FI106129B - Menetelmät valmistaa muuntuneita CD44-pintaproteiineja ja näitä proteiineja vastaan vaikuttavia vasta-aineita - Google Patents

Description

l 106129

Menetelmät valmistaa muuntuneita CD44-pintaproteiineja ja näitä proteiineja vastaan vaikuttavia vasta-aineita Förfaranden för framställning av variants CD44-ytproteiner och antikroppar mot dessa proteiner

Keksinnön kohteena ovat menetelmät valmistaa muuntuneita CD44-pintaproteiineja, näitä muuntuneita proteiinikappaleita koo-daavilla DNA-sekvensseillä ja menetelmät näiden proteiinien muuntuneiden determinanttien vastaan vaikuttavien vasta-aineiden valmistamiseksi.

Pahanlaatuisten kasvainsolujen varsinainen hengenvaarallisuus johtuu niiden kyvystä muodostaa etäispesäkkeitä. Alkuperäiset primäärikasvainsolut saavat tämän ominaisuuden luultavasti lukuisten, kasvaimen kehittymisen aikana tapahtuvien muutosten seurauksena. Näiden tapahtumien tuloksena alkuperäisestä kas-vainmassasta irtoaa jatkuvasti syöpäsolumuunnoksia, jotka tunkeutuvat solun ulkopuolisen matriisin läpi ja kulkeutuvat imujärjestelmään tai verenkiertoon. Nämä etäispesäkkeitä muodostavat, usein toisiinsa liimautuneet syöpäsolut siirtyvät verenkierto- tai imujärjestelmässä ja poistuvat suonijärjestel-mästä muissa paikoissa, joissa ne tunkeutuvat toisiin kudok-siin tytärkasvaimia muodostaen (yleiskatsauksia julkaisuissa .·. : Hart et ai., 1989; Nicolson, 1987) . Etäispesäkkeiden muodostu- • · * • · minen edellyttää lukuisia vuorovaikutuksia kasvainsolujen ja V." solujen välisen matriisin tai muiden solujen välillä. Lähes • · · kaikissa näissä vuorovaikutuksissa tarvitaan solun pintakompo- • ♦ * *·* * nentteja kuten esimerkiksi reseptoreita matriisia ja laminaa varten, pintaan sitoutuneita proteolyyttisiä entsyymejä sekä " solun tarttumismolekyylejä, mukaan lukien ne molekyylit, jotka ··· V · aiheuttavat elinspesifistä tarttumista ja jotka johtavat näin ' ollen siihen, että etäispesäkkeitä muodostuu herkemmin tiet- tyihin elimiin, tämän lisäksi kasvutekijöitä sekä kasvuteki- • joiden reseptoreita.

• t 106129

Tunnettua on se, että rotassa esiintyvästä BSp73-kasvaimesta peräisin olevien, etäispesäkkeitä muodostavien ja niitä muodos-tamattomien kasvainsolujen kalvoproteiinit eroavat toisistaan, mikä on osoitettu vasta-ainereaktiolla (Matzku et ai., 1983 ja 1989) .

Tämän jälkeen on todettu, että etäispesäkkeitä muodostavat BSp73ASML-kasvainsolut sisältävät sellaista pintaproteiinia, joka vastaa osittain tunnettua, lymfosyyttien tarttumiseen sekä solu-solu- ja solu-matriisi-vuorovaikutukseen osallistuvaa glykoproteiinia (ihmisen normaaleista glykoproteiineista käytetään merkitää CD44, Hermes-1, hiiren vastaavista: Ppg-1 ja rotan vastaavista HEBFln). Tämä uusi poikkeava eli muuntunut CD44-pintaproteiini eroaa kuitenkin näistä tunnetuista sekvensseistä 154 aminohappoa käsittävän, solun ulkopuolisen alueen (SUA) suhteen, joka alue on sijoittunut ihmisen CD44-sekvenssissä 220. ja 237. aminohapon väliin (vastaavasti hiiren sekvenssissä 224. ja 239. aminohapon väliin). Tämä uusi glykoproteiini näyttää olevan hyvin merkittävä solu-matriisi-tai solu-solu-sitoutumisen kannalta etäispesäkkeiden muodostuessa. Näin ollen tämän proteiinialueen (SUA) valmistus ja sen tunnusomaisten piirteiden selvittäminen ovat oheisen kek-’·* * sinnön eräs tehtävä. Pernasoluja, jotka muodostavat muuntuneen • » φ :...: CD44-pintaproteiinin SUA:ta vastaan vaikuttavia vasta-aineita, *.*·; tuotettiin immunoimalla hiiriä BSp73ASML:sta saaduilla kalvop- *i* roteiineilla. Ne fuusioitiin myeloomasoluihin Köhler:in mene- telmällä (1981) polyetyleeniglykolia käyttäen pysyvien viljel-mien aikaansaamiseksi. Tätä uutta proteiiniosaa SUA spesifisesti vastaan vaikuttavia vasta-aineita saadaan kloonaamalla ja ;·. valikoimalla ne viljelmät, joiden tuottamat vasta-aineet rea- • · ♦ ‘...^ goivat BSp73ASML:n kanssa, mutta eivät kuitenkaan reagoi etäis- • · · *. pesäkkeitä muodostamattoman perusmuodon BSp73AS:n kanssa eivät- kä myöskään muiden, kasvaimia aiheuttamattomien rottasolujen kanssa. Muita tutkimuksia varten valittiin monoklonaalinen : vasta-aine, joka värjää BSp73ASML-soluja erityisen voimakkaas- • * · mAbl.lASML (mAb = monoklonaalinen vasta-aine).

' ti immunofluoresenssikokeessa, ja josta käytetään merkintää • · 3 106129

Westernblot-kokeessa BSp73ASML-solujen proteiinihydrolysaatis-ta voidaan määrittää mAbl.1ASML:llä 4 proteiinivyöhykettä, joiden molekyylipainot ovat 120 000, 150 000, 180 000 ja 200 000, kun taas rotan fibroblastisolujen ja rotasta peräisin olevien, etäispesäkkeitä muodostamattornien kasvainsolujen uutteet eivät tuottaneet merkittävää reaktiota. Vielä ei olla kyetty määrittämään sitä, johtuvatko nämä kokoerot erilaisista alkuperäisistä aminohapposekvensseistä vai proteiineissa jälkikäteen tapahtuneista, voimakkuudeltaan erilaisista muokkautumisista. Joka tapauksessa vasta-aineen tunnistama epitooppi on läsnä näissä kaikissa 4 proteiinilajissa, sen puuttuessa vertailuna käytetyistä proteiineista, jotka oli saatu etäispesäkkeitä muodostamattomista BSp73AS-soluista tai normaaleista rottasoluista.

Pintaproteiinin SUArta koodaavien cDNA-sekvenssien eristäminen

Monoklonaalista vasta-ainetta mAbl.lASML käytettiin SUA:ta koodaavien cDNA-sekvenssien löytämiseksi bakteeriperäisestä ilmentämiskirjastosta. Tämä kirjasto muodostettiin BSp73ASML-soluista peräisin olevan polyA+ RNA-.n ja pEX-vektorijärjestel-V : män avulla (Stanley & Luzio, 1984). Näiden cDNA-sekvenssien

IM

koodaamat tuotteet ilmaistaan β-galaktosidaasi-fuusioproteii- :**.« neina vasta-aineiden avulla. Tällä tavalla eristetty, monoklo- ··· naalisen vasta-aineen 1.1ASML suhteen positiivinen cDNA-kloo- • · ♦ · ni, josta käytetään nimitystä pEX34, käsittää 167 nukleotidin pituisen cDNA-sekvenssikappaleen. Sitten tätä cDNA-kappaletta ♦ · · käytettiin hyväksi vektorissa pSP65, joka sekin oli saatu .. BSp73ASML-RNA:sta, läsnäolevan suuremman cDNA-kirjaston tutki- • · miseksi. Erästä näistä tällä tavalla eristetyistä klooneista, • « * *·* pM66, käytettiin sitten, niinkutsuttua "aluke"-pidennystä ·:··: (lähtöoligonukleotidi) ja polymeraasi-ketjureaktiota (PCR) ·;··; apunakäyttäen, täysipituisen cDNA-kloonin pMeta-1 eristämi- .* . seen. Osoitus täydestä pituudesta saatiin alukepidennyksen ** * (3207 nukleotidiä) avulla. Kolineaarisuus BSp73ASML-kasvai- 4 106129 mesta peräisin olevan RNA:n kanssa todettiin RNaasi- ja Sl-suoj a-analyys i1la.

cDNA-sekvenssien eristäminen bakteereissa toteutetulla ilmentämisellä ja vasta-aineen avulla tunnistamalla osoittaa, että vasta-aine tunnistaa primäärin aminohapposekvenssin pintaproteiinin SUA:han kuuluvan primäärin aminohapposekvenssin.

SUA:ta koodaava lähetti-RNA ilmentyy BSp73ASML-soluissa, mutta ei BSp73AS-soluissa cDNA-klooneista muodostettiin kolme erilaista sekvenssikoetin-ta spesifisten lähetti-RNA-molekyylien osoittamiseksi hybridi-saatiolla. Koetin A peittää sen cDNA-alueen, johon SUA on koodautunut (asemat 941-1108). Koetin B edustaa asemien 1403-1572 välisiä sekvenssejä ja koetin C käsittää pMeta-l:n alusta asemaan 794 ulottuvia sekvenssejä (kuvio 1). BSp73-kas-vainsolulinjojen poly A+ RNA erotettiin elektroforeettisesti ja analysoitiin RNA-siirtohybridisaation avulla. Neljä niistä solulinjoista, jotka eivät muodosta etäispesäkkeitä, ei sisällä sellaista RNA:ta, joka on homologinen koettimen A suhteen, kun taas etäispesäkkeitä muodostavista kasvainsoluista • · · *·*/ BSp73ASML peräisin olevat RNA-molekyylit reagoivat voimakkaas- *·»·* ti. Koetin A tunnistaa tästä RNA-preparaatista alueella \ *: 2,2-3,3 kb olevien erikokoisten RNA-molekyylien heterogeenisen seoksen sekä yhden suuremman, 4,9 kb:n suuruisen RNA-lajin.

: Monoklonaalisen vasta-aineen 1.1ASML tunnistamien spesifisten kalvoproteiinien ilmentyminen yksinomaan etäispesäkkeitä muodostavissa kasvainsolumuunnoksissa johtuu ilmeisesti vastaa-vien SUA:ta koodaavien lähetti-RNA-molekyylien erityisestä il- • · · #·;·. mentymisestä. Ilmeisesti täydellinen cDNA-klooni pMeta-1, • · · jonka suuruus on 3,2 kb, ei kykene edustamaan tämän RNA-lajin *’'*· kaikkia sekvenssejä. Se voi esittää vain yhtä lajia eri ko- koisten RNA-molekyylien heterogeenisesta seoksesta. Koettimil-

: la B ja C saadaan sama hybridisaatiokuvio kuin koettimella A

• « | BSp73ASML RNA:n erotuksessa, ainakin siinä määrin kuin mitä » · tämän heterogeenisyyden puitteissa voidaan todeta, toisin s 106129 sanoen nämä RNA-lajit käsittävät sekvenssejä, jotka täydentävät kaikkia kolmea koetinta A, B ja C. Toisin kuin koetin A koetin B ja C tunnistavat myös lähetti-RNA-lajeja etäispesäkkeitä muodostamattomissa solulinjoissa. Nämä RNA-koot eroavat kuitenkin selvästi BSp73ASML-soluissa esiintyvistä pituuksista, sillä neljä selvästi erottuvaa lähetti-RNA-lajia voidaan osoittaa, joiden lähetti-RNA-molekyylien pituus on 1,5, 2,0, 2,9 ja 4,3 kb. Vaikka näitä RNA-lajeja voikin olla piilossa BSp73ASML-soluista peräisin olevien RNA-molekyylien heterogeenisessa seoksessa, niin kuitenkin on varmaa, ettei niitä esiinny samanlaisena määränä BSp73ASML-soluissa. Ratkaisevaa on se, että koetinta A täydentävät RNA-sekvenssit puuttuvat ilmeisesti täydellisesti soluista, jotka eivät muodosta etäispesäkkeitä. Tämän perusteella voidaan siis vetää se varovainen johtopäätös, että koettimien A, B ja C sekvenssit ovat läsnä samoissa RNA-molekyyleissä etäispesäkkeitä muodostavan kasvaimen tapauksessa siten, että ikäänkuin koettimen A sekvenssit olisivat jatkostuneet B-C-positiivisiin RNA-molekyyleihin ja ikäänkuin tätä vaihtoehtoista jatkostumistapahtumaa esiintyisi vain etäispesäkkeitä muodostavassa solulinjassa.

Sl-nukleaasi- ja RNaasi-suoja-analyyseja tehtiin RNA:n ja » · » V ' cDNA:n välisen kolineaarisuuden osoittamiseksi ja BSp73AS- ja » · · BSp73ASML-soluista peräisin olevien RNA-molekyylien välisen • · IV. erilaisuuden analysoimiseksi. Suojatut DNA- tai RNA-kappaleet ·;· voivat olla vain kokopituutta lyhyempiä, koska 5' -päät sisäl- • · · · ·*·.. tävät vektorisekvenssejä, jotka eivät kykene hybridisoitumaan kasvainsoluista peräisin olevien RNA-molekyylien kanssa. Ensin tarkastellaan 3'-puolen siirtymäkohtia: siirtymä sekvensseis-tä, joilla on homologiaa koettimen A kanssa, sekvensseihin, - · · · *... joilla on homologiaa koettimen B kanssa. Kummallakin teknii- • · » kalla BSp73AS-soluista todetaan yksi ainoa RNA-laji, joka on koettimien kanssa kolineaarinen laajalla alueella. Siitä 5'-·;··: suuntaan cDNA- tai RNA-koetin, joka vastaa BSp73ASML-soluista / . saatuja RNA-sekvenssejä, eroaa BSp73AS-soluista peräisin ole- * ’. vasta RNA: sta. BSp73ASML-soluista peräisin olevat RNA-molekyy-lit sisältävät ennen kaikkea sekvenssejä, jotka suojaavat koet- s 106129 timien suurempia kappaleita. Suurimmat kappaleet vastaavat suoja-analyysiin tarjottujen DNA- tai RNA-kappaleiden täyttä pituutta. Myös pienempiä kappaleita voidaan osoittaa. Koska RNA-siirtohybridisaatiot ovat paljastaneet erikokoisten RNA-molekyylien heterogeenisen seoksen, niin mahdollista on se, että nämä pienemmät suojatut kappaleet osoittavat RNA-lajeja, jotka poikkeavat cDNArsta jostain muusta kohdasta, eli kohdista, jotka sijaitsevat aikaisemmin osoitetun poikkeamispisteen ja tarjottujen koettimien 51-pään välissä. Myöskään näitä RNA-lajeja ei kyetä osoittamaan BSp73AS-soluista.

Seuraavaksi tarkastellaan 5'-puolella olevaa poikkeamispistet-tä eli siirtymää koettimen C kanssa hybridisoituvista sekvensseistä sekvensseihin, jotka hybridisoituvat koettimen A eli SUA:ta koodaavan sekvenssin kanssa. Analyysi tuottaa vastaavia tuloksia 5'-murtopisteelle. BSp73AS-soluista peräisin olevat RNA: t voivat suojata tarjottuja koettimia vain pienellä alueella. BSp73ASML-soluista peräisin olevat lähetti RNA:t suo-jaavat pitempiä kappaleita. Ne ovat nimittäin kolineaarisia tarjottujen koettimien koko pituuden suhteen. Niinpä voidaan päätellä, että cDNA-klooni pMeta-1 edustaa sekvenssejä, jotka korostuvat etäispesäkkeitä muodostavissa kasvainsoluissa *·* ‘ BSp73ASML. 3'- ja 51-alueita todetaan myös BSp73AS-soluista peräisin olevista RNA-molekyyleistä. SUArta koodaavat sekvens-'·.'·· sit, joiden käsittämät siirtymäkohdat voidaan kartoittaa näil- *:* lä edellä kuvatuilla tekniikoilla, osoittavat, että vaihtoeh- *··· ·*·.. toisen jatkostusmekanismin on esiinnyttävä RNA-muodostuksessa.

;‘t‘. SUA-sekvensseihin johtavien siirtymäkohtien 5'- ja 3'-murtopis- teet on esitetty kuviossa 1 nuolilla.

• · • » • · ·

Monoklonaalinen vasta-aine 1.1ASML tunnistaa glykoproteiinin II» • · · *. CD44 erään muun tiineen muodon • · ·:·*: Rakennetietojen saamiseksi pintaproteiinista kaikkien kloonat- j tujen cDNA-molekyylien sekvenssi on määritetty. Täysipituisen ! kloonin pMeta-1 nukleotidisekvenssi ja siitä päätellyt amino happosekvenssit on esitetty kuviossa 2. Täysipituinen cDNA- 7 106129 klooni käsittää 3207 nukleotidiä. 31-päätteessä on polyA-pää, kaksi ylimääräistä polyadenylointisignaalia sijaitsee asemissa 2288 ja 1743. Ensimmäinen ATG-kodoni sijaitsee konsenssi-aloi-tussekvenssin jälkeen ja avaa 1509 nukleotidiä käsittävän, 503 aminohappoa vastaavan lukukehyksen. Kuten kalvoproteiinin tapauksessa onkin odotettavaa, ensimmäiset 21 aminohappoa ovat hydrofobisia ja esittävät signaalipeptidiä. Tähän saakka mitään osaa näistä sekvensseistä ei löydy tietokannoista. Keksinnön puitteissa todettiin kuitenkin sekvenssihomologiaa verrattuna vähän aikaa sitten julkaistuihin tietoihin lymfosyyttien Homing-reseptorista CD44 (tai vastaavasti Pgp-1) (Idzerda et ai., 1989; Goldstein et ai., 1989; Stamenkovic et ai., 1989; Nottenburg et ai., 1989; Zhou et ai., 1989). Nämä homologiat rajoittuvat tiukasti cDNA:n 5'- ja 3'-osiin, lukematta jääneet alueet mukaan lukien, ja ne päättyvät jo edellä mainittuihin, BSp73AS ja BSp73ASML RNA-sekvenssien välisiin poikkeamispisteisiin. Koko poikkeamispisteiden välinen pätkä (esitetty kuviossa 2 värimerkinnällä) , eli etäispesäkkeille spesifistä SUA:ta koodaavan sekvenssin koko pätkä, ei ole läsnä Pgpl- eikä CD44-sekvensseissä. Etäispesäkkeille spesifinen glykoproteiini on ilmeisesti CD44-glykoproteiinin muunnos. Se käsittää nimittäin 156 aminohaposta koostuvan, ylimääräi- • * * V * sen, solun ulkopuolisen domeenin ja näin ollen 410 aminohappoa • » · ·...’· käsittävän laajentuneen, solun ulkopuolisen alueen (vähennetty- *·.'·· nä 21 aminohaposta koostuvalla signaalipeptidillä) verrattuna *:* 270 aminohaposta (myös vähennettynä signaalipeptidillä) muodos- tuvaan muuttumattomaan CD44-glykoproteiiniin. Etäispesäkkeitä muodostamattomista BSp73AS-soluista löytyy kuitenkin tämän CD44-perheen muuntumattomia muotoja. Näiden BSp73AS-RNA-mole-kyylien cDNA-sekvenssit on myös kloonattu, ja samanlaisuus . · · · etäispesäkkeille spesifisten kloonien kanssa ylimääräisen • * ♦ • · · *. domeenin ulkopuolella on osoitettu.

« » · CD44-muunnoksen ilmentyminen ja etäispesäkkeiden muodostamis- ; kyky korreloivat keskenään • · ·

Keksinnön puitteissa tutkittiin rotan isogeenisten kasvainso- 8 106129 lulinjojen toista sarjaa, nimittäin maitorauhaskarsinoomajär-jestelmän 13762 NF kasvainsolulinjoja (Neri et ai., 1982), millä pyrittiin selvittämään, ilmentyvätkö muuntuneet CD44-gly-koproteiinit poikkeuksetta BSp73ASML-soluissa ja liittyvätkö ne näiden solujen kykyyn muodostaa etäispesäkkeitä vai yleisesti etäispesäkkeiden muodostumiseen. Tässä tutkimuksessa emokas-vaimesta johdettuja solulinjoja, eli MTPa-, MTC-, MTF7- ja MTA-soluja (ryhmä 1) verrattiin imusolmukkeista tai keuhkoissa esiintyvistä etäispesäkkeistä saatuihin solulinjoihin eli MTLy-, MTLn2-, MTLn3-soluihin (ryhmä 2). Ryhmän 1 solut ilmentävät olennaisesti normaalia CD44-kuviota, joka on BSp73AS-so-luista peräisin olevien RNA-molekyylien kaltainen, koettimella B hybridisoitaessa. Sitä vastoin koettimella A saadaan osoitetuksi pieni määrä sekavaa RNA-massaa, jonka koko on noin 2,5 kb. Toisaalta ryhmään 2 kuuluvilla soluilla on täysin erilainen RNA-kuvio. Molemmat koettimet A ja B hybridisoituvat suurempiin RNA-lajeihin. Nämä koot ovat samankaltaisia kuin BSp73ASML-soluista osoitetut koot. Tämä samankaltaisuus varmistetaan myös RNaasi- ja SI-suoja-analyysein. Näiden tulosten perusteella päätellään, että RNA:n jatkostumiskuvion muuttuminen ja CD44-muunnoksen ilmentyminen liittyvät jollakin tavalla etäispesäkkeiden muodostumiseen, ja että tämä syntynyt kuvio 1*1 V ‘ näissä etäispesäkkeitä muodostavissa maitorauhaskarsinooman e * · soluissa vastaa läheisesti edellä etäispesäkkkeitä muodostavan • · :/·· BSp73ASML-solulinjan yhteydessä kuvattua kuviota. Suurimolekyy- *i’ liset, vasta-aineen avulla tunnistetut proteiinit vastaavat • · · · ·*·.. kumpaakin suurimolekyylistä proteiinilajia, jotka on osoitettu .*)*. BSp73ASML-uutteista. Tästä maitorauhaskasvainsarjassa todetaan siis samoin RNA-lajien ja suurimolekyylisten proteiinien etäis-pesäkkeille spesifistä ilmentymistä. Sen, että ryhmästä 1 eli • ·* *... niinkutsutuista emäsolulinjöistä löydetään ylipäätään sellais- * * * ta RNA:ta, joka hybridisoituu koettimen A eli SUArta koodaavan i *ϊ‘'1 sekvenssin kanssa, ja että erään proteiinin, jonka molekyyli- i paino on 100 00 0 Daltöniä, heikko värjäytyminen voidaan todeta ; vasta-aineen avulla, katsotaan johtuvan siitä, että ryhmään 1 • * ( ! kuuluvilla soluilla on myös vähäistä kykyä muodostaa etäispe säkkeitä toisin kuin alkuperäisellä kasvainsolulinjalla 9 106129 BSp73AS, jolla ei ollut lainkaan etäispesäkkeiden muodostumiseen johtavaa käyttäytymistä.

Monoklonaalinen vasta-aine 1.1ASML estää etäispesäkkeiden muodostumista rotassa

Eräässä koesarjassa etäispesäkkeiden muodostamiseksi kasvainso-lulinjan BSp73ASML soluilla isogeenisissa rotissa rottiin injektoitiin ihon alaisesti näitä soluja ja eri ajanhetkillä monoklonaalista vasta-ainetta 1.1ASML vatsaontelon sisäisesti kahden...kolmen vuorokauden välein ennen kasvainsolujen antamista ja sen jälkeen. Tämän immunologisen kokeen puitteissa määritettiin myös se, millä tavalla rotan immuunivaste injektoidulle vasta-aineelle kehittyi. Eläimissä kehittyi nimittäin antihiiri-imunoglobuliinivasta-aineita sekä anti-idiotyyppi-vasta-aineita. Tästä koesarjasta saatiin tulokseksi se, että 1.1ASML-injektiot hidastivat huomattavasti kasvaimen kiinnikas-vamista ja etäispesäkkeiden muodostumista. Tämän viivästymisen kinetiikasta voidaan vetää se johtopäätös, että vasta-aine häiritsee jotakin etäispesäkkeiden muodostumiseen liittyvää primääriä prosessia. Tämä koe osoittaa, että vasta-aineen tunnistamalla proteiinirakenteella, joka sijaitsee etäispesäk-V * keitä muodostavien solujen pinnalla, on jokin merkitys etäispe- t * · säkkeiden muodostumisessa, ja että hoito- ja diagnoositavoit- : teet ovat realistisia.

« · ·»· « « « · S*.^ Rotan cDNAtn SUA:ta koodaavan sekvenssiosan suhteen homologi- sen ihmis sekvenssin eristäminen ♦ ♦ · .. Viljelmänä olevien, ihmisestä saatujen kasvainsolujen tapauk- • * ♦· sessa ei luonnollisestikaan ole ilman muuta mahdollista sei- • · · vittää, rottajärjestelmässä toteutetulla tavalla, onko soluil-:·*: la vielä etäispesäkkeiden muodostumista aiheuttavia ominaisuuk- ·;··; siä. Immuunivajai 11a hiirillä toteutettujen kokeiden perusteel- . la voidaan vetää vain hyvin rajoitetusti päätelmiä kyvystä • * i * muodostaa etäispesäkkeitä ihmisessä. Tästä syystä suhteellisen monista kasvainsolulinjoista, joista on tehty viljelmiä jo 10 106129 kauan aikaa sitten jossain päin maailmaan, oli selvitettävä, ilmentyikö niissä sekvenssejä, joita voitiin osoittaa oheisen keksinnön puitteissa rotan etäispesäkkeistä. Keksinnön puitteissa onnistuttiin löytämään yksi tällainen kasvainsolulinja. Se on peräisin ihmisen suurisoluisesta keuhkosyövästä, ja sille on annettu numeroksi LCLC97. Tästä kasvainsolulinjasta voidaan osoittaa kolme määrättyä RNA-lajia (koot: 5,5, 3,4 ja 2,8 kb), jotka käyttäytyivät täysin niiden RNA-molekyylien tavoin, joita RNA-molekyylejä on voitu osoittaa rotasta peräisin olevista, etäispesäkkeitä muodostavista kasvainsolulin-jöistä. Ne hybridisoituvat nimittäin sekä koettimeen A että myöskin koettimiin B ja C, mikä tarkoittaa sitä, että myös nämä ihmisestä saadut RNA-lajit ovat laajoilta alueilta samanlaisia kuin cDNA pMeta-l-klooni (85-prosenttisesti).

Monoklonaalinen vasta-aine 1.1ASML ei reagoinut kuitenkaan tämän kasvainsolun kanssa, toisin sanoen vasta-aineen tunnistaman proteiiniosan on erottava antigeenideterminanttien alueen suhteen niistä proteiineista, joita esiintyy ihmisestä peräisin olevan kasvainsolun pinnalla. Reagoimattomuuteen riittävät jo pienimmätkin poikkeamat vasta-aineiden suuresta spesifi-syydestä johtuen. Tätä ihmisen kasvainsolua LCLC97 käytettiin .···. nyt pelkästään cDNA-kirjaston muodostamiseen. Rotta- ja ihmis- • « · .·. : sekvenssien välisen suuren yhtäpitävyyden perusteella voitiin eristää yksi cDNA-klooni, jolla oli homologiaa koettimeen A.

"** Ihmisen cDNA:n sekvenssi määritettiin. Kuviossa 3 (a,b) on • « esitetty primääriketju ja siitä päätelty aminohapposekvenssi.

• · ·

Voidaan todeta, että rotta- ja ihmissekvenssit ovat keskenään samanlaisia laajoilla alueilla. Tämä ihmissekvenssi sekä siitä • · • *·· päätelty aminohapposekvenssi ovat samoin oheisen patenttijul- • · · : :· kaisun kohteina.

. Suoritusesimerkit • »

Solut ia vasta-aineet » ·

Tutkimuksissa käytettiin seuraavia kloonattuja Bsp-solulin- 11 106129 joja: BSp73 14ASML-1 ja 10AS-7, joita pidettiin viljelmissä julkaisussa Matzku et ai., (1983) kuvatulla tavalla; lisäksi julkaisussa Neri. et ai., (1982) kuvatut maitorauhassyövän solulinj at.

BSp73 ASML-kalvoproteiineja vastaan vaikuttavia monoklonaali-sia vasta-aineita valmistettiin immunoimalla Balb/c-hiiriä. Sen jälkeen, kun immunoidun hiiren pernasolut oli eristetty, ne fuusioitiin Ag8-myeloomasoluihin niiden saamiseksi kuolemattomaan muotoon, käyttäen Köhler:in (1981) menetelmää monoklo-naalisten vasta-aineiden valmistamiseksi. Tällä tavalla saadut hybridomasolut seulottiin sellaisten solujen löytämiseksi, joiden solujen tuottama vasta-aine vaikutti spesifisesti BSp73ASML-soluja vastaan, ei kuitenkaan BSp73AS-soluja eikä rotan normaaleja fibroblastisoluja vastaan. Täsmällinen menettelytapa on kuvattu julkaisussa Matzku et ai. (1989).

Toivotulla tavalla spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta (mAk) tuottavien hybridomasolujen annettiin lisääntyä kudosvil-jelmässä ja viljelyalastaan erittynyt mAk väkevöitiin voimakkaasti ammoniumsulfaatilla saostamalla ja pylväskromatografiaa apunakäyttäen (proteiini A-Sepharose ja MonoQ) ja sitä käytet-.···. tiin tässä muodossa oheisissa tutkimuksissa. Eräs näistä vasta- aineista on mAkl.lASML.

• · · **·· Immuunif luoresenssi • · i • ·

• M

··« *.* * Muuntuneen CD44-molekyylin osoittamiseksi erilaisten kasvain- solujen pinnalta nämä solut siirrettiin viljelmään, ne pestiin j ·.. fosfaatilla puskuroidulla keittosuolaliuoksella (PBS) ja niitä inkuboitiin l.lASML:n kanssa 30 minuuttia 40 °C:n lämpötilas- « sa. Sekundäärisenä vasta-aineena sitoutumisen osoittamiseksi • * . käytettiin rodamiiniin kytkettyä kaniinin anti-hiiri IgG:tä ja havainnot tehtiin fluoresenssimikroskoopilla.

12 106129 cDNA-ilmentämiskiriastoien muodostaminen ia immuuniseulonta BSp73ASML-soluista peräisin olevan polyA+ RNA:n alukkeena käytettiin oligo (dT):tä ja koostumukseltaan erilaisia heksa- nukleotidejä, ja cDNA:n ensimmäinen juoste syntetisoitiin AMV:stä saadun käänteiskopioijaentsyymin avulla. cDNA:n toinen juoste valmistettiin E. coli DNA-polymeraasi I:n RNaasi H:n ja E. coli-ligaasin avulla, minkä jälkeen kaksijuosteisen cDNA:n päät korjattiin T4 DNA-polymeraasin avulla. Vektorit pEXl, 2 ja 3 (Stanley ja Luzio, 1984), jotka tekevät mahdolliseksi cDNA:n fuusioimisen kolmeen erilaiseen lukukehykseen, avattiin

Smal-restriktioendonukleaasilla ja ligatoitiin cDNA:n kanssa (T4 DNA-ligaasi). Kyvykkäät E. coli DH5-bakteerit (pCI857), jotka tuottavat lämpötilaherkkää repressoria, transfektoidaan pEX-cDNA-muodosteella ja niitä viljellään nailonsuodattimilla.

Lämpötilaherkän repressorin RCI857 geeni sijaitsee plasmidissa pCI857, joka sopii yhteen pEX-plasmidien kanssa. lPj^-promootto- ri, joka ohjaa fuusioproteiinien synteesiä, ei toimi 28 °C:n lämpötilassa. Kun lämpötila nostetaan arvoon 42 °C CI-repres- sori inaktivoituu ja β-galaktosidaasi/ASML-fuusioproteiinien synteesi käynnistyy erittäin voimakkaana. Sitten suodattimien .'j*. päällä olevat, lämmön avulla indusoidut bakteripesäkkeet dena- .···. turoidaan kloroformihöyryllä, sitten niitä inkuboidaan PBS- • « liuoksessa, joka sisältää 3 % kuivamaitojauhetta, lysotsyymiä « · · * .* ja DNaasia. Näille nailonsuodattimille kiinnitettyjä bakteeri- • · · ·*·* peräisiä fuusioproteiine j a inkuboidaan nyt mAkl.lASML:n • · : ** kanssa, epäspesifisesti sitoutunut mAk pestään pois, minkä • · · V * jälkeen sitoutuminen osoitetaan käyttämällä sekundäärisenä vas ta-aineena 125I-merkittyä kaniinin anti-hiiri-IgG:tä. Auto-: *·· radiografian jälkeen alkuperäiseltä bakteerisuodattimelta eristettiin positiivisia klooneja, jotka analysoitiin pääpiir-teissään. Eräs klooni, jonka syntetisoima fuusioproteiini • * . reagoi spesifisesti l.lASML:n kanssa, oli pEX34. Bakteerikloo-nin sisältämä pEX-plasmidi käsittää 167 nukleotidin pituisen *. *·« cDNA:n, johon on koodautunut mm. epitooppi (tai antigeenideter- ·;··: minantti) , jolla mAkl. 1ASML on spesifinen.

13 106129 Täysipituisen cDNA mMeta-l:n eristäminen tapahtui sitten standardimenetelmien mukaisesti.

Rottien immunointi mAkl.1ASML:llä BDX-rottiin, jotka ovat syngeenisiä BSp73-kasvainsolujen suhteen, injektoitiin ihonalaisesti tai vatsaontelon sisäisesti mAkl.lASMLrää {liitettynä keyhole limpet-nilviäisen hemosya-niiniin) yhdessä Freund:in täydellisen apuaineen kanssa. Ensimmäinen injektio annettiin (käpälän rasvakerrokseen) 10, 7 ja 3 vuorokautta ennen BSpASML-solujen injektointia, seuraavat injektiot annettiin sitten 3, 7, 11, 14 ja 21 vuorokautta tämän jälkeen. Rotat tapetaan 28 vuorokauden kuluttua, eri imusolmukkeet erotetaan, punnitaan ja keuhkoissa esiintyvät, makroskooppisesti näkyvät etäispesäkkeet lasketaan.

Muuntuneiden CD44-pintaproteiinien ilmentymisen ~ia etäispesäkkeiden muodostamiskvvvn välinen riippuvuus

Toista rotan kasvainsolulinjojen joukkoa, joka oli saatu 13762NF-maitorauhaskarsinoomasta (Neri et ai., 1982), tutkimal-la pyrittiin selvittämään se, onko muuntuneiden CD44-glukopro-teiinien ilmentyminen pelkästään tutkitun BSp73ASML-solulinjan • ♦ · .·. : ominaisuus, vai voidaanko tämän ilmentymisen katsoa liittyvän kykyyn muodostaa etäispesäkkeitä. Lisäksi primäärikasvaimista V." saatuja solulinjoja [MTPa, MTC, MTF7 ja MTA (ryhmä 1)] verrat- • · tiin solulinjoihin, jotka olivat peräisin imusolmukkeissa ja • · · *·' keuhkoissa esiintyvistä etäispesäkkeistä [MTLy, MTLn2, MTLn3 (ryhmä 2)]. CD44:stä saadun RNA:n kuvio on esitetty kuviossa • ’·· 4, koettimien A, B ja D vastatessa tämän hakemuksen sivulla 4 • · · : sekä kuviossa 1 kuvattuja koettimia. Kaikilla ryhmään 1 kuulu- villa soluilla saadaan koetinta B käyttäen normaali CD44-ku- i>: vio. Sitävastoin ryhmään 2 kuuluvilla soluilla saadaan tästä • · . poikkeava kuvio. RNA on suurempi kuin ryhmän 1 RNA, ja se ·,*·: vastaa BSp73ASML:n RNA:ta. Pienemmät RNA:t menetetään koetti- ·”· meen D hybridisoitaessa. Kuvion loppuosasta nähdään rotan kummankin kasvainjärjestelmän välinen samankaltaisuus.

14 106129

Myös koetinta A käyttäen saatu ryhmän 2 RNA-kuvio vastaa BSp73ASML:n kuviota. Koetin A ei hybridisoidu BSp73ASML:stä peräisin olevaan RNA:hän, kun taas ryhmään 1 kuuluvilla soluilla saadaan pieni sekava, 2,5 kb:n RNA-vyöhyke. Myös RNaa-silla ja Sl-nukleaasilla toteutetut suoja-analyysit osoittavat rakenteellisen samankaltaisuuden. Näiden tulosten perusteella pilkkomiskuviossa ja muuntuneiden CD44 RNA-molekyylien ilmentymisessä tapahtuu muutos etäispesäkkeiden muodostuessa.

Etäispesäkkeiden muodostamiskvvyn siirtäminen etäispesäkkeitä muodostamattomiin BSp73AS-soluihin pMeta-l:tä vli-ilmentämällä

Muuntuneiden CD44-lajien ilmentymisen ja etäispesäkkeiden muodostumiskyvyn välinen riippuvuus kahdessa rotan kasvainsar-jassa viittaa siihen, että näillä glykoproteiineilla on syy-yhteyttä etäispesäkkeiden muodostumisessa. Tämän tutkimiseksi pMeta-1 siirrettiin BSp73AS-soluihin, minkä jälkeen selvitettiin, muuttaako tämä näiden solujen käyttäytymistä. pMeta-1 :n (kuvio 2) täydellinen koodaava alue sijoitettiin SV40-promoot-torin alapuolelle, ja tämä muodoste (kaavio kuviossa 5) istu-tettiin yhdessä PSV2neo:n kanssa BSp73AS-soluihin. Tällä ta-.···. valla saatiin yksittäisiä G418:lle vastustuskykyisiä ja pMe- ; ta-l:tä ilmentäviä pesäkkeitä. Kuviossa 5 on esitetty kahdesta • · * pesäkkeestä saatu RNA-kuvio. Muuntuneelle CD44:lle spesifisen • · · **·· koettimen A hybridisaatio osoittaa noin 2,2 kb: n suuruisen • · • ]’ hallitsevan kopion, joka vastaa kokonsa puolesta pienintä *.* ' yleisintä, BSp73ASML-soluissa kopioituvaa RNA:ta (kuvio 5) .

Transformoidut solut sisältävät kuitenkin tätä RNA:ta noin j *.· 10-kertaa enemmän kuin BSp73ASML.

• · · • ♦ · • · · ’t. Toisenlaisia suuruusluokkia todetaan eräässä transfektoidussa . solussa (BSp73ASML-pSVMetal-14) , mikä saattaa riippua plasmi- , din yhdentymiskohdasta. pSV2neo-simulointisiirtoklooni (ei esi- ί/·| tetty) ja vastaanottavat BSp73AS-solut eivät sisällä sellaista ·;·: RNA:ta, joka olisi koetinta A täydentävä vastine. Endogeenis- ten normaalien CD44-kopioiden (ilman pSVMeta-l:n ylimääräistä is 106129 domeenia) havaitsemiseksi transfektanteista suodatin paljastettiin ja siihen hybridisoitiin koetin D. Lukematta jääneen 31-sekvenssin tämä osa ei ole läsnä ilmentymiskloonissa (vrt. kuvio 5). Koetin D osoittaa kaksi pääasiallista, 2,9 ja 4,9 kb:n suuruista kopiota kummankin transfektantin RNA.-ssa (kuvio 5 oikea sarake), sekä vertailussa BSp73AS että myöskin BSp73AS-pSVneo:ssa, jota ei olla esitetty.

Erilaisten yhtäpitävien hybridisointien likimääräinen kvanti-tointi osoittaa, että nämä transfektantit ilmentävät noin 5 kertaa enemmän muuntuneen CD44:n RNA:ta, joka on kopioitunut ilmentymisplasmidin avulla, kuin endogeeniset geenikopiot.

Yli-ilmentynyt cDNA luetaan proteiiniksi. Kumpikin kuviossa 5 esitetty transfektantti syntetisoi mAbl.1ASML:n avulla immuu-nivärjäytyviä proteiineja, jotka ovat näennäisesti samankokoisia, nimittäin 150 kDa:n kokoista pääasiallista tuotetta ja 100 kDa:n kokoista, heikompaa vyöhykettä. Koska tämä cDNA-sekvenssi koodaa vain 503 aminohappoa käsittävää primääriä proteiinituotetta (vastaten noin 60 000 Daltonia), niin kaikkien näkyvien vyöhykkeiden on esitettävä muokkautuneita muoto-ja. 150 kDa:n vyöhyke yhtyy muuntuneen CD44:n erääseen muok-.···. kautuneeseen muotoon, jota ilmentyy etäispesäkkeitä muodosta- ; vassa solussa BSp73ASML. BSp73AS tai simulointisiirretyt BSp73ASpSVneo-solut eivät käsitä tätä proteiinia. Samoin kuin BSp73ASML-soluissakin, transfektanttien ilmentämien solujen • · •>#** epitooppi on paljaana solun pinnalla.

• » · • · ·

Jotta saataisiin osoitetuksi se, että muuntuneen CD44:n ilmen- • « • ’·· tyminen riittää saamaan aikaan BSp73AS-soluissa etäispesäkkei- • · · ϊ J ί den muodostumiskykyä, transfektantteja injektoitiin syngeeni- siin BDX-rottiin (spontaanin etäispesäkkeen menetelmä) . Aikai-semmissa kokeissa etäispesäkkeitä muodostavat kasvainsolut . BSp73ASML leväsivät nopeasti injektiokohdasta, ja ne olivat t t hajaantuneet täydellisesti noin 10 vuorokautta injektion jäl-keen (Matzku, 1984). Kaikki paikalliset kasvaimet poistettiin tästä syystä leikkaamalla ne irti 10. vuorokautena. Kaikkien 16 106129 BSp73ASML-solujen kantajien ja kaikkien niiden eläinten, joihin oli injektoitu yli-ilmentäviä transfektanteja, keuhkoihin kehittyi etäispesäkkeitä (taulukko 1) . Etäispesäkkeiden muodostuminen tapahtui verrattain nopeasti, 5-8 viikossa injektion jälkeen. Eläimet, jotka olivat saaneet BSp73AS-soluja tai simu-lointitransfektantteja, olivat tämän ajan jälkeen täysin terveitä (leikkauksia lukuunottamatta), eikä etäispesäkkeitä voitu todeta edes vielä 5:kään kuukauden jälkeen.

Voimakkaassa etäispesäkkeiden muodostumisessa todettavasta yllättävästä samankaltaisuudesta huolimatta havaitaan myös eräitä mielenkiintoisia eroja. BSp73ASML-solut saavuttavat kaikissa eläimissä imusolmukkeet ja aiheuttavat eri solmukkeiden huomattavaa suurenemista nivusalueessa ja aortan vieressä (taulukko 1) . Transfektantti (BSp73AS-pSVMetal-14) aiheuttaa imusolmukkeiden suurenemista 3 eläimessä kahdeksasta, vaikka kaikkien eläinten keuhkoissa kehittyykin lukuisia etäispesäkkeitä (taulukko 1) . Toisella transfektantilla (BSp73AS-pSV-metal-15) ei voida todeta imusolmukkeiden suurenemista. Näin ollen nämä transfektantit näyttävät kykenevän muodostamaan pesäkkeitä keuhkoihin ilman pakollista kasvuvaihetta imusol-mukkeissa.

« · ·' ; Taulukon 1 mukainen koe viittaa lisäksi toiseen, BSp73AS-trans- fektanttien ja BSp73ASML-solujen väliseen eroon. Keuhkojen • · · **·* yksittäiset etäispesäkkeet ovat makroskooppisesti näkyviä, kun • · • *’ taas BSp73ASML:n aiheuttamat etäispesäkkeet ovat pieniä ja *·* * niitä on paljon, kuitenkin BSp73ASML-soluilla toteutetussa suuremmassa koesarjassa (Reber et ai., 1990) 11 eläimessä • *·· 20:sta kehittyy 5-20 suurempaa pesäkettä keuhkoa kohden trans- : : : fektantteihin verrattuna.

« · . Jotta voitaisiin varmistua siitä, että muodostuneet etäispe säkkeet johtuvat injektoiduista transfektanteista, spontaanin :/·· mutaation, joka saa aikaan etäispesäkkeiden muodostamiskykyä, v: epätodellinen mahdollisuus täten poissulkien, epitooppiposi- tiiviset proteiinit määritettiin koko keuhkoista tehdyistä 17 106129 uutteista sekä uudestaan viljellyistä, etäispesäkkeitä tuottavista soluista saaduista uutteista. 150 kDa:n glykoproteiini voidaan osoittaa koko keuhkoista saadusta uutteesta sekä eläimen, joka oli saanut BSpAS-pSVMetal-15-transfektantteja, spesifisestä keuhkopesäkkeestä saaduista uutteista. G418:lle vastustuskykyinen kanta ilmentää in vitro-kasvun aikana proteiinia, jolla on näennäisesti tämä sama molekyylipaino.

Diagnostiikka ia hoito 1. Ihmisen kasvainmateriaali analysoidaan in situ-hvbridisoin-neilla jo olemassaoleviin, ihmisen pMeta-l-sekvensseihin. Nämä kokeet on tarkoitettu esikokeiksi, ennenkuin saadaan aikaan ihmisen SUA:n tunnistama vasta-aine.

2. Ihmisen SUA:ta vastaan vaikuttavien vasta-aineiden valmistus. Ihmisen pMeta-l-sekvenssit kloonataan bakteeriperäisiin ilmentämisvektoreihin siten, että syntyy fuusioita β-galaktosidaasi- tai tryptofaani E-tuotteeseen. Kaniinit immunoidaan näillä fuusioproteiineilla tai SUA:sta peräisin olevilla syntetisoiduilla peptideillä (kantajamolekyyleihin /:·. kytkettyinä). Moniarvoiset tai monospesifiset vasta-aineet .···. eristetään.

• · Käyttömahdollisuudet: • · · · • ]* - kliinisen kasvainmateriaalin immunohistologiset tutkimukset • · * *·* * (diagnostiikka) ; - liukoisen SUA:n osoittaminen potilaan seerumista ELISA-määri- • · • '·· tyksillä (diagnostiikka) ; : - toksiiniin kytkettyjen vasta-aineiden muodostaminen toksii- nin viemiseksi vasta-aineen avulla kasvaimen tai etäispesäk-. keen alueeseen (hoito); . - vasta-aineiden, joissa on kaksi määrättyä antigeenin sitou- • 4 ’·/·: tumiskohtaa, muodostaminen. Tällä kaksoisspesifisyydellä pyritään laukaisemaan sytotoksisia reaktioita etäispesäkkeen alueessa (esim. anti-CD2- tai CD3-kytkentä) (hoito).

18 106129 3. hMeta-1-proteiinin valmistus transfektoimalla ihmisen tai rotan soluja sellaisella ilmentämisvektorilla, joka käsittää täydellisen hMeta-1 cDNA-sekvenssin; tai puhdistus LCLC97-soluista.

Käyttömahdollisuudet: - Proteiinin tai sen osan injektointi kasvainsolujen kudos-sitoutumiskohtien salpaamiseksi ; - sitoutumiskohtien karakterisoinnin jälkeen ajateltavaa olisi myös käyttö hoitosovellutuksissa, jotka perustuvat sitoutu-misproteiinin suurten määrien injektointiin liikkuvien kasvainsoluj en salpaamiseksi.

Kirj allisuusluettelo:

Goldstein, L.A., Zhou, D. F. H., Picker, L. J., Minty, C. N.,

Bargatze, R. F., Ding, J. F. and Butcher, E. C. (1989) A human lymphocyte homing receptor, the hermes antigen, is related to cartilage proteoglycan core and link proteins. Cell 56: .··. 1063-1072.

« «

« 4 I

,:. Hart, I. R., Goode, N. T. and Wilson, R. E. (1989) Molecular ‘.I’* aspects of the metastatic cascade. Biochim. Biophys. Acta 989: h.!’ 65-84.

• · · • · ·

Idzerda, R. L. , Carter, W. G. , Nottenburg, C., Wayner, E. A., • ·

! *** Gallatin, W. M. and St. John, T. (1989) Isolation and DNA

• · · · sequence of a cDNA clone encoding a lymphocyte adhesion receptor for high endothelium. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.

t » ,,,,r 86: 4659-4663.

t Köhler, G. (1981) In: I. Lefkovits and B. Pernis (eds) .

'>" Immunological Methods. Vol. 2 p. 285. N.Y. Academic Press.

19 106129

Matzku, S., Komitowski, Mildenberger and Zöller, M. (1983) Characterization of Bsp 73, a spontaneous rat tumor and its in vivo selected variants showing different metastasizing capacities. Inv. Met. 3: 109-123.

Matzku, S., Wenzel, A., Liu, S. and Zöller, M. (1989). Antigenic differences between metastatic and nonmetastatic BSp73 rat tumor variants characterized by monoclonal antibodies. Cancer Res. 49: 1294-1299.

Neri, A., Welch, D., Kawaguchi, T. and Nicolson, G. L. (1982) Development and biologic properties of malignant cell sublines and clones of spontaneously metastasizing rat mammary adenocarcinoma. J. Natl. Cancer Inst. 68: 507-517.

Nicolson, G. L. (1987) Tumor cell instability, diversification, and progression to the metastatic phenotype: from oncogene to oncofetal expression. Cancer Res. 47: 1473-1487.

Nottenburg, C. , Rees, G. and St. John, T. (1989) Isolation of mouse CD44 c DNA: structural features are distinct from the • · · .···. primate cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 8521-8525.

4 4 · • 4 4

Stamenkovic, I., Amiot, M., Pesando, J. M. and Seed, B. (1989) • · · ♦ **** A lymphocyte molecule implicated in lymph node homing is a • · member of the cartilage link protein family. Cell 56: ; 1057-1062 .

• · • ’·· Stanley K.K. and Luzio, J.P. (1984), Construction of a new • · * :/ : family of high efficiency bacterial expression vectors: ^*,5 identification of cDNA clones coding for human liver proteins.

• · i(_. EMBO J. 3: 1429-1434.

'·,<; Wenzel, A. (1986) Charakterisierung von Dif ferenzierungs- ( antigenen auf dem Rattentumor Bsp 73 mit Hilfe monoklonaler Antikörper. Diplomityö, Karlsruhen yliopisto.

20 106129

Zhou, D. F. H., Ding, J. F., Picker, L.F., Bargatze, R. F., Butcher, E. C. and Goeddel, D. V. (1989) Molecular cloning and expression of Pgp-l - The mouse homolog of the human H-CAM (Hermes) lymphocyte homing receptor. J. Immunol. 143: 3390-3395.

Taulukko 1

Muuntunutta CD44 cDNA pMeta-l:tä ilmentävien BSp73AS-solujen etäispesäkkeitä aiheuttava leviäminen***

Paikallinen Hajaantuminen etsittäessä etäis-Kasvain- esiinty- pesäkkeitä ruumiinavauksella klooni_tvminen_LN* inq_LN* par_Keuhkot BSp73ASML 0/8 8/8 8/8 8/8 φ 1,5-2,5** φ 2,2-5,0 jyvämäinen BSp73AS- 0/8 3/8 3/8 8/8 pSVMetal-14 φ 0,3-1,2 φ 1,0-4,5 moninkert.

φ 0,3-5,0 BSp73AS- 0/8 0/8 0/8 8/8, 5-20 pSVMetal-15 φ 0,3-10,0 BSp73AS 1/8 0/8 0/8 0/8 • « « *·.*.' BSp73AS - 0/8 0/8 0/8 0/8 ^ / pSVneo • · • · · “ * LN = imusolmukkeet ** Keskimääräinen halkaisija millimetreinä • · • *·· *** Taulukossa on esitetty tila 60 vuorokautta mainittujen • · · : : : solujen injektion jälkeen.

• · * · • · · • · · • · · • * * ♦ • « « « « • « « • < «iti I «

Claims (8)

106129

1. Menetelmä valmistaa polypeptidi, joka käsittää aminohapposekvenssit . . . r-protei in i. .. IATTPWVSAHTKQNQERTQWNPIHSNPEVL LQTTTRMTDIDRNSTSAHGENWTQEPQPPF NNHEYQDEEETPHATSTTWADPNSTTEEAA TQKSKWFENEWQGKNPPTPSEDSHVTEGTT AS A HNNHPSQR M TTQSQZDVS λ TDFFDP I S H F M G Q G H Q Γ E S K ja h-proteiini : I s S T I S T T ? R A F D H T K Q N Q D W T Q W N ? S r. S N ? E V L L Q T T T R M T D V D R N! G T T A Y Ξ G N W N ? Ξ A J·]* H ? ? L I H H E H H E E E E T ? H S ? S T I Q A T ? S S T T \.. Ξ Ξ T A T Q K E Q vv F G N R W H I G Y R Q Γ ? R E G S H S T T G T A A A S A H T S H ? M Q G R T T ? Ξ P Ξ D S Ξ W 7 G F F N F I S H F M G R G H Q A G R ?. sekä niiden alleelit muunnokset, ja glykosylaatiotuotteet, » · :/·· joka on osa etäispesäkkeitä muodostavien kasvainsolujen : : eräästä pintaproteiinista, tunnettu siitä, että tätä h_ polypeptidiä koodaava DNA-kappale valitaan 22 1 06 1 29 a) nukleotidisekvenssien ...rMeta-1... ATT GCA ACT ACT CCA TGG GTT TCT GCC CAC ACA AAA CAG AAC CAG GAA CGG ACC CAG TGG AAC CCG ATC CAT TCA AAC CCA GAA GTA CTA CTT CAG ACA ACC ACC AGG ATG ACT GAT ATA GAC AGA AAC AGC ACC AGT GCT CAT GGA GAA AAC TGG ACC CAG GAA CCA CAG CCT CCT TTC AAT AAC CAT GAG TAT CAG GAT GAA GAG GAG ACC CCA CAT GCT ACA AGC ACA ACC TGG GCA GAT CCT AAT AGC ACA ACA GAA GAA GCA GCT ACC CAG AAG GAG AAG TGG TTT GAG AAT GAA TGG CAG GGG AAG AAC CCA CCC ACC CCA AGT GAA GAC TCC CAT GTG ACA GAA GGG ACA ACT - GCC TCA GCC CAC AAC AAC CAT CCA AGT CAA AGA AGT ACA ACA CAG AGT CAA GAG GAT GTT TCA TGG ACC GAT TTC TTC GAC CCA ATC TCA CAT CCA ATG GGA CAA ja hMe ta-1. . ; AAC CCA AGC CATTCA AAT CCG GAA GTG CTA CTT CAG ACA ACC ACA AGG ATG CAT GAT GTA GAC AGA AAT GGC ACC ACT GCT TAT • « .··. GAA GGA AAC TGG AAC CCA GAA GCA CAC CCT CCC CTC ATT CAC CAT GAG CAT CAT GAG GAA GAA GAG . ACC CCA CAT TCT ACA AGC ' / ACA ATC CAG GCA ACT CCT AGT AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT ;;· ACC CAG AAG GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG- GGA « · : *' TAT CGC CAA ACA CCC AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG • · · * AL.-. OW 1 U'w.-. VJV..W . wA OL* AL, AGv_ C-Λ- LCA Λ-VJ LA .···. b) nukleotidisekvenssien, jotka ovat degeneroituneet kchdas- φ··.β sa a) mainittuihin DNA-sekvensseihin verrattuna ja/tai ovat • · *!* niiden alleelisia muunnoksia, • » • · · * «t joukosta ja sijoitetaan promoottorin alapuolelle lisääntv-.j. miskykyisten solujen geeniainekseen, jotka solut viljellään ja saadaan lisääntymään tunnetulla tavalla ja polypep- : tidi eristetään viljelyssä selvinneistä ja/tai lisääntyneistä soluista. 106129

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että valitaan nukleotidisekvenssejä, jotka hybri-disoituvat jonkin patenttivaatimuksessa la) mainitun nukleo-tidisekvenssin kanssa ja koodaavat etäispesäkkeitä muodostavien kasvainsolujen täydellistä pinnan glykoproteiinia.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että patenttivaatimuksessa 1 mainitun nukleotidi-sekvenssin kanssa hybridisoituva sekvenssi on vähintään 85-prosenttisesti homologinen reaktiokumppaniin nähden.

4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen DNA-kappale viedään vektoriperäiseen nukleotidisekvenssiin yhdistelmä-DNA molekyylin muodostamiseksi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että yhdistelmä-DNA-molekyyli on ilmentämisvek-tori .

6. Patenttivaatimusten 4-5 mukainen menetelmä, tunnet - V · t u siitä, että polypeptidi ilmennetään isär.täsolulla, joka : : on transformoitu patenttivaatimusten 4 ja 5 mukaisella yhdistelmä-DNA-molekyylillä tai sisältää patenttivaatimus- ··. ten 1, 2 tai 3 mukaisen DNA-kappaleen . * · · * • « • « « · ·

7. Menetelmä valmistaa moni- ja yksiarvoisia vasta-aineita « · · jotka ovat patenttivaatimusten 1-5 mukaisella menetelmällä ... aikaansaatujen polypeptidien epitoopin kanssa reagoivia, ♦ · ”·* tunnettu siitä, että ne aikaansaadaan immunisoimai- *·..· la sopivat isäntäeläimet jollakin patenttivaatimusten 1-6 mukaiseen polypeptidiin kuuluvalla epitoopilla ja eläinten vereen muodostunut vasta-aine eristetään tai vasta-aineet · · * · · • « 24 1 06 1 29 tuotetaan sinänsä tunnetulla hybridoma-tekniikalla.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukaisella menetelmällä valmistetun vasta-aineen käyttö patenttivaatimusten 1-6 mukaisen polypeptidin tunnistamiseksi, valmistamiseksi tai eristämiseksi . • · • · * « · » · · * · · • · · • · • « t * « ♦ « c • · « • * • · · » ♦ # f e t 4 ( < t 106129