CN116333122A - 单克隆抗体、其衍生物及它们的应用 - Google Patents

单克隆抗体、其衍生物及它们的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种单克隆抗体、其衍生物及它们的应用，本发明分别利用两株杂交瘤制备得到两种ROR1单克隆抗体，通过对两个单克隆抗体进行测序，明确了两个单克隆抗体的CDR区和轻、重链的核苷酸与氨基酸序列。在对两种单抗的核苷酸序列转化载体后，表达得到的融合单抗，其对ROR1的识别性和吸附效果良好。

Description

单克隆抗体、其衍生物及它们的应用
相关申请的交叉引用
本申请与电子格式的序列表一同提交，所提供的序列表名称为“202112序列表.txt”，创建于2021年12月20日，其文件大小为24.0kb。该序列表的电子格式的信息通过引用其全文纳入本申请文件中。
技术领域
本发明涉及能够识别受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)的单克隆抗体、其衍生物及它们的应用。
背景技术
ROR1(Receptor-tyrosine-kinase-like orphan receptor 1，类受体酪氨酸激酶孤儿受体1)的编码基因共2814bp，位于染色体1p31.3。ROR1膜蛋白由937个氨基酸组成，分子量约105kDa。ROR1结构在生物种间高度保守，如人与鼠的ROR1氨基酸序列同源性可达97％。如图1所示，人源ROR1由一个胞外的免疫球蛋白样结构域(Ig)、两个富含半胱氨酸的结构域(FZD)、近膜kringle结构域、单次跨膜结构以及一个胞内酪氨酸激酶结构域(TKD)、两个丝/苏氨酸富集结构域(S/TRD)和一个脯氨酸富集结构域(PRD)组成(NicholasBorcherding，David Kusner，Guang-Hui Liu，et al.ROR1，an embryonic protein withan emerging role in cancer biology[J].Protein Cell.2014，5(7):496–502.)。
免疫球蛋白样结构域(Ig)和半胱氨酸富集结构域(FZD)与ROR1结合配体的功能相关。其中FZD结构域由10个保守的半胱氨酸残基和5个相应的二硫键组成。FZD结构还见于平滑肌家族受体(如Smo)、卷曲家族受体(如sFRP)、金属羧肽酶Z(CPZ)、collagenα1XVIII和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)。这些蛋白大都可以结合Wnt蛋白并参与Wnt通路的信号转导。目前大量研究己经证实ROR1也是通过FZD结合Wnt5a并激活非经典Wnt信号通路。Kringle结构域在ROR家族中比较保守，由80个氨基酸组成，其结构特点是含有三个由二硫键形成的环状结构，这三个环状结构也参与了ROR受体识别Wnt蛋白的过程。
许多研究表明，ROR1在恶性细胞中高水平表达。ROR1首先在在血液系统恶性肿瘤中被确定为癌胚基因。2001年，两研究团队通过cDNA芯片观察到与正常B淋巴细胞相比，慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞中ROR1的转录水平较高(Hudecek M，Schmitt TM，Baskar S，Lupo-Stanghellini MT，Nishida T，Yamamoto TN，et al.The B-cell Tumor-AssociatedAntigen ROR1 can be Targeted With T Cells Modified to Express a ROR1-specificChimeric Antigen Receptor.Blood(2010)116:4532–41.)。然而，ROR1的重要性直到几年后才被认识。2008年，Fukuda等利用单克隆抗体(mAb)在蛋白水平鉴定CLL细胞中异常表达的ROR1。这项研究还确定了Wnt5a是ROR1的配体，它以ROR1依赖的方式刺激促生存信号的激活(Fukuda T，Chen L，Endo T，Tang L，Lu D，Castro JE，et al.Antisera Induced byInfusions of Autologous Ad-CD154-Leukemia B Cells Identify ROR1 as anOncofetal Antigen and Receptor for Wnt5a.Proc Natl Acad Sci USA(2008)105:3047–52)。同时发现ROR1的表达对CLL患者的预后有显著影响。此外，发现ROR1在B急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的一个亚组中表达，主要在t(1；19)染色体易位的患者中表达。这些B-ALL细胞对siRNA介导的ROR1沉默敏感，表明ROR1维持白血病细胞存活的关键功能(BicoccaVT，Chang BH，Masouleh BK，Muschen M，Loriaux MM，Druker BJ，et al.CrosstalkBetween ROR1 and the Pre-B Cell Receptor Promotes Survival of T(1；19)AcuteLymphoblastic Leukemia.Cancer Cell(2012)22:656–67.)。ROR1在套细胞淋巴瘤(MCL)中也异常表达，触发与CLL和B-ALL相似的促生存信号。研究发现，其他几种类型的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤表达ROR1，但其功能尚未明确表征。此外，在CD34+急性髓系白血病(AML)细胞中发现ROR1，可被mAb靶向作用(Balaian L，Sadarangani A，Widhopf GF II，Zhong R，Prussak C，Marra M，etal.A Highly Selective Anti-ROR1 Monoclonal Antibody Inhibits Human AcuteMyeloid Leukemia CD34+Cell Survival and Self-Renewal.Blood(2012)120:2560.)。
此外，除了在血液恶性肿瘤中，还在广泛的实体瘤中发现ROR1的异常表达，因此，ROR1可作为生物标志物和治疗靶点。在乳腺癌中，发现ROR1在肿瘤标本中呈阳性而在正常乳腺组织中不呈阳性(Zhang S，Chen L，Cui B，Chuang HY，Yu J，Wang-Rodriguez J，etal.ROR1 is Expressed in Human Breast Cancer and Associated With EnhancedTumor-Cell Growth.PloS One(2012)7:e31127.)。ROR1在乳腺癌中的高表达与上皮间质转化(EMT)、肿瘤转移和侵袭性疾病有关。ROR1在肺癌细胞中也有高水平的发现，作为肺腺癌患者的预后生物标志物。ROR1沉默导致代表人肺腺癌的细胞系生长抑制。在卵巢癌中，ROR1高表达的肿瘤细胞表现出干细胞样基因表达特征，并具有更强的植入免疫缺陷小鼠的能力。也有关于ROR1在其他类型癌症中表达的报道，包括结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、黑色素瘤和胰腺癌。
目前，在临床试验和临床前研究中已开发并评价了几种针对ROR1的治疗策略。大多数靶向癌症治疗使用小分子药物或基于mAb(单克隆抗体)的策略。mAb直接阻断配体结合，激活免疫系统消除肿瘤细胞。小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是ATP竞争性抑制剂，靶向酪氨酸激酶的催化结构域。目前，已经开发了多种抗ROR1的mAb。这些mAb介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、ROR1内化和表达ROR1的恶性肿瘤细胞凋亡。这些抗体大多在临床前研究和临床研究阶段，因而，仍需要开发更多的有效的抗ROR1的抗体。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种抗原ROR1的单克隆抗体，其包含：
(i)第一重链可变结构域，所述第一重链可变结构域包含如SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，
VHCDR1包含序列GFTFSSYA(SEQ ID NO:1)；
VHCDR2包含序列INRGVTT(SEQ ID NO:2)；
VHCDR3包含序列ARYDGNYEGMDY(SEQ ID NO:3)；
(ii)第一轻链可变结构域，所述第一轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中：
VLCDR1包含序列QDINSY(SEQ ID NO:4)；
VLCDR2包含序列RAN(SEQ ID NO:5)；
VLCDR3包含序列LQYDEFPYT(SEQ ID NO:6)，其中，CDR是根据Kabat编号定义的。
进一步的，所述第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域分别包含如SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所列的氨基酸序列。
本发明还提供了另外一种抗原ROR1的单克隆抗体，其包含：
(i)第二重链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO:7-9所示的重链互补决定区VHCDR4、VHCDR5和VHCDR6，其中：
VHCDR4包含序列GYTFTECA(SEQ ID NO:7)；
VHCDR5包含序列INPNNGGT(SEQ ID NO:8)；
VHCDR6包含序列AREAIYYDYAMDY(SEQ ID NO:9)；
(ii)第二轻链可变结构域，所述第二轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:7-9所示的轻链互补决定区VHCDR4、VHCDR5和VHCDR6，其中：
VLCDR4包含序列QSLLDSDGKTY(SEQ ID NO:10)；
VLCDR5包含序列LVS(SEQ ID NO:11)；
VLCDR6包含序列WQGTHFPGT(SEQ ID NO:12)，其中，CDR是根据Kabat编号定义的。
进一步的，所述第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域分别包含如SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16所列的氨基酸序列。
本发明还提供了编码前面所述的单克隆抗体的分离的核酸分子。
本发明还提供了含有前面所述的核酸分子的载体。
本发明还提供了一种包含前述的分离的抗体的融合物或缀合物。
本发明还提供了一种组合物，其包含前述分离的抗体、核酸分子、载体、融合物或缀合物，及其相应的可药用载体。本发明还提供了一种检测生物样品中ROR1的方法，包括使生物样品与前述的分离的抗体或融合物或缀合物接触。
本发明还提供了一种前述的抗体或抗原结合片段或组合物在制备用于治疗ROR1活性有害的病症的药物中的用途。
本发明得到了两种分别来源于两株杂交瘤的抗ROR1单克隆抗体，通过对其进行测序，并得到了两种单克隆抗体的CDR区和轻、重链的核苷酸序列。在对两种单克隆抗体的轻、重链核苷酸序列进行重组后得到的抗ROR1嵌合抗体进行性能检测后，结果表明二者都能与抗原ROR1进行有效结合。
附图说明
图1为ROR1的结构示意图；
图2为在一些示例性的实施例中的pCDNA3.1-ROR1-FC质粒的图谱；
图3为在一些示例性的实施例中的pCDNA3.1-ROR1-HIS质粒的图谱；
图4为在一些示例性的实施例中的抗原ROR1的电泳图；
图5为在一些示例性的实施例中的利用ROR1抗原对小鼠免疫后的ELISA检测结果；
图6为在一些示例性的实施例中的重组嵌合抗体的SDS-PAGE检测结果；
图7为在一些示例性的实施例中的重组嵌合抗体的ELISA检测结果。
具体实施方式
术语“互补决定区”和“CDR”同义，是本领域已知的，指抗体可变区内非连续的氨基酸序列，其赋予抗体特异性和/或结合亲和性。通常，在各重链可变区中存在三种CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)且在各轻链可变区中存在三种CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”是本领域已知的，其指所述重链和轻链的可变区的非CDR部分。
本发明的的“单克隆抗体”指抗体的片段及其衍生物。作为单克隆抗体的片段及其衍生物，具体的如Fab、Fab’、F(ab)2以及sFv片段等(Blazar et al.，1997，Journal ofImmunology，159：5821-5833以及Bird et al.，1988，Science，242：423-426)。
术语“抗ROR1mAb”为抗ROR1的单克隆抗体。
本发明的“治疗用于治疗ROR1活性有害的病症的药物中的用途”，其中所述病症是ROR1表达型癌症，其中所述ROR1表达型癌症包括但不限于以下病症：B细胞白血病、淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌和头颈癌。
实施例1：ROR1抗原制备
在一些实施例中，ROR1抗原制备按照如下步骤进行：
(1)ROR1抗原基因模板的合成：ROR1-FC和ROR1 HIS的基因模板通过利用PCR扩增方法合成得到，ROR1-FC和ROR1 HIS的基因模板为现有技术中已知的。ROR1-FC的基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；ROR1-HIS的基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；
(2)用HindIII/EcoRI酶切PCDNA3.1质粒载体并利用胶回收试剂盒回收大片段，胶回收试剂盒购自天根生化，货号：DP209-03，操作步骤参见说明书，同样用胶回收试剂盒回收步骤(1)的ROR1抗原基因模板的PCR产物。
(3)用基因重组试剂盒(ClonExpressUltraOneStepCloningKit，Vazyme#C115)，将步骤(2)得到的ROR1抗原的PCR片段和pCDNA3.1质粒酶切产物进行重组，反应条件为：50℃反应5-15min。
(4)利用步骤(3)的重组产物直接转化感受态细胞，将克隆用的化学感受态细胞(Fast-T1CompetentCell，Vazyme#C505)置于冰上解冻。取5-10μl步骤(3)的重组产物加入到100μl的感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μlLB液体培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200rpm)。将氨苄抗性的LB固体培养基平板在37℃培养箱中预热。5，000rpm(2，500×g)离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12-16h。委托金唯智生物公司进行测序鉴定，保存正确质粒克隆。
(5)用无内毒素质粒提取试剂盒提取步骤(4)得到的大肠杆菌TOP10中的重组质粒，命名为：pCDNA3.1-ROR1-FC(如图2所示)和pCDNA3.1-ROR1-HIS(如图3所示)，用质粒大抽试剂盒抽提上述两个质粒，用于后续瞬转表达。
(6)培养293F细胞，当细胞密度达到2×106-3×106细胞/毫升时，利用步骤(5)的重组质粒分别对293F细胞进行转染(转染试剂：Thermo，货号：A14525)，转染后培养7天，收集上清，高速离心；
利用镍柱(层析填料：中科森辉，货号：11-0030-06)纯化融合蛋白ROR1-HIS；利用proteinA(层析填料：赛分科技，货号：MabPurix A65)柱纯化融合蛋白。
(7)通过SDS-PAGE方法对步骤(6)纯化得到的融合蛋白进行检测，结果如图4所示，由图4可看出，ROR1-HIS和ROR1-FC重组蛋白已成功表达和纯化，制备得到纯品蛋白。
实施例2：动物免疫
(1)选择6-8周龄左右的雄性Balb/C健康小鼠，将实施例1纯化得到的ROR1-FC抗原与弗氏完全佐剂、PBS混合，完全乳化后，制备得到的抗原试剂。
(2)利用步骤(1)的抗原试剂，并按照100μg抗原试剂每只每次，采取背部多点免疫。免疫程序：经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再21天后进行第三次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；7天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融合。
ELISA检测结果显示，A2号小鼠血清效价较高(如图5)，选择A2号小鼠的脾脏进行后续融合实验。
实施例3：杂交瘤细胞融合
(1)融合前准备：
骨髓瘤细胞可以选用任意现有技术中的来源，示例性的，可以使用来源于小鼠、大鼠、人等的骨髓瘤。示例性的，使用小鼠作为骨髓瘤细胞的来源时，可以选自小鼠骨髓瘤细胞系P3X63-Ag8、X63-Ag8-653、NS-1、FO或SP2/0中的任意一种。
在本发明的一些实施方式中，选用SP2/0细胞，在融合前7-10天，解冻SP2/0细胞，每天观察细胞生长状态，对半换液使细胞处于对数生长期，融合时所用SP2/0细胞要求活细胞率在95％以上。
准备饲养细胞：饲养细胞也可以为任意现有技术中的来源的饲养细胞，示例性的，将饲养细胞与骨髓瘤细胞选择来源于同一种类的动物或不同种类的动物均可。
在本发明的一些实施方式中，饲养细胞选取自普通小鼠腹腔渗出细胞，饲养细胞的准备方式可以用任意现有技术中的方式。示例性的，饲养细胞的活细胞浓度为1*10E5/ml。制备得到小鼠腹腔渗出细胞悬液后，于杂交瘤融合步骤前一天将饲养细胞按100μl/孔接种接种于96孔培养板上。
(2)脾细胞分离：
末次免疫3天后，小鼠放血，75％酒精中浸泡3min，开腹，取脾，经清洗，用脾细胞分离器分离脾细胞，收集单细胞悬液。
(3)细胞融合：采用电融合仪融合的方式融合(品牌：BTX，型号：
ECM2001)按1.1:1的比例混匀脾细胞和骨髓瘤细胞，1500rpm离心5min；弃尽上清，重悬于20ml电融合缓冲液中，1500rpm离心5min，重复一次；用电融合缓冲液稀释细胞至密度为1-2×107/ml，体积为8-9ml，细胞总量不能超过2*10E8；以尽量快的速度，将细胞混合物加入到电融合杯中，按下电融合仪的自动运行键；程序运行指示灯至红色，后熄灭，融合完成；维持静止5mim后，轻轻混匀电融合杯中的细胞，转移至新的50ml离心管中，HAT培养基重悬至40ml，室温静置10-20min；之后放在T175培养瓶培养，培养1周后，通过流式细胞分选仪做单细胞分选，将杂交瘤分选至步骤(1)的培养有饲养细胞的96孔板中。
(4)融合细胞的早期培养
细胞融合后，一般每隔两天HT选择性培养基对半换液。8-10天后换用1640完全培养基。观察96孔是否有克隆，选生长良好的克隆孔检测，阳性克隆孔扩大培养，从96孔板扩至24孔板，最后扩大到培养瓶中。
在本发明的一些实施例中，杂交瘤细胞按照如下方式冻存(细胞冻存液为10％DMSO(20％FBS-1640配制)，选取存活率在95％以上的杂交瘤细胞，离心，弃上清，用冻存液悬浮细胞，移于冷冻管中，并立即放于-80℃冰箱内，第二天，移入液氮罐中。
实施例4：杂交瘤产生的抗ROR1mAb与抗原的结合性能评估
4.1ELISA检测
间接ELISA：以ROR1 HIS抗原包被载体，4℃过夜，以无关蛋白(BSA)37℃封闭2h，加入实施例3的杂交瘤细胞培养上清液100μl，37℃孵育1h，0.05％Tween 20-PBS，洗涤5-6次，加二抗(如HRP-GAM)，再经37℃孵育2h，同上洗涤，以底物(OPD)显色，显色到一定程度后加入终止液(3M H2SO4)，终止反应，在酶标仪上读OD492，结果如表1所示。
4.2流式检测
选择ROR1靶点阳性的肿瘤细胞系MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)作为实验细胞，对步骤(4)得到的样品的上清进行流式染色，确认不同杂交瘤克隆的流式荧光信号强度和细胞阳性率，结果如表1所示。
表1杂交瘤产生的抗ROR1mAb与抗原的结合性能对比
Figure BDA0003431488380000111
实施例5：对杂交瘤产生的抗ROR1mAb测序
对排名靠前的两个克隆6G3/10F6产生的抗ROR1mAb进行测序，方法如下：
将克隆6G3的杂交瘤培养液和10F6的杂交瘤培养液保存在Trizol溶液中充分裂解，12000×g离心5min，弃沉淀。按200μl氯仿/ml在Trizol中加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。避免使用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。4℃，12000×g离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。避免吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。
按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇，混匀，室温放置5-10min。4℃2000×g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
4℃8000×g离心5min，尽量弃上清。室温晾干或真空干燥5-10min。用50μl H2O溶解RNA样品。测OD值，定量RNA浓度。利用逆转录试剂盒(型号Thermo Fisher，货号：18091050)完成RNA逆转录操作获得抗ROR1mAb的cDNA。利用抗ROR1mAb的重链和轻链扩增引物，扩增轻链和重链片段，通过TA克隆试剂盒构建轻重链的TA克隆，将克隆送样测序，获得抗ROR1mAb的轻、重链序列。
杂交瘤6G3产生的抗ROR1抗体的可变域序列，如下表2所示，基于Kabat编号的互补决定区(CDR)加下划线显示。
表2.1杂交瘤6G3产生的抗ROR1mAb的可变域的氨基酸序列
Figure BDA0003431488380000121
表2.2杂交瘤6G3产生的抗ROR1mAb的可变域的核苷酸序列
Figure BDA0003431488380000131
杂交瘤10F6产生的抗ROR1抗体可变域序列，如表3所示，基于Kabat编号的互补决定区(CDR)加下划线显示。
表3.1杂交瘤10F6产生的抗ROR1mAb的可变域的氨基酸序列
Figure BDA0003431488380000132
表3.2杂交瘤10F6产生的抗ROR1mAb的可变域的核苷酸序列
Figure BDA0003431488380000133
Figure BDA0003431488380000141
实施例6：重组嵌合抗体的制备
对杂交瘤6G3和10F6产生的抗ROR1mAb进行测序后，将其重链序列分别克隆到pCDNA3.1-hIgG1-CH载体，轻链序列分别克隆到pCDNA3.1-KappaCL载体。分别获得克隆CDNA3.1-hIgG1CH-6G3VH(ROR1)，pCDNA3.1-hIgG1CH-10F6VH(ROR1)，pCDNA3.1-KappaCL-6G3VL(ROR1)和pCDNA3.1-KappaCL-10F6VL(ROR1)。通过质粒大抽试剂盒大抽获得瞬转用质粒。质粒构建方法和瞬转表达方法同实施例1，利用proteinA填料纯化抗体。通过共同瞬转CDNA3.1-hIgG1CH-6G3VH(ROR1)和pCDNA3.1-KappaCL-6G3VL(ROR1)获得6G3重组嵌合抗体，通过共同瞬转pCDNA3.1-hIgG1CH-10F6VH(ROR1)和pCDNA3.1-KappaCL-10F6VL(ROR1)获得10F6重组嵌合抗体。
实施例7：重组嵌合抗体的性能检测
7.1对重组嵌合抗体的SDS-PAGE检测结果
对实施例6制备得到的重组嵌合抗体进行SDS-PAGE检测，结果如图6所示，图中泳道M代表marker，泳道NR代表非还原电泳；泳道R代表还原电泳。结果表明，重组嵌合抗体能表达出抗体。
7.2对重组嵌合抗体的结合亲和性检测
包被ROR1-HIS抗原(浓度：1μg/ml，100μl/孔)，进行ELISA检测，结果如图7所示，结果表明，重组嵌合抗体能与RORS-HIS有效结合，重组嵌合抗体与ROR1-HIS抗原的结合亲和性(EC50)结果如表4所示：
表4重组嵌合抗体的结合亲和性
重组嵌合抗体来源 6G3 10F6
EC50(μg/ml) 0.01264 0.001327
ForteBio Octet设备对实施例6制备得到的重组嵌合抗体与ROR1 HIS蛋白的结合动力学和亲和力进行测定，结果如下：
表5重组嵌合抗体的结合动力学
样品名称 KD(M) ka(1/Ms) kdis(1/s)
10F6 1.02E-08 3.95E+04 4.04E-04
6G3 1.08E-08 7.11E+04 7.65E-04
来源于杂交瘤株10F6的单克隆抗体的重组嵌合抗体的亲和力为：1.02*10E-8M；来源于杂交瘤株6G3的单克隆抗体的重组嵌合抗体样品亲和力为：1.08*10E-8M。
在本发明的一些实施方式中，通过利用实施例4的杂交瘤制备得到的抗ROR1mAb及其核酸分子或融合物等，或实施例6的重组嵌合抗体以及包含重组嵌合抗体的载体用于表达ROR1的癌细胞的检测，或用于制备治疗ROR1活性的病症的药物，及其相应的可药用载体。例如，ROR1阳性造血系统恶性肿瘤，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，或ROR1阳性实体瘤，肺癌和乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)等。
在一些其他的实施方式中，可将本发明的抗ROR1mAb或其片段用于试剂盒以用于对ROR1的检测和识别。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 思格（苏州）生物科技有限公司
<120> 单克隆抗体、其衍生物及它们的应用
<130> 202112序列表
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ile Asn Arg Gly Val Thr Thr
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ala Arg Tyr Asp Gly Asn Tyr Glu Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Arg Ala Asn
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Cys Ala
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ala Arg Glu Ala Ile Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Leu Val Ser
1
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr
1 5
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Arg Gly Val Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asp Gly Asn Tyr Glu Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Phe Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Ile Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Cys
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Ile Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 1812
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
caagaaacag agctgtcagt cagtgctgaa ttagtgccta cctcatcatg gaacatctca 60
agtgaactca acaaagattc ttacctgacc cttgatgaac caatgaataa catcaccacg 120
tctctgggcc agacagcaga actgcactgc aaagtctctg ggaatccacc tcccaccatc 180
cgctggttca aaaatgatgc tcctgtggtc caggagcccc ggaggctctc ctttcggtcc 240
accatctatg gctctcggct gcggattaga aacctcgaca ccacagacac aggctacttc 300
cagtgcgtgg caacaaacgg caaggaggtg gtttcttcca ctggagtctt gtttgtcaag 360
tttggccccc ctcccactgc aagtccagga tactcagatg agtatgaaga agatggattc 420
tgtcagccat acagagggat tgcatgtgca agatttattg gcaaccgcac cgtctatatg 480
gagtctttgc acatgcaagg ggaaatagaa aatcagatca cagctgcctt cactatgatt 540
ggcacttcca gtcacttatc tgataagtgt tctcagttcg ccattccttc cctgtgccac 600
tatgccttcc cgtactgcga tgaaacttca tccgtcccaa agccccgtga cttgtgtcgc 660
gatgaatgtg aaatcctgga gaatgtcctg tgtcaaacag agtacatttt tgcaagatca 720
aatcccatga ttctgatgag gctgaaactg ccaaactgtg aagatctccc ccagccagag 780
agcccagaag ctgcgaactg tatccggatt ggaattccca tggcagatcc tataaataaa 840
aatcacaagt gttataacag cacaggtgtg gactaccggg ggaccgtcag tgtgaccaaa 900
tcagggcgcc agtgccagcc atggaattcc cagtatcccc acacacacac tttcaccgcc 960
cttcgtttcc cagagctgaa tggaggccat tcctactgcc gcaacccagg gaatcaaaag 1020
gaagctccct ggtgcttcac cttggatgaa aactttaagt ctgatctgtg tgacatccca 1080
gcttgcgatt caaaggattc caaggagaag aataaaatgg aaatcctgta cgacaaaact 1140
cacacatgcc caccgtgccc agcaccggaa ctcctgggcg gaccgtcagt cttcctcttc 1200
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 1260
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1320
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1380
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1440
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1500
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1560
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1620
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc 1680
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1740
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1800
tctccgggta aa 1812
<210> 18
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Gln Glu Thr Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser
1 5 10 15
Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp
20 25 30
Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu
35 40 45
His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys
50 55 60
Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp
85 90 95
Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser
100 105 110
Ser Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser
115 120 125
Pro Gly Tyr Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr
130 135 140
Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met
145 150 155 160
Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala
165 170 175
Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln
180 185 190
Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu
195 200 205
Thr Ser Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu
210 215 220
Ile Leu Glu Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser
225 230 235 240
Asn Pro Met Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu
245 250 255
Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile
260 265 270
Pro Met Ala Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr
275 280 285
Gly Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln
290 295 300
Cys Gln Pro Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala
305 310 315 320
Leu Arg Phe Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro
325 330 335
Gly Asn Gln Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe
340 345 350
Lys Ser Asp Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys
355 360 365
Glu Lys Asn Lys Met Glu Ile Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
370 375 380
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
385 390 395 400
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
405 410 415
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
420 425 430
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
435 440 445
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
450 455 460
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
465 470 475 480
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
485 490 495
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
500 505 510
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
515 520 525
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
530 535 540
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
545 550 555 560
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
565 570 575
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
580 585 590
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
595 600
<210> 19
<211> 1155
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
caagaaacag agctgtcagt cagtgctgaa ttagtgccta cctcatcatg gaacatctca 60
agtgaactca acaaagattc ttacctgacc cttgatgaac caatgaataa catcaccacg 120
tctctgggcc agacagcaga actgcactgc aaagtctctg ggaatccacc tcccaccatc 180
cgctggttca aaaatgatgc tcctgtggtc caggagcccc ggaggctctc ctttcggtcc 240
accatctatg gctctcggct gcggattaga aacctcgaca ccacagacac aggctacttc 300
cagtgcgtgg caacaaacgg caaggaggtg gtttcttcca ctggagtctt gtttgtcaag 360
tttggccccc ctcccactgc aagtccagga tactcagatg agtatgaaga agatggattc 420
tgtcagccat acagagggat tgcatgtgca agatttattg gcaaccgcac cgtctatatg 480
gagtctttgc acatgcaagg ggaaatagaa aatcagatca cagctgcctt cactatgatt 540
ggcacttcca gtcacttatc tgataagtgt tctcagttcg ccattccttc cctgtgccac 600
tatgccttcc cgtactgcga tgaaacttca tccgtcccaa agccccgtga cttgtgtcgc 660
gatgaatgtg aaatcctgga gaatgtcctg tgtcaaacag agtacatttt tgcaagatca 720
aatcccatga ttctgatgag gctgaaactg ccaaactgtg aagatctccc ccagccagag 780
agcccagaag ctgcgaactg tatccggatt ggaattccca tggcagatcc tataaataaa 840
aatcacaagt gttataacag cacaggtgtg gactaccggg ggaccgtcag tgtgaccaaa 900
tcagggcgcc agtgccagcc atggaattcc cagtatcccc acacacacac tttcaccgcc 960
cttcgtttcc cagagctgaa tggaggccat tcctactgcc gcaacccagg gaatcaaaag 1020
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gcttgcgatt caaaggattc caaggagaag aataaaatgg aaatcctgta ccatcatcac 1140
caccaccatc atcac 1155
<210> 20
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Gln Glu Thr Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser
1 5 10 15
Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp
20 25 30
Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu
35 40 45
His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys
50 55 60
Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp
85 90 95
Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser
100 105 110
Ser Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser
115 120 125
Pro Gly Tyr Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr
130 135 140
Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met
145 150 155 160
Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala
165 170 175
Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln
180 185 190
Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu
195 200 205
Thr Ser Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu
210 215 220
Ile Leu Glu Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser
225 230 235 240
Asn Pro Met Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu
245 250 255
Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile
260 265 270
Pro Met Ala Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr
275 280 285
Gly Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln
290 295 300
Cys Gln Pro Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala
305 310 315 320
Leu Arg Phe Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro
325 330 335
Gly Asn Gln Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe
340 345 350
Lys Ser Asp Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys
355 360 365
Glu Lys Asn Lys Met Glu Ile Leu Tyr His His His His His His His
370 375 380
His
385
<210> 21
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gaggtgaagc tggtggagtc agggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcct tgtcctgggt tcgccagact 120
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attaatcgtg gtgttaccac ctactatcca 180
gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtacctg 240
caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag atatgatggt 300
aactacgaag gtatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354
<210> 22
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gatatcaaga tgacccaatc tccatcttcc atgtttgcat ctctaggaga gagagtcact 60
atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tgatagatgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240
gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 23
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gaggtgaagc tgcaggagtc aggacctagc ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatgtgcca tgcactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggaggt ataaatccta acaatggtgg tactacctac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggacctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagagaggcc 300
atctactatg attacgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 24
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gatgtcgtga tgacccaaac tccactcact ttgtcggtta cccttggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggggtt tattattgct ggcaaggtac acattttcct 300
gggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

Claims (10)

1.一种单克隆抗体，其包含：
(i)第一重链可变结构域，所述第一重链可变结构域包含如SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，
VHCDR1包含序列GFTFSSYA(SEQ ID NO:1)；
VHCDR2包含序列INRGVTT(SEQ ID NO:2)；
VHCDR3包含序列ARYDGNYEGMDY(SEQ ID NO:3)；
(ii)第一轻链可变结构域，所述第一轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中：
VLCDR1包含序列QDINSY(SEQ ID NO:4)；
VLCDR2包含序列RAN(SEQ ID NO:5)；
VLCDR3包含序列LQYDEFPYT(SEQ ID NO:6)，其中，CDR是根据Kabat编号定义的。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域分别包含如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所列的氨基酸序列。
3.一种单克隆抗体，其包含：
(i)第二重链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO:7-9所示的重链互补决定区VHCDR4、VHCDR5和VHCDR6，其中：
VHCDR4包含序列GYTFTECA(SEQ ID NO:7)；
VHCDR5包含序列INPNNGGT(SEQ ID NO:8)；
VHCDR6包含序列AREAIYYDYAMDY(SEQ ID NO:9)；
(ii)第二轻链可变结构域，所述第二轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:7-9所示的轻链互补决定区VHCDR4、VHCDR5和VHCDR6，其中：
VLCDR4包含序列QSLLDSDGKTY(SEQ ID NO:10)；
VLCDR5包含序列LVS(SEQ ID NO:11)；
VLCDR6包含序列WQGTHFPGT(SEQ ID NO:12)，其中，CDR是根据Kabat编号定义的。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域分别包含如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所列的氨基酸序列。
5.编码如权利要求1-2中任一项或3-4中任一项所述的单克隆抗体的分离的核酸分子。
6.含有如权利要求5所述的核酸分子的载体。
7.一种包含权利要求1-2中任一项或3-4中任一项的分离的抗体的融合物或缀合物。
8.一种组合物，其包含权利要求1-2中任一项或3-4中任一项的分离的抗体、权利要求5的核酸分子、权利要求6的载体、权利要求7的融合物或缀合物，及其相应的可药用载体。
9.一种检测生物样品中ROR1的方法，包括使生物样品与权利要求1-4任一项的分离的抗体或权利要求7的融合物或缀合物接触。
10.权利要求1-5任一项的抗体或抗原结合片段或权利要求8的组合物在制备用于治疗ROR1活性有害的病症的药物中的用途。
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