lotion)、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液，乳剂或其他本领域技术人员熟知的形式。参见例如《雷明顿药学和药物剂型入门》(Remington's Pharmaceutical Sciences andIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms)，第19版，Gennaro编，麦克出版公司(Mack Pub.Co.)，宾夕法尼亚州伊斯顿(1985)。就非可喷雾局部剂型而言，通常使用包含与局部给药相容的运载体或一种或多种赋形剂并且在某些情况下具有大于水的动态粘度的粘稠至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于溶液、悬浮剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂、粉剂、搽剂(liniment)、抹膏剂(salve)等，可根据需要对其进行灭菌或与辅料(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合来影响各种特性(例如渗透压)。其他合适的局部剂型包括可喷雾气雾剂制剂，其中，活性成分(某些情形中与固体或液体惰性运载体组合)与加压挥发物(例如气态推进剂，例如氟利昂)形成混合物装在一起或装在挤压瓶中。如果需要，还可以在药物组合物和剂型中添加保湿剂或润湿剂。此类添加成分的例子是本领域熟知的。
如果包含LFA3多肽分子的组合物鼻内给药，则可将其配制成气雾剂形式、喷雾剂，雾剂或滴剂形式。尤其，可以采用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)以加压包装或喷雾器给出的气雾剂的形式方便地递送本文所述用途的预防或治疗药剂。增压气溶胶的情形中，剂量单位可通过用阀来递送计量好的量来确定。用于吸入器或吹入器中的胶囊或药筒(包含例如明胶)可配制成含有化合物与合适粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。
与第二种治疗剂例如细胞因子、类固醇、化疗剂、抗生素或辐射联合给药或联合治疗的方法是本领域熟知的(参见例如Hardman等(编)(2001)《哥德曼和基尔曼的治疗的药理学基础》(Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第10版，McGraw-Hill，纽约州纽约；Poole和Peterson(编)(2001)《药物治疗实践进阶：实用方法》(Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach)，Lippincott,Williams and Wilkins出版社，宾夕法尼亚州费城；Chabner和Longo(编)(2001)《癌症的化学疗法与生物疗法》(Cancer Chemotherapy and Biotherapy)，Lippincott,Williams and Wilkins出版社，宾夕法尼亚州费城)。有效量的治疗剂可以使症状减少或减轻至少10％、至少20％、至少约30％、至少40％或至少50％。
实施方式之一中，本文所述LFA3多肽分子可与治疗自身免疫性疾病和紊乱的组合物联合给药，后者包括但不限于阿霉素、硫唑嘌呤、白消安、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环孢菌素A、癌得星(Cytoxan)、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、6-巯基嘌呤、皮质类固醇、非甾体类抗炎药、西罗莫司(雷帕霉素)和他克莫司(F-506)。其他实施方式中，免疫调节剂或免疫抑制剂是抗体，所述抗体选自莫罗单抗-CD3、阿仑单抗
Figure BDA0002804257820001322
巴利昔单抗、达克珠单抗、莫罗单抗
Figure BDA0002804257820001321
利妥昔单抗、抗胸腺细胞珠蛋白和IVIg等，以上是本领域技术人员所熟知的。
实施方式之一中，本文所述LFA3多肽分子可与用于治疗糖尿病的组合物联合给药，后者包括但不限于双胍类(例如丁双胍、二甲双胍和苯乙双胍(phenform))，激素及其类似物(胰淀素(amylin)、胰岛素、门冬胰岛素、地特胰岛素、甘精胰岛素、赖谷胰岛素、赖脯胰岛素、利拉鲁肽和普兰林肽)，磺酰脲类衍生物(醋酸己脲、氨磺丁脲、氯磺丙脲、格列波脲、格列齐特、格列美脲、格列吡嗪、格列喹酮、格列派特、格列苯脲、格列噻唑、格列丁唑、格列己脲、格列嘧啶、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲和格列环脲)，噻唑烷二酮类(吡格列酮、罗格列酮和曲格列酮)，阿卡波糖，艾塞那肽，米格列醇，米格列奈，莫格他唑，那格列奈，瑞格列奈，西他列汀，特利他唑(tesaglitazar)，维达列汀和伏格列波糖。
某些实施方式中，本文所述LFA3多肽分子可配制成确保正确的体内的分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高亲水性化合物。为了确保本文所述的治疗性化合物穿透BBB(如果需要)，可将它们配制成例如脂质体。制造脂质体的方法可见例如美国专利第4,522,811、5,374,548和5,399,331号。脂质体可包含一个或多个选择性地向特定细胞或器官内转运的部分，由此增强靶向性药物递送(参见例如V.V.Ranade,1989,J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向部分包括叶酸和生物素(参见例如美国专利第5,416,016号)；甘露糖甙(Umezawa等，Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等，1995，FEBSLett.357:140；M.Owais等，1995，Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等，(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；pl20(Schreier等，(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；另见K.Keinanen；M.L.Laukkanen,1994,FEBS Lett.346:123；Killion；Fidler,1994；Immunomethods 4:273。
本文提供将包含本文所述LFA3多肽分子的药物组合物单独或与其他治疗联合对有需要的对象给药的方案。本文所述联合治疗中的治疗(例如预防性或治疗性药剂)可以相伴(concomitant)或依序给予对象。本文所述联合治疗中的治疗(例如预防性或治疗性药剂)还可以循环施用。循环治疗包括一段时间地施以第一治疗(例如第一预防性或治疗性药剂)，然后一段时间地施以第二治疗(例如第二预防性或治疗性药剂)，并且重复以上按序施用，即循环，目的在于减少对某一治疗(例如药剂)抗性的生成从而避免或减少某一治疗(例如药剂)副作用和/或改善治疗的疗效。
本文所述联合治疗中的治疗(例如预防性或治疗性药剂)可以同时给予对象。术语“同时”不限于多种治疗(例如预防性或治疗性药剂)正好在同一时刻施用，它的意思是在一定的时间区间内按一定的顺序将包含本文所述LFA3多肽分子的药物组合物向对象给药，由此使得本文所述LFA3多肽分子能够与其他一种或多种治疗一同作用，从而提供相比它们以其他方式给药更多或更高的收益。例如，各项治疗可以同时或依序在不同时间点给予对象；然而，如非同时给药，它们的给药在时间上必需足够近从而提供所需的治疗性或预防性效果。各项治疗可以分开给予对象，以任意合适的形式和合适的途径。各种实施方式中，这些治疗(例如预防性或治疗性药剂)向对象的给药相隔少于15分钟、少于30分钟、少于1小时，相隔约1小时，相隔约1小时至约2小时，相隔约2小时至约3小时，相隔约3小时至约4小时，相隔约4小时至约5小时，相隔约5小时至约6小时，相隔约6小时至约7小时，相隔约7小时至约8小时，相隔约8小时至约9小时，相隔约9小时至约10小时，相隔约10小时至约11小时，相隔约11小时至约12小时，相隔24小时，相隔48小时，相隔72小时，或相隔1周。其他实施方式中，两项或更多项治疗(例如预防性或治疗性药剂)在同一次患者探望时给药。
联合治疗中的预防性或治疗性药剂可以同一药物组合物的形式向对象给药。或者，联合治疗中的预防性或治疗性药剂可以分开的组合物的形式向对象同时给药。预防性或治疗性药剂可以相同或不同的给药途径给药。
VII.试剂盒
本文还提供包含任意或全部本文所述多肽分子的试剂盒。本文所述的试剂盒包括一个或多个容器，容器中包含本文所述的LFA3多肽分子，还包括按照任意本文所述方法使用的说明。通常，这些说明包括就上述治疗方法而言多肽分子的给药说明。一些实施方式中，提供的试剂盒用于形成单剂量给药单位。某些实施方式中，试剂盒可包括含有干燥蛋白质的第一容器和含有水性制剂的第二容器。某些实施方式中，包括含有给药器的试剂盒，所述给药器例如单室和多室预充式注射器(例如液体注射器和粉针剂注射器(lyosyringe))。
LFA3多肽分子使用说明一般包括针对所需治疗的剂量、给药计划和给药途径等信息。所述容器可以是单位剂量、合并包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量的。本文所述试剂盒中的说明一般为标签或包装内插页(例如试剂盒的纸质插页)上的字面说明，但也可以是机器可读的说明(例如磁盘或光盘上的说明)。
本文所述试剂盒有合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶(vial)，瓶子(bottle)，广口瓶(jar)，软包装(例如密封的密拉(Mylar)袋或塑料袋)等。还可以是与特定装置联用的包装，所述装置例如吸入器、鼻腔给药装置(例如雾化器)或输液装置(例如微型泵)。试剂盒可具有无菌入口(例如，容器可以是静脉溶液袋或小瓶，具有可被皮下注射针刺穿的塞子)。容器也可具有无菌入口(例如，容器可以是静脉溶液袋或小瓶，具有可被皮下注射针刺穿的塞子)。组合物中至少活性成分之一是本文所述的LFA3多肽分子。容器还可包含第二药学活性物质。
试剂盒可以或选性地提供其他成分和/或组件，例如缓冲液和说明性信息。通常，试剂盒包括容器和位于容器上或与之关联的标签或包装插页。
本文还提供包含任意或全部本文所述多肽分子的诊断试剂盒。诊断试剂盒可用于例如检测样品中CD2的存在性。一些实施方式中，诊断试剂盒可用来鉴定有潜在疾病、紊乱或状况的个体，所述潜在疾病、紊乱或状况令所述个体处于发生CD2介导的疾病、紊乱或状况或CD2缺陷性疾病、紊乱或状况的风险中。一些实施方式中，诊断试剂盒可用来检测疑有CD2介导的疾病或CD2缺陷性疾病、紊乱或状况的个体中CD2的存在和/或水平。
本文所述的诊断试剂盒包括一个或多个容器，容器中包含本文所述的LFA3多肽分子，还包括按照任意本文所述方法使用的说明。通常，这些说明包括用LFA3多肽分子检测疑有CD2介导的疾病或CD2缺陷性疾病、紊乱或状况或有这些风险的个体中CD2的说明一些实施方式中，示例性诊断试剂盒可构造为包含例如LFA3多肽分子、阴性对照样品、阳性对照样品等试剂和试剂盒使用说明。
VIII.等同
以上说明和后文实施例详细描述了本文内容的具体实施方式，并且描述了发明人认为的最佳方式。然而，可以看出，不论前文记述如何详尽，本文公开的内容可以多种方式实施，因此，对本文公开内容的解读须符合权利要求及其所有等同形式和方式。
尽管以就多种应用、方法、试剂盒和组合物对公开内容进行了描述，可以看出，可以进行多种不悖离本文所述和权利要求所述的改变和调整。后文实施例仅供更好地说明本文公开的内容，不为限定本文公开内容的范围。尽管本文的记载已经描述了示例性实施方式，本领域技术人员不难理解，无需过度实验即可对这些示例性实施方式做出多种改变和调整。所有的这些改变和调整都包括在本公开的范围之内。
本文中引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及其中引用的参考文献，倘若尚未通过引用全文纳入本文，在此全部通过引用全文纳入本文。如果纳入的文献和类似材料中有一篇或多篇与本申请不同或矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、记载的技术等，以本申请为准。
IX.普遍性记载
应该理解，本发明不限于当然可以不同的具体合成方法。除非另作说明，本方面所用的科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。此外，除非另作说明，单数术语包涵复数含意且复数术语包涵单数含意。通常，本文中细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学及杂交中使用的命名和技术是本领域公知且常用的。
除非另作说明，本发明的实施采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学，生物化学和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。这些技术在文献中共有全面的记载，例如：《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第2版(Sambrook等，1989)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编，1984)；《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，Humana出版社；《细胞生物学：实验室手册》(CellBiology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编，1998)学术出版社；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney编(1987))；《细胞和组织培养入门》(Introductionto Cell and Tissue Culture)(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum出版社；《细胞和组织培养实验室方法》(Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures)(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编，1993-1998)J.Wiley和Sons出版社；《酶学方法》(Methodsin Enzymology)(学术出版社有限公司)；《实验免疫学手册》(Handbook of ExperimentalImmunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞基因传递载体》(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等编，1987)；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction)，(Mullis等编，1994)；《新编免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)(J.E.Coligan等编，1991)；Sambrook和Russell，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)，第3板，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约州冷泉港(2001)；Ausubel等，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley&Sons出版社，纽约(2002)，Harlow和Lane，《抗体应用：实验室手册》(Using Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社,纽约州冷泉港(1998)；Coligan等，《简明蛋白质学方法》(Short Protocols in Protein Science)，John Wiley&Sons出版社，纽约(2003)；《简明分子生物学方法》(Short Protocols inMolecular Biology)(Wiley与Sons，1999)；《免疫学》(Immunobiology)(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；《抗体》(Antibodies)(P.Finch,1997)；《抗体：实践方法》(Antibodies:apractical approach)(D.Catty编，IRL出版社，1988-1989)；《单克隆抗体：实践方法》(Monoclonal antibodies:a practical approach)(P.Shepherd和C.Dean编，牛津大学出版社，2000)；《抗体应用：实验室手册》(Using antibodies:a laboratory manual)(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社，1999)；《抗体》(The Antibodies)(M.Zanetti和J.D.Capra编，Harwood学术出版社，1995)。
酶促反应和纯化技术按照生产商的说明书或按照本领域常规操作或按照本文所述来进行。本文所述分析化学、生物化学、免疫学、分子生物学、合成有机化学以及医学和药物化学中使用的命名以及实验室方法和技术是本领域公知且常用的。化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者采用标准技术。
实施例
结合以下实验性实施例进一步详细描述本发明。除非另作说明，这些实施例仅用于说明目的，没有限定性。因此，本文公开的内容不应解释为局限于以下实施例，而应解释为涵盖由本文记载可以看出的任意及所有变化形式和方式。
实施例1：酵母展示LFA3的稳定性和亲和力成熟
方法：
蛋白质表达与纯化
将带有C-末端铰链区-Pfe Fc的人LFA3变体克隆到哺乳动物表达载体pRY19中，并分别用ExpiFectamine 293转染试剂盒(ThermoFisher#A14525)和CHO表达系统试剂盒(ThermoFisher#A29133)按照制造商的说明瞬时转染Expi293(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))和ExpiCHO(赛默飞世尔公司)细胞。表达4-7天后，收获蛋白质，用MabSelectSuRe树脂(GE Healthcare#17-5438-01)蛋白A亲和柱纯化，然后用Superdex20013100Increase柱(GE医疗公司(GE Healthcare))进行尺寸排阻色谱(SEC)。
为了大规模的表达，生成CHO SSI合并稳定细胞系。过滤含LFA3-Fc M1-d1和M1-d3的上清液，并捕获在MabSelect SuRe LX树脂上。中和洗脱的蛋白质，作为精纯步骤以流穿模式过SP柱。对于野生型(WT)LFA3-Fc蛋白，用SEC纯化单体部分。用检测残留蛋白A、宿主细胞蛋白(HCP)和DNA的市售试剂盒测定工艺杂质。
人LFA3的酵母表面展示
用pRNYD2或pRNYDG载体(辉瑞)在酿酒酵母(S.cerevisiae)BJ5465株表面展示人LFA3的N-末端Ig-结构域(残基1-93)，例如SEQ ID NO:24所示多肽。两载体都展示带有N-末端V5表位标签的LFA3，LFA3的C-末端与Muc3和膜锚定区融合。pRNYD2载体用Axl2跨膜区将LFA3锚定在酵母表面上，pRNYDG则利用GPI接头。用流式细胞术检测V5表位染色和CD2结合来确认活性LFA3的表面展示(未出示数据)。发现与pRNYD2系统相比，pRNYDG系统在酵母表面展示LFA3高效得多且表达水平高得多。
一代库的设计与构建
基于野生型人LFA3:CD2复合物的晶体结构(Wang等，(1999)，Cell 97,791-803)，选取LFA3的15个接触残基和16个朝向内的疏水“核”残基随机化，采用重叠延伸PCR和后文所述含简并密码子的PCR引物。构建了两个库：1–S(稳定性库)，仅含“核”残基的随机化；和2–AS(亲和力和稳定性库)，既有接触残基又有“核”残基的随机化。已知，酵母上的表达水平与重组蛋白质的热稳定性相关(Shusta等(1999)Journal of molecular biology 292,949-956)。所以，在表面表达较低的pRNYD2展示平台上构建这些一代库，用来扩大可改善的LFA3热稳定性的范围。
接触残基的PCR引物：
Glu25＝VAK,Leu27＝NTT,Lys29＝ANG,Lys32＝ANG,Asp33＝VAM,Lys34＝ANG,Glu37＝VAK,Glu39＝VAM,Glu42＝VAK,Arg44＝ANG,Phe46＝NWT,Ser47＝RST,Pro80＝CNT,Ile82＝NTT,Asp84＝VAM5’–gagtaacgttcctttgaagVAKgtcNTTtggANGaaacaaANGVAMANGgtggcagaattagagaatag–3’(SEQ ID NO:5)
5’–gaaaaaacaaaaagataaagtggcaVAKttaVAMaatagtVAKtttANGgctNWTRSTtcatttaagaatagggtc–3’(SEQ ID NO:6)
5’–gtacgaaatggagtccCNTaatNTTacaVAMacaatgaagttttttttgtac–3’(SEQ ID NO:7)
“核”残基的PCR引物：
Phe15＝NTT,Val17＝NTT,Leu23＝NTT,Val26＝NTT,Trp28＝TKS,Val35＝NTT,Ala36＝KYA,Leu38＝NTT,Phe43＝NTT,Ala45＝KYA,Leu55＝NTT,Gly60＝RST,Leu62＝NTT,Met77＝WTS,Met86＝WTS,Phe88＝NTT
5’–gtttacggtaatgtgactNTTcacNTTccgagtaacgttcctNTTaaggaaNTTttaTKSaaaaaacaaaaagataaagtg–3’(SEQ ID NO:8)
5’–cttatggaaaaaacaaaaagataaaNTTKYAgaaNTTgagaatagtgagNTTaggKYAtttagttcatttaagaatag–3’(SEQ ID NO:9)
5’–catttaagaatagggtctatNTTgatactgtatccRSTtctNTTaccatttataatttaacaagtag–3’(SEQ ID NO:10)
5’–gatgaagacgagtacgaaWTSgagtcccctaatattacagacacaWTSaagNTTtttttgtacgttttggg–3’(SEQ ID NO:11)
至于AS库的构建，用ApaI/NcoI双消化的pRNYD2载体分别扩增含有接触残基随机化的LFA3基因片段和含有“核”残基随机化的LFA3基因片段，混在一起，然后进行电穿孔。按照此前的记载(Chao等，(2006)Nature protocols 1,755-768)进行酵母库的电穿孔、拯救和扩增。最后的AS库和S库分别含有约1.5x108和1.3x108个转化体。
一代选择
各轮选择中都于20℃诱导LFA3变体的酵母上表达，通过改变两个选择参数来进行库选择：1–施加酵母上热变性来提高热稳定性；和2–保持或降低CD2浓度来保持或提高亲和力。每库进行总共4轮选择。
S库选择：
就S库选择而言，将配体(hCD2-生物素)保持在1μM的恒定浓度，随每轮选择提高热暴露以富集最为热稳定同时保持对CD2野生型样亲和力的克隆。该选择策略是由先前的酵母上蛋白质稳定性进化法(Shusta等(2000)Nature biotechnology 18,754-759)调整得出。第1轮，约2.0x109个细胞与hCD2-生物素4℃孵育1小时，无其他热暴露，然后用PBE(PBS,pH 7.4+0.5％(w/v)BSA+2mM EDTA,pH 8.0)清洗两次。接着用1:50链霉亲和素-PE(SA-PE，Life Technologies#S21388)对库染色15分钟，清洗两次，用1:10顺磁性抗PE微珠(Miltenyi#130-048-801)标记20分钟，全部在4℃进行。用MACS LS柱(Miltenyi#130-042-401)和QuadroMACS分离器(Miltenyi#130-090-976)按照制造商的说明进行库选择。第2-4轮，用加热块(Eppendorf公司)令含于PBE中的1.0x108个细胞分别暴露于[20分钟@46℃]、[30分钟@46℃]和[20分钟@46℃+10分钟@50℃]。热变性后，库用1μM hCD2-生物素4℃染色1小时，洗涤两次，并用SA-PE(用于检测hCD2结合)和抗V5-FITC(用于检测LFA3变体表达)4℃联合标记10分钟。用双色FACS进行库选择，用SH800分选器(Sony公司)选出CD2+V5+双阳群。
AS库选择：
就AS库选择而言，在多轮选择中降低hCD2-生物素的浓度并提高热暴露从而富集最为热稳定且具有最高亲和力的克隆。AS库多轮选择的标准和模式与前文S库基本相同，但有一处改动：第2-4轮，不是用1μM配体对库进行染色，而是用40nM hCD2-生物素对AS库4℃染色1小时。
选择结束时，用ZymoprepTM酵母质粒小型制备II试剂盒(Yeast Plasmid MiniprepII Kit)(Zymo Research#D2004)按照制造商的说明，用100μl第4轮后的S库和AS库来抽提库DNA。将提取的DNA转化到化学感受态的TOP10大肠杆菌中并接种培养以进行各个克隆的测序。
二代“合并”库的设计与构建
为了进一步提高LFA3变体的亲和力，用WT和3个一代变体(M1、M4和M5)作为模板进行重叠延伸PCR并用后文所述简并引物进行FG环随机化来构建二代库。由于FG环是电荷/表面互补性最低的LFA3:CD2界面区域，该设计的理念是对该环进行完全随机化来优化结合能。在pRNYDG展示平台上构建“环”库以获得最佳表面表达，为的是避免对高表达但未必高亲和力克隆的偏性选择。
环残基的PCR引物：
Ser79＝NNK,Pro80＝NNK,Asn81＝NNK,Ile82＝NNK,Thr83＝NNK,Asp84＝NNK,Ser85＝NNK
基于WT模板：
5’–gaagacgagtacgaaatggagNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKatgaagttttttttgtacgttttg–3’(SEQ ID NO:12)
基于M1模板：
5’–gaagacgagtacgaaatggagNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKttcaagttttttttgtacgttgg–3’(SEQ ID NO:13)
基于M4或M5模板：
5’–gaagacgagtacgaattcgagNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKttcaagttttttttgtacgttg–3’(SEQ ID NO:14)
按照此前的记载(Chao等，(2006)Nature protocols 1,755-768)进行酵母库的电穿孔、拯救和扩增。最后的文库含有约2.9x108的转化体。
二代选择
对环库进行总共6轮选择，逐渐提高亲和力而非是稳定性的选择压力，由此富集高亲和力的LFA3变体。首轮选择，用50nM单体hCD2-生物素通过MACS选取3x109个细胞，过程类似于一代库第一轮。此后的几轮采用动力学选择策略(Boder等，(1997)Naturebiotechnology 15,553-557)来富集最慢解离速率(off-rate)的克隆。简而言之，动力学选择策略包括将1x108个酵母用250nM单体hCD2-生物素室温染色1小时，用PBE清洗两次，室温下与1μM单体非生物素化hCD2进行时间逐渐递增的竞争，用PBE清洗两次，最后，用MACS或双色FACS进行富集。第2-6轮竞争的时长分别为10、20、40、80和80分钟。选择模式为2-3轮用MACS，4-6轮用FACS。
选择结束时，如一代选择中所述对各克隆进行测序。
酵母上滴定
为了评估酵母上的CD2亲和力，连续稀释的hCD2-生物素与LFA3表达酵母4℃振荡孵育1小时。用200μl PBE清洗两次洗去未结合的hCD2-生物素。hCD2-生物素标记的酵母与1:100SA-PE于4℃振荡孵育15分钟，然后用PBE清洗两次。在Accuri C6流式细胞仪(BDBiosciences公司)上进行样品分析。数据代表荧光强度均值，用Prism 6(Graphpad公司)对数据点进行S形量效曲线拟合。
用先前公开的方法(Orr等(2003)Biotechnology progress 19,631-638)并进行了某些调整来评估酵母上蛋白质热稳定性。简而言之，用Tetrad 2Peltier热循环仪(BioRad公司)，将含于PBE中的LFA3-表达酵母在30-70℃之间的所示温度加热15分钟然后冷却至4℃。酵母与500nM hCD2-生物素孵育1小时，用PBE清洗两次，然后用1:100SA-PE于4℃染色15分钟。在Accuri C6流式细胞仪上进行样品分析。数据代表相对各LFA3变体最大结合归一化了的荧光强度均值，用Prism 6对数据点进行S形量效曲线拟合。
稳定性评估
差示扫描荧光测定法(DSF)
用ViiA 7实时PCR系统(Thermo Fisher公司)和蛋白质热漂移染色试剂盒(Protein Thermal Shift Dye Kit)(Thermo Fisher#4461146)按照制造商的说明进行实验。简而言之，0.8-1mg/ml LFA3变体与PBS中1:1000稀释的染料混合。样品(20μl反应体积)铺排在MicroAmp Optical 96孔反应板(Applied Biosystems#N8010560)上，避开板的边缘，用光学贴膜(Applied Biosystems#4360954)密封。Viia 7实时PCR系统由程序控制升温，以0.05℃/秒的速度从25℃至99℃。通过在ViiA 7软件上测定熔解曲线第一转折的对应温度来定量LFA3-Pfe变体的熔解温度，数据点用Prism 6作图。
热促聚集
用Tetrad 2Peltier热循环仪(BioRad公司)将PBS(pH 7.2)中1mg/ml的LFA3-Pfe变体(20μl/反应)在所示温度加热24小时。为了评估热诱导聚集水平，将15μl/样品上样到YMC-Pack Diol-200(YMC)柱上进行尺寸排阻色谱(SEC)分析。用得到的色谱图定量与温度相关的％高分子量物质(HMMS)，％二聚体和％单体。
持续低pH
PBS(pH 7.2)中1.5mg/ml的LFA3-Pfe变体与10％(v/v)0.4M甘氨酸、pH 2.7或PBS、pH 7.2混合(即将5μl甘氨酸或PBS加入50μl蛋白质中)，室温孵育5小时。样品用4.55％(v/v)的0.25M Tris Base、pH 7.4或PBS中和(即将2.5μl中和缓冲液加入55μl样品中)。为了评估低pH诱导聚集的水平，将25μl/样品上样到YMC-Pack Diol-200(YMC)柱上进行尺寸排阻色谱(SEC)分析。用得到的色谱图定量与温度相关的％高分子量物质(HMMS)，％二聚体和％单体。
冻融和振荡稳定性
通过将材料在-80℃或-20℃冷冻≥30分钟然后5℃融化≥30分钟并涡旋搅拌来评估冻融稳定性。该过程重复5轮，用分析SEC对样品进行评估。至于振荡稳定性，样品以300rpm(有和没有PS80)振荡24小时，检查可溶聚集物和沉淀。
热稳定性(差示扫描量热法)
用MicroCal VP-毛细DSC评估DSC热稳定性，用60℃/小时的速度进行10-110℃的扫描。样品以缓冲液稀释至1mg/ml。
蛋白质分析
毛细管凝胶电泳(CGE)
样品稀释至1mg/ml。非还原样品用碘乙酰胺(IAM)处理，还原样品用DTT处理。用cGE LabChip HT Antibody Express 200法(Perkin Elmer公司)进行分析。
分析SEC
用YMC-Pack Diol-200色谱(YMC美国公司)柱进行SEC-HPLC分析。
粘度
用RheoSense m-VROC粘度计测定粘度。将蛋白质配制在组氨酸蔗糖EDTA缓冲液pH5.8中，在直到150mg/ml的各浓度测定粘度。
蛋白质表征
亲和捕获自相互作用纳米颗粒光谱(AC-SINS)
用抗人IgG包被的包衣金纳米颗粒进行AC-SINS检测。PBS中50μg/ml的样品与包衣纳米颗粒混合并孵育2小时。将样品转移至UV透明板并测定450至650nm的吸光度。
FcRn色谱
将生物素化的人FcRn捕获在链霉亲和素树脂上并装柱。将50μg样品注射到柱上，进行pH 5.5至8.8梯度线性洗脱。将相对洗脱时间与对照mAb的进行比较，记录50％峰高处的峰宽。
多反应性ELISA
ELISA板用10μg/ml dsDNA或5μg/ml胰岛素包被过夜。板用ELISA缓冲液(PBS，0.05％Tween-20，1mM EDTA)封闭，用从1μg/ml开始的4倍连续稀释施加测试蛋白质。用偶联HRP的山羊抗人IgG检测结合。
计算机模拟的(in silico)免疫原性
用EpiVax ISPRI基于网络的筛选工具组件评估计算机模拟的(in silico)免疫原性。
结合亲和力分析
用Biacore T200仪(GE Healthcare公司，新泽西州皮斯卡塔维)通过表面等离子体共振测定LFA3-Fc变体结合重组CD2的亲和力。在链霉亲和素(SA)包被的Biacore传感器芯片(Series S传感器芯片SA，BR100531，GE Healthcare公司)上低偶联密度地捕获生物素化的CD2蛋白质。在0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl和0.005％v/v表面活性剂P20(HBS-P)缓冲液中，25℃，用30μl/分钟流速进行实验。将LFA3-Fc变体注射在表面上2分钟，然后观察解离5分钟或10分钟，由此鉴定高亲和力克隆。无需再生。用Biacore T200评估软件分析数据，对于每种抗体，从背景中减去仅固定链霉亲和素的相邻对照流动孔的信号以及仅缓冲液进样的孔。使用平衡结合模型来计算亲和常数(Kd)。
结果
用基于结构的设计来构建基于人LFA3第一胞外结构域的酵母展示库(图1)。AS库和S库估计分别含约1.5x108和～1.3x108转化体。初始文库的序列分析确认各库中约每克隆6-7处突变。
诱导后将库暴露于逐渐升高的热暴露，并且，对AS库逐渐降低CD2配体的浓度。四轮选择后，对各克隆测序，鉴定到6个热点残基：A36、L38、F43、A45、M77和M86(图2A和2B)。根据这六个位置中观察到的最高频残基(图2C)设计了6个重组变体(M1->M6)(图2D)，并在哺乳动物细胞中表达为Fc融合蛋白。M1至M6 Fc融合蛋白包含与人IgG1 Fc区(SEQ ID NO:16)融合的变体LFA3胞外结构域(分别对应SEQ ID NO:17-22)(表2)。人IgG1 Fc区SEQ ID NO:16在图中和在本申请中亦称“Pfe”。对应的核苷酸序列见表3。
在实施例1和实施例2所述的研究中，将M1至M6 Fc融合蛋白以及其他变体LFA3-Fc融合蛋白与野生型LFA3-Fc融合蛋白进行了比较。在研究中使用了两种参比野生型LFA3-Fc融合蛋白，它们均包含与人IgG1 Fc区融合的人LFA3的野生型第一胞外结构域。第一参比分子称为“WT LFA3-Fc”或“LFA3-Fc WT”(SEQ ID NO:4)，是根据阿法西普(Alefacept)的公开序列生成的。该参比分子的记载可见US5547853，其内容通过引用完全纳入本文。第二个参比分子称为“WT LFA3-Pfe”(SEQ ID NO:120)，包含与WT LFA3-Fc中相同的野生型人LFA3第一胞外结构域，但所含人IgG1 Fc区略有不同。一些实施方式中，LFA3-Fc WT(SEQ ID NO:4)和/或WT LFA3-Pfe(SEQ ID NO:120)具有羧基末端赖氨酸残基。一些实施方式中，SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:120不含羧基末端赖氨酸残基。一些实施方式中，SEQ ID NO:128不含羧基末端赖氨酸残基。
对LFA3变体Fc融合蛋白进行表征以评估重组蛋白的稳定性和潜在的可制造性属性。根据变体的单体表达、总产率、热稳定性和热应激聚集倾向对变体进行排序(图3A-3D)。根据该分析，变体M1、M4和M5被鉴定为具有最理想的特性。
二代库设计成能鉴定CD2结合亲和力提高的克隆。该库用野生型、M1、M4和M5变体作为模板对LFA3 FG环上7个残基进行了突变(图4)。根据序列分析，设计并在哺乳动物细胞中表达了12个变体LFA3-Fc融合蛋白用于后续分析(CM1d1->CM6d1和ML1d1->ML6d1)。CM1d1至CM6d1 Fc融合蛋白包含与人IgG1 Fc区(SEQ ID NO:16)融合的变体LFA3胞外结构域(分别对应SEQ ID NO:30-35)(表2)。类似的，ML1d1至ML6d1 Fc融合蛋白包含与人IgG1 Fc区(SEQ ID NO:16)融合的变体LFA3胞外结构域(分别对应SEQ ID NO:36-41)(表2)。对应的核苷酸序列见表3。
将二代环库中鉴定到的克隆表达为Fc融合蛋白，并用差示扫描荧光法(DSF)评估热稳定性(图5B)，用Biacore结合检测通过SPR评估对重组CD2蛋白的结合亲和力(图5A)。评估为最高亲和力的克隆具有60-100nM的表观亲和力(图5A)。评估为最高亲和力的克隆其亲和力相比亲本WT LFA3-Fc蛋白提高约20倍，相比M1d1-Pfe(亦称“LFA3-Fc M1d1”)和M4d1-Pfe变体提高10倍(图5A)。变体CM2d1-Pfe、CM5d1-Pfe和ML3d1-Pfe的DSF测得热稳定性高于野生型构建体(WT LFA3-Fc和WT LFA3-Pfe)和亲本变体构建体(M1d1-Pfe和M4d1-Pfe)(图5B)。
用基于结构分析的理性设计来拓展表达构建体中LFA3结构域的C末端边界(图6A)。表达并纯化了在野生型LFA3结构域(LFA3-Fc d1)或M-变体(M1-d1和M4-d1)上编码额外c-末端亮氨酸残基的构建体。LFA3-Fc d1、M1-d1(亦称“M1d1”)和M4-d1(亦称“M4d1”)Fc融合蛋白包含与人IgG1 Fc区(SEQ ID NO:16)融合的LFA3结构域(分别对应SEQ ID NO:24、26和28)(表2)。对应的核苷酸序列见表3。本申请发现，相比表达的具有LFA3 Fc融合蛋白先前公开的结构域边界的蛋白，d1变体的聚集体形成降低且热稳定性提高(图6B和6D)。在M1或M4背景上添加结构域边界修饰(d1)进一步提高了细胞培养物中蛋白质的单体分量(图6C)和DSF测得的热稳定性(图6D)。
以Fc融合蛋白的形式生产了包含额外的一个(d1，+L)(图7A)或六个(d3，
+LESLPS)(图7B)内源氨基酸的变体，对其稳定性和结合亲和力进行了表征。M1-d1和M1-d3(亦称“M1d3”)Fc融合蛋白包含与人IgG1 Fc区(SEQ ID NO:16)融合的LFA3结构域(分别对应SEQ ID NO:26和27)(表2)。对应的核苷酸序列见表3。M1-d1和M1-d3这两个变体表现出相似的CD2结合亲和力和体外热稳定性(图7C和7D)。
另外设计了一个LFA3变体M7，其相比M1在第86位多一个野生型残基(图8A)。M7-d1(亦称“M7d1”)Fc融合蛋白包含与人IgG1 Fc区(SEQ ID NO:16)融合的LFA3结构域(SEQ IDNO:29)(表2)。对应的核苷酸序列见表3。对M7-d1进行表征来评估单体分量(图8B)、热稳定性(图8C)和对重组CD2的结合亲和力(图8D)。
对变体LFA3-Fc和WT LFA3-Fc的稳定性和潜在的可制造性属性进行了表征(表4和表5)。这些检测发现，M1-d1(亦称“M1d1”)变体在单体蛋白表达、热稳定性、聚集倾向、对持续低pH的敏感性和冻融循环方面比野生型Fc融合体稳定得多(表4)。
表4.LFA3-Fc变体新的有用的分子特性
Figure BDA0002804257820001451
HMWS指高分子量物质，LMWS指低分子量物质。
*涵盖了本文全部LFA3-Fc变体的示例性实施方式。
表5.LFA3-Fc M1-d1工程化变体的分子特性概述
Figure BDA0002804257820001461
实施例2：M1d1的进一步体外和体内表征
导言
LFA3-Fc靶向一条重要的治疗途径，该途径如加以优化有可能在1型糖尿病(T1D)中恢复免疫耐受性，T1D迄今为止对改变疾病的干预措施基本上都有抗性，因此代表着最大的未得到满足的医疗需求，尤其是在儿童中。
M1d1(亦称“M1-d1”，“LFA3-Fc M1d1”和“LFA3-Fc M1-d1”)是二聚体LFA3-Fc融合蛋白，包含与IgG1 Fc区融合的LFA3第一胞外结构域。M1d1经工程化在LFA3细胞外结构域中包含四个非内源氨基酸以提高稳定性和可制造性。不希望受到理论的束缚，M1d1可通过ADCC/细胞毒性减少记忆CD4 T细胞和记忆CD8 T细胞，同时相对保留Treg和T初始细胞，并调节CD2/LFA3相互作用，从而改善CD4+T细胞和CD8+T细胞中的Treg/TEM比和Treg/TCM比。M1d1被证明调节猕猴的免疫表型，这与拟议的作用机理(MOA)和治疗假定一致。M1d1非临床研究表明PK是线性的且剂量成正比，并且，非GLP TK研究未发现除预期的淋巴细胞减少以外任何安全性问题。以下表6包括了药理学特性的概括，数据为靶标CD4记忆细胞群的数据
表6.LFA3-Fc变体新的有用的药理学特性
Figure BDA0002804257820001471
*涵盖了本文全部LFA3-Fc变体的示例性实施方式。
方法
CD2表达分析
对于淋巴细胞亚群，用Lymphoprep(Stemcell Technologies#07851)分离人外周血单核细胞(PBMC)。用90％的PBS配制的Lymphoprep(Corning#21-040-CM)分离猕猴PBMC，并将细胞重悬于荧光活化细胞分选(FAC)缓冲液(PBS加0.2％BSA(Jackson ImmunoResearch#001-000-173))。用人TruStain FcX(BioLegend#422302)封闭人细胞。每份样品染色200万个PBMC。对于T辅助细胞亚群，使用Easy Sep试剂盒(Stem Cell Technology#19052)按照制造商的说明分离CD4细胞，然后每份样品染色100万个细胞。至于表面染色，在分析之前，将细胞固定在细胞内(IC)固定缓冲液(Ebioscience#00-8222-49)中。至于FoxP3染色，按照制造商的说明用人FoxP3缓冲液组(BD Pharmingen#560098)。对人PBMC，细胞用以下抗体染色：CD4 BUV395，CD3 PerCp-e710，CD2 PE，CD45RO PeCy7，CD8 FITC，CCR7BV421，TIGIT APC，PD1 BV650，近红外(IR)活度(组1)；或CD4 BUV 395，CD3 Percp-e710，CD2 PE，CD8 BUV 496，CD20 FITC，CD159a A647，CD25 BV421，CD127 BV605和近红外(IR)活度。对猕猴PBMC，细胞用以下抗体染色：CD95 BUV 395，CD4 PerCP-e710，CD2 PE，CD28PeCy7，CD8 BUV496，CD3 FITC，CD20 V450，CD159a APC，PD1 BV650，近红外(IR)活度(组1)；或CD4Percpe710，CD3 FITC，CD25 BV421，CD2 PE，FoxP3 APC和近红外(IR)活度。在LSRFortessa上分析细胞，样品收集时进行Quantibrite珠处理(按照制造商的说明)。用近红外(IR)荧光活度染料(Invitrogen#L34976)来鉴别活细胞。数据表示为几何平均荧光强度(gMFI)。
LFA3-Fc竞争性结合检测
PBMC及亚群分离
来自Trima单采收集物并富集了PBMC的健康供体的Trima残留物获自从太平洋血液中心(Blood Centers of the Pacific)(加利福尼亚州旧金山)。通过密度梯度离心分离PBMC。用负选试剂盒(干细胞技术公司(StemCell Technologies))从PBMC中分离了纯化的CD4/CD8初始细胞群、中央记忆细胞群和效应记忆细胞群。
用CD4富集RosetteSepTM混合物(干细胞技术公司)并用标志物CD4-异硫氰酸荧光素(FITC)CD127-PE和CD25-APC进行荧光活细胞分选从全血中分离调节性T细胞。据CD4高CD127低CD25高鉴定调节性T细胞。在DynaBead人Treg扩增珠(英杰公司(Invitrogen))存在下，将分离的调节性T细胞在X-VIVO培养基(隆萨公司(Lonza))中扩增培养至多两周。
细胞结合检测
分离之后，CD4亚群和CD8亚群按每孔5x104个细胞的密度接种。对板离心并重悬于FACS缓冲液(含2％BSA的PBS)中测定Kd，其中含有人结晶片段Fc嵌段(每孔2μl)，LFA3-FcM1d1或LFA3-Fc WT的连续稀释液和竞争者市售抗CD2-FITC(克隆RPA2.10)。竞争者浓度在低于EC50的值上保持恒定(3.23x10-8M)，这样，竞争抗体仍然可检测但能够被竞争下来。细胞在冰上孵育2小时。细胞用FACS缓冲液清洗三次，重悬于100μl含活度染料的FACS缓冲液中。对于CD4效应细胞和中央记忆细胞分布，包括CCR7-BV421。15分钟的孵育之后，细胞用FACS缓冲液清洗，重悬于50μl FACS缓冲液，并进行流式细胞分析。
数据分析
用Cheng Prusoff方程计算LFA3-Fc的Kd。
Figure BDA0002804257820001481
通过将竞争者结合的几何平均荧光强度(gMFI)相对于LFA3-Fc抗体浓度的对数(log)值作图得出细胞结合曲线。对值进行归一化，最大结合为无竞争样品的平均值，最小值为无竞争者CD2-异硫氰酸荧光素(FITC)的样品。制做每一PBMC细胞亚群的细胞结合曲线(图11)。用GraphPad
Figure BDA0002804257820001491
(6.0版，GraphPad软件公司，加利福尼亚圣地亚哥)非线性回归曲线拟合和拮抗剂量效模型的S形log曲线来测定竞争者的IC50值(最大反应50％抑制时的有效浓度)。
MLR检测
从冷冻的PBMC库中选择HLA基因型完全不匹配的供体。用CD3和CD56正选试剂盒消减“刺激者”供体PBMC中的T细胞和NK细胞。对于所有NK消减检测，还用CD56正选试剂盒清除了“响应者”供体的NK细胞。将112500个细胞或75μl的各刺激者细胞群和响应者细胞群加入U形底96孔板的孔中。制备LFA3-Fc蛋白的3x连续稀释液，在各孔中加入75μl蛋白质。板在37℃孵育5天。离心分离细胞，用荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液(含2％BSA的PBS)清洗，然后用免疫表型分型抗体染色15分钟。采用以下抗体：CD3(BUV496)，CD4(BUV395)，CD8 PerCp-e710，CD45RO PeCy7，CD45RA FITC，CD25 PE-CF594，CD56 BV421，CD2-PE和近红外(IR)活度。临流式细胞分析之前向各孔中添加10μl CountBright珠。
计算CD4记忆细胞、CD4初始细胞、CD8记忆细胞、CD8初始细胞和CD56 NK细胞的绝对数。计算或报道CD4记忆细胞群的反应百分数：
Figure BDA0002804257820001492
同种异体反应抑制百分数计算为100减去反应百分数。将所得值对LFA3-Fc抗体浓度的log值作图。测定检测反应，将其作为记忆细胞绝对数的函数。用GraphPad
Figure BDA0002804257820001493
(6.0版，GraphPad软件公司，加利福尼亚圣地亚哥)非线性回归曲线拟合和激动剂量效模型的S形log曲线来测定EC50值。
TT回忆检测
对分离自Trima残留物分离的PBMC筛选破伤风类毒素反应性(Astarte生物制剂公司(Astarte Biologics))。保存强阳性响应者用于TTR检测。在U形底96孔板中，每孔添加100μl的200 000个PBMC。制备4x的LFA3-Fc多肽，每孔添加50μl的各LFA3蛋白。每孔添加50μl破伤风类毒素蛋白(1μg/mL)，37℃孵育5天。孔板16000rpm离心5分钟。采集125μl上清液用ELISA分析IFNγ生成。离心分离细胞，用FACS缓冲液(含2％BSA的PBS)清洗，然后用免疫表型分型抗体染色15分钟。采用以下抗体：CD3(BUV496)，CD4(BUV395)，CD8 PerCp-e710，CD45RO PeCy7，CD45RA FITC，CD25 PE-CF594，CD56BV421，CD2-PE和近红外(IR)活度。临流式细胞分析之前向各孔中添加10μl CountBright珠。
用IFNγ浓度来测定反应百分数。如前文MLR检测中所述计算反应百分数。记忆回忆反应抑制百分数计算为100减去反应百分数。将所得值对LFA3-Fc抗体浓度的log值作图。用GraphPad
Figure BDA0002804257820001501
(6.0版，GraphPad软件公司，加利福尼亚圣地亚哥)非线性回归曲线拟合和激动剂量效模型的S形log曲线来确定EC50值。
PK检测
在猕猴血清中制备标准品和质控品(QC)，然后用检测缓冲液(含0.5M NaCl的Scytek Superblock)对MRD进行20倍稀释。样品也用检测缓冲液按照MRD稀释。样品的任何其他稀释都用含5％猴血清的检测缓冲液进行，并添加到96孔PCR板上。分别制备50μg/mL和1μg/mL的生物素化捕获抗体(抗LFA3，英杰公司(Invitrogen)，MA1-19503)和AF647标记的检测抗体(驴抗人IgG H+L，Jackson免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)，709-005-149)，并上样到另一96孔PCR板上。在Gyrolab仪上设置板、Gyros 1000 CD和洗涤缓冲液以进行处理和分析。
结果
体外分析
T1D中组织破坏和病理的关键驱动因素之一是CD4+ TEM细胞。尽管CD2在所有T细胞上表达，CD2在TEM细胞上表达水平最高。CD2表达在TCR活化后进一步增加5倍。人细胞上的CD2水平(每细胞分子数)见图9和图10。M1d1结合(最大gMFI)与T细胞上CD2表达水平相关。M1d1具有IgG1 Fc，所述IgG1 Fc具有FcR结合性效应功能。通过i)细胞结合检测，ii)原代ADCC检测，iii)纯化NK细胞介导的细胞毒性检测，iv)混合淋巴细胞反应(MLR)中对同种异体刺激CD4和CD8增殖的抑制和v)使用破伤风类毒素的抗原回忆检测中对CD4mem产生IFNγ的抑制来表征体外药理学特性。此外，M1d1可能具有非ADCC依赖性作用机制。在体外，这通过MLR检测中的NK细胞消减以及采用Fc效应子功能变体分子来证明。所有体外检测中，将M1d1与作为基准的WT LFA3-Fc分子进行比较。其他对照包括同种型对照(mAb阴性对照，无Fc突变)和在所有以下所述检测中都没有活性/抑制作用的M1d1-Fc的效应子功能变体(“无效应”或“无eff”)(未出示数据)。不希望受理论所束缚，这些体外检测评估了M1d1的作用机制，包括优先靶向CD2高记忆T细胞，以及随后抑制记忆细胞反应。
CD2表达分析
所有T细胞都表达CD2。然而，不同细胞亚群上的绝对表达是不同的，记忆T细胞的CD2表达水平高于初始T细胞(图9)。B细胞不表达CD2，NK细胞表达不同低水平的CD2。活化后，CD2表达增加约5倍，然后在一周内恢复至基础水平(图10)。这样的表达提供了一个窗口，在该窗口中可以靶向CD2高TEM细胞而不靶向Treg和T初始细胞。
在人PBMC中，CD2分子定量显示CD4记忆细胞和CD8记忆细胞上分子数量最大，具体地说，CD4中央记忆(“cen mem”)细胞平均表达9220个分子；人CD4效应记忆(“eff mem”)细胞平均表达11,000个分子；人CD8中央记忆细胞平均表达11,800个分子；人CD8效应细胞平均表达10,000个分子(表7，图9)。人CD8记忆细胞中，中央记忆细胞的分子数大于效应记忆细胞(p＝<0.05)。人CD4记忆细胞中，效应记忆细胞的CD2分子多于中央记忆细胞(p＝<0.05)。
表7.人PBMC中淋巴细胞亚群上的CD2定量
Figure BDA0002804257820001511
Treg＝调节性T细胞
用Quantibrite分析定量CD2表达(图17)。与人类的一样，猕猴记忆T细胞比初始细胞表达更高的每细胞CD2分子数。在猕猴中，与人类不一样，CD8+细胞具有双模态的CD2表达，约10-20％为CD2阴性。CD2分子定量显示，CD4记忆细胞和CD8记忆细胞上的分子数量最多，其中，CD4中央记忆细胞表达8,570个分子，CD4效应记忆表达8,140个分子，CD8中央记忆表达7,100个分子，CD8效应记忆表达5,880个分子(图17，表8)。
表8.猕猴PBMC中淋巴细胞亚群上的CD2定量
Figure BDA0002804257820001512
人和猕猴B细胞都有可忽略不计的CD2表达，分别为28.6和42.1个分子。人初始CD8和CD4细胞以及Treg细胞分别有6,510、5,280和6,720分子，代表人PBMC中T淋巴细胞亚群中的最低CD2分子数。猕猴初始CD8和CD4分别表达4,510和5,200个分子，因此在猕猴T细胞亚群中为最低数量。
人CD4记忆细胞中，Klrg1-Tigit+PD1+细胞中，CD2表达为11,800gMFI，相比之下，Klrg1+细胞为17,000(图25A-25B)。Klrg1-Tigit+PD1+表达被建议用于鉴定变应性表型的T细胞。
T辅助细胞亚群中，相比Treg细胞和Th2细胞，CD2表达在炎性Th17/Th1细胞和Th22细胞中最高(图26A-26B)。
表9.人辅助T细胞亚群上的CD表达
Figure BDA0002804257820001521
CCR7＝7型C-C趋化因子受体；PD1＝程序性细胞死亡蛋白1；TH＝T辅助细胞；Tfh＝滤泡辅助T细胞；Treg＝调节性T细胞。
人和非人灵长类PBMC中，所有T细胞亚群都表达CD2。T细胞区室中，非调节性记忆T细胞表达最多的每细胞CD2分子数，每细胞CD2分子数比初始T细胞多大约1.5-2倍。这些结果显示，重要的细胞群(例如T细胞)表达LFA3-Fc M1d1治疗肽的靶标。这些数据还显示，可利用免疫表型分型来为LFA3-Fc多肽治疗进行患者分级。
LFA3-Fc竞争性结合分析
LFA3-Fc与CD2的结合是亲和力相对较低的相互作用，如SPR所测定的(1μM)。由于清洗严格性会显著影响数据，因此难以实现LFA3-Fc与原代T细胞的饱和结合。所以，用抗CD2抗体进行竞争性结合检测来测定M1d1对T细胞亚群的表观亲和力(表10和图11)。LFA3-Fc WT对CD4记忆细胞和CD4初始细胞的平均表观亲和力分别为0.501和0.391nM(表10)。LFA3-Fc M1d1对CD4记忆细胞和CD4初始细胞的平均表观亲和力分别为0.094和0.054nM(表10)。这些研究显示，LFA3-Fc WT和LFA3-Fc M1d1结合CD2+细胞(例如CD4记忆细胞和CD4初始细胞)，并且，LFA3-Fc M1d1对细胞表面CD2的亲和力约5倍高于LFA3-Fc WT。因此，这些研究显示，治疗性多肽LFA3-Fc M1d1表现出对靶表面标志物CD2提高的亲和力。
表10：抗CD2抗体竞争性结合检测测定的LFA3-Fc与原代人T细胞的结合。
Figure BDA0002804257820001531
EM＝效应记忆；CM＝中央记忆
MLR检测
混合淋巴细胞反应(MLR)响应评估对同种异体刺激的CD4+和CD8+T细胞反应(例如扩增)，并且包括在刺激时为初始态的细胞的反应。这是更复杂的功能性反应并由此能够评估ADCC之外的机制。M1d1完全抑制响应同种异体刺激的CD4+T细胞(图14A)和CD8+T细胞的扩增(未出示数据)，比WT LFA3-Fc更强烈(图14A和14B)。
为了体外评估M1d1是否具有除NK介导的细胞杀伤之外的作用机制，从MLR检测中消减KN细胞。在无NK细胞的情形下M1d1仍然在MLR中抑制CD4+T细胞扩增，虽然IC50有所提高(图15A-15C)。获得的其他支持性数据显示缺乏CD16结合性(与ADCC相关的FcR)的LFA3-Fc效应子功能变体也能够抑制同种异体反应(未出示数据)。这符合LFA3-Fc相关非NK细胞依赖性作用机制。
这些研究表明，治疗性多肽LFA3-Fc M1d1在同种异体MLR检测中抑制T细胞反应，并且，LFA3-Fc M1d1的体外功效高于LFA3-Fc WT。
TTR检测
为了评估预存记忆细胞反应抑制，用破伤风类毒素(TT)离体(ex vivo)刺激TT反应性供体PBMC。M1d1完全抑制响应TT类毒素的离体抗原特异性记忆细胞扩增和细胞因子分泌(IFNγ)(图16A和16B)。WT LFA3-Fc抑制该反应的效力低于M1d1(图16A和16B)。这些研究表明，治疗性多肽LFA3-Fc M1d1在TTR检测中抑制T细胞反应，并且，LFA3-Fc M1d1的体外功效高于LFA3-Fc WT。
实施例3：体内分析
人LFA3不结合啮齿动物CD2，但是结合非人灵长动物CD2。已经对非人类灵长类动物的阿法西普治疗所致免疫调节和记忆T细胞消减进行了评估(Weaver等，(2009)NatMed.15(7):746–749)。
在猕猴中进行了两项M1d1研究：第一项是单剂量考察性研究(17-MA005)。第二项研究17MA057是重复剂量PK/PD研究，设计有广泛的免疫表型分析，用以支持对量效关系、单剂量和重复剂量效应以及受累细胞恢复的理解。包括WT LFA3-Fc平行剂量反应。因为在雌猴中未观察到明显差异，因此合并了雄性和雌性的数据进行分析。
有8周观察期的单剂量IV探索性毒性研究(17MA005)
对猕猴以载剂对照或剂量为0.3mg/kg或100mg/kg的LFA3-Fc M1d1通过首日一次IV推注给药。未见与试验品相关的死亡也未见临床症状征。0.3mg/kg LFA3-Fc M1d1给药的动物中，所有参评细胞类型都没有试验品相关改变。100mg/kg LFA3-Fc M1d1给药的雄猴和雌猴中都观察到某些淋巴细胞亚群中有试验品相关改变(表12)，虽然所有细胞亚群都在第57天或此前回到基线值。总体而言，100mg/kg的Cmax值和AUC终值(1-1368小时)分别为3590μg/mL和238,00μg*h/mL。0.3mg/kg LFA3-Fc M1d1给药的动物的抗药物抗体诱导的发生率为66％(2/3)，100mg/kg LFA3-Fc M1d1给药的动物为50％(1/2)。
在第-14、1(给药前)、2、4、8、15、29、43和57天采集外周血样品。用流式细胞术测定各淋巴细胞亚群的百分比。100mg/kg的LFA3-Fc M1d1给药在至少一个动物的外周血中引起总T细胞、辅助T细胞和细胞毒性T细胞数量试验品相关性地瞬态性降至基线以下。T细胞毒性细胞和T辅助细胞中的初始、中央记忆和效应记忆亚群数量也有降低。还观察到CD25Foxp3 T辅助(调节性T)细胞的数量以及PD-1+ T细胞毒性细胞的数量和百分比降低。所有亚群降低的范围在0.01-0.37x。大部分的降低可见于第15天和/或第29天。所有细胞亚群在第57天或此前恢复到基线。B细胞和NK细胞的数量、或是PD-1+ T辅助细胞或PD-1+效应或中央记忆T辅助细胞和T细胞毒性细胞的百分比都没有试验品相关的改变。0.3mg/kg LFA3-FcM1d1给药的动物中，所有参评细胞类型都没有试验品相关改变。
猕猴PBMC与M1d1或WT LFA3-Fc蛋白离体孵育，并用流式细胞术评估细胞毒性。M1d1诱导剂量依赖性CD4+ TEM体外细胞毒性。M1d1的最大细胞毒性与WT LFA3-Fc相当，强于WT LFA3-Fc分子(图18A和18B)。总体上，猕猴细胞的EC50高于人PMBC的。有6周观测期的4周IV推注PK/PD研究(17MA057)
17MA057的实验设计见图19。在第1、8、15和22天(即4周，每周一次)对猕猴IV推注给药0.03、0.3或3mg/kg/剂的LFA3-Fc M1d1或LFA3-Fc WT，接着是6周的观测期。在给药开始前、于给药日并于观测期内的第36、43、50、57、64和71天采集所有动物的血样。用流式细胞术测定各淋巴细胞亚群的百分比。LFA3-Fc M1d1或LFA3-Fc WT给药后淋巴细胞亚群中变化的测定限于总T细胞、CD4+ T细胞，CD8+ T细胞，NK细胞，B细胞，CD4+和CD8+初始、中央记忆和效应记忆T细胞和调节性T细胞。用绝对细胞数和与基线值之比来测定改变。
LFA3-Fc M1d1给药的动物观察到与基线相比的B细胞和NK细胞数量改变。0.3(1.37x-1.94x基线)、0.3(1.41x基线)或3(1.50x-2.92x基线)mg/kg/剂给药的动物B细胞增加，≥0.03mg/kg/剂给药时NK细胞降低(0.27x-0.44x基线)，主要在第一或其他给药日的给药后6小时。大多数动物的B细胞和NK细胞改变在给药后24小时内恢复到基线值。
M1d1重复给药降低外周CD4+ TEM细胞(图20A和34A)。相对而言，M1d1不大作用于Treg，因此，Treg/TEM比升高(图20B和34B)。CD8+ TEM细胞也降低。对T初始细胞作用极小。恢复期结束，第57天内可见恢复趋势或新基线确立。
M1d1对总T细胞数的总体影响比较中度(3mg/kg时<50％降低)，未达到免疫抑制相关阈值(图21)。治疗不减少B细胞(未显示)。在体内，M1d1优先靶向CD2高TEM细胞(图21)。
如前所述，研究17MA057中包括WT LFA3-Fc平行剂量反应用作基准。猕猴内WTLFA3-Fc重复给药降低CD4 EM细胞，提高Treg/CD4+ TEM比(图22A和22B以及图35A和35B)。
通过将NHP重复给药研究数据(4周，每周0.03、0.3或3mg/kg，随后6周恢复期)拟合到2分室PK模型来测定M1d1和WT LFA3-Fc的NHP PK参数(图23A和23B)。通过对来自文献的临床平均数据(0.04、0.15和0.2mg/kg的单剂量(IV/IM/SC))数字化并将其拟合到2分室PK模型得出阿法西普的人PK参数。这些PK参数见以下表11。M1d1的清除比WT LFA3-Fc慢2倍。
评估了LFA3-Fc M1d1有效剂量估值。假设LFA3-Fc M1d1皮下途径吸收接近阿法西普肌内给药且估计LFA3-Fc M1d1清除率比阿法西普低2倍，则每周7.5mg LFA3-FC M1d1的SC剂量将是对人有效的。
表11.M1d1和WT LFA3-Fc的PK参数
Figure BDA0002804257820001561
*基于公开数据；**预估
在猴子的单剂量考察性毒性研究中未见M1d1相关不良事件。100mg/kg M1d1给药的动物中，T淋巴细胞减少是唯一的试验品相关改变，随后在第57天之前恢复。基于阿法西普的公开数据，毒性靶标仅为那些预期与CD2阳性淋巴细胞中度至显著消减以及相关免疫抑制相关的靶标。M1d1毒性研究综述见表12。
表12.M1d1毒性研究综述
Figure BDA0002804257820001562
Figure BDA0002804257820001571
a 边界为PK/PD研究(17MA057)得出的基于预估有效曝露的估值：
M1d1在有效剂量的预估AUC范围是16至550μg*day/mL，剂量范围是0.22–7.5mg。
b Cmax＝血清中观测到的最高药物浓度；AUC168＝给药后0-168小时的时间-药物浓度曲线下面积。
实施例4：LFA3-Fc M1d1和LFA3-Fc WT的生物物理学表征和稳定性研究
对LFA3-Fc M1d1(亦称“LFA3-Fc M1-d1”，“M1d1”，“M1-d1”或“M1d1-Pfe”)和LFA3-Fc WT(亦称“WT LFA3-Fc”)的生物物理学特征和稳定性进行鉴定，用来预计相对可制造性。
热稳定性评估
通过DSC(差示扫描量热法)在Tris缓冲液(pH 7.5)、组氨酸缓冲液(pH 5.8)和谷氨酸盐缓冲液(pH 4.5)中评估LFA3-Fc M1d1的热稳定性。该蛋白质在组氨酸和Tris缓冲液中的转变温度(TM1)高于65℃(表13和图27)。
表13.LFA3-Fc M1d1的热转变温度
Figure BDA0002804257820001572
为了分别分析LFA3结构域和Fc结构域(CH2和CH3)，将样品用FabRICATOR IdeS(Genovis AB公司，马萨诸塞州剑桥市)在37℃处理30分钟。LFA3结构域(亦称“LFA3片段”)表现出的热转变温度与Fc片段CH2结构域的热转变温度相近(图28)。
用DSC比较LFA3-Fc M1d1与LFA3-Fc WT的热稳定性。LFA3-Fc WT在所有条件下的热解折叠稳定性都低于LFA3-Fc M1d1。LFA3-Fc WT的热解折叠稳定性显著低于抗体的目标温度(例如TM1≥65℃)(表14)。
表14.LFA3-Fc M1d1和LFA3-Fc WT的热转变温度
Figure BDA0002804257820001573
Figure BDA0002804257820001581
如后文所述用DSC接FabRICATOR IdeS比较LFA3-Fc M1d1与LFA3-Fc WT的热稳定性。还分别分析了消化所得LFA3结构域和Fc结构域(即CH2和CH3)。M1d1 LFA3结构域/CH2结构域比WT LFA3结构域/CH2结构域具有显著更高的热解折叠稳定性(分别为64.8℃相比52.2℃)(表15)。
表15.LFA3-Fc M1d1和LFA3-Fc WT结构域的热转变温度
LFA3/CH2 LFA3 CH2 CH3
LFA3-Fc M1d1 66.8 - 82.3
M1d1 Fc - 73.4 80.7
M1d1 LFA3 64.8 - -
LFA3-Fc WT 53.2 67 83.2
WT Fc - 73.4 81.7
WT LFA3 52.2 - -
电荷异质性
用等电点毛细管电泳在以下三种条件下评估LFA3-Fc M1d1和LFA3-Fc WT的电荷异质性：20mM Tris pH 7.5，20mM组氨酸pH 5.8和20mM谷氨酸盐pH 4.5。两种分子均表现出复杂的电荷分布，包含15-18个不同类别(图29A-29C)。LFA3-Fc WT和M1d1(>20种pI)的异质性反映六个LFA3-Fc N-连接聚糖位点上的酸性唾液酸修饰。与LFA3-Fc M1d1相比，观察到LFA3-Fc WT化合物的解析度较低。
稳定性
在2、4或6周的时程性研究中评估LFA3-Fc M1d1和LFA3-Fc WT的稳定性。用分子量截值为30K的再生纤维素滤膜(Amicon公司)对样品进行离心超滤/渗滤。将25μl或100μl的各多肽制剂(表16)装入500μl冷冻管中。研究条件见表16。
表16.稳定性研究条件
Figure BDA0002804257820001582
Figure BDA0002804257820001591
毛细管凝胶电泳
在第2、4和6周用非还原条件(NR)下的毛细管凝胶电泳(CGE)分析多肽的片段化，即低分子量物质(LMMS)百分比升高所体现的片段化。与LFA3-Fc M1d1相比，在40℃，LFA3-Fc WT的片段化显著增加(图30A-30C)。在25℃，在LFA3-Fc WT样品中观察到LMMS百分比增加的趋势，但在LFA3-Fc M1d1样品中LMMS百分比没有增加(未出示数据)。LFA3-Fc WT和M1d1在5℃的LMMS百分比均无显著变化(未出示数据)。LFA3-Fc M1d1在各种缓冲液配方中的稳定性相似。然而，与组氨酸或谷氨酸盐相比，配制在Tris中时LFA3-Fc WT明显更稳定。
LFA3-Fc WT制剂在还原和非还原条件下的纯度为约97％。LFA3-Fc M1d1制剂在还原和非还原条件下的纯度为约99％。
尺寸排阻色谱
40℃存放2或4周后，通过尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)分析多肽(图31A-31D)。与第0周相比并与配制在谷氨酸盐缓冲液中的LFA3-Fc M1d1相比，在第2周和第4周，LFA3-Fc WT谷氨酸盐制剂中的聚集量显著增加，表现出高分子量物质(HMMS)百分比增加(图31C)。用谷氨酸盐或组氨酸缓冲液配制的LFA3-Fc WT中，LMMS的形成也显著增加(图31D)。在LFA3-Fc M1d1组氨酸和谷氨酸盐制剂中，在4周时观察到LMMS增加2-3％(图31D)。
25℃存放2、4或6周后，通过SE-HPLC分析多肽(图32A-32D)。与LFA3-Fc M1d1制剂相比，在LFA3-Fc WT制剂中检测到更高的HMMS起始百分比。在LFA3-Fc M1d1制剂中，测得HMMS增加1-2％，而在LFA3-Fc WT制剂中HMMS增加2-10％。在用谷氨酸盐/海藻糖缓冲液配制的LFA3-Fc WT中检测到HMMS百分比的最显著增加(～10％)(图32C)。全部LFA3-Fc M1d1制剂中均未见LMMS的显著增加，但在组氨酸/蔗糖缓冲液和谷氨酸盐/海藻糖缓冲液中配制的LFA3-Fc WT在6周时观察到LMMS增加约7％(图32D)。
5℃存放2、4或6周后，通过SE-HPLC分析多肽(图33A-33D)。与LFA3-Fc M1d1制剂相比，在LFA3-Fc WT制剂中检测到更高的HMMS起始百分比(图33A-33C)。在用谷氨酸盐/海藻糖缓冲液配制的LFA3-Fc WT中检测到HMMS百分比的最显著增加(～2.8％)(图33C)。
总体而言，在所有测试条件下，与LFA3-Fc WT相比，LFA3-Fc M1d1表现出优异的抗片段化稳定性。具体地说，LFA3-Fc WT在所测试的制剂中在低pH下表现出明显的不稳定性。与Tris和组氨酸缓冲液中40℃相比，25℃时LFA3-Fc WT的聚集速率更高，由此提示浓度依赖性或赋形剂不相容性。
溶解度
在pH 4.5、含谷氨酸盐、海藻糖和EDTA的缓冲液中，测得LFA3-Fc WT的溶解度可达165mg/mL。在pH 4.5、含谷氨酸盐、海藻糖和EDTA的缓冲液中，测得LFA3-Fc M1d1的溶解度可达148mg/mL。
聚糖分析
LFA3-Fc WT和LFA3-Fc M1d1多肽都包含抗体Fc结构域的特征性N-聚糖。WT多肽的LFA3结构域包含高度分支的聚糖和约22nmol唾液酸/nmol LFA3-Fc WT多肽。M1d1多肽的LFA3结构域也包含高度分支的聚糖和约14nmol唾液酸/nmol LFA3-Fc M1d1多肽。
实施例5：FA3-Fc M1d1的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
该研究中表征了LFA3-Fc M1d1和LFA3-Fc WT对人T细胞的体外ADCC。CD2在所有T细胞上表达，相比初始或调节性T细胞在记忆T细胞上表达最高。LFA3-Fc结合CD2，且主要作用机制是ADCC。
这项研究表明，LFA3-Fc M1d1诱导记忆CD4细胞ADCC比LFA3-Fc WT强3-4倍。而且，相比初始T细胞，LFA3-Fc M1d1优先靶向记忆CD4+ T细胞。
方法
PBMC ADCC检测与流式细胞分析_
用SepMateTM管和LymphoprepTM按照制造商的说明(干细胞技术公司，华盛顿州克维拉)通过密度梯度离心分离采自健康人类供体的PBMC。分离后，将PBMC按每孔2.0X105个细胞的密度接种在圆底96孔板中的完全RPMI培养基中。该检测中，PMBC是天然杀伤(NK)效应细胞和靶T细胞(CD4记忆和非记忆细胞，CD8记忆和非记忆细胞)的来源。根据CD45RO表达区分记忆和非记忆细胞(记忆细胞为CD45RO+；非记忆细胞为CD45RO-)。将LFA3-Fc融合蛋白的连续稀释液添加至孔中，细胞于37℃、5％CO2孵育约20小时。
将板室温(RT)下300X g(重力)离心5分钟。用冰冷的荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液清洗PBMC，重悬于50μL的冰冷FACS缓冲液中，该缓冲液含有用于染色淋巴细胞亚群的荧光偶联抗体。染色组包括：CD3(BUV496)、CD4(BUV395)、CD8(PerCP-e710)、CD45RO(PeCy7)、CD45RA(FITC)、CD25(PE-CF594)、CD56(BV421)、CD2(PE)和近红外(IR)活度。
4℃孵育15-30分钟后，PBMC用冰冷的FACS缓冲液清洗两次，重悬于100μL含0.5％多聚甲醛(PFA)的PBS中。将CountBrightTM绝对计数珠(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))添加入各孔(10μL)。通过流式细胞分析(BD LSRFortessasTM细胞分析仪)对板进行分析。
NK滴定细胞毒性检测
新鲜分离的PBMC在完全RPMI+10％FBS中、5x106细胞/ml放置过夜。次日，用干细胞技术公司的分离试剂盒分离靶细胞(CD4记忆细胞，CD4初始细胞或B细胞)。还分离了来自同一供体的对应自然杀伤(NK)细胞。将体积为50μL的靶细胞按30,000个细胞/孔接种在V形底96孔板中。将NK细胞制备成2倍连续稀释液，取50μL加至靶细胞。制备10x的LFA3-Fc多肽，最终工作浓度为100nM。将11μL多肽加入相应孔中，将板在37℃孵育4小时。洗板，并用含有膜联蛋白V Alexa Fluor 488、7-AAD，CD56 BV421和CD4APH-H7的染色缓冲液染色30分钟。用膜联蛋白V结合缓冲液清洗细胞，在PBS中用2％PFA固定10分钟，清洗，然后进行流式细胞分析。各孔中均包含CountBright珠来测定绝对数。
数据分析
通过将抗原结合群的细胞毒性百分数相对于LFA3-Fc多肽浓度的log对数作图来生成细胞毒性滴定曲线。细胞毒性百分数的计算为无处理对照减去实验样品之间的活细胞绝对数之差除以无处理对照乘以100。比细胞毒性百分数的计算为无处理对照减去实验样品的活细胞绝对数之差除以无处理对照减去同种型对照之差再乘以100。用GraphPad
Figure BDA0002804257820001611
(6.0版，GraphPad软件公司，加利福尼亚圣地亚哥)非线性回归曲线拟合和激动剂量效模型的S形log曲线来测定50％最大反应的有效浓度(EC50)值。
结果
LFA3-Fc WT和LFA3-Fc M1d1在所有参试细胞类型中诱导ADCC。与LFA3-Fc WT相比，LFA3-Fc M1d1显示在记忆和非记忆细胞中ADCC效力提高(表17，图12A-12E)。
表17.LFA3-Fc多肽的ADCC诱导
Figure BDA0002804257820001621
各细胞类型的n＝5
相比初始细胞或B细胞，LFA3-Fc WT和LFA3-Fc M1d1诱导优先杀伤分离的CD2高表达记忆细胞。
表18.NK细胞毒性
Figure BDA0002804257820001622
ND＝未测定
评估NK介导的细胞毒性的另一种检测是用纯化的NK细胞与靶细胞按照递增比例培养。在多个供体上用更高浓度多肽进行的NK滴定细胞毒性试验证实了对分离记忆细胞的优先杀伤。纯化的靶细胞群(CD4记忆细胞，CD4初始细胞和B细胞)与NK细胞按不同的效应细胞与靶细胞之比并与100nM的LFA3-Fc WT或LFA3-Fc M1d1一起培养(图13B-13C)。在10:1的效应细胞/靶细胞之比(E:T)与100nM的蛋白质浓度下，LFA3-Fc WT和LFA3-Fc M1d1在CD4记忆细胞和初始细胞中诱导细胞毒性(表19)。
表19.NK细胞毒性
Figure BDA0002804257820001623
各细胞类型的n＝3
这项研究举例说明了在采用人PBMC的体外检测中LFA3-Fc蛋白诱导对CD2+T细胞的ADCC。LFA3-Fc M1d1诱导记忆CD4细胞ADCC比LFA3-Fc WT强3-4倍。LFA3-Fc M1d1优选靶向记忆CD4+T细胞，记忆CD4+T细胞比初始CD4T细胞表达更高水平的CD2蛋白。因此，这些研究表明，治疗性多肽LFA3-Fc M1d1诱导靶细胞即CD2+T细胞的ADCC。
表20.LFA3-Fc变体新的有用的特性
Figure BDA0002804257820001631
Figure BDA0002804257820001641
*涵盖了本文全部LFA3-Fc变体的示例性实施方式。
尽管以就多种应用、方法、试剂盒和组合物对公开内容进行了描述，可以看出，可以进行多种不悖离本文所述和要求保护的发明的改变和调整。以上实施例仅供更好地说明本文公开的内容，不为限定本文公开内容的范围。尽管本文的记载已经描述了示例性实施方式，本领域技术人员不难理解，无需过度实验即可对这些示例性实施方式做出多种改变和调整。所有的这些改变和调整都都包括在本公开的范围之内。
本文中引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及其中引用的参考文献，倘若尚未通过引用全文纳入本文，在此全部通过引用全文纳入本文用于所有目的。如果纳入的文献和类似材料中有一篇或多篇与本申请不同或矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、记载的技术等，以本申请为准。
对本领域的技术人员显而易见的是，可以对本发明进行各种修改和改变而不偏离本发明的范围或精神。本领域的技术人员通过考虑本申请说明书和实施本文发明，将会明显看出本发明的其他实施方式。本说明书和实例应仅视为示例性的，本发明真正的范围和精神由所附权利要求书来说明。
序列表
<110> 弗埃塞股份有限公司(PFIZER INC.)
加利福尼亚大学董事会(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA)
<120> LFA3变体及其组合物与用途
<130> PC72432A
<150> US 62/650,002
<151> 2018-03-29
<150> US 62/783,986
<151> 2018-12-21
<160> 130
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val
1 5 10 15
Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln
20 25 30
Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn
35 40 45
Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala
50 55 60
Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg
65 70 75 80
Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr
85 90 95
Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp
100 105 110
Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr
115 120 125
Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile
130 135 140
Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp
145 150 155 160
Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys
165 170 175
Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro
180 185 190
Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser
195 200 205
Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala
210 215 220
Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Ile Leu Lys Cys
225 230 235 240
Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn
245 250
<210> 2
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu
85 90 95
Pro Ser Pro Thr Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val
100 105 110
Gln Cys Met Ile Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met
115 120 125
Tyr Ser Trp Asp Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser
130 135 140
Ile Tyr Phe Lys Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr
145 150 155 160
Leu Ser Asn Pro Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr
165 170 175
Cys Ile Pro Ser Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Leu Ala Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly
195 200 205
Ile Leu Lys Cys Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn
210 215 220
<210> 3
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val
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<210> 4
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser
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Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
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65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Asp Lys Thr His
85 90 95
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
100 105 110
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
115 120 125
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
130 135 140
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
145 150 155 160
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
165 170 175
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
180 185 190
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
195 200 205
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
210 215 220
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
225 230 235 240
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
245 250 255
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
260 265 270
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
275 280 285
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
290 295 300
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
305 310 315
<210> 5
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<222> (20)..(20)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> N是A, C, G或T
<400> 5
gagtaacgtt cctttgaagv akgtcntttg gangaaacaa angvamangg tggcagaatt 60
agagaatag 69
<210> 6
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<222> (57)..(57)
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gaaaaaacaa aaagataaag tggcavaktt avamaatagt vaktttangg ctnwtrsttc 60
atttaagaat agggtc 76
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<211> 52
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
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<210> 8
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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gtttacggta atgtgactnt tcacnttccg agtaacgttc ctnttaagga anttttatks 60
aaaaaacaaa aagataaagt g 81
<210> 9
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<222> (56)..(56)
<223> K是G或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> Y是C或T
<400> 9
cttatggaaa aaacaaaaag ataaanttky agaanttgag aatagtgagn ttaggkyatt 60
tagttcattt aagaatag 78
<210> 10
<211> 67
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
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catttaagaa tagggtctat nttgatactg tatccrsttc tnttaccatt tataatttaa 60
caagtag 67
<210> 11
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<220>
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<220>
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gatgaagacg agtacgaawt sgagtcccct aatattacag acacawtsaa gntttttttg 60
tacgttttgg g 71
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> K是G或T
<400> 12
gaagacgagt acgaaatgga gnnknnknnk nnknnknnkn nkatgaagtt ttttttgtac 60
gttttg 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<222> (37)..(38)
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<220>
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<220>
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<223> N是A, C, G,或T
<220>
<221> misc_feature
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<223> K是G或T
<400> 13
gaagacgagt acgaaatgga gnnknnknnk nnknnknnkn nkttcaagtt ttttttgtac 60
gttgg 65
<210> 14
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
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<220>
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<220>
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<222> (25)..(26)
<223> N是A, C, G或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> K是G或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(29)
<223> N是A, C, G或T
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(32)
<223> N是A, C, G或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> K是G或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(35)
<223> N是A, C, G或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> K是G或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(38)
<223> N是A, C, G或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> K是G或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(41)
<223> N是A, C, G或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> K是G或T
<400> 14
gaagacgagt acgaattcga gnnknnknnk nnknnknnkn nkttcaagtt ttttttgtac 60
gttg 64
<210> 15
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 16
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 17
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val
85 90
<210> 18
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Phe Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val
85 90
<210> 19
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Val Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val
85 90
<210> 20
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Val Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Phe Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val
85 90
<210> 21
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Ile Arg Val Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Phe Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val
85 90
<210> 22
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Leu Glu Phe Glu Asn Ser Glu Leu Arg Val Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Phe Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val
85 90
<210> 23
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val
85 90
<210> 24
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu
85 90
<210> 25
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu
85 90 95
Pro Ser
<210> 26
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
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50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro
65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
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<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
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Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
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<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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1 5 10 15
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<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
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Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
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<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
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Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
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Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
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<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
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50 55 60
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<210> 35
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
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1 5 10 15
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35 40 45
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<223> 合成构建体
<400> 36
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1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
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50 55 60
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Tyr Pro Tyr Glu Ser Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu
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<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Val Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Phe Glu Ser Trp
65 70 75 80
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85 90
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<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
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50 55 60
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Tyr Pro Tyr Arg Gln Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu
85 90
<210> 39
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
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<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
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Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
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65 70 75 80
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<210> 41
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
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<210> 42
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
atgggctggt cctgtatcat cctctttctg gtggccacag ctaccggagt gcatagc 57
<210> 43
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggaaga gatgaccaag 420
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggt 678
<210> 44
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtcccct 240
aatattacag acacattcaa gttttttttg tacgtt 276
<210> 45
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaatt cgagtcccct 240
aatattacag acacattcaa gttttttttg tacgtt 276
<210> 46
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggtatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtcccct 240
aatattacag acacattcaa gttttttttg tacgtt 276
<210> 47
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggtatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaatt cgagtcccct 240
aatattacag acacattcaa gttttttttg tacgtt 276
<210> 48
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgagatta gggtatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaatt cgagtcccct 240
aatattacag acacattcaa gttttttttg tacgtt 276
<210> 49
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttttaga atttgagaat 120
agtgagctta gggtatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaatt cgagtcccct 240
aatattacag acacattcaa gttttttttg tacgtt 276
<210> 50
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtcccct 240
aatattacag acacaatgaa gttttttttg tacgtt 276
<210> 51
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
ttttcccaac aaatatatgg tgttgtgtat gggaatgtaa ctttccatgt accaagcaat 60
gtgcctttaa aagaggtcct atggaaaaaa caaaaggata aagttgcaga actggaaaat 120
tctgaattca gagctttctc atcttttaaa aatagggttt atttagacac tgtgtcaggt 180
agcctcacta tctacaactt aacatcatca gatgaagatg agtatgaaat ggaatcgcca 240
aatattactg ataccatgaa gttctttctt tatgtcctc 279
<210> 52
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
ttttcccaac aaatatatgg tgttgtgtat gggaatgtaa ctttccatgt accaagcaat 60
gtgcctttaa aagaggtcct atggaaaaaa caaaaggata aagttgcaga actggaaaat 120
tctgaattca gagctttctc atcttttaaa aatagggttt atttagacac tgtgtcaggt 180
agcctcacta tctacaactt aacatcatca gatgaagatg agtatgaaat ggaatcgcca 240
aatattactg ataccatgaa gttctttctt tatgtccttg agagtctgcc cagc 294
<210> 53
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtcccct 240
aatattacag acacattcaa gttttttttg tacgttctc 279
<210> 54
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtcccct 240
aatattacag acacattcaa gttttttttg tacgttcttg agagtctgcc cagc 294
<210> 55
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggtatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaatt cgagtcccct 240
aatattacag acacattcaa gttttttttg tacgttctc 279
<210> 56
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtcccct 240
aatattacag acacaatgaa gttttttttg tacgttctc 279
<210> 57
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtccagg 240
aatggtggac ctgatttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 58
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtccagg 240
aatccttata gaaggttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 59
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtccagg 240
aatccttata gagacttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 60
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtcctgg 240
aatggtggac ctgatttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 61
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtcctgg 240
aatccttata gaaggttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 62
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtcctgg 240
aatccttata gagacttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 63
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
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tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagggtcgg 240
tatccgtatg agtcgttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 64
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
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tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaatt cgagagttgg 240
gagcctggga gggagttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 65
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
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tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggaggctcgg 240
tatccttatc ggcagttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 66
<211> 279
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
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tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagatgcgg 240
aatggtggtc ctgatttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 67
<211> 279
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
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gatgggggtc ctgatttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 68
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtcgtgg 240
tctccttata aggcgttcaa gttttttttg tacgttttg 279
<210> 69
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Asp Lys Thr
85 90 95
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
100 105 110
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
115 120 125
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
130 135 140
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
145 150 155 160
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
165 170 175
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
180 185 190
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
195 200 205
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
210 215 220
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
225 230 235 240
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
245 250 255
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
260 265 270
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
275 280 285
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
290 295 300
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
305 310 315
<210> 70
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
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<220>
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<220>
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<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
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<222> (42)..(42)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(47)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 70
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Xaa Val Xaa Trp Xaa Lys Gln Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Val Ala Xaa Leu Xaa Asn Ser Xaa Phe Xaa Ala Xaa Xaa Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Xaa
65 70 75 80
Asn Xaa Thr Xaa Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 71
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa是K, R, M, T, Q,或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa是D, E, N, K, Q,或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa是D, E, N, K, Q,或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 71
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Xaa Val Xaa Trp Xaa Lys Gln Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Val Ala Xaa Leu Xaa Asn Ser Xaa Phe Xaa Ala Xaa Xaa Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Xaa
65 70 75 80
Asn Xaa Thr Xaa Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 72
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> Xaa是D, E, N, K, Q,或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa是K, R, M,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> Xaa是D, E, N, K, Q,或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是K, R, M,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> Xaa是D, E, N, K, Q,或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> Xaa是D, E, N, K, Q,或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是D, E, N, K, Q,或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> X为缺失, L,或LESLPS
<400> 72
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Xaa Val Xaa Trp Xaa Lys Gln Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Val Ala Xaa Leu Xaa Asn Ser Xaa Phe Xaa Ala Xaa Xaa Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90
<210> 73
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 73
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Xaa His
1 5 10 15
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85 90
<210> 74
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa是F, I, L, V, M, A,或Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa是A, V, S, L,或I
<220>
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<222> (38)..(38)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是F, I, L, V, A,或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A, V, S, L,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> Xaa是F, I, L, V, Nle, M,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(60)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> Xaa是F, I, L, V, Nle, M,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M, L, I,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是M, L, I,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (88)..(88)
<223> Xaa是F, I, L, V, A,或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 74
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Xaa His
1 5 10 15
Xaa Pro Ser Asn Val Pro Xaa Lys Glu Xaa Leu Xaa Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Xaa Xaa Glu Xaa Glu Asn Ser Glu Xaa Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Xaa Asp Thr Val Ser Xaa Ser Xaa Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Xaa Lys Xaa Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 75
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> Xaa是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> Xaa是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa是W, F, L,或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> Xaa是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Xaa是A, V, S,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> Xaa是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A, V, S,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> Xaa是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(60)
<223> Xaa是S, T, A,或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> Xaa是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M, L, I,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是M, L, I,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (88)..(88)
<223> Xaa是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 75
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Xaa His
1 5 10 15
Xaa Pro Ser Asn Val Pro Xaa Lys Glu Xaa Leu Xaa Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Xaa Xaa Glu Xaa Glu Asn Ser Glu Xaa Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Xaa Asp Thr Val Ser Xaa Ser Xaa Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Xaa Lys Xaa Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 76
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 76
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Xaa Glu Xaa Glu Asn Ser Glu Xaa Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Xaa Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 77
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Xaa是A, V, S, L,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> Xaa是F, I, L, V, Nle, M,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是F, I, L, V, A,或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A, V, S, L,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M, L, I,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是M, L, I,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 77
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Xaa Glu Xaa Glu Asn Ser Glu Xaa Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Xaa Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 78
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Xaa是A, V, S,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> Xaa是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是F, I, L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A, V, S,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M, L, I,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是M, L, I,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 78
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Xaa Glu Xaa Glu Asn Ser Glu Xaa Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Xaa Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 79
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Xaa是V, L,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> Xaa是F或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是V, I, L,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A, V,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M, F, I,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是F, M, I,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 79
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Xaa Glu Xaa Glu Asn Ser Glu Xaa Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Xaa Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 80
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Xaa是V或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是V, I,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是F或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 80
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Xaa Glu Phe Glu Asn Ser Glu Xaa Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Xaa Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 81
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Xaa是V或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是V, I,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 81
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Xaa Glu Phe Glu Asn Ser Glu Xaa Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 82
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是V或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 82
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Xaa Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
Ser Pro Asn Ile Thr Asp Thr
1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是S, G, A, M,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R, W, P,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是N, Y, S, E, D, Q, H, K,或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是P, G, I, L, V, M, A, F,或Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Y, G, T,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是R, E, K, P, D,或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是R, D, S, Q, A, E, T,或S
<400> 84
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是S, G, A,或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R, W,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是N, Y, S, E,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是P, G,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Y, G,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是R, E, K, P,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是R, D, S, Q, A, E,或T
<400> 85
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是S, G, A,或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是N, Y, S, E,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是P或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是R, E, K,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是R, D, S, Q, A,或E
<400> 86
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R, W, P,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是P, G, I, L, V, M, A, F,或Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Y, G, T,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是R, P, D,或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是R, D, T,或S
<400> 87
Ser Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R, W,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是P, G,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Y, G,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是R, P,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是R, D,或T
<400> 88
Ser Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是P或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是R或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是R或D
<400> 89
Ser Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是S, G, A, M,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R, W, P,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是N, Y, S, E, D, Q, H, K,或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是P, G, I, L, V, M, A, F,或Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Y, G, T,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是R, E, K, P, D,或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是D, S, Q, A, E, T,或S
<400> 90
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是S, G, A,或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X是R, W,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是N, Y, S, E,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是P, G,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Y, G,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是R, E, K, P,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是D, S, Q, A, E,或T
<400> 91
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是S, G, A,或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是N, Y, S, E,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是P或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是R, E, K,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是D, S, Q, A,或E
<400> 92
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 93
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Xaa是V, L,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> Xaa是F或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是V, I, L,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A, V,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M, F, I,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> Xaa是S, G, A,或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa是R或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa是N, Y, S, E,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa是P或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是R, E, K,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是R, D, S, Q, A,或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是F, M, I,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 93
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Xaa Glu Xaa Glu Asn Ser Glu Xaa Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 94
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Xaa是V或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> Xaa是F或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是V, I,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> Xaa是S, G, A,或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa是R或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa是N, Y, S, E,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa是P或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是R, E, K,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是R, D, S, Q, A,或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是F或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 94
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Xaa Glu Xaa Glu Asn Ser Glu Xaa Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 95
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(85)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 95
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 96
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A, V, L,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M, F, L,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> Xaa是S, G, A, M,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa是R, W, P,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa是N, Y, S, E, D, Q, H, K,或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa是P, G, I, L, V, M, A, F,或Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是Y, G, T,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是R, E, K, P, D,或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是R, D, S, Q, A, E, T,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 96
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 97
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> Xaa是S, G, A,或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa是R, W,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa是N, Y, S, E,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa是P, G,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是Y, G,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是R, E, K, P,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是R, D, S, Q, A, E,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 97
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 98
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> Xaa是S, G, A,或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa是R或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa是N, Y, S, E,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa是P或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是R, E, K,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是R, D, S, Q, A,或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 98
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 99
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(85)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 99
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Xaa
65 70 75 80
Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 100
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa是R, W, P,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa是P, G, I, L, V, M, A, F,或Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是Y, G, T,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是R, P, D,或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是R, D, T,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 100
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Xaa
65 70 75 80
Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 101
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa是R, W,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa是P, G,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是Y, G,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是R, P,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是R, D,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 101
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Xaa
65 70 75 80
Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 102
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa是R或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa是P或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是R或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是R或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 102
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Xaa
65 70 75 80
Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 103
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A, V, L,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M, F, L,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> Xaa是S, G, A, M,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa是R, W, P,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa是 N, Y, S, E, D, Q, H, K,或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa是 P, G, I, L, V, M, A, F,或Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是 Y, G, T,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是R, E, K, P, D,或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是D, S, Q, A, E, T,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 103
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 104
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> Xaa是S, G, A,或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa是R, W,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa是N, Y, S, E,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa是P, G,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是Y, G,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是R, E, K, P,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是D, S, Q, A, E,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 104
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 105
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是M或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> Xaa是S, G, A,或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa是R或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa是N, Y, S, E,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa是P或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是R, E, K,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是D, S, Q, A,或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa为缺失, L,或LESLPS
<400> 105
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Val Glu Phe Glu Asn Ser Glu Val Arg Xaa Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Xaa Glu Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Lys Phe Phe Leu Tyr Val Xaa
85 90
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Ser Arg Asn Gly Gly Pro Asp
1 5
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
Ser Arg Asn Pro Tyr Arg Arg
1 5
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Ser Arg Asn Pro Tyr Arg Asp
1 5
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Ser Trp Asn Gly Gly Pro Asp
1 5
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
Ser Trp Asn Pro Tyr Arg Arg
1 5
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
Ser Trp Asn Pro Tyr Arg Asp
1 5
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Gly Arg Tyr Pro Tyr Glu Ser
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
Ser Trp Glu Pro Gly Arg Glu
1 5
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Ala Arg Tyr Pro Tyr Arg Gln
1 5
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Met Arg Asn Gly Gly Pro Asp
1 5
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Ala Arg Asp Gly Gly Pro Asp
1 5
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
Ser Trp Ser Pro Tyr Lys Ala
1 5
<210> 118
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
Leu Glu Ser Leu Pro Ser
1 5
<210> 119
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly
1 5 10 15
Ser Ile Glu Val
20
<210> 120
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His
1 5 10 15
Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys
20 25 30
Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser
35 40 45
Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile
50 55 60
Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro
65 70 75 80
Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Asp Lys Thr His
85 90 95
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
100 105 110
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
115 120 125
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
130 135 140
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
145 150 155 160
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
165 170 175
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
180 185 190
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
195 200 205
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
210 215 220
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
225 230 235 240
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
245 250 255
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
260 265 270
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
275 280 285
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
290 295 300
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
305 310 315
<210> 121
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp
1 5 10 15
Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp
20 25 30
Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg
35 40 45
Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys
50 55 60
Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys
85 90 95
Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser
100 105 110
Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr
115 120 125
Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser
130 135 140
Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe
145 150 155 160
Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro
165 170 175
Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile
180 185 190
Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe
195 200 205
Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu
210 215 220
Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys
225 230 235 240
Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln
245 250 255
His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg
260 265 270
Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro
275 280 285
Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu
290 295 300
Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn
325
<210> 122
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
atgggctggt cctgtatcat cctctttctg gtggccacag ctaccggagt gcatagcttt 60
tcacagcaga tttacggtgt tgtttacggt aatgtgactt ttcacgttcc gagtaacgtt 120
cctttgaagg aagtcttatg gaaaaaacaa aaagataaag ttgtagaatt tgagaatagt 180
gaggttaggg catttagttc atttaagaat agggtctatt tggatactgt atccggttct 240
ttgaccattt ataatttaac aagtagtgat gaagacgagt acgaaatgga gtcccctaat 300
attacagaca cattcaagtt ttttttgtac gttctcgaca aaactcacac atgcccaccg 360
tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 420
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 480
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 540
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 600
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 660
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 720
tacaccctgc ccccatcccg ggaagagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 780
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 840
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 900
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 960
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggt 1014
<210> 123
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
ttttcacagc agatttacgg tgttgtttac ggtaatgtga cttttcacgt tccgagtaac 60
gttcctttga aggaagtctt atggaaaaaa caaaaagata aagttgtaga atttgagaat 120
agtgaggtta gggcatttag ttcatttaag aatagggtct atttggatac tgtatccggt 180
tctttgacca tttataattt aacaagtagt gatgaagacg agtacgaaat ggagtcccct 240
aatattacag acacattcaa gttttttttg tacgttctcg acaaaactca cacatgccca 300
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 360
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 420
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 480
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 540
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 600
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 660
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaagag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 720
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 780
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ttggactccg acggctcctt cttcctctac 840
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 900
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 957
<210> 124
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
atggttgctg ggagcgacgc ggggcgggcc ctgggggtcc tcagcgtggt ctgcctgctg 60
cactgctttg gtttcatcag ctgtttttcc caacaaatat atggtgttgt gtatgggaat 120
gtaactttcc atgtaccaag caatgtgcct ttaaaagagg tcctatggaa aaaacaaaag 180
gataaagttg cagaactgga aaattctgaa ttcagagctt tctcatcttt taaaaatagg 240
gtttatttag acactgtgtc aggtagcctc actatctaca acttaacatc atcagatgaa 300
gatgagtatg aaatggaatc gccaaatatt actgatacca tgaagttctt tctttatgtc 360
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 420
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 480
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 540
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 600
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 660
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 720
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 780
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 840
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 900
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 960
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1020
ctctccctgt ctccgggtaa a 1041
<210> 125
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
ttttcccaac aaatatatgg tgttgtgtat gggaatgtaa ctttccatgt accaagcaat 60
gtgcctttaa aagaggtcct atggaaaaaa caaaaggata aagttgcaga actggaaaat 120
tctgaattca gagctttctc atcttttaaa aatagggttt atttagacac tgtgtcaggt 180
agcctcacta tctacaactt aacatcatca gatgaagatg agtatgaaat ggaatcgcca 240
aatattactg ataccatgaa gttctttctt tatgtcgaca aaactcacac atgcccaccg 300
tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 360
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 420
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 480
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 540
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 600
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 660
tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 720
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 780
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 840
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 900
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 957
<210> 126
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
ttttcccaac aaatatatgg tgttgtgtat gggaatgtaa ctttccatgt accaagcaat 60
gtgcctttaa aagaggtcct atggaaaaaa caaaaggata aagttgcaga actggaaaat 120
tctgaattca gagctttctc atcttttaaa aatagggttt atttagacac tgtgtcaggt 180
agcctcacta tctacaactt aacatcatca gatgaagatg agtatgaaat ggaatcgcca 240
aatattactg ataccatgaa gttctttctt tatgtc 276
<210> 127
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 128
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 129
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val
1 5 10 15
Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys
20 25
<210> 130
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
atggttgctg ggagcgacgc ggggcgggcc ctgggggtcc tcagcgtggt ctgcctgctg 60
cactgctttg gtttcatcag ctgt 84

Claims (36)

1.特异性结合CD2的分离的多肽分子或其功能性变体，
其中，所述多肽分子包含与氨基酸序列SEQ ID NO:69有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同度的氨基酸序列，并且
其中，所述多肽分子不含氨基酸序列SEQ ID NO:4。
2.如权利要求1所述的分离的多肽分子或其功能性变体，
其中，所述多肽分子包含与氨基酸序列SEQ ID NO:69有至少90％相同度的氨基酸序列，并且
其中，所述多肽分子不含氨基酸序列SEQ ID NO:4。
3.如权利要求1或2所述的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含氨基酸序列SEQID NO:69。
4.特异性结合CD2的分离的多肽或其功能性变体，其包含LFA3结构域，所述LFA3结构域包含与选自SEQ ID NO:17-41的氨基酸序列有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的氨基酸序列，并且所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
5.如权利要求4所述的分离的多肽或其功能性变体，其中，所述氨基酸序列是SEQ IDNO:17、18、19、20、21、22或23，并且，所述LFA3结构域还包含氨基酸残基Leu或氨基酸序列LESLPS(SEQ ID NO:118)。
6.如权利要求4所述的分离的多肽或其功能性变体，其中，所述LFA3结构域包含与SEQID NO:26有至少90％相同度的氨基酸序列，并且所述LFA3结构域不含氨基酸序列SEQ IDNO:3。
7.如权利要求4或6所述的分离的多肽，其中，所述LFA3结构域包含氨基酸序列SEQ IDNO:26。
8.包含LFA3结构域的分离的多肽或其功能性变体，
其中，所述LFA3结构域包含按照SEQ ID NO:3编号位于残基36、38、43和86的一处或多处突变的氨基酸序列SEQ ID NO:3。
9.如权利要求8所述的分离的多肽或其功能性变体，其中，所述LFA3结构域还包含氨基酸残基Leu或氨基酸序列LESLPS(SEQ ID NO:118)。
10.如权利要求8或9所述的分离的多肽或其功能性变体，其中，所述按照SEQ ID NO:3编号位于残基36、38、43和86的一处或多处突变是A36V、L38F、F43V和M86F。
11.如权利要求4-10中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体，还包含第二结构域，
其中，所述第二结构域包含免疫球蛋白，例如重链恒定区，例如人重链恒定区，或其功能性变体；
其中，所述第二结构域包含重链(例如人IgG1重链)的Fc区或其功能性变体；或者
其中，所述第二结构域包含铰链区、CH2区和CH3区、或其功能性变体。
12.如权利要求4-11中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体，还包含第二结构域，其中，所述第二结构域包含Fc结构域，所述Fc结构域包含与SEQ ID NO:16有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％相同度的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的分离的多肽或其功能性变体，其中，所述第二结构域包含Fc结构域，所述Fc结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16。
14.如权利要求11-13中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体，还包含接头，所述接头将所述第二结构域的N末端与所述LFA3结构域的C末端相连。
15.如权利要求11-14中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体，其中：
iii.所述第二结构域能够与另一第二结构域形成二聚体，例如通过分子间二硫键，和/或
iv.所述第二结构域能够介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
16.如权利要求11-15中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体：
其中，所述LFA3结构域包含含有与SEQ ID NO:26有至少90％相同度的氨基酸序列的多肽，且所述多肽不含氨基酸序列SEQ ID NO:3；并且
其中，所述Fc结构域包含含有与SEQ ID NO:16有至少90％相同度的氨基酸序列的多肽。
17.如权利要求11-15中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体，
其中，所述多肽或其功能性变体包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，并且
其中，所述氨基酸序列包含按照SEQ ID NO:4编号位于残基36、38、43、86、92、228和230的一处或多处突变。
18.如权利要求17所述的分离的多肽或其片段，其中，所述按照SEQ ID NO:4编号位于残基36、38、43、86、92、228和230的一处或多处突变是A36V、L38F、F43V、M86F、V92_D93insL、D228E和L230M。
19.结合例如特异性结合CD2的分离的多肽分子，其中，所述多肽分子包含LFA3结构域并具有一项或多项以下特征：
i.增强的单体表达，该特征是由以下情形展现的：用尺寸排阻色谱测定的单体百分比相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子高约70％、75％、80％、85％、90％或95％，
ii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的单体表达和降低的多聚体表达，该特征是由以下情形展现的：据尺寸排阻色谱测定，单体百分比高于约75％、80％、85％、90％或95％，低分子量物质(LMWS)百分比低于约10％、8％、6％、4％或2％，和/或高分子量物质(HMWS)百分比低于约5％、2％或1％，
iii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子降低的热应激聚集倾向，该特征是由以下情形展现的：据尺寸排阻色谱测定，37.4℃孵育24小时后单体百分比高于约90％、92％或95％和/或40℃孵育24小时后单体百分比高于约75％、80％或85％，
iv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子降低的热应激聚集倾向，该特征是由以下情形展现的：据尺寸排阻色谱测定，40℃时的HMWS增加不超过约5％、10％、15％或20％和/或50℃时的HMWS增加不超过约5％、10％、15％、20％或25％，
v.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子降低的低pH聚集倾向，该特征是由以下情形展现的：用尺寸排阻色谱测定的低pH下5小时HMWS增加不超过约6％、7％、8％或9％，
vi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性，该特征是由以下情形展现的：40℃存放2或4周后用毛细管凝胶电泳(CGE)或尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％、1.5％或2％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％、2％、3％、4％或5％，
vii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性，例如25℃存放2、4或6周后用SE-HPLC测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％、1.5％或2％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％，
viii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的稳定性，例如5℃存放2、4或6周后用SE-HPLC测定的HMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％和/或LMMS增加不超过约0.5％、1％或1.5％，
ix.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的冻融稳定性，该特征是由以下情形展现的：5轮冻融后用尺寸排阻色谱测定的HMWS增加不超过约0.5％、1％或1.5％，
x.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子提高的产率，该特征是由以下情形展现的：产率高于每20mL Expi293培养物约5.5、6、6.5或7mg，
xi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的多肽分子提高的Tm，该特征是由以下情形展现的：差示扫描荧光测定法(DSF)测定的Tm高于约38、40、42、45或50℃，
xii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，该特征是由以下情形展现的：DSF测定的Tm高于约40、45、50、55或60℃，
xiii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，该特征是由以下情形展现的：据差示扫描量热法(DSC)测定的Tm高于约50或60℃，
xiv.据DSC测定，pH 7.5时Tm1高于约55、58、60、62、64或66℃且Tm2高于约75、78、80或82℃；pH 5.8时Tm1高于约55、58、60、62或64℃且Tm2高于约75、78、80或82℃；或pH 4.5时Tm1高于约55、58或60℃且Tm2高于约75、78或80℃，
xv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，该特征是由以下情形展现的：据DSC测定，pH 7.5或pH 4.5时Tm高于约50或60℃，或者pH 5.8时Tm高于约50或62℃，
xvi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的Tm，该特征是由以下情形展现的：DSC和FabRICATOR IdeS测定的Tm高于约50或60℃，
xvii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2结合亲和力，该特征是由以下情形展现的：SPR测定的对人CD2的KD低于约1.2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1或0.08μM，
xviii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2结合亲和力，该特征是由以下情形展现的：据SPR测定，对人CD2的KD低于约1.3、1.2、1.1或1μM，且/或对猕猴CD2的KD低于1.4、1.3、1.2、1.1或1μM，
xix.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，该特征是由以下情形展现的：SPR测定的结合CD4 Tmem细胞的Kd不超过约100、200、300或400pM，
xx.据SPR测定，相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，该特征是由以下情形展现的，例如用SPR和/或实施例2中就表10和图11所述的方法测定，结合CD4记忆T细胞的算得IC50不超过约300、400、500、600、700、800、1000、1200或1500pM；结合CD4+TEM细胞的算得IC50不超过约150、300、400、500、600、700、800、1000或1200pM；结合CD4+TCM细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400、500、600、700或800pM；结合CD4初始T细胞的算得IC50不超过约200、300、400、500、600、700、800、1000或1200pM；结合扩增CD4 Treg细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD8记忆T细胞的算得IC50不超过约100、200、300、400、500或600pM；和/或结合CD8初始T细胞的算得IC50不超过约300、400、500、600、700、800、1000、1200、1500、1600或1700pM，
xxi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的CD2表达细胞结合亲和力，该特征是由以下情形展现的：据SPR测定，结合CD4记忆T细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD4+TEM细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400、500或600pM；结合CD4+TCM细胞的算得Kd不超过约100、200、300、400或500pM；结合CD4初始T细胞的算得Kd不超过约100、200、300或400pM；结合扩增CD4 Treg细胞的算得Kd不超过约100、200或300pM；结合CD8记忆T细胞的算得Kd不超过约50、100或150pM；结合CD8初始T细胞的算得Kd不超过约50、100、200、300、400或500pM，
xxii.增强的CD2表达细胞结合亲和力，该特征是由以下情形展现的：相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子，SPR测定的结合猕猴CD4+TEM细胞EC50降低，
xxiii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的对CD2表达细胞的细胞毒性，该特征是由以下情形展现的：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)检测测定的杀伤CD4 Tmem细胞的EC50不超过约400、600、800、1000、1200或1400pM，
xxiv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的对CD2表达细胞的细胞毒性，该特征是由以下情形展现的：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)检测测定的杀伤CD8 Tmem细胞的EC50不超过约1、5、10、20、30、40或50nM，
xxv.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的同种异体T细胞反应抑制，其中，所述同种异体T细胞反应是T细胞增殖和/或细胞因子产生，该特征是由以下情形展现的：混合淋巴细胞反应(MLR)检测的IC50不超过约400、800、1200、1600、2000或2400pM，
xxvi.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的同种异体T细胞反应抑制，其中，所述同种异体T细胞反应是T细胞增殖和/或细胞因子产生，该特征是由以下情形展现的：无NK细胞混合淋巴细胞反应(MLR)检测的IC50不超过约330、400、500、600、800、1000、1500或2000pM，
xxvii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子增强的破伤风类毒素回忆反应抑制，该特征是由以下情形展现的：破伤风类毒素回忆(TTR)检测测定的对CD4 TmemIFNγ产生的IC50不超过约1、2、5、10、15、20或25nM，
xxviii.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子减缓的体内清除，该特征是由以下情形展现的：PK/PD研究测定的中心清除率不超过约0.14、0.16、0.18、0.2或0.22mL/hr/kg，和/或
xxix.相比包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽分子提高的纯度，即毛细管凝胶电泳测得至少约98％或99％的纯度。
20.一种分离的核酸，其编码权利要求1-19中任一项所述的分离的多肽或其功能性变体。
21.如权利要求20所述的分离的核酸，包含与SEQ ID NO:43、53和/或123有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％相同度的核酸序列。
22.如权利要求20或21所述的分离的核酸，包含核酸序列SEQ ID NO:43、53和/或123。
23.一种载体，其包含权利要求20-22中任一项所述的核酸。
24.一种宿主细胞，其包含权利要求20-22中任一项所述的核酸或权利要求23所述的载体。
25.如权利要求24所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是选自Expi293细胞、ExpiCHO细胞、CHO细胞、COS细胞、HEL-293细胞、NSO细胞、PER.C6细胞或SP2.0细胞的哺乳动物细胞。
26.如权利要求24或25所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是Expi293细胞或ExpiCHO细胞。
27.一种药物组合物，其包含权利要求1-19中任一项所述的多肽分子和药学上可接受的运载体或赋形剂。
28.如权利要求27所述的药物组合物，包含7.5mg权利要求1-19中任一项所述的多肽分子和HEPES缓冲盐溶液。
29.一种制造特异性结合CD20的分离的多肽分子的方法，包括培养权利要求24-26中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞在培养条件下表达所述多肽分子。
30.如权利要求29所述的方法，还包括分离所述多肽分子。
31.权利要求1-19中任一项所述的分离的多肽或权利要求27或28所述的药物组合物，用于处置需要免疫抑制的对象。
32.权利要求1-19中任一项所述的分离的多肽或权利要求27或28所述的药物组合物用于治疗免疫疾病、紊乱或状况的用途。
33.一种治疗或预防人对象中CD2介导的免疫疾病、紊乱或状况的方法，所述人对象需要所述的治疗或预防，所述方法包括给予所述对象有效量的权利要求27或28所述的药物组合物，其中，所述疾病、紊乱或状况选自：1型糖尿病，银屑病，斑块状银屑病，掌跖脓疱病，手足心脓疱型银屑病，掌跖脓疱症，手足心脓疱病，特应性皮炎，扁平苔藓，移植物抗宿主病(GVHD)，白癜风，毛发红糠疹，移植(例如器官移植，例如肾脏移植)，银屑病性关节炎，需要同种异体造血干细胞移植的疾病、紊乱或状况，地中海贫血，镰状细胞病，血小板无力症，维斯科特-奥尔德里奇综合征，慢性肉芽肿性疾病，严重先天性中性粒细胞减少症，白细胞黏附缺乏症，施瓦曼-戴蒙德综合征，戴蒙德-布莱克范贫血，范科尼贫血，先天性角化不良，薛迪克-东氏症候群，再生障碍性贫血，斑秃和T细胞淋巴瘤(例如皮肤T细胞淋巴瘤或外周T细胞非霍奇金淋巴瘤)。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述疾病是糖尿病，例如1型糖尿病(T1D)，例如新发T1D，例如有残留β细胞功能的新发T1D(例如对象确诊不到100天)，例如第二阶段或第三阶段T1D。
35.权利要求1-19中任一项所述分离的多肽用于制造用于治疗免疫疾病、紊乱或状况的药物的用途。
36.一种用权利要求1-19中任一项所述分离的多肽或其功能性变体检测样品、组织或细胞中CD2的方法，包括将所述样品、组织或细胞与所述多肽或其功能性变体接触和检测所述多肽或其功能性变体。
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