NO317154B1 - Fremgangsmate til fremstilling av et polypeptid - Google Patents
Fremgangsmate til fremstilling av et polypeptid Download PDFInfo
- Publication number
- NO317154B1 NO317154B1 NO19980293A NO980293A NO317154B1 NO 317154 B1 NO317154 B1 NO 317154B1 NO 19980293 A NO19980293 A NO 19980293A NO 980293 A NO980293 A NO 980293A NO 317154 B1 NO317154 B1 NO 317154B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cells
- rna
- bsp73asml
- cdna
- tumor
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title abstract description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title abstract 2
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 5
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 abstract description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 64
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 36
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 32
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 30
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 18
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 241000894007 species Species 0.000 description 16
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 7
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000683 nonmetastatic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 108010037936 CCCGGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101150017002 CD44 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100351961 Caenorhabditis elegans pgp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 102000010836 Lymphocyte Homing Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241001503485 Mammuthus Species 0.000 description 1
- 206010027459 Metastases to lymph nodes Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 206010056342 Pulmonary mass Diseases 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008619 cell matrix interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 1
- 102000048851 human CD44 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 108700041430 link Proteins 0.000 description 1
- 201000009546 lung large cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 231100001222 nononcogenic Toxicity 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2884—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD44
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/828—Cancer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte til fremstilling av varianter av CD44 overflateproteiner for fremstilling av antistoffer for diagnostiske og terapeutiske formål, og som kodes av DNA-fragmenter slik det fremgår av innledningen i det etterfølgende krav.
Evnen til å danne metastaser utgjør ondartede tumor-cellers egentlige livstruende egenskap. De opprinnelige primærtumorceller erverver sannsynligvis denne egenskap gjennom en hel serie forandringer i løpet av tumorutvik-lingen. Som resultat av disse prosesser løsner kreftcelle-variantene stadig fra den primære tumormasse, gjennom-trenger den ekstracellulære matrise og vandrer inn i lymfesystemet eller blodsirkulasjonen. De metastasedannende tumorceller blir, ofte klebet til hverandre, tran-sportert i blod- eller lymfesystemet, forlater karsystemet på andre steder for der å trenge inn i sekundærvev og danne dattertumorer (oversikter av Hart et al., 1989 og Nicolson, 1987). Dannelsen av metastaser krever en hel rekke interaksjoner mellom tumorceller og intercellulær matrise eller andre celler. Nesten alle disse interaksjoner behøver celleoverflatekomponenter, f.eks. resep-torene for matrise og plater, overflatebundne proteo-lytiske enzymer, samt celleadhesjonsmolekyler inklusivt slike som betinger metastasedannelsens organspesifikke adhesjon og derved organpreferanse, foruten vekstfaktorer og vekstfaktorreseptorer.
Det er kjent at membranproteinene til ikke-metastasedannende og metastasedannende tumorceller fra BSp73A rottetumorer er forskjellige fra hverandre, påvist ved hjelp av antistoffreaksjon (Matzku et al-, 1983 og 1989).
Det har vist seg at de metastasedannende BSp73ASML tumorceller inneholder et overflateprotein som delvis tilsvarer et kjent glykoprotein som deltar i lymfocyttadhe-sjonen og celle-celle- og-celle-matrise-vekselvirkningen (betegnelser på det normale glykoprotein hos mennesket: CD44, Hermes-1, hos mus:Ppg-l og hos rotte:HEBFln). Fra disse kjente sekvenser avviker imidlertid et variant CD44-overflateprotein ved et ekstracellulært område (EZB) med 154 aminosyrer, som er innskjøvet mellom den 220. og 227. aminosyre i den humane CD44-sekvens (henholdsvis mellom 224. og 239. aminosyre i sekvensen hos mus). Dette nye glykoprotein synes å spille en viktig rolle for henholdsvis celle/matrise- og celle/cellebindingen ved metastasedannelsen. Det er derfor ønskelig å fremstille og karakterisere dette proteinområde (EZB). Ved immunisering av mus med membranproteiner som er utvunnet av BSp73ASML ble det frembrakt miltceller som danner antistoffer mot det variante CD44-overflateproteins EZB. Ved Kohler<1>s metode fra 1981 ble disse ved hjelp av polyetylenglykol smeltet sammen med ryggmargceller for å oppnå bestandige kulturer. Ved hjelp av kloning og utvelgelse av de kulturer som produserer antistoffer som reagerer med BSp73ASMLr men ikke med den ikke-metastasedannende stammeform BSp73AS og heller med andre ikke-onkogene rotteceller, er det mulig å utvinne antistoffer som er spesifikke mot den nye proteindel EZB. For den videre undersøkelse ble det valgt et monoklonalt antistoff, som farger BSp73ASML-cellene særlig intens i immunfluorescenstesten og som fikk betegnelsen mAbl.lASML (mAb=monoklonalt antistoff).
I "Westernblof-prøven er det i et proteinhydrolysat av BSp73ASML-celler mulig å bestemme 4 proteinbånd med molekylvekter på 120.000, 150.000, 180.000 og 200.000 med mAbl.l. ASML, mens ekstrakter av rottefibroblastceller og ikke-metastasedannende rottetumorceller ikke gir noen markert reaksjon. Det kunne ennå ikke bestemmes om disse stør-relsesforskjeller skyldes en forskjellig, opprinnelig aminosyresekvens eller en forskjellig sterk, senere pro-teinmodifikasjon. I alle fall foreligger epitopen som er gjenkjent av antistoffet i alle fire proteinarter, men ikke i kontrollproteinene fra de ikke-metastasedannende BSp73AS-celler eller fra normale rotteceller.
Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjenne-tegnet ved at DNA-fragmentene uttrykkes i egnete vertsceller, hvoretter overflateproteinvarianter isoleres og renses.
Isolering av cDNA- sekvenser som koder for overflateproteinets EZB.
Det monoklonale antistoff mAbl.lASML ble anvendt i et bakterielt ekspresjonsbibliotek for å påvise de cDNA-sekvenser som koder for EZB. Biblioteket ble konstruert ved hjelp av PolyA+ RNA fra BSp73ASML-celler og pEX-vektor-systemet (Stanley & Luzio, 1984). Produktene som kodes av cDNA-sekvensene påvises ved hjelp av antistoffene å være p-galaktosidasefusjonsproteiner. En således isolert cDNA-klon som har betegnelsen pEX34 og som er positiv for det monoklonale antistoff 1.1ASML bærer et cDNA-sekvensstykke på 167 nukleotider. Dette cDNA-stykke ble nå anvendt til å oppnå et større cDNA-bibliotek i vektoren pSP65, igjen fra BSp73ASML RNA. En klon, pM66, som er isolert med denne tjente til ved hjelp av såkalt "primer"-forlengelse (starter-oligonukleotid) og polymerasekjedereaksjonen (PCR) å isolere den fulle lengde cDNA-klon pMeta-1. Bevis for den fulle lengde ble oppnådd ved hjelp av primerforlengelsen (3207 nukleotider). Kolineariteten med en RNA fra Bsp73ASML-tumoren ble dokumentert ved hjelp av RNase og Sl-beskyttelsesanalyse.
Isoleringen av de forskjellige cDNA-er ved hjelp av ekspresjonen i bakterier og påvisningen ved hjelp av antistoffene beviser at antistoffet gjenkjenner primær aminosyresekvens i overflateproteinets EZB.
Budbærer- RNA som koder for EZB uttrykkes i BSp73ASML-, men ikke i BSp73AS- celler.
3 forskjellige sekvensprober ble frembrakt fra cDNA-klonene for å påvise spesifikke budbærer-RNA-er ved hjelp av hybridisering. Probe A dekker det cDNA-område som koder for nevnte EZB (posisjonene: 941-1108). Probe B representerer sekvensene mellom posisjonene 1403-1572, og probe C bærer sekvensene fra begynnelsen til posisjonen 794 fra pMeta-1 (fig. 1). Poly A+ RNA fra BSp73-tumorcellelinjene ble separert elektroforetisk og analysert ved hjelp av RNA-transferhybridisering. Fire av cellelinjene, som ikke danner metastaser, inneholder intet RNA som er homolog til probe A, mens RNA fra de metastasedannende tumorceller Bsp73ASML reagerer sterkt. Probe A gjenkjenner i dette RNA-preparat en heterogen blanding av forskjellige RNA-størrelser på mellom 2,2 og 3,3 kb og en større RNA-art på 4,9 kb. Den utelukkende ekspresjon av de spesifikke membranproteiner, som gjenkjennes av det monoklonale antistoff 1.1ASML i den metastasedannende tumorcellevariant skyldes åpenbart den utelukkende ekspresjon av de tilsvarende budbærer-RNA som koder for nevnte EZB. Åpenbart kan den fullstendige cDNA-klon pMeta-1 med 3,2 kb ikke representere alle sekvenser av denne RNA-art. Den kan bare fremstille én art av den heterogene blanding av RNA-størrelse. Probene B og C gir samme hybridiseringsmønster som probe A ved oppdelingen av BSp73ASML RNA, i hvertfall så langt man kan fastslå med heterogeniteten, dvs. at disse RNA-arter bærer sekvenser som er komplementær til alle tre prober A, B og C. I motsetning til probe A gjenkjenner probene B og C også budbærer-RNA-arter i de ikke-metastasedannende cellelinjer. Størrelsene på RNA avviker imidlertid tydelig fra størrelsene i BSp73ASML. Det påvises nemlig fire klart forskjellige budbærer-RNA-arter, med størrelsene 1,5, 2,0, 2,9 og 4,3 kb. Selv om disse RNA-arter vil kunne være gjemt i den heterogene blanding av RNA-ene fra BSp73ASML er det imidlertid sikkert at de ikke foreligger i samme mengde i BSp73ASML. Det avgjørende er at RNA-sekvensene med komplementaritet til probe A åpenbart er fullstendig fraværende i de ikke-metastasedannende celler. Det kan derfor forsiktig trekkes den slutning at sekvensene i probene A, B og C foreligger i de samme RNA-er i den metastasedannende tumor, og det på en måte som om sekvensene i probe A var innspleiset i de B-C-positive RNA-er og som om denne alternative spleising bare forekom i den metastasedannende cellelinje.
For å bevise kolineariteten mellom RNA og cDNA og for å analysere forskjellen mellom RNA i BSp73AS- og BSp73ASML-cellene ble det gjennomført Sl-nuklease- og RNase-proteksjonsanalyser. De beskyttede DNA- eller RNA-fragmenter kan bære være mindre enn den totale lengde, som følge av at 5'-endene inneholder vektorsekvenser som ikke kan hybridisere med RNA-ene fra tumorcellene. Først betraktes overgangen på 3'-siden: Overgangen av sekvenser med homologi til probe A etter slike frekvenser med homologi til probe B. Begge metoder viser én eneste RNA-art i BSp73AS-celler som er kolineare med probene i et bredt område. Mer 5' fra dette avviker henholdsvis cDNA- og RNA-proben, som jo tilsvarer RNA-sekvenser fra BSp73ASML, fra RNA fra BSp73AS-cellene. RNA-ene fra BSp73ASML inneholder fremfor alt sekvenser som beskytter større fragmenter av probene. De største fragmenter tilsvarer hele lengden av henholdsvis DNA- og RNA-stykkene som tilbys til beskyttelsesanalysen. Også mindre fragmenter kan påvises. Idet RNA-transferhybridiseringene har iakttatt en heterogen blanding av RNA med forskjellige størrelser er det mulig at disse mindre, beskyttede fragmenter oppviser RNA-arter som avviker fra cDNA-ene på annen måte, dvs. på steder mellom det tidligere påviste diver-genspunkt og til de tilbudte probers 5'-ender. Disse RNA-arter kan heller ikke påvises i BSp73AS-cellene.
Nå betraktes divergenspunktet på 5'-siden, altså overgangen fra sekvenser som danner hybrider med probe C med de som danner hybrider med probe A, altså sekvensen som koder for nevnte EBZ. Analysen gir tilsvarende resultater for 5'-bruddpunktet. RNA-er fra BSp73AS-celler kan bare beskytte de tilbudte prober i et mindre område. Budbærer-RNA-er fra BSp73ASML-celler beskytter lengre fragmenter. De er nemlig kolineare i hele lengden av den tilbudte prøve. Man kan altså trekke den slutning at cDNA-klonen representerer pMeta-l-sekvenser som blir utpreget i de metastasedannende tumorceller BSp73ASML. 3'- og 5'-områdene finnes også i RNA-ene fra BSp73AS-celler. Sekvensene som koder for nevnte EZB og som har de definerte overganger, som ved hjelp av de ovenfor beskrevne metoder kan kartlegges, viser at det her må foreligge en alternativ spleisemekanisme for RNA-dannelsen. 5'- og 3'-bruddpunktene i overgangene til EZB-sekvensene er markert i fig. 1 ved hjelp av piler.
Det monoklonale antistoff 1. 1ASML identifiserer en variant-form av glykoproteinet CD44.
For å oppnå strukturelle informasjoner om overflate-proteinet er alle klonete cDNA-molekyler blitt sekvensert. Nukleosidsekvensene til totallengdeklonen pMeta-1 og de derav avledete aminosyresekvenser er vist i fig. 2. Total-lengde-cDNA-klonen spenner over 3.207 nukleotider. 3'-terminusen bærer en polyA-ende, mens to ytterligere poly-adenyleringssignaler ligger i posisjonene 2288 og 1743. Den første ATG-kodon følger etter en konsens-initieringssekvens og åpner en leseramme på 1.509 nukleotider, noe som tilsvarer 503 aminosyrer. Slik man vil anta for et membran-stadig protein er de første 21 aminosyrer hydrofobe og ut-gjør et signalpeptid. Ingen del av disse sekvenser er hit-til funnet i databasene. I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse fant man imidlertid sekvenshomologi til nylig publiserte data over lymfocytt-Homing-reseptoren CD44
(respektivt Pgp-1) (Idzerda et al., 1989; Goldstein et al., 1989; Stamenkovic et al., 1989, Nottenburg et al., 1989 og Zhou et al., 1989). Homologene er strengt begrenset til 5'-og 3'-delene av cDNA med tillegg av ikke-translaterte områder, og de ender i de ovennevnte divergenspunkter mellom BSp73AS- og BSp73ASML RNA-sekvensene. Den totale strekning mellom divergenspunktene (i fig. 2 vist ved hjelp av farge-markering), dvs. hele utstrekningen av den metastasespesifikke sekvens som koder for nevnte EZB, er ikke represen-tert i Pgpl- eller CD44-sekvensene. Det metastasespesifikke
glykoprotein representerer åpenbart en variant av CD44-glykoproteinene. Det bærer nemlig et ytterligere, ekstracellulært område med 156 aminosyrer og følgelig et mang-foldiggjort, ekstracellulært område med 410 aminosyrer (med fradrag av 21 aminosyrers signalpeptid), sammenlignet med 270 aminosyrer (likeledes med fradrag av signalpeptid) i det uforandrete CD44-glykoprotein. I de ikke-metastasedannende BSp73AS-celler påvises imidlertid de uforandrete former av denne CD44-familie. cDNA-sekvenser i disse BSp73AS-RNA-er er også blitt klonet, og identiteten med de metastasespesifikke kloner utenfor ekstraområdet er blitt påvist.
Det variante CD44 sin ekspresjon er korrelert med det metastatiske potensiale.
For å kontrollere om ekspresjonen av de variante CD4 4 glykoproteiner utelukkende foregår i BSp7 3ASML-cellene og om de har sammenheng med disse cellers metastatiske potensiale eller det metastatiske potensiale generelt, ble en annen serie isogeniske rottetumorcellelinjer, nemlig tumor-cellelinjene fra Mammokarsinom-systemet 13762 NF (Neri et al., 1982), undersøkt. Derved ble cellelinjer som var avledet fra mortumoren, nemlig cellene MTPa, MTC, MTF7 og MTA (gruppe 1) sammenlignet med cellelinjer som ble dannet av lymfeknuter eller lungemetastaser, nemlig MTLy, MTLn2 og MTLn3 (gruppe 2). Cellene i gruppe 1 uttrykker stort sett det normale CD44-mønster, lignende mønsteret til RNA-ene fra BSp73AS-cellene når probe B hybridiseres. Med probe A påvises det derimot en mindre mengde av et diffust RNA-bånd som har omtrent størrelsen 2,5 kb. Cellene i gruppe 2 oppviser på den annen side et helt annet RNA-mønster. Begge prober A og B hybridiserer med større RNA-arter. Størrel-sene ligner de som påvises i BSp73ASML. Likheten dokumen-teres også ved hjelp av RNAse- og Sl-proteksjonsanalyser. På grunn av disse data trakk man den slutning at en for-andring av spleisemønsteret til RNA og ekspresjonen av variant CD44 korrelerer med dannelsen av metastaser, og at det oppnådde mønster i disse metastasedannende mammokarsi-nomceller tilsvarer meget godt de man ovenfor har gjort seg kjent med for den metastasedannende BSp73ASML-cellelinje. De høymolekylære proteiner, som gjenkjennes ved hjelp av antistoffene, tilsvarer de to høymolekylære arter av proteiner som er påvist i BSp73ASML-ekstraktene. I denne mammotumorserie påvises det også en metastasespesifikk ekspresjon av RNA-arter og av høymolekylære proteiner. At det i gruppe 1, altså i de såkalte modercellelinjer, overhodet ble funnet RNA-er, som hybridiserer med probe A, altså med sekvensen som koder for nevnte EBZ, og at det også kan ses en svak farging av et protein av 100.000 Da med antistoffet, tilbakeføres til at cellene i gruppe 1. også har en liten evne til å danne metastaser, helt i motsetning til den opprinnelige tumorcellelinje BSp73AS, som overhodet ikke viser noen metastasedannelse.
Det monoklonale antistoff 1. 1ASML hemmer metastasedannelse i rotter.
I en forsøksserie for metastasedannelse av tumorcelle-linjen BSp73ASML i isogeniske rotter ble celler injisert subkutant, og på forskjellige tidspunkter ble det monoklonale antistoff 1.1ASML innsprøytet intraperitonealt i avstander på fra 2 til 3 dager før og etter tumoradmini-streringen. Innenfor rammen av denne immunologiske proto-koll ble det også bestemt hvordan rottens immunitetsreak-sjon overfor det injiserte antistoff hadde foregått. Det dannes nemlig antimus-immunglobulinantistoffer og anti-idiotype-antistoffer. Resultatet av denne forsøksserie er at tumorens vekst og metastasedannelse forsinkes sterkt ved injeksjon av 1.1ASML. Denne forsinkelse tillater i sin kinetikk den slutning at antistoffet innvirker på en primær prosess av metastasedannelsen. Forsøket viser at den av antistoffet erkjente proteinstruktur på overflaten av de metastasedannende celler spiller en rolle i metastasedan-nelsesprosessen og at terapeutiske og diagnostiske planer er realistiske.
Isolering av den homologe, humane sekvens til den sekvens-del i cDNA fra rotte som koder for nevnte EBZ.
For humane tumorceller i kultur foreligger selvfølge-lig ikke uten videre muligheten til å påvise, på tilsvarende måte som i rottesystemene, om de bibeholder metastasedannende egenskaper. Forsøk med mus med mangelfull immunitet tillater bare meget begrenset utsagn om meta-stasepotensialet hos mennesker. Derfor måtte det testes forholdsvis mange tumorcellelinjer som på langt tilbake-liggende tidspunkter var anbrakt i kultur ett eller annet sted i verden og som kunne påvises for rottemetastasene. Det har lykkes å finne en slik tumorcellelinje. Den stammer fra en storcellet lungekarsinom fra menneske og har num-meret LCLC97. I denne tumorcellelinje kan det påvises tre definerte RNA-arter (størrelse: 5,5, 3,4 og 2,8 kb), som forholder seg nøyaktig tilsvarende til RNA-ene som kan påvises i de metastasedannende tumorcellelinjer hos rottene. De hybridiserer nemlig både med probe A og med probene B og C, dvs. at også disse humane RNA-arter i store områder er identisk med cDNA pMeta-1 (85%).
Det monoklonale antistoff 1.1ASML reagerte riktignok ikke med denne tumorcelle, dvs. at proteinstykket som ble gjenkjent av antistoffet må i området for antigendeterminanten være forskjellig fra de proteiner som befinner seg på overflaten av den humane tumorcelle. For ikke-reaktivi-teten er allerede de minste avvikelser som følge av anti-stoffenes høye spesifisitet tilstrekkelig. Den humane tumorcelle LCLC97 tjente nå til å konstruere et cDNA-bibliotek. På grunn av den høye overensstemmelse mellom sekvensene hos henholdsvis rotte og menneske kunne det isoleres en cDNA-klon som viste homologi med probe A. Den humane cDNA ble sekvensert. Fig. 3 (a,b) viser primær-sekvensen og aminosyresekvensen som var avledet av denne. Det fremgår at i store områder foreligger det langt på vei identitet mellom sekvens hos henholdsvis rotte og menneske.
Utførelseseksempler:
Celler og antistoffer.
Følgende klonete Bsp-cellelinjer ble anvendt for undersøkelsen: BSp73 14ASML-1 og 10AS-7 og oppbevart i kultur slik som beskrevet av Matzku et al., 1982. Dessuten ble de av Neri et al., 1982, beskrevne mammokarsinomcelle-linjer monoklonale antistoffer mot BSp73 ASML membranproteiner fremstilt ved immunisering av Balbc-mus. Etter isolering av miltcellene fra en immunisert mus ble disse fusjonert med Ag8 ryggmargceller for udødeliggjøring ved fremgangsmåten til fremstilling av monoklonale antistoffer ifølge K5hler (1981). De derved oppnådde hybridomceller ble underkastet en screening for å finne slike antistoffer som er spesifikke mot BSp73ASML, men ikke mot BSp73AS og normale rottefibroblastceller. Den nøyaktige fremgangsmåte er beskrevet i et diplomarbeid av Wenzel i 1986 og av Matzku et al. i 1989.
Hybridomceller som produserer monoklonale antistoffer (mAk) og som har tilsvarende spesifisitet ble mangfoldig-gjort i vevskulturen, og det monoklonale antistoff som ble oppnådd i mediet ble ved ammoniumsulfatutfelling og kolon-nekromatografi (protein A-sepharose og MonoQ) sterkt an-riket og i denne form anvendt til undersøkelsene. Ett av dem er mAkl.lASML.
Immunfluorescens:
For fremstilling av det variante CD44 molekyl på forskjellige tumorceller ble disse opptatt i kultur, deretter vasket med fosfatbufret koksaltløsning (PBS) og inkubert med 1.1ASML i 10 minutter ved 40°C. Som sekundært antistoff for påvisning av bindingen ble det anvendt et rhodamin-koplet kanin anti-mus immunglobulin og vist i fluorescens-mikroskop.
Oppbygning av cDNA- ekspresjonsbiblioteker og iromun-screening.
PolyA+ RNA fra BSp73ASML-celler ble primet med oligo-(dT) og heksanukleotider av forskjellig sammensetning og syntetisert med revers transkriptase fra AMV fra den første kjede i cDNA. Den andre kjede i cDNA ble fremstilt med E.coli DNA polymerasel, RNaseH og E.coli ligase, og deretter ble den dobbeltkjedete cDNA sine ender gjort like lange ved hjelp av T4DNA polymerase. Vektorene pEXl, 2 og 3 (Stanley og Luzio, 1984), som muliggjør fusjoneringen av cDNA-ene i tre forskjellige leserastre ble kuttet opp med Smal-restriksjonsendonuklease og ligert til cDNA (T4 DNA ligase). Kompetente E.coli DH5 (pCl857) bakterier som produserer en temperaturømfintlig repressor transformeres med pEX-cDNA-produktene og dyrkes på nylonfiltre. Genet for den temperaturømfintlige repressor RCI857 ligger på plasmidet pCl857, som er forenelig med pEX-plasmidene. Ved 28°C er lPR-promoteren, som styrer syntesen av fusjonsprote-inene, utkoplet. Ved temperaturøkning til 42°C inaktiveres CI-repressoren, og syntesen av p-galaktosidase/ ASML-fusjonsproteiner settes massivt i gang. De varmeinduserte bakteriekolonier denatureres deretter med kloroformdamp på filtrene, og disse inkuberes deretter i PBS som inneholder 3% tørrmelkpulver, lysozym og DNase. De bakterielle fusjonsproteiner som er fiksert på nylonfilteret inkuberes nå med mAkl.lASML og blir etter utvasking av ikke-spesifikt bundet mAk anvendt til å påvise bindingen som sekundært antistoff 125J markert kanin anti-mus IgG. Etter autoradio-grafi ble positive kloner isolert fra det opprinnelige bakteriefilter og analysert vidtgående. En klon som syntetiserte fusjonsproteinet, som reagerte spesifikt med 1.1ASML, var pEX34. pEX-plasmidet som finnes i bakteri-eklonen inneholder 167 nukleotide cDNA-er, som blant annet koder for epitopen (respektivt antigendeterminanten) hvis spesifisitet mAK.l.lASML bærer.
Isoleringen av de totale lengder cDNA mMeta-1 foregikk deretter ved standardmetoder.
Immunisering av rotter med mAkl. lASML.
BDX-rotter, som er syngeniske med BSp73-tumorcellene, ble injisert subkutant respektivt intraperitonealt med mAkl.lASML (koplet til Keyhole Limpet Haemocyanin) sammen med komplett Freunds adjuvans. Den første injeksjon ble foretatt 10, 7 og 3 dager før injeksjonen av BSpASML-cellene (inn i fotfettpolsteret), de følgende deretter 3,
7, 11, 14 og 21 dager senere. Etter 28 dager avlives rottene, de forskjellige lymfeknuter prepareres og veies, og makroskopisk synlige lungemetastaser telles.
Sammenheng mellom ekspresjonen av variante CD44 overflateproteiner og metastatisk potensiale.
For å fastslå om ekspresjonen av variante CD44 gluko-proteiner utelukkende er en egenskap hos den undersøkte BSp73ASML-cellelinje, eller om ekspresjonen kan bringes i sammenheng med det metastatiske potensiale, ble en annen serie rottetumorcellelinjer, som er avledet fra 13762NF-mammo karsinom (Neri et al., 1982) undersøkt. Dessuten ble cellelinjer, som er avledet av primærtumorer (MTPa, MTC, MTF7 og MTA (gruppe 1)) sammenlignet med cellelinjer som er avledet fra lymfeknute- og lungemetastaser (MTLy, MTLn2, MTLn3 (gruppe 2)). Mønsteret til RNA avledet fra CD44 er gjengitt i fig. 4, hvorved probe A, B og D tilsvarer probene som er beskrevet på side 4 og i fig. 1. Celler i gruppe 1 oppviser alle et normalt CD44-mønster med probe B. Celler i gruppe 2 oppviser derimot et mønster som avviker fra dette. RNA er større enn RNA i gruppe 1 og tilsvarer RNA fra BSp73ASLM. Mindre RNA-er går tapt ved hybridiseringen med probe D. Det øvrige mønster viser likhet mellom de to rottetumorsystemer.
Også med probe A tilsvarer RNA-mønsteret i gruppe 2 mønsteret til BSp73ASML. Mens probe A ikke hybridiserer med RNA fra BSp73AS opptrer det et lite, diffust RNA-bånd på ca. 2,5 kb hos celler fra gruppe 1. RNase- og Sl-nuklease-proteksjonsanalyse viser også den strukturelle likhet. Av disse resultater synes det å opptre en skifting i spalt-ningsmønsteret og ekspresjonen til variante CD44 RNA-er med dannelsen av metastaser.
Overføring av det metastatiske potensiale til ikke- metastasedannende BSp73AS- celler ved overekspresjon av pMeta- 1.
Sammenhengen mellom ekspresjonen av variante CD4 4-arter med det metastatiske potensiale i to serier av rottetumorer indikerer en kausal rolle for disse glykoproteiner i den metastasedannende prosess. For å undersøke denne rolle ble p-Meta-1 overført i BSp73AS-celler og undersøkt om de derved forandret cellenes beteende. Det fullstendige, kodende område av pMeta-1 {fig. 2) ble innført nedenfor SV40-promoteren, og denne formasjon (diagram i fig. 5) ble sammen med PSV2neo innført i BSp73AS-celler. Enkelte G418-resistente og pMeta-l-uttrykkende kolonier ble oppnådd. Disse to koloniers RNA-mønster er gjengitt i fig. 5. Hybridiseringen av den variante CD44 spesifikke probe A oppviser en dominant transkript på ca. 2,2 kb, noe som i størrelse tilsvarer den minste, hyppige RNA som transkriberes i BSp7 3ASML-cellene (fig. 5). De transkriberte celler inneholder imidlertid ca. 10 ganger så mye av denne RNA som BSp73ASML.
Andre størrelsesordner iakttas i en av de transkriberte celler (BSp73AS-pSVMetal-14), noe som kan være av-hengig av stedet for plasmidintegrasjonen. En pSV2neo-simu-leringsoverføringsklon (ikke gjengitt) og BSp73AS-mottaker-cellene inneholder ingen RNA som er komplementær til probe A. For å påvise de endogene, normale CD44-transkripsjoner (uten ekstraområdet til pSVMeta-1) i transfektene ble filteret strippet og rehybridisert med probe D. Denne del av den ikke-oversatte 3'-sekvens finnes ikke i ekspresjons-klonen (se fig. 5). Probe D oppviser to hovedtranskripter på 2,9 og 4,9 kb i de to transfekters RNA-er (fig. 5, høyre spalte) både i kontrollen BSp73AS og i den ikke avbildete BSp73ASpSVneo.
Omtrentlige kvantifiseringer av de forskjellige, over-ensstemmende hybridiseringer viser at transfektene uttrykker ca. 5 ganger så mye av de variante CD44 RNA-er, som transkriberes ved hjelp av ekspresjonsplasmidet, slik som de endogene gentranskripter.
De overuttrykte cDNA-er oversettes til et protein. De to transfekter som er vist i fig. 5, syntetiserer mAbl.lASML-immunfargbare proteiner av samme tilsynelatende størrelse, nemlig et hovedprodukt på 150 kDa og svakere bånd ved 100 kDa. På grunn av at cDNA-sekvensen koder for et primært proteinprodukt med bare 503 aminosyrer (tilsvarer 60.000 Da), må alle synlige bånd fremvise modifiserte former. Båndet på 150 kDa løper sammen med én av de modifiserte former av variant CD44, som uttrykkes i den metastasedannende celle BSp73ASML. BSp73AS lier simultan-overførte BSp73ASpSVneo-celler har ikke dette protein. Som i BSp73ASML-cellene ligger epitopen til cellene som uttrykkes av transfekten fritt på celleoverflaten.
For å bevise at ekspresjonen av variant CD44 er tilstrekkelig til å bibringe BSp73AS-celler et metastatisk
potensiale ble transfekter injisert i syngeniske BDX-rotter (spontan metastaseprotokoll). I tidligere forsøk bredte det seg fra injeksjonsstedet hurtig ut metastatiske tumorceller BSp73ASML og var ca. 10 dager etter injeksjonen fullstendig fordelt (Matzku, 1984). Alle lokale tumorer ble derfor
fjernet den 10. dag ved hjelp av amputasjoner. Alle bærere av BSp73ASML-celler og alle dyr som var injisert med én av de overuttrykte transfekter utviklet lungemetastaser (tabell 1). Forløpet for metastasedannelsen var forholdsvis hurtig, i løpet av 5-8 uker etter injeksjonen. Dyr som hadde fått BSp73AS-cellene eller simultantransfekter var etter dette tidspunkt helt friske (bortsett fra som følge av amputasjonen), og også etter 5 måneder kunne det ikke påvises noen metastaser.
Til tross for en overraskende likhet i den sterke metastasedannelse foreligger det enkelte interessante for-skjeller. BSp73ASML-celler når i alle dyr frem til lymfeknutene og fører til en massiv forstørrelse av forskjellige knuter i området for inguinalranden og ved siden av aorta (tabell 1). En transfekt (BSp73AS-pSVMetal-14) forårsaker lymfeknuteforstørrelser i 3 av 8 dyr, selv om alle dyr utvikler multiple lungemetastaser (tabell 1). Med den andre transfekt (BSp73AS-pSVMetal-15) kan det ikke fastslås noen lymfeknuteforstørrelse. Transfektene synes derfor å være i stand til å danne kolonier i lungen uten en obligatorisk vekstfase i lymfeknutene.
Forsøket ifølge tabell 1 tyder dessuten på en annen forskjell mellom BSp73AS-transfektene og BSp73ASML. De individuelle lungemetastaser er synlige makroskopisk, mens de fra BSp73ASML er små og tallrike. Imidlertid utvikler i en større serie med BSp73ASML (Reber et al., 1990) 11 av 20 dyr fra 5 til 20 knuter per lunge, enn transfektene.
For å fastslå at de dannete metastaser forårsakes av den injiserte transfekt og for å utelukke den usannsynlige mulighet for en spontan mutasjon, som overfører et metastatisk potensiale, ble de epitop-positive proteiner bestemt i de totale lungeekstrakter og i ekstrakter fra rekultiverte, metastasefrembringende celler. I den totale lungeekstrakt og i ekstraktene til en spesifikk lungeknute fra et dyr som hadde mottatt BSpAS-pSVMetal-15-transfekter, kan 150 kDa glykoproteinet påvises. Den G418-resistente stamme uttrykker ved vekst in vitro et protein med den samme tilsynelatende molekylvekt.
Diagnostikk og terapi.
1. Analyse av humant tumormateriale ved hjelp av hybridiseringer in situ med de foreliggende, humane pMeta-1 sekvenser. Disse forsøk er tenkt som innledende forsøk før det foreligger et antistoff som gjenkjenner den humane EZB. 2. Fremstilling av antistoffer mot den humane EZB. Kloning av de humane pMetal-sekvenser i bakterielle ekspre-sjonsvektorer, slik at det oppstår fusjoner med p-galaktosidase eller tryptofan E-produkt. Immunisering av kaniner med disse fusjonsproteiner respektivt med syntetiserte peptider fra nevnte EZB (koplet på bærermolekyler). Isolering av de polyvalente respektivt monospesifikke antistoffer.
Anvendelsesmuligheter:
Immunhistologiske undersøkelser av klinisk tumormateriale (diagnostikk).
Påvisning av løselig EZB i serum fra pasienter ved hjelp av ELISA-tester (diagnostikk).
Konstruksjon av toksinkoplede antistoffer for ved hjelp av antistoffet å bringe toksinet inn i tumor/metastaseområdet (terapi).
Konstruksjon av antistoffer med to definerte antigen-bindings steder.
Ved hjelp av denne dobbeltspesifisitet skal det for-søkes å utløse cytotoksiske reaksjoner i metastaseområdet (f.eks. Anti-CD2- eller -CD3-kopling) (terapi). 3. Produksjon av hMeta-1 protein ved hjelp av trans-for-masjon av humane celler eller rotteceller med en ekspresjonsvektor som bærer den fullstendige hMeta-1 cDNA-sekvens, respektivt rensing av LCLC97-celler.
Anvendelsesmuligheter:
Injeksjon av proteinet eller deler derav for å blokkere tumorcellenes vev-bindingsseter.
Etter karakterisering av bindingssetene kunne også an-vendelse i terapi være tenkelig, som kunne bestå i injiser-ing av store mengder bindingsprotein som ville blokkere de vandrende tumorceller.
Litteraturliste:
L.A. Goldstein, D.F.H. Zhou, L.J. Picker, C.N. Minty, R.F. Bargatze, J.F. Ding og E.C. Butcher, A human lymphocyte homing receptor, the hermes antigen, is related to cartilage proteoglycan core and link proteins. Cell, Vol 56, 1989, p. 1063-1072. I.R. Hart, N.T. Goode og R.E. Wilson, Molecular aspects of the metastatic cascade., Biochim. Biophys. Acta, Vol 989, 1989, p. 65-84.
R.L. Idzerda, W.G. Carter, C. Nottenburg, E.A. Wayner, W.M. Gallatin og T. St. John, Isolation and DNA sequence of a cDNA clone encoding a lymphocyte adhesion receptor for high endothelium., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., Vol 86, 1989, p. 4659-4663.
G. Kohler, i: I. Lefkovits og B. Pernis (eds). Immuno-logical Methods, Vol 2, 1981, p. 285. N.Y. Academic Press.
S. Matzku, Komitowski, Mildenberger og M. Z611er, Characterization of Bsp 73, a spontaneous rat tumor and its in vivo selected variants showing differenct metastasizing capacities. Inv. Met., Vol 3, 1983, p. 109-123.
S. Matzku, A. Wenzel, S. Liu og M. Zoller, Antigenic differences between metastatic and nonmetastatic BSp73 rat tumor variants characterized by monoclonal antibodies. Cancer Res., Vol 49, 1989, p. 1294-1299.
A. Neri, D. Welch, T. Kawaguchi og G.L. Nicolson, Development and biologic properties of malignant cell sublines and clones of spontaneously metastasizing rat mammary adenocarcinoma. J. Nati. Cancer Inst., Vol 68, 1982, p. 507-517.
G.L. Nicolson, Tumor cell instability, diversi-fication, and progression to the metastatic phenotype: from oncogene to oncofetal expression. Cancer Res., Vol 47, 1987, p. 1473-1487. C. Nottenburg, G. Rees og T. St. John, Isolation of mouse CD44 cDNA: structural features are distinct from the primate cDNA. Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., Vol 86, 1989, p. 8521-8525. I. Stamenkovic, M. Amiot, J.M. Pesando og B. Seed, A lymphocyte molecule implicated in lymph node homing is a member of the cartilage link protein family. Cell, Vol 56, 1989, p. 1057-1062.
K.K. Stanley og J.P. Luzio, Construction of a new family of high efficiency bacterial expression vectors: identification of cDNA clones coding for human liver proteins. EMBO J., Vol 3, 1984, p. 1429-1434.
A. Wenzel, Charakterisierung von Differenzierungs-antigenen auf dem Rattentumor Bsp 73 mit Hilfe monoklonaler AntikSrper. Diplomarbeid, universitetet i Karlsruhe.
D.F.H. Zhou, J.F. Ding, L.F. Picker, R.F. Bargatze, E.C. Butcher og D.V. Goeddel, Molecular cloning and expression of Pgp-1 - The mouse homolog of the human H-CAM (Hermes) lymphocyte homing receptor., J. Immunol., Vol 143, 1989, p. 3390-3395.
Claims (1)
- Analogifremgangsmåte til fremstilling varianter av CD44 overflateproteiner som skal anvendes ved fremstilling av antistoffer for diagnostiske og terapeutiske formål, og som kodes av DNA-fragmenter som velges blant: a) nukleotid-sekvensene b) nukoleotid-sekvenser som er degenerert i forhold til de under a) angitt DNA-sekvenser og/eller utgjør alle variasjoner, karakterisert ved at DNA-fragmentene uttrykkes i egnete vertsceller, hvoretter overflateproteinvarianter isoleres og renses.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4014510A DE4014510A1 (de) | 1990-05-07 | 1990-05-07 | Variante cd44-oberflaechenproteine, diese kodierende c-dna-sequenzen, antikoerper gegen diese proteine sowie ihre verwendung in der diagnostik und therapie |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO980293L NO980293L (no) | 1993-01-04 |
NO980293D0 NO980293D0 (no) | 1998-01-23 |
NO317154B1 true NO317154B1 (no) | 2004-08-30 |
Family
ID=6405813
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO924234A NO309770B1 (no) | 1990-05-07 | 1992-11-04 | DNA-fragment som koder for en del av et overflateproteins metastasedannende tumorceller; ekspresjonsvektor; transformert vertscelle; polypeptid for anvendelse i et in vitro system; antistoff; samt anvendelse av antistoffet |
NO19980293A NO317154B1 (no) | 1990-05-07 | 1998-01-23 | Fremgangsmate til fremstilling av et polypeptid |
NO20001668A NO310661B1 (no) | 1990-05-07 | 2000-03-31 | Anvendelse av et DNA-fragment, samt komplement¶re kjeder, derivater og deler derav |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO924234A NO309770B1 (no) | 1990-05-07 | 1992-11-04 | DNA-fragment som koder for en del av et overflateproteins metastasedannende tumorceller; ekspresjonsvektor; transformert vertscelle; polypeptid for anvendelse i et in vitro system; antistoff; samt anvendelse av antistoffet |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20001668A NO310661B1 (no) | 1990-05-07 | 2000-03-31 | Anvendelse av et DNA-fragment, samt komplement¶re kjeder, derivater og deler derav |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US5506119A (no) |
EP (1) | EP0531300B1 (no) |
JP (1) | JP3133062B2 (no) |
KR (1) | KR0184691B1 (no) |
AT (1) | ATE106943T1 (no) |
AU (1) | AU646858B2 (no) |
BR (1) | BR1100650A (no) |
CA (1) | CA2082382C (no) |
DE (2) | DE4014510A1 (no) |
DK (1) | DK0531300T3 (no) |
FI (1) | FI106128B (no) |
HU (1) | HU218905B (no) |
IE (1) | IE62096B1 (no) |
IL (3) | IL134982A (no) |
NO (3) | NO309770B1 (no) |
NZ (1) | NZ238056A (no) |
PT (1) | PT97574B (no) |
TW (1) | TW212202B (no) |
WO (1) | WO1991017248A1 (no) |
YU (1) | YU49126B (no) |
ZA (1) | ZA913389B (no) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5002873A (en) * | 1989-03-17 | 1991-03-26 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | DNA sequence encoding a lymphocyte adhesion receptor for high endothelium |
US5443750A (en) * | 1991-01-16 | 1995-08-22 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions with high activity cellulase and softening clays |
DE4134982A1 (de) * | 1991-10-23 | 1993-04-29 | Kernforschungsz Karlsruhe | Verwendung von antikoerper enthaltenden praeparationen zur immunsuppression |
DE69302276T2 (de) * | 1992-07-21 | 1996-09-19 | Isis Innovation | Diagnostische Methode |
JPH08511419A (ja) | 1993-06-18 | 1996-12-03 | ヤルカネン、シルパ | 組成物およびCD44v6に対するモノクローナル抗体を用いる診断方法 |
DE4320623C2 (de) * | 1993-06-22 | 1997-11-20 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Diagnose und Analyse von Adenokarzinomen |
EP0767378A1 (de) * | 1993-06-22 | 1997-04-09 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Verfahren zur Diagnose und Analyse von Magenkarzinomen |
DE4320624A1 (de) * | 1993-06-22 | 1995-02-09 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Diagnose und Analyse von Mammakarzinomen |
DE4326573A1 (de) * | 1993-08-07 | 1995-02-23 | Boehringer Ingelheim Int | Durch Exon v5 des CD44-Gens kodierte Polypeptide als Targets für Immuntherapie und Immunszintigraphie von Tumoren |
DE4431297A1 (de) * | 1994-09-02 | 1996-03-07 | Boehringer Ingelheim Int | Monoklonaler Antikörper gegen CD44v6 |
DE19540515C1 (de) * | 1995-10-31 | 1997-02-06 | Boehringer Ingelheim Int | Tumortherapie durch adoptiven Transfer CD44v-spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten |
DE19653607A1 (de) | 1996-12-20 | 1998-06-25 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen |
DE19708713C2 (de) * | 1997-03-04 | 2002-11-28 | Boehringer Ingelheim Int | Verwendung von anti-CD44 Antikörpern enthaltenden Präparationen zur Behandlung bestimmter Tumore und zur Unterdrückung von Immunreaktionen |
US20080124327A1 (en) * | 1999-10-08 | 2008-05-29 | Arius Research, Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US8048416B2 (en) | 1999-10-08 | 2011-11-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US20050100542A1 (en) * | 1999-10-08 | 2005-05-12 | Young David S. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US7947496B2 (en) * | 1999-10-08 | 2011-05-24 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US8071072B2 (en) | 1999-10-08 | 2011-12-06 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US7189397B2 (en) * | 1999-10-08 | 2007-03-13 | Arius Research Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US20090004103A1 (en) * | 1999-10-08 | 2009-01-01 | Young David S F | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
DE10026833A1 (de) * | 2000-05-30 | 2001-12-13 | Karlsruhe Forschzent | Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Modulierung der Aktivität eines Tumorsuppressorgens |
AU2003272511A1 (en) * | 2002-09-13 | 2004-04-30 | Dyax Corporation | Cd44-binding ligands |
PL2886126T3 (pl) | 2013-12-23 | 2017-11-30 | Exchange Imaging Technologies Gmbh | Nanocząstka sprzężona z peptydami wiążącymi CD44 |
CN109608537B (zh) * | 2018-12-12 | 2020-09-15 | 深圳市龙华区人民医院 | 基于前列腺癌干细胞标志物cd44的抗原表位多肽cd44-p2及其应用 |
CN109608536B (zh) * | 2018-12-12 | 2020-09-15 | 深圳市龙华区人民医院 | 基于前列腺癌干细胞标志物cd44的抗原表位多肽cd44-p3及其应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4753894A (en) * | 1984-02-08 | 1988-06-28 | Cetus Corporation | Monoclonal anti-human breast cancer antibodies |
US5108904A (en) * | 1990-03-26 | 1992-04-28 | Alan Landay | CD44 as a marker for HIV infection |
-
1990
- 1990-05-07 DE DE4014510A patent/DE4014510A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-03-30 DK DK91906994.8T patent/DK0531300T3/da active
- 1991-03-30 US US07/946,497 patent/US5506119A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-30 AT AT91906994T patent/ATE106943T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-03-30 DE DE59101889T patent/DE59101889D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-30 KR KR1019920702741A patent/KR0184691B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-03-30 CA CA002082382A patent/CA2082382C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-30 JP JP03506825A patent/JP3133062B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-30 AU AU75659/91A patent/AU646858B2/en not_active Ceased
- 1991-03-30 EP EP91906994A patent/EP0531300B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-30 HU HU9203449A patent/HU218905B/hu unknown
- 1991-03-30 WO PCT/EP1991/000614 patent/WO1991017248A1/de active IP Right Grant
- 1991-05-02 IL IL13498291A patent/IL134982A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-05-02 IL IL9802491A patent/IL98024A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-05-06 PT PT97574A patent/PT97574B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-05-06 NZ NZ238056A patent/NZ238056A/xx unknown
- 1991-05-06 IE IE152691A patent/IE62096B1/en unknown
- 1991-05-06 ZA ZA913389A patent/ZA913389B/xx unknown
- 1991-05-06 TW TW080103527A patent/TW212202B/zh active
- 1991-05-07 YU YU79491A patent/YU49126B/sh unknown
-
1992
- 1992-11-04 NO NO924234A patent/NO309770B1/no unknown
- 1992-11-06 FI FI925043A patent/FI106128B/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-07 US US08/478,882 patent/US5885575A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/483,322 patent/US5760178A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-07 BR BR1100650-1A patent/BR1100650A/pt active IP Right Grant
-
1998
- 1998-01-23 NO NO19980293A patent/NO317154B1/no unknown
-
2000
- 2000-03-09 IL IL13498200A patent/IL134982A0/xx active IP Right Grant
- 2000-03-31 NO NO20001668A patent/NO310661B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO317154B1 (no) | Fremgangsmate til fremstilling av et polypeptid | |
JP7091447B2 (ja) | 新型なscFvアミノ酸配列、それを含むキメラ抗原受容体、およびその使用 | |
AU664994B2 (en) | Cell surface receptors homologous to coagulation factors V and VIII | |
WO2006132272A1 (ja) | 抗体の作製方法 | |
CN115947854A (zh) | 抗人cd40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用 | |
CN112684185A (zh) | 一种可溶性b7-h4定量检测试剂盒及其应用 | |
WO1989004871A1 (en) | Improvements relating to the production of monoclonal antibodies | |
CN112250767B (zh) | 一种结合Strep-Tag II标签的抗体及其应用 | |
Pata et al. | Three different immunogen preparation strategies for production of CD4 monoclonal antibodies | |
SADO et al. | A novel method for production of monoclonal antibodies. Evaluation and expectation of the rat lymph node method in cell and molecular biology | |
WO2018235964A1 (en) | ANTIBODY ANTI-TGF-BETA1 | |
JP2011111422A (ja) | モノクローナル抗体 | |
CN111349164B (zh) | 糖基磷脂酰肌醇锚定糖蛋白(c4.4a)的单克隆抗体及其应用 | |
EP0638648A2 (en) | Monoclonal antibodies specifically reacting with PAF receptor, production process thereof, and hybridomas producing the antibodies | |
FI106129B (fi) | Menetelmät valmistaa muuntuneita CD44-pintaproteiineja ja näitä proteiineja vastaan vaikuttavia vasta-aineita | |
CN111434691A (zh) | Pd-l2单克隆抗体及其应用 | |
Weissinger et al. | Induction of plasmacytomas that secrete monoclonal anti-peptide antibodies by retroviral transformation | |
JP2014519337A (ja) | Abca1ポリペプチドに結合する抗体 | |
JPH07101998A (ja) | Paf受容体に特異的に反応するモノクローナル抗体、その製造方法、及び該抗体を産生するハイブリドーマ | |
CN111349157A (zh) | 钙粘附蛋白6的单克隆抗体及其应用 | |
CN101402684A (zh) | 抗牛成熟叠朊蛋白的单克隆抗体mab-bomDpl-9及其应用 | |
EA043515B1 (ru) | Анти-gpc3-антитело | |
JPH08173187A (ja) | ヒトキラー細胞表面分子に対するモノクローナル抗体 | |
JPH04112899A (ja) | マウスリンパ球表面抗原およびそれを認識するモノクローナル抗体 |