HU218905B - Eljárás áttételképző tumorsejt felületifehérje-variánsok előállítására - Google Patents

Description

A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 15 lap ábra)

HU 218 905 Β képletű r-Meta-1 nukleotidszekvencia, valamint az ezzel hibridizáló és felületi fehérjét kódoló, és a DNSszekvenciák degenerációja miatt eltérő és/vagy allélváltozatai, illetve humán áttételképző tumorsejtek valamely felületi fehérjéjének egy részét kódoló

AAC	CCA	AGC	CAT	TCA	AAT	CCG
ACA	AGG	ATG	CAT	GAT	GTA	GAC
GAA	GGA	AAC	TGG	AAC	CCA	GAA
CAT	GAG	CAT	CAT	GAG	GAA	GAA
ACA	ATC	CAG	GCA	ACT	CCT	AGT
ACC	CAG	AAG	GAA	CAG	TGG	TTT
TAT	CGC	CAA	ACA	ccc	AGA	GAA
ACA	GCT	GCA	GCC	TCA	GCT	CAT

GAA	GTG	CTA	CTT	CAG	ACA	ACC
AGA	AAT	GGC	ACC	ACT	GCT	TAT
GCA	CAC	CCT	CCC	CTC	ATT	CAC
GAG	ACC	CCA	CAT	TCT	ACA	AGC
AGT	ACA	ACG	GAA	GAA	ACA	GCT
GGC	AAC	AGA	TGG	CAT	GAG	GGA
GAC	TCC	CAT	TCG	ACA	ACA	GGG
ACC	AGC	CAT	CCA	ATG	CA

képletű h-Meta-1 nukleotidszekvencia, valamint az ezzel hibridizáló és felületi fehéijét kódoló, és a DNSszekvenciák degenerációja miatt eltérő és/vagy alléi változatai előállítására valamely patkánytumor-áttételképzó és áttételt nem képző sejtjeinek, illetve humán áttételképző sejtnek tenyésztésével, az áttételt képző sejtek ellen monoklonális antitestek képzésével, ezekből immortalizált hibridóma-sejtvonalak kialakításával, az áttételt képző tumorsejtekkel reagáló, de az áttételt nem képző tumorsejtekkel nem reagáló antitesteket képző hibridómasejtek kiválasztásával.

A találmánynak az a lényege, hogy patkány-, illetve humán tumorok áttételt képző sejtjeiből bakteriális kifejező könyvtárakat hoznak létre, a könyvtárakat a nevezett antitestekkel átvizsgálják, a pozitív klónokkal adott esetben újabb bakteriális kifejező könyvtár átvizsgálását hajtják végre, és a pozitív kiónokat teljes hosszúságú kiónokká egészítik ki, a teljes hosszúságú kiónokat elemezik, és az áttételképzésért felelős szekvenciát kiválasztják.

A találmány CD44 felületifehéije-variánsokkal, ezen fehérjék különböző determinánsai elleni antitestekkel, valamint ezek előállítási eljárásaival foglalkozik; foglalkozik továbbá azokkal a DNS-szekvenciákkal, amelyek ezeket a különböző fehérjedarabokat kódolják, valamint ezen fehérjék vagy részeik előállítási eljárásaival és az ezek ellen irányuló antitestekkel a tumoráttételek diagnózisához és terápiájához.

Az áttételre való lehetőség képezi a rosszindulatú tumorsejtek tulajdonképpeni életveszélyes tulajdonságát. Az eredeti primer tumorsejtek ezt a tulajdonságot valószínűleg átalakulások egész sorozata során szerzik meg a tumor fejlődése folyamán. Ezen folyamatok eredményeképpen állandóan ráksejtvariánsok válnak le a primer tumortömegből, áthatolnak az extracelluláris mátrixon, és a nyirokrendszerben vagy a véráramban vándorolnak. Gyakran egymáshoz tapadva szállítódnak az áttételképző tumorsejtek, a vér vagy nyirokrendszerben egy másik helyen elhagyva a véredényrendszert, hogy ott szekunder szövetekbe behatoljanak, és tumoráttételeket képezzenek (ezzel kapcsolatos áttekintések például az alábbiak: Hart és munkatársai, 1989; Nicolson, 1987). Az áttételek képződése tumorsejtek kölcsönhatásainak egész sorát igényli az intracelluláris mátrixszal vagy más sejtekkel. Csaknem minden ilyen kölcsönhatáshoz szükség van sejtfelületi komponensekre, mint például receptorokra, valamint sejtadhéziós molekulákra, beleértve azokat, amelyek a szervspecifikus adhéziót és ezáltal az áttételképzésnél bizonyos szervek előnyben részesítését biztosítják, valamint növekedési faktorokra és növekedésifaktor-receptorokra.

Ismeretes, hogy a BSp73 patkánytumorok áttételképző és áttételt nem képző tumorsejtjeinek membránfehérjéi különböznek antitest-reakcióval kimutathatóan (Matzku és munkatársai, 1983 és 1989).

Eddig már felismerték azt, hogy az áttételképző BSp73ASML tumorsejtek egy olyan felületi fehérjét tartalmaznak, amely egy részben ismert, a limfocitatapadásban, valamint a sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatásban részt vevő glikoproteinnek felel meg (a normális glikoproteinek elnevezése embernél: CD44, Hermes-1, egérnél: Ppg-1; és patkánynál: HEBFln). Ezektől az ismert szekvenciáktól az új CD44 felületi fehérje azonban különbözik egy 154 aminosavas extracelluláris tartományban [„extrazelluleren Bereich (EZB)], amely az emberi CD44 szekvencia 220. és 237 aminosavai (illetve az egérszekvencia 224. és 239. aminosavai) közé van beiktatva. Ennek az új glikoproteinnek, úgy tűnik, komoly szerepe van a sejt-mátrix, illetve sejt-sejt kötésben az áttételek keletkezésénél. Ennek a fehérjetartománynak (EZB) az előállítása és jellemzése képezi tehát a jelen találmány feladatainak egyikét. Az egerek immunizálása során olyan membránfehérjékkel, amelyeket BSp73ASML-ből kaptunk, olyan lépsejtek jönnek létre, amelyek a különböző CD44 felületi fehérjék EZB-je ellen antitesteket képeznek. Köhler eljárása (1981) szerint ezeket polietilénglikol segítségével mielómasejtekkel összeforrasztjuk, hogy állandó tenyészeteket nyerjünk. Azon tenyészetek klónozása és kivá2

HU 218 905 Β lasztása után, amelyek antitesteket termelnek - mégpedig olyanokat, amelyek BSp73ASML-lel reagálnak, nem reagálnak azonban a BSp73AS nem áttételképző törzsformájával, sem más, nem tumorképző patkánysejtekkel -, az új EZB fehérjerészre fajlagos antitesteket kaphatunk. A további kutatásokhoz kiválasztunk egy monoklonális antitestet, amely a BSp73ASML sejteket az immunfluoreszcenciás vizsgálatban különösen intenzíven színezi, ennek az mAbl.lASML elnevezést adjuk (mAb: monoklonális antitest).

A BSp73ASML sejtekből készített fehérjehidrolizátummal végzett Western-folt vizsgálatban mABl.l.ASML-lel négy fehéijecsík határozható meg 120 000; 150 000; 180 000 és 200 000 molekulatömeggel, miközben a patkány fibroblaszt sejtekből és áttételt nem okozó patkánytumorsejtekből való extraktumok nem mutatnak szignifikáns reakciót. Még nem sikerült megállapítani, vajon ezek a nagyságbeli különbségek különböző eredetű aminosavszekvenciákon vagy különböző erősségű utólagos fehérjemódosításokon alapulnak. Mindenesetre az antitestek által felismert epitóp mind a négy fehéijefajtában megtalálható, nem található meg viszont a kontrollként szolgáló fehérjékben, amelyek az áttételt nem okozó BSp73AS sejtekből vagy normális patkánysejtekből származnak.

cDNS-szekvenciák izolálása, amelyek a felületi fehérjék EZB-jét kódolják.

Az mAb.l.lASML monoklonális antitestet arra alkalmazzuk, hogy az EZB3-at kódoló cDNS-szekvenciákat egy bakteriális kifejezőkönyvtárban felfedezzük. A könyvtárat BSp73ASML sejtekből való poli A+ RNS és pEX vektorrendszer segítségével alkotjuk meg (Stanley és Luzio, 1984). A cDNS-szekvencia által kódolt terméket β-galaktozidáz fúziós fehérjeként az antitestek segítségével találjuk meg. Egy így izolált, az 1.1ASML monoklonális antitestekre pozitív, pEX34 nevű cDNS-klón egy 167 nukleotidból álló cDNS-szekvencia-darabot kódol. Ezt a cDNS-darabot alkalmazzuk azután, hogy egy nagyobb, pSP65 vektorban levő cDNS-könyvtárat (ismét BSpASML RNS-ből) átvizsgálhassunk. Az ilyen módon izolált kiónok egyike, a pM66, szolgál azután arra, hogy - az úgynevezett „primer”-toldás (starter-oligonukleotid) és a polimeráz láncreakció (PCR) segítségével - izolálhassuk a teljes hosszúságú pMeta-1 cDNS-klónt. A teljes hossz bizonyítását primer meghosszabbítás segítségével kapjuk meg (3207 nukleotid). A kolinearitást egy, a BSp73ASML tumorból származó RNS-sel RN-áz és SÍ védőelemzéssel dokumentáljuk.

A cDNS izolálása a baktériumokban való kifejezés és az antitestekkel való felismerés segítségével bebizonyítja, hogy a felületi fehérjék EZB-jében levő primer aminosavszekvenciát az antitestek felismerik,

EZB-t kódoló hírvivő (messenger) RNS fejeződik ki Bp73ASMLben, de nem fejeződik ki BSp73AS sejtekben.

Három különböző szekvenciapróbát (vizsgáló mintát) alakítunk ki a cDNS-klónokból, hogy hibridizálással fajlagos hírvivő RNS-eket szerezzünk. Az A próba befedi azt a cDNS-tartományt, amely az EZB-t kódolja.

A B próba azt a szekvenciát reprezentálja, amely a pMeta-l-ben a 1403-1572 helyek között terül el, míg a C próba a pMeta-1-ben a kiindulástól a 794. helyig terjedő szekvenciát hordozza (1. ábra). A BSp73 tumor-sejtvonal poliA+RNS-ét elektroforetikusan szétválasztjuk, és RNS transzfer hibridizálás segítségével elemezzük. Négy olyan sejtvonal, amely nem képez áttételt, nem tartalmaz olyan RNS-t, amely az A próbával homológ, miközben az áttételképző BSp73ASML tumorsejtekből való RNS-ek erősen reagálnak. Az A próba ebben az RNS-készítményben különböző RNS-hoszszúságok heterogén keverékét ismeri fel 2,2 és 3,3 kb között, továbbá felismer egy nagyobb, 4,9 kb-os RNSfajtát. Az 1.1ASML monoklonális antitestek által felismert fajlagos membránfehérjék kizárólagos kifejezése az áttételképző tumorsejt-variánsokban nyilvánvalóan a megfelelő, EZB-t kódoló hírvivő RNS-ek kizárólagos kifejezésén alapul. A teljes, 3,2 kb-os pMeta-1 klón nyilvánvalóan nem tudja ezen RNS-fajta összes szekvenciáit reprezentálni. Ebből a heterogén keverékből egy fajtához csak egy RNS-nagyság tartozhat. Az A, B és C próbák ugyanazokat a hibridizálási mintázatokat adják, mint az A próba a BSp73ASML RNS szétválasztásánál, amennyire ez ilyen heterogenitásnál megállapítható, vagyis ezek az RNS-fajták olyan szekvenciákat hordoznak, amelyek komplementerek mind a három próbával, vagyis az A, B és C próbákkal. Az A próbával ellentétben a B és C próbák felismerik az áttételt nem okozó sejtvonalakban levő hírvivő RNS-fajtákat is. Az RNS-nagyságok azonban világosan különböznek a BSp73ASML-ben levő RNS-nagyságoktól; nevezetesen négy megkülönböztethető hírvivő RNS-fajta mutatható ki 1,5; 2,0; 2,9; és 4,3 kb nagysággal. Bár ezek az RNS-fajták a BSp73ASML-ból való heterogén RNS-keverékben is elrejtőzhetnek, mégis biztos, hogy a BSp73ASML-ben nem azonos mennyiségben léteznek. Döntő tényező, hogy az A próbával komplementaritást mutató RNS-szekvenciák nyilvánvalóan tökéletesen hiányoznak az áttételt nem okozó sejtekben. Mi ezért körültekintően is következtethetünk arra, hogy az A, B és C próbák szekvenciái ugyanabban az RNS-ben csak az áttételképző tumorban találhatók meg, mégpedig olyan mádon, mintha az A próba szekvencia a csak B-C pozitív RNS-ekben ki lenne hasítva, és mintha ez az alternatív hasítási folyamat csak az áttételképző sejtvonalakban történne meg.

Abból a célból, hogy a kolinearitást az RNS és a cDNS között bebizonyítsuk, és hogy az RNS-ek különbözőségét a BSp73AS és a BSp73ASMl sejtek között elemezhessük, Sl-nukleáz és RN-áz védőelemzést végzünk. A védett DNS- vagy RNS-fragmentumok teljes hossza csak kicsiny lehet, mivel olyan 5’ végű vektorszekvenciákat tartalmaznak, amelyek a tumorsejtekből való RNS-ekkel nem képesek hibridizálni. Először megvizsgáljuk az átmenetet a 3’ oldalon: az A próbához homológ szekvenciák átmenetét a B próbákhoz homológ szekvenciák felé. Mindkét technika egy egyedi RNSfajtát jelez a BSp75AS sejtekben, amely a próbákkal egy távoli tartományban kolineáris. Ezenkívül 5’-felé ettől azok a cDNS-, illetve RNS-próbák, amelyek bizto3

HU 218 905 Β san a BSp73ASML-ből való RNS-szekvenciáknak felelnek meg, különböznek a BSp73AS-sejtekből való RNS-től. A BSp73ASML-ből való RNS-ek mindenekelőtt olyan szekvenciákat tartalmaznak, amelyek védik a próbák nagyobb fragmentumait. A nagyobb fragmentumok a teljes hosszúságú DNS-, illetve RNS-daraboknak felelnek meg, amelyek a védőelemzéshez ajánlottak. A kisebb fragmentumok is kimutathatók. Mivel az RNS transzfer hibridizálás különböző nagyságú RNSek ugyancsak heterogén keverékét deríti fel, lehetséges, hogy ezek a kisebb védett fragmentumok olyan RNSfajtákat jeleznek, amelyek a cDNS-től másutt térnek el, azaz egy olyan helyen, amely az imént bemutatott eltérési pont és az ajánlott próbák 5’ vége között van. Ezek az RNS-fajták éppen így nem mutathatók ki a BSp73AS sejtekben.

Megfigyelve ezután az eltérés pontját az 5’ oldalon, tehát azoknak a szekvenciáknak az átmenetét, amelyek a C próbával hibridizálnak, azokhoz, amelyek az A próbával, vagyis az EBZ-t kódoló szekvenciával hibridizálnak. Az elemzés megfelelő eredményeket nyújt az 5’ törésponthoz. A BSp73AS sejtekből való RNS-ek az ajánlott próbákat csak egy kis tartományban védik. A BSp73ASML sejtekből való hírvivő RNS-ek hoszszabb fragmentumokat védenek. Ezek ugyanis kolineárisak az ajánlott próba teljes hosszával. Arra is lehet tehát következtetni, hogy a cDNS-klón pMeta-1 szekvenciákat képvisel, amelyek a BSpASML áttételképző tumorsejtekben kifejeződnek. A 3’ és 5’ tartományok megtalálhatók a BSp73AS sejtekből való RNS-ekben is. A meghatározott átmenetekkel bíró, EZB-t kódoló szekvenciák, amelyeket a fentebb ismertetett technikák segítségével fel lehet térképezni, jelzik, hogy itt az RNS-képzéshez egy alternatív hasítási mechanizmusnak kell léteznie. Az átmenetek 5’ és 3’ töréspontjait az EZB-szekvenciákhoz az 1. ábrában nyíllal jelezzük.

Az 1.1ASML monoklonális antitestek a CD44 glikoproteinek egy variáns formáját azonosítják.

Abból a célból, hogy a felületi fehérjéről szerkezeti információkat szerezzünk, az összes klónozott cDNS-molekula szekvenciaelemzését elvégezzük. A pMeta-1 teljes hosszúságú kiónok nukleotidszekvenciáját és az ebből levezethető aminosavszekvenciákat a 2. ábrában mutatjuk be. A teljes hosszúságú cDNS-klón 3207 nukleotidot ér át. A 3’ terminális egy poli A véget hordoz, és két kiegészítő poliadenilező szignál fekszik a 2288. és 1743. helyeknél. Az első ATG kodon egy konszenzus iniciációs szekvencia után következik, és egy 1509 nukleotidos leolvasókeret nyílik meg, amely 503 aminosavnak felel meg. Mint ami egy membránhoz rögzített fehérjéről vélhető, az első 21 aminosav hidrofób és egy szignálpeptidet képez. Ezen szekvenciák egyetlen részlete sem található meg eddig az adatbázisokban. Mi azonban találtunk szekvenciahomológiát nemrégiben publikált adatok között, amelyek a CD44 limfocitavezérlő receptorral (illetve Pgpl-gyel) foglalkoznak (Idzerda és munkatársai, 1989; Goldstein és munkatársai, 1989; Stamenkovic és munkatársai, 1989; Nottenburg és munkatársai, 1989; Zhou és munkatársai, 1989). A homológiák szigorúan a cDNS 5’ és 3’ részeire korlátozódnak, beleértve a nem transzlatált területeket is, és befejeződnek a BSp73AS és BSp73 ASML RNS-szekvenciák közti eltérés már fentebb említett pontjainál. A teljes szakasz az eltérési pontok között (a 2. ábrában csíkozással jelezve), tehát az áttételképzésre fajlagos EZB-t kódoló szekvencia teljes szakasza nincsen jelen a Pypl vagy CD44 szekvenciákban. Az áttételképzésre fajlagos glikoprotein nyilvánvalóan a CD44 glikoprotein egyik változatát képviseli. Ez tudniillik egy 156 aminosavas kiegészítő extracelluláris tartományt hordoz, így tehát egy kiterjesztett, 410 aminosavas extracelluláris tartományt (leszámítva a 21 aminosavas szignálpeptidet), szemben a változatlan CD44 glikoproteinek 270 aminosavával (szintén leszámítva a szignálpeptidet). Az áttételt nem okozó BSp73AS sejtekben azonban ezen CD44-család változatlan formája mutatható ki. Ezen BSp73AS RNS-ek cDNS-szekvenciáit szintén klónozzuk, és az azonosságát az áttételképzésre fajlagos kiónokkal a többlettartományon kívül bizonyítjuk.

A CD44 variánsok kifejezése korrelációban van az áttételképző képességgel.

Abból a célból, hogy ellenőrizzük, vajon a CD44 glikoproteinvariánsok kifejeződése kivétel nélkül a BSp73ASML sejtekben megy-e végbe, és vajon ez összhangban van-e ezen sejtek áttételképző potenciáljával vagy az áttételképző potenciállal általában, tanulmányozzuk izogén patkánytumor-sejtvonalak egy másik sorozatát, mégpedig a 13762 NF emlőkarcinóma-rendszer tumorsejtvonalait (Neri és munkatársai, 1982). Itt összevetjük azokat a sejtvonalakat, amelyek a szülőtumorból vezethetők le, mégpedig az MTPa, MZC, MTF7 és MTA sejteket (1. csoport) azokkal a sejtvonalakkal, amelyek nyirokcsomókból vagy tüdőáttételekből erednek, mégpedig az MTLy, MTLn2 és MTLn3 sejtekkel (2. csoport). Az 1. csoport sejtjei lényegében a normális CD44 mintázatot fejezik ki, hasonlóan a BSp73AS sejtekből való RNS-ekhez, amikor B próbával hibridizáljuk. Az A próbával viszont egy diffúz RNS-csík csekély mennyiségét mutatjuk ki, amely mintegy 2,5 kb mérettel bír. Másrészt a 2. csoport sejtjei egy teljesen eltérő RNS-mintázatot mutatnak. Mind az A, mind a B próba hibridizál a nagyobb RNS-fajtákkal. A nagyság hasonlít ahhoz, amelyet a BSp73ASML-ben mutattunk ki. A hasonlóságot dokumentáljuk RN-áz és SÍ védőelemzéssel is. Ezen adatok alapján következtetünk arra, hogy egy változás az RNS hasítási mintázatában és a CD44 variánsok kifejeződése korrelációban van az áttételek keletkezésével, és arra, hogy a szerzett mintázat ezekben az áttételképző emlőkarcinóma-sejtekben nagymértékben megfelel annak, amelyet fentebb az áttételképző BSp73 ASML sejtvonalaknál ismertettünk. A nagy molekulatömegű, az antitestek által felismert fehéijék megfelelnek mindkét nagy molekulatömegű fehéqefajtának, amelyek jelenléte a BSp73ASML-kivonatokban igazolható. Ebben az emlőtumor-sorozatban éppen úgy felfedeztük tehát RNS-fajták és nagy molekulatömegű fehérjék áttételképzésre fajlagos kifejeződését. Az, hogy az 1. csoportban, tehát az úgynevezett szülősejtvonalakban egyáltalán olyan RNS-eket találunk, amelyek az A pró4

HU 218 905 Β bával, vagyis az EZB-t kódolószekvenciával hibridizálnak, és az, hogy egy 100 000 daltonos fehéije gyenge színeződése is látható az antitestekkel, arra a következtetésre indít minket, hogy az 1. csoport sejtjei is bírnak csekély áttételkialakító képességgel, teljes mértékben ellentétben a mi eredeti BSp73AS tumorsejtvonalunkkal, amely egyáltalán nem mutat áttételképző viselkedést.

Az 1.1ASML monoklonális antitestek gátolják az áttételképzést patkányokban.

Egy, a BSp73ASML tumorsejtvonal áttételképzésének vizsgálatára szolgáló kísérletsorozatban izogén patkányokba szubkután sejteket injektálunk, és különböző időpontokban intraperitoneálisan 1.1ASML monoklonális antitesteket fecskendezünk be 2-3 nappal a tumorbeadás előtt és után. Ezen immunológiai munkamenet keretében azt is megállapítjuk, milyen immunválaszt alakítanak ki a patkányok az injektált antitestek ellen. Ez létrehoz anti-egérimmunglobulinantitesteket, valamint antiidiotípusos antitesteket. Ezen kísérletsorozat eredménye az, hogy a tumorok növekedése és áttételképzése a 1.1ASML injektálása során erősen lelassul. Ez a lelassulás végül is kinetikailag valószínűsíti, hogy az antitestek interferálnak az áttételképzés primer folyamatával. A kutatás megmutatja, hogy az antitestek által felismert, az áttételképző sejtek felületén levő fehérjeszerkezetnek szerepe van az áttételképzés folyamataiban, és hogy az ezekkel kapcsolatos terápiás és diagnosztikai elképzelések reálisak.

A homológ emberi szekvencia izolálása a patkány cDNS-EBZ-t kódoló szekvenciarészéhez.

Az emberi tumorsejtekhez természetesen nem áll fenn minden további nélkül a patkányrendszerekhez hasonló lehetőség annak igazolására, vajon ezek megtartják-e áttételképző tulajdonságaikat. Az immunhiányos egerekkel végzett kísérletek csak nagyon korlátozott hatású meghatározásokat tesznek lehetővé az emberekben kialakuló áttételképzés lehetőségeiről. Ezért viszonylag sok tumorsejtvonalat, amelyek a világon bárhol már régóta tenyészetben megtalálhatók, kellett átvizsgálni, vajon azok a szekvenciák fejeződnek-e ki, amelyeket a patkányáttételeknél megismertünk. Végül sikerült egy ilyen tumorsejtvonalat találnunk. Ez egy emberi nagy sejtes tüdőkarcinómából ered, és LCLC97 nevet visel. Ebben a tumorsejtvonalban három határozott RNS-fajta mutatható ki (5,5; 3,4; és 2,8 kb nagyság); ezek teljesen megfelelnek azoknak az RNS-eknek, amelyek a patkányok áttételképző tumorsejtvonalaiban kimutathatók. Ezek ugyanis hibridzálnak mind az A próbával, mind a B és C próbával, vagyis ezek az emberi RNS-fajták szélesebb tartományban azonosak a pMeta-1 cDNS-sel (85 °C).

Az 1.1ASML monoklonális antitestek természetesen nem reagálnak ezekkel a tumorsejtekkel, vagyis az antitestek által felismert fehérjeszakasznak az antigéndetermináns tartományában különböznie kell azoktól a fehérjéktől, amelyek az emberi tumorsejtek felületén előfordulnak. A reaktivitás hiánya már a legcsekélyebb eltérésnél is fellép az antitestek nagy fajlagossága alapján. Az LCLC97 emberi tumorsejt ezért arra a célra szolgál, hogy cDNS-könyvtárat alkothassunk meg. A patkány- és emberi szekvenciák közti nagyfokú egyezés alapján olyan cDNS-klónt izolálhatunk, amely homológiát mutat az A próbához. Az emberi cDNS-szekvencia elemzését elvégezzük. A 3a. és 3b. ábrákban bemutatjuk a primer szekvenciát és az abból levezethető aminosavszekvenciát. Felismerhető, hogy nagy tartományban áll fenn a folyamatos azonosság a patkány és az emberi szekvenciák között. Ezek az emberi szekvenciák, valamint az ezekből levezethető aminosavszekvenciák szintén tárgyai ennek a szabadalmi bejelentésnek.

Kiviteli példák

Sejtek és antitestek

Az alábbi klónozott BSp sejtvonalakat alkalmazzuk a kutatómunkához: BSp73 14ASML-1 és 10AS-7; ezeket tenyészetben tartjuk úgy, ahogyan ezt Matzker és munkatársai által leírt (1982) emlőkarcinóma-vonalakkal BSp73 ASML membránfehéije elleni monoklonális antitesteket állítunk elő Balb/c egerek immunizálásával. Egy immunizált egér lépsejtjeinek izolálása után ezeket Ag8 mielómasejtelekel fuzionáltatjuk immortalitás, vagyis „halhatatlanná tevés” céljából Köhler (1981) monoklonális antitestek előállítására szolgáló eljárása szerint. Az így kapott hibridómasejteket átvizsgálási eljárásnak vetjük alá, hogy megtaláljuk a sejteket, amelyek BSp73ASM ellen fajlagos antitesteket termelnek, azonban nem alakítanak ki antitesteket BSp73AS ellen, és normális patkány fibroblaszt sejtek ellen. A pontos kiviteli módot például Matzku és munkatársai írják le (1989).

A megfelelő fajlagossággal bíró monoklonális antitesteket (mAk) termelő hibridómasejteket szövettenyészetben szaporítjuk, és a tápközegben kialakult mAk-t ammónium-szulfátos kicsapással és oszlopkromatográfiával („A”-fehérje-Sepharose és MonoQ) erősen betöményítjük, és ebben a formában alkalmazzuk a kísérletekhez. Ezek egyike az 1.1 ASML mAk.

Immunfluoreszcencia

A különböző tumorsejteken levő CD44 variáns molekulák kimutatásához ezeket a tumorsejteket tenyészetbe visszük, majd foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal (PBS) mossuk és l.lASML-lel 10 percen át inkubáljuk 40 °C hőmérsékleten. A kötés kimutatására második antitestként rodaminnal kapcsolt nyúl-antiegér IgG-t alkalmazunk, és ezeket fluoreszcenciamikroszkóp alatt vizsgáljuk át.

cDNS kifejező könyvár megalkotása, és immunátvizsgálás

BSp73ASML sejtekből való poliA+ RNS-ekből oligo(dT)-vel és hexanukleotidokkal különböző összetételű „primer”-eket képzünk, és AMV eredetű reverz transzkriptázzal a cDNS-ek első szálát szintetizáljuk. A cDNS-ek második szálát E. coli DNS-polimeráz Igyel, RN-áz H-val és E. coli ligázzal alakítjuk ki, majd a kettős szálú cDNS-t T4 DNS-polimerázzal a végein egyenesre alakítjuk. A pEXl, 2 és 3 vektorokat (Stanley és Luzio, 1984), amelyek a cDNS egyesítését három különböző leolvasókeretben teszik lehetővé, Smal restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és a cDNSsel ligáljuk (T4 DNS-ligáz). Kompetens E. coli DH5 (pCI857) baktériumokat, amelyek egy hőmérséklet5

HU 218 905 Β érzékeny represszort termelnek, a pEX-cDNS-konstrukcióval fertőzzük át, és nejlonszűrőkön tenyésztjük. A hőmérséklet-érzékeny RCI857 represszor génje a pCI857 plazmidon található, amely kompatíbilis a pEX plazmidokkal. 28 °C hőmérsékleten az 1P_R promotor, amely a fúziós fehérje szintéziseit szabályozza, ki van kapcsolva. Amikor a hőmérsékletet 42 °C hőmérsékletre emeljük, a Cl represszor inaktiválódik, és a β-galaktozidáz/ASML fúziós fehérje szintézise erőteljesen beindul. A hővel indukált baktériumtelepeket ezután a szűrőn kloroformgőzzel denaturáljuk, majd ezeket olyan PBS-ben inkubáljuk, amely 3% száraz tejport, lizozimot és DN-ázt tartalmaz. A nejlonszűrőn rögzített bakteriális fúziós fehérjéket ekkor 1.1ASML mAk-val inkubáljuk, és a nem fajlagosan kötött mAk-k kimosása után a kötés kimutatásához használjuk fel, szekunder antitestként J¹²⁵-tel jelzett nyúl-antiegér IgG-t alkalmazva. Az autoradiogram felvétele után az eredeti baktériumszűrőről a pozitív kiónokat izoláljuk, és ezekkel további elemzéseket végzünk. Az egyik klón, amely l.lASML-lel fajlagosan reagáló fúziós fehérjét szintetizál, a pEX34. A baktériumklónban található pEX plazmid 167 nukleotid cDNS-t hordoz, amelyek többek között azt az epitópot (illetve az antigén-determinánst) kódolják, amely az 1.1ASML mAk fajlagosságát hordozza.

A teljes hosszúságú mMeta-1 cDNS izolálása azután standard eljárásokkal történhet.

Patkányok immunizálása 1.1ASML mAk-val

BDX patkányokat, amelyek szinergikusak a BSp73 tumorsejtekkel, szubkután, illetve intraperitoneálisan injektáljuk 1.1ASML mAk-val [amely kulcslyuk-kagyló hemocianinnal (keyhole limpet hemocianin) van összekapcsolva] : az injektáló oltóanyag Freund-féle komplett adjuvánssal van kiegészítve. Az első injekció 10,7 és 3 nappal a BSpASM sejtek (lábzsírpámába való) injektálása előtt történik, majd ezt 3, 7, 11,14 és 21 nap múlva további injekciók követik. 28 nap múlva a patkányokat leöljük, a különböző nyirokcsomókat kipreparáljuk és lemérjük, majd a makroszkóposán látható tüdőáttételeket megszámoljuk.

Összefüggés a CD44 felületifehérje-variánsok kifejeződése és az áttételképzési potenciál között

Annak megállapítására, hogy vajon a CD44 variáns glükoproteinek kifejezése egyedül a vizsgált BSp73ASML sejtvonal tulajdonsága-e, vagy vajon a kifejeződés az áttételképzési potenciállal összefüggésbe hozható-e, patkány-tumorsejtvonalak további sorozatát vizsgáljuk át, amely a 13762NF emlőkarcinómából származik. Összehasonlítjuk továbbá azokat a sejtvonalakat, amelyek primer tumorokból származnak MTPa, MTC, MTF7 és MTA (1. csoport) azokkal a sejtvonalakkal, amelyek nyirokcsomókból és tüdőáttételekből származnak MTLy, MTLn2, MTLn3 (2. csoport). A CD44-ből kialakított RNS mintáját a 4. ábrában mutatjuk be, ahol az A, B és D próbák a bejelentés elején szereplő és 1. ábrában bemutatott próbáknak felelnek meg. Az 1. csoport sejtjei mind normális CD44 mintázatot mutatnak a B próbával. A 2. csoport sejtjei ezzel ellentétben ettől eltérő mintázatot mutatnak. Az RNS nagyobb, mint az 1. csoport RNS-e és a BSp73ASML RNS-ének felel meg. A kisebb RNS-ek eltűnnek a D próbával végzett hibridizálásnál. A többi minta hasonlóságot mutat a két patkány-tumorsejtvonal között.

A 2. csoport RNS-mintázata az A próbával is megfelel a BSp73 ASML-nek. Miközben az A próba a BSp73AS-ből való RNS-sel nem hibridizál, egy kis diffúz RNS-csíkot mutat mintegy 2,5 kb-nél az 1. csoportbál származó sejteknél. Az RN-áz és SÍ nukleáz védőelemzés szintén szerkezeti hasonlóságot mutat. Ezekből az eredményekből változás tűnik ki a CD44 variáns RNS-ek hasítási mintájában és kifejeződésében, amikor áttételek képződése lép fel.

Az áttételképzési potenciálok átvitele áttételt nem képző BSp73AS sejtekre pMeta-1 túlkifejezésével

Az áttételképző potenciállal bíró CD44 variánsfajták kifejezésével összefüggésben patkánytumorok két sorozatában utaltunk ezeknek a glikoproteineknek a kiváltó szerepére az áttételképzési folyamatban. Abból a célbál, hogy ezeket megvizsgálhassuk, pMeta-1-et BSp73AS sejtekre visszük fel és azt kutatjuk, vajon ezzel a sejtek viselkedése változik-e. A pMeta-1 teljes kódolóterületét (2. ábra) az SV40 promotorokhoz iktatjuk, és ezt a képződményt (lásd az 5. ábra diagramját) a PSV2neo-val együtt BSp73AS sejtekbe vezetjük be. Egyedi, G418-rezisztens és pMeta-1-et kifejező telepeket kapunk. Ezen telepek közül kettőnek az RNS-mintázatát az 5. ábrában mutatjuk be. A CD44 variáns hibridizálása a fajlagos A próbával egy domináns, mintegy 2,2 kb-os átiratot mutat, amely megfelel nagyság szerint annak a legkevésbé gyakori RNS-nek, amely a BSp73ASML sejtekben átíródik (5. ábra). Az átfertőzött sejtek azonban mintegy tízszer annyi ilyen RNS-t tartalmaznak, mint a BSp73ASML.

Más nagyságrendet figyelünk meg az átfertőzött sejtek egyikében (BSp73AS-pSVMetal-14), amely függhet a plazmid integrálódásának a helyétől. Egy pSV2neo szimulációs átvivő klón (nem ábrázoljuk) és a BSp73AS befogadósejtek nem tartalmaznak olyan RNS-t, amely komplementer az A próbával. Abból a célból, hogy az endogén, normál CD44 átiratokat (a pSVMeta-1 többlettartomány nélkül) az átfertőzésben felfedezzük, a szűrőből másolatot készítünk és D próbával újrahibridizáljuk. A le nem fordított 3’ szekvenciának ezt a részét a kifejező klón nem tartalmazza (lásd az 5. ábrát). A D próba két fő átiratot mutat ki 2,9 és 4,9 kb mérettel mindkét átfertőzés RNS-ében (lásd az 5. ábra jobb oldali hasábját), mind a kontroll BSp73AS-ben, mind a nem ábrázolt BSp 73ASpSVneo-ban.

A különböző, összhangban levő hibridizálások hozzávetőleges mennyiségi értékelése azt mutatja, hogy az átfertőzések (transzfektánsok) mintegy ötször több CD44 variáns RNS-t (amely a kifejező plazmiddal van átírva) fejeznek ki, mint az endogén génátiratok.

A túlkifejezett cDNS egy fehérjévé fordítódik át. Mindkét átfertőzés (transzfektáns), amelyet az 5. ábrában bemutatunk, azonos látszólagos nagyságú, 1.1ASML mAk-val színezhető fehérjét szintetizál, mégpedig egy 150 kDa-os főterméket és egy 100 kDa-os

HU 218 905 Β gyengébb csíkot. Mivel a cDNS-szekvencia egy csak 503 aminosavas primer fehéjeterméket kódol (amely mintegy 60 000 daltonnak felel meg), az összes látható csíknak módosított formájúnak kell lennie. A 150 kDaos csík egy CD44 variáns módosított formájával fut együtt, amely a BSp73ASML áttételképző sejtjeiben fejeződik ki. A BSp73AS vagy a szimulációs átvivő BSp73ASpSVneo sejtek ezt a fehérjét nem tartalmazzák. Ugyanúgy, mint a BSp73ASML sejtekben az átfertózésből (transzfektánsból) kifejezett sejtek epitópja a sejtfelületen helyezkedik el.

Annak bizonyítására, hogy a CD44 variánsok kifejezése elegendő ahhoz, hogy a BSp73AS sejteknek áttételképző potenciált kölcsönözzön, a transzfektánsokat szinergikus BDX patkányokba injektáljuk (spontán áttételképzési munkamenet). Korábbi kísérletekben a BSp73ASML áttételképző tumorsejtek injekciójának helyétől áttételes tumorsejtek terjedtek szét gyorsan, és mintegy 10 nappal az injekció után teljesen szétterültek (Matzku, 1984). Az összes helyi tumort innen a 10. napon amputálással eltávolítjuk. A BSpASML sejtek összes hordozója, és minden állat, amely egy túlkifejező transzfektánssal volt injektálva, tüdőáttételeket fejleszt ki (1. táblázat). Az áttételképzés lefolyása egyformán gyors, 5-8 héten belül végbemegy az injekció időpontjától számítva. Azok az állatok, amelyek BSp73AS sejteket vagy szimulációs transzfektánsokat kaptak, ebben az időpontban teljesen egészségesek (az amputálásból eredő következményeket nem számítva), és még 5 hónap múlva sem lehet megállapítani áttételek kialakulását.

A meglepő hasonlatosság ellenére az erős áttételképzésben van néhány érdekes különbség. A BSp73ASML sejtek az összes állatban elérik a nyirokcsomókat, és a különböző csomók erőteljes megnagyobbodását idézik elő az inguinális lágyék tartományában és az aorta mellett (1. táblázat). Az egyik transzfektáns (BSp73AS-pSVMetal-14) 8 állatból 3-nál okoz nyirokcsomó-megnagyobbodást, holott az összes állatban többszörös tüdőáttétel fejlődik ki (1. táblázat. Egy másik transzfektánssal (BSp73AS-pSVMetal-15) nyirokcsomó-megnagyobbodás nem mutatható ki. Úgy tűnik, hogy ebben a helyzetben a transzfektáns telepeket képez a tüdőben anélkül, hogy egy kötelezőnek hitt fejlődési fázison átmenne a nyirokcsomókban.

Az 1. táblázat szerinti kísérlet utal egy további különbségre is a BSp73AS transzfektánsok és a BSp73ASML között. Az egyedi tüdőáttételek makroszkóposán láthatók, míg azok, amelyek a BSp73ASMLből valók, kicsik és nagyszámúak; nagyobb sorozat fejlődik BSp73ASML-lel (Reber és munkatársai, 1990), mint a transzfektánsokból, de ezeknél 20 állatból 11nél tüdőnként 5-20 nagyobb csomó is kialakul.

Annak megállapítására, hogy a képződött áttételeket az injektált transzfektánsok idézik elő, és kizárhassuk egy áttételképző potenciált hordozó spontán mutáció valószínűtlen lehetőségét, meghatározzuk az epitóppozitív fehérjéket a teljes tüdő extraktumában és az újratenyésztett áttételképző sejtek extraktumában. Egy állat teljes tüdőextraktumában, valamint speciális nyirokcsomóinak, amelyek BSpAS-pSVMetal-15 transzfektánst tartalmaznak, extraktumában a 150 kDa-os glikoprotein kimutatható. A G418-rezisztens törzs in vitro fejlődése során azonos látszólagos molekulatömegű fehérjét fejez ki.

Diagnosztika és terápia

1. Emberi tumoranyagok elemzése in situ hibridizálás segítségével a rendelkezésre állá emberi pMeta-1 szekvenciákkal. Ez a kísérlet előkísérletként képzelhető el, mielőtt egy olyan antitest rendelkezésre állna, amely az emberi EZB-t felismeri.

2. Antitestek előállítása emberi EZB ellen. Emberi pMeta-1 szekvenciák klónozása bakteriális kifejező vektorokban úgy, hogy fúziós tennék keletkezzék Bgalaktozidázzal vagy triptofán-E termékkel. Nyulak immunizálása ezekkel a fúziós fehérjékkel, illetve az EZB-ből való szintetikus peptidekkel (amelyek hordozómolekulákkal vannak összekapcsolva). A polivalens, illetve monospecifikus antitestek izolálása.

Alkalmazási lehetőségek

- Klinikai tumoranyagok immunhisztológiai kutatása (diagnosztika)

- Oldható EZB kimutatása betegek szérumában ELISA-vizsgálat segítségével (diagnosztika)

- Toxinnal kapcsolt antitestek megalkotása, hogy az antitestek segítségével a toxin eljusson a tumor vagy az áttétel tartományába (terápia)

- Két határozott antigénkötő hellyel bíró antitestek megalkotása. Ezzel a kettős fajlagossággal meg lehet kísérelni a citotoxikus reakciók megvalósítását az áttételes területen (például anti-CD2- vagy anti-CD3-kapcsolás) (terápia)

3. hMeta-1 fehérje előállítása emberi vagy patkánysejtek átfertőzésével valamilyen olyan kifejező vektorral, amely a teljes hMeta-1 cDNS-szekvenciát hordozza, illetve tisztítás LCLC97 sejtekből.

További alkalmazási lehetőségek:

- A fehérjék vagy ennek részei injektálása, hogy a tumorsejtek szöveti kötőhelyeit blokkoljuk.

- A kötőhelyek jellemzése után terápiás alkalmazás is elképzelhető; ez azon alapulhat, hogy nagy mennyiségben injektálunk olyan kötőfehérjét, amely azután a vándorló tumorsejteket blokkolja.

Irodalmi hivatkozások:

Goldstein L. A.; Zhou D. F. H.; Picker L. J.; Minty C. N.; Bargatze R. F.; Ding J. F.; és Butcher E. C.: A humán lymphocyte homing receptor, the hermes antigén, is related to cartilage proteoglycan core and link proteins. (Humán limfocitavezérlő receptor, a Hermes antigén, amely rokonságban van a porc proteoglikanmagjával és az ízületi fehérjékkel). Cell 56, 1063-1072(1989).

Hart I. R., Goode N. T., és Wilson R. E.: Molecular aspects of the metastatic cascade. (Az áttételi kaszkád molekuláris szempontjai). Biochim. Biophys. Acta 989, 65-84 (1989).

Idzerda R. L., Carter W. G., Nottenburg C., Wayner E. A., Gallatin W. M. és St. John T.: Isolation and DNA sequence of a cDNA clone encoding a lymphocyte

HU 218 905 Β adhesion receptor fór high endothelium. (Felső belhám adhéziós receptort kódoló cDNS-klón izolálása és DNS-szekvenciája). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 4659-4663 (1989).

Köhler, G.: Immunological Methods (Immunológiai módszerek). 2. kötet 285. oldal. Lefkovits I. és Pemis B. (szerkesztők). N. Y. Academic Press (1981).

Matzku S., Komitowski, Mildenberger és Zöller M.: Characterization of Bsp73, a spontaneous rat tumor and its in vivő selected variants showing different metastasizing capacities. (Bsp73, egy spontán patkánytumor és különböző áttételképző kapacitású, in vivő szelektált variánsai jellemzése). Inv. Met. 3, 109-123 (1983). Matzku S., Wenzel A., Liu S. és Zöller M.: Antigenic differences between metastatic and nonmetastatic BSp73 rat tumor variants characterized by monoclonal antibodies. (Monoklonális antitestekkel jellemzett antigenikus különbségek az áttételképző és áttételt nem képző BSp73 patkánytumor-variánsok között). Cancer Rés. 49,1294-1299(1989).

Neri A., Weich D., Kawaguchi T. és Nicolson G. L.: Development and biologic properties of malignant cell sublines and clones of spontaneously metastasizing rat mammary adenocdrcinoma. (Spontán módon áttételképző patkányemlő-karcinóma rosszindulatú sejtalvonalainak és kiónjainak kifejlesztése és biológiai tulajdonságai). J. Natl. Cancer Inst. 68, 507-517 (1982). Nicolson G. L.: Tumor cell instability, diversification, and progression to the metastatic phenotype: from oncogene to oncofetal expression. (Tumorsejt-instabilitás, változatosság, és kifejlődés az áttételes fenotípussá: onkogén kifejeződésből onkofetális kifejeződéssé). Cancer Rés. 47,1473-1487 (1987).

Nottenburg C., Rees G., és St. John T.: Isolation of mouse CD44 cDNA: structural features are distinct from the primate cDNA. (Egér CD44 cDNS-izolálása: a szerkezeti vonások eltérőek a főemlős-cDNStől). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 8521-8525 (1989).

Stamenkovic I., Amiut M., Pesando J. M. és Seed B.: A lymphocyte molecule implicated in lymph node homing is a member of the cartilage link protein family. (A nyirokcsomó-vezérlésben érdekelt limfocita molekula a porc ízületi fehérje család tagja)]. Cell 56, 1057-1062 (1989).

Stanley K. K. és Luzio J. P.: Construction of a new family of high efficiency bacterial expression vectors: identification of cDNA clones coding fór humán liver proteins. (Nagy hatékonyságú bakteriális kifejezővektorok új családjának megalkotása: humán májfehéijéket kódoló cDNS-klónok azonosítása). EMBO J. 3, 1429-1434 (1984).

Wenzel A.: Charakterisierung von Differenzierungsantigenen auf dem Rattentumor Bsp 73 mit Hilfe monoklonaler Antikörper. (Monoklonális antitestekkel megkülönböztethető antigének a Bsp 73 patkánytumoron). Diplomamunka, Universitát Karlsruhe (1986). Zhou D. F. H., Ding J. F., Picker L. F., Bargatze R. F., Butcher E. C. és Goeddel D. V.: Molecular cloning and expression of Pgp-1 - The mouse homolog of the humán H-CAM (Hermes) lymphocyte homing receptor. (A Pgp-1 molekuláris klónozása és kifejezése. Ez a humán HCAM (Hermes) limfocitavezérlő receptor egérhomológja). J. Immunoi. 143, 3390-3395 (1989).

1. táblázat

BSp73AS sejtek áttételes elterjedése, amely sejtek pMeta-1 CD44 variáns cDNS-t fejeznek ki.

Tumorklón	Helyi előfordulás	Megoszlás áttételes autopsziánál
*LN ing	*LN pár	Tüdő
BSp7ASML	0/8	8/8 1,5-2,5	8/8 **2,5-5,0	8/8 kölesszerű
BSp73AS- pSVMetal-14	0/8	3/8 0,3-1,2	3/8 1,0-4,5	8/8 többszörös 0 0,3-5,0
BSp73AS- pSVMetal-15	0/8	0/8	0/8	8/8 5-20; 0 0,3-10,0
BSp73AS	1/8	0/8	0/8	0/8
BSp73AS-pSVneo	0/8	0/8	0/8	0/8

** középső átmérő mm-ben *** A táblázat a 60 napos stádiumot adja meg az adott sejtek injektálása után * LN=nyirokcsomók

HU 218 905 Β

Claims (15)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás patkány áttételképző tumorsejtek valamely felületi fehéqéjének egy részét kódoló

ATT GCA ACT ACT CCA TGG GTT TCT GCC CAC ACA AAA CAG AAC CAG GAA CGG ACC CAG TGG AAC CCG ATC CAT TCA AAC CCA GAA GTA CTA CTT CAG ACA ACC ACC AGG ATG ACT GAT ATA GAC AGA AAC AGC ACC AGT GCT CAT GGA GAA AAC TGG ACC CAG GAA CCA CAG CCT CCT TTC AAT AAC CAT GAG TAT CAG GAT GAA GAG GAG ACC CCA CAT GCT ACA AGC ACA ACC TGG GCA GAT CCT AAT AGC ACA ACA GAA GAA GCA GCT ACC CAG AAG GAG AAG TGG TTT GAG AAT GAA TGG CAG GGG AAG AAC CCA CCC ACC CCA AGT GAA GAC TCC CAT GTG ACA GAA GGG ACA ACT GC C TC A GC C CA C AA C AAC CAT CCA AGT CAA AGA AGT ACA ACA CAG AGT CAA GAG GAT GTT TCA TGG ACC GAT TTC TTC GAC CCA ATC TCA CAT CCA ATG

GGA CAA képletű r-Meta-1 nukleotidszekvencia, valamint az ez- 25 változatai, illetve humán áttételképző tumorsejtek valazel hibridizáló és felületi fehérjét kódoló, és a DNS- mely felületi fehérjéjének egy részét kódoló szekvenciák degenerációja miatt eltérő és/vagy allél-

AAC CCA AGC CAT TCA AAT CCG GAA GTG CTA CTT CAG ACA ACC ACA AGG ATG CAT GAT GTA GAC AGA AAT GGC ACC ACT GCT TAT GAA GGA AAC TGG AAC CCA GAA GCA CAC CCT CCC CTC ATT CAC CAT GAG CAT CAT GAG GAA GAA GAG ACC CCA CAT TCT ACA AGC ACA ATC CAG GCA ACT CCT AGT AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT ACC CAG AAG GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAA ACA CCC AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT GCA GCC TCA GCT CAT ACC AGC CAT CCA ATG CA

képletű h-Meta-1 nukleotidszekvencia, valamint az ezzel hibridizáló és felületi fehérjét kódoló, és a DNSszekvenciák degenerációja miatt eltérő és/vagy allélváltozatai előállítására valamely patkánytumor-át- 45 tételképző és áttételt nem képző sejtjeinek, illetve humán áttételképző sejtnek tenyésztésével, az áttételt képző sejtek ellen monoklonális antitestek képzésével, ezekből immortalizált hibridóma-sejtvonalak kialakításával, az áttételt képző tumorsejtekkel reagáló, 50 de az áttételt nem képző tumorsejtekkel nem reagáló antitesteket képző hibridómasejtek kiválasztásával és ezek tenyésztésével kialakított antitestek alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy patkány- vagy humán tumorok áttételt képző sejtjeiből bakteriális kifejező- 55 könyvtárakat hozunk létre, a könyvtárakat a nevezett antitestekkel átvizsgáljuk, a pozitív kiónokkal adott esetben újabb bakteriális kifejezőkönyvtár átvizsgálását hajtjuk végre, és a pozitív kiónokat teljes hosszúságú kiónokká egészítjük ki, a teljes hosszúságú kló- 60 nokat elemezzük, és az áttételképzésért felelős szekvenciát kiválasztjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás r-Meta-1 nukleotidszekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy

- tumorképző sejtekként BSp73 patkánytumorok sejtjeit alkalmazzuk,

- antitestként 1.1ASML monoklonális antitestet alkalmazunk,

- első bakteriális kifejezőkönyvtárként BSp73ASML sejtekből való poli A+RNS és pEX vektorrendszerrel megalkotott E. coli könyvtárat alkalmazunk,

- az első bakteriális kifejezőkönyvtár átvizsgálása után a pEX34 cDNS-klónt izoláljuk,

- a PEX34 cDNS-klónnál pSP65 vektorban levő cDNS-könyvtárat vizsgálunk át,

- a pozitív kiónokat teljes hosszúságú p-Meta-1 cDNS kiónokká primer toldással és polimeráz láncreakcióval egészítjük ki.

HU 218 905 Β

3. Eljárás az 1. vagy 2. igénypontok szerinti nukleotidszekvenciákat tartalmazó vektorok előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely vektorba bevezetünk valamely 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-molekulát. 5

4. Eljárás az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleotidszekvenciákat tartalmazó transzformált gazdasejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely gazdasejtbe bevezetünk valamely 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát vagy bevezetünk valamely 3. igénypont szerinti vektort.

5. Eljárás a patkány áttételképző tumorsejtek felületi fehérjéjének egy részét képező

IATTPWVSAHTKQNQERTQWNPIHSNPEVL

LQTTTRMTDIDRNSTSAHGENWTQEPQPPF

NNHEYQDEEETPHATSTTWADPNSTTEEAA

TQKEKWFENEWQGKNPPTPSEDSHVTEGTT

ASAHNNHPSQRMTTQSQEDVSWTDFFDPIS

HPMGQGHQTESK képletű polipeptid, vagy ennek allélváltozatai és gli- 20 kozilezett termékei előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) valamely 4. igénypont szerinti gazdasejtet megfelelő körülmények között tenyésztünk, és a kapott terméket kinyerjük, vagy.

b) valamely 3. igénypont szerinti vektort tartalmazó gazdasejtet megfelelő körülmények között tenyésztünk és a kapott terméket kinyerc) a polipeptidet az egyes aminosavakból szintetikusan felépítjük.

6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleotidszekvenciák alkalmazása, azzal jellemezve, hogy ezek komplementer szálait, származékait és részeit olyan

25 nukleotidszekvenciák vagy részeik azonosítására vagy izolálására használjuk fel, amelyek áttételképző tumorsejtek valamely felületi fehérjéjét kódolják.

7. Eljárás humán áttételképző tumorsejtek valamely jük, vagy felületi fehérjének egy részét kódoló

AAC CCA AGC CAT TCA AAT CCG GAA GTG CTA CTT CAG ACA ACC ACA AGG ATG CAT GAT GTA GAC AGA AAT GGC ACC ACT GCT TAT GAA GGA AAC TGG AAC CCA GAA GCA CAC CCT CCC CTC ATT CAC CAT GAG CAT CAT GAG GAA GAA GAG ACC CCA CAT TCT ACA AGC ACA ATC CAG GCA ACT CCT AGT AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT ACC CAG AAG GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAA ACA CCC AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT GCA GCC TCA GCT CAT ACC AGC CAT CCA ATG CA

képletű h-Meta-1 nukleotidszekvencia, valamint az ezzel hibridizáló és felületi fehérjét kódoló, és a DNSszekvenciák degenerációja miatt eltérő és/vagy alléi- 45 változatai előállítására, azzal jellemezve, hogy humán tumorsejtvonalakat vizsgálunk át homológiára, az 1. igénypont szerinti pMeta-1 cDNS-sel homológiát mutató tumorsejtekből cDNS-könyvtárat készítünk, a könyvtárat a pMeta-l-gyel való homológiára még 50 egyszer átvizsgáljuk, a megfelelően homológ kiónokat elemezzük, és az áttételképzésért felelős szekvenciát kiválasztjuk

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pozitív kiónoknak a legalább 85% homológiát mu- 55 tatókat tekintjük, az első homológiavizsgálat után az LCK C97 emberi nagy sejtes tüdőkarcinómát választjuk ki, a humán tumosejtvonalak átvizsgálását homológiára részpróbákkal való hibridizálással végezzük.

9. Eljárás a 7. vagy 8. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó vektorok előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely vektorba bevezetünk valamely 7. vagy 8. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-molekulát.

10. Eljárás a 7. vagy 8. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó transzformált gazdasejtek előállítására, azzaljellemezve, hogy valamely gazdasejtbe bevezetjük a 7. vagy 8. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát vagy bevezetünk valamely 9. igénypont szerinti vektort.

11. Eljárás a humán áttételképző tumorsejtek felületi fehérjéjének egyik részét képező

ISSTISTTPRAFDHTKQNQDWTQWNPSHSN

PEVLLQTTTRMTDVDRNGTTAYEGNWNPEA

HU 218 905 Β

HPPLIHHEHHEEEET EETATQKEQWFGNRW TGTAAASAHT SHPMQ FNPISHPMGRGHQAG képletű polipeptid vagy ennek allélváltozatai és glükozilezett termékei előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) valamely 4. vagy 10. igénypont szerinti gazdasejtet megfelelő körülmények között tenyésztünk és a kapott terméket kinyerjük, vagy

b) valamely 3. vagy 9. igénypont szerinti vektort tartalmazó gazdasejtet megfelelő körülmények között tenyésztünk és a kapott terméket kinyeijük, vagy

c) a polipeptidet az egyes aminosavakból szintetikusan felépítjük.

12. A 7. vagy 8. igénypont szerinti nukleotidszekvenciák alkalmazása, azzal jellemezve, hogy ezek komplementer szálait, származékait és részeit olyan nukleotidszekvenciák vagy részeik azonosítására vagy izolálására használjuk fel, amelyek áttétképző tumorsejtek valamely felületi fehérjéjét kódolják.

PHSTSTIQATPSSTT

HEGYRQTPREDSHST

GRTTPSPEDSSWTDF

R R

13. A 7. igénypont szerinti nukleotidszekvencia és a 11. igénypont szerinti felületi fehérje alkalmazása, azzal jellemezve, hogy gyógyszerek és diagnosztikumok előállítására alkalmazzuk tumorellenes gyógyszerek előállításához és áttételképző tumorsejtek felületi fehérjéjének kimutatásához.

14. Eljárás antitestek előállítására humán áttételképző tumorsejtek 11. igénypont szerinti áttételképző felületi fehérjéje ellen, azzal jellemezve, hogy valamely 11. igénypont szerinti felületi fehérjét tartalmazó fehérjével valamely emlősállatot immunizálunk, és a keletkezett antitesteket izoláljuk.

i

15. A 14. igénypont szerinti antitestek alkalmazása, azzal jellemezve, hogy tumorellenes gyógyszerek előállítására alkalmazzuk.