JP3447322B2 - マウス細胞表面抗原に対するハムスターモノクローナル抗体 - Google Patents
マウス細胞表面抗原に対するハムスターモノクローナル抗体Info
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- JP3447322B2 JP3447322B2 JP12390593A JP12390593A JP3447322B2 JP 3447322 B2 JP3447322 B2 JP 3447322B2 JP 12390593 A JP12390593 A JP 12390593A JP 12390593 A JP12390593 A JP 12390593A JP 3447322 B2 JP3447322 B2 JP 3447322B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、マウス細胞表面抗原に
対するモノクローナル抗体に関する。
対するモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
【従来技術】哺乳類の細胞の発生の各段階での細胞の死
滅の多くがいわゆるアポトーシスと呼ばれる「計画的な
死」によることが知られており、このアポトーシスと緊
密な関係にある細胞表面の物質（ポリペプチド）が「細
胞表面抗原（ＦasまたはＦas抗原)」である。アポトー
シスは、種々の細胞の交替、死滅に際して観察されてい
る［ウイリーら（Wyllie et al.）Int. Rev. Cytol. 6
8: 251-306(1980)］。これはまた、免疫細胞（胸腺細
胞）の死や腫瘍細胞の死滅の形態であることから、生理
学および医学分野で注目されている。例えば、胸腺にお
いて、Ｆasは、前駆体Ｔ細胞がＴ細胞になる過程での該
前駆体細胞の死滅に関与する可能性が指摘されている
［ワタナベ−フクナガら(Watanabe-Fukunaga,R.） Natu
re 356: 314-317 (1992)
滅の多くがいわゆるアポトーシスと呼ばれる「計画的な
死」によることが知られており、このアポトーシスと緊
密な関係にある細胞表面の物質（ポリペプチド）が「細
胞表面抗原（ＦasまたはＦas抗原)」である。アポトー
シスは、種々の細胞の交替、死滅に際して観察されてい
る［ウイリーら（Wyllie et al.）Int. Rev. Cytol. 6
8: 251-306(1980)］。これはまた、免疫細胞（胸腺細
胞）の死や腫瘍細胞の死滅の形態であることから、生理
学および医学分野で注目されている。例えば、胸腺にお
いて、Ｆasは、前駆体Ｔ細胞がＴ細胞になる過程での該
前駆体細胞の死滅に関与する可能性が指摘されている
［ワタナベ−フクナガら(Watanabe-Fukunaga,R.） Natu
re 356: 314-317 (1992)
【０００３】また、ＴＮＦとＦas抗原とはダウンレギュ
レーションの関係にあり、ＴＮＦの細胞毒性作用の発現
にＦas抗原が加担していることが推測されている。とこ
ろで、細胞表面のＴＮＦレセプター（Ｉ型およびII
型）、神経成長因子（ＮＧＦ）レセプター、Ｂ細胞抗原
ＣＤ４０およびＴ細胞抗原ＯＸ４０等は、すべて生理学
的に重要な細胞表面膜タンパク質群を構成しておりＮＧ
ＦＲ／ＴＮＦＲファミリーと称される。Ｆａｓ抗原もこ
のファミリーに属している。［イトウら（Itoh, N., Ce
ll 66:233-243 (1991); ワタナベ−フクナガら(Watanab
e-Fukunaga,R., J.Immunol. 148: 1274-1279 (199
2)］。
レーションの関係にあり、ＴＮＦの細胞毒性作用の発現
にＦas抗原が加担していることが推測されている。とこ
ろで、細胞表面のＴＮＦレセプター（Ｉ型およびII
型）、神経成長因子（ＮＧＦ）レセプター、Ｂ細胞抗原
ＣＤ４０およびＴ細胞抗原ＯＸ４０等は、すべて生理学
的に重要な細胞表面膜タンパク質群を構成しておりＮＧ
ＦＲ／ＴＮＦＲファミリーと称される。Ｆａｓ抗原もこ
のファミリーに属している。［イトウら（Itoh, N., Ce
ll 66:233-243 (1991); ワタナベ−フクナガら(Watanab
e-Fukunaga,R., J.Immunol. 148: 1274-1279 (199
2)］。
【０００４】さらに本発明者らは先の研究でマウスのリ
ンパ増殖性突然変異（lpr）をコードする構造遺伝子
は、Ｆａｓ抗原遺伝子であることを示した［ワタナベ−
フクナガ（Watanabe-Fukunaga,R) Nature 356:314-317
(1982)］。また、悪性Ｂ−細胞およびＴ−細胞系で高度
に発現されているＡＰＯ−１抗原がＦas抗原と同定され
た［オームら(Oehm,A., J.Biol.Chem. 267: 10709-1071
5 (1992)］。
ンパ増殖性突然変異（lpr）をコードする構造遺伝子
は、Ｆａｓ抗原遺伝子であることを示した［ワタナベ−
フクナガ（Watanabe-Fukunaga,R) Nature 356:314-317
(1982)］。また、悪性Ｂ−細胞およびＴ−細胞系で高度
に発現されているＡＰＯ−１抗原がＦas抗原と同定され
た［オームら(Oehm,A., J.Biol.Chem. 267: 10709-1071
5 (1992)］。
【０００５】一方、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感
染細胞が抗Ｆasモノクローナル抗体の細胞死滅作用に対
して高い感受性を有していること、並びにインターフェ
ロン−γ（ＩＮＦ−γ）で処理されたヒト結腸がんＨＴ
−２９細胞には細胞表面Ｆas抗原が誘導され、該腫瘍細
胞の抗Ｆas抗体の細胞毒性作用に対する感受性が高めら
れることが示されている。これらの研究結果はＦas抗原
に特異的なモノクローナル抗体の、ＨＩＶ感染症治療お
よび結腸がん治療における有用性を強く示唆するもので
ある。
染細胞が抗Ｆasモノクローナル抗体の細胞死滅作用に対
して高い感受性を有していること、並びにインターフェ
ロン−γ（ＩＮＦ−γ）で処理されたヒト結腸がんＨＴ
−２９細胞には細胞表面Ｆas抗原が誘導され、該腫瘍細
胞の抗Ｆas抗体の細胞毒性作用に対する感受性が高めら
れることが示されている。これらの研究結果はＦas抗原
に特異的なモノクローナル抗体の、ＨＩＶ感染症治療お
よび結腸がん治療における有用性を強く示唆するもので
ある。
【０００６】上記のことから、Ｆas抗原に特異的な抗体
を用いてＦas抗原を発現する細胞を特異的にアポトーシ
スにより死滅させることが可能であり、その臨床面での
有用性が予測される。これに関連し、Ｆas抗原に対する
作動性抗体（agonistic antibody)を、ＥＢ−ウイルス
誘発性リンパ増殖性病巣［ファークら（Falk,M.H.) Blo
od 79: 3300-3306 (1992)］、ＨＴＬＶ−１関連悪性疾
患［デバチンら(Debatin,K-M.) Lancet 335: 497-500
(1990)］またはエイズ患者［コバヤシら(Kobayashi,N.)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 9620ー9624 (1990)］に
投与することが提案された。
を用いてＦas抗原を発現する細胞を特異的にアポトーシ
スにより死滅させることが可能であり、その臨床面での
有用性が予測される。これに関連し、Ｆas抗原に対する
作動性抗体（agonistic antibody)を、ＥＢ−ウイルス
誘発性リンパ増殖性病巣［ファークら（Falk,M.H.) Blo
od 79: 3300-3306 (1992)］、ＨＴＬＶ−１関連悪性疾
患［デバチンら(Debatin,K-M.) Lancet 335: 497-500
(1990)］またはエイズ患者［コバヤシら(Kobayashi,N.)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 9620ー9624 (1990)］に
投与することが提案された。
【０００７】しかしながら、安全で有効な治療を達成す
るには、臨床適用の前にマウスなどを用いた十分な動物
実験を重ねる必要がある。既に、ヒトＦas抗原に対する
マウスモノクローナル抗体は得られているが、それは、
ヒトＦas抗原を発現している細胞に対してのみ溶解作用
を示し、マウスFas抗原を発現している細胞には作用し
ないことが分かっている［ヨネハラら、J. Exp. Med. 1
69: 1747-1756(1989)]。従って、上記の目的を達成する
には、マウスＦas抗原に対するハムスターモノクローナ
ル抗体を得る必要がある。
るには、臨床適用の前にマウスなどを用いた十分な動物
実験を重ねる必要がある。既に、ヒトＦas抗原に対する
マウスモノクローナル抗体は得られているが、それは、
ヒトＦas抗原を発現している細胞に対してのみ溶解作用
を示し、マウスFas抗原を発現している細胞には作用し
ないことが分かっている［ヨネハラら、J. Exp. Med. 1
69: 1747-1756(1989)]。従って、上記の目的を達成する
には、マウスＦas抗原に対するハムスターモノクローナ
ル抗体を得る必要がある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、マウスＦ
as抗原に特異的なハムスターモノクローナル抗体を供給
することを目的として研究を重ね、マウスＦas抗原と特
異的に反応するモノクローナル抗体の開発に成功した。
以下、本明細書中、単に抗Ｆas抗体というときは、本発
明のマウス細胞表面抗原に特異的なハムスターモノクロ
ーナル抗体を指すものとする。本発明のモノクローナル
抗体はマウスミエローマ細胞とマウス細胞表面抗原を発
現するＷ４形質転換細胞で免疫された哺乳類の脾臓細胞
とを融合させ、目的の抗体を生産する融合細胞をクロー
ン化することにより得られるハイブリドーマＪｏ２を培
養することにより製造される。
as抗原に特異的なハムスターモノクローナル抗体を供給
することを目的として研究を重ね、マウスＦas抗原と特
異的に反応するモノクローナル抗体の開発に成功した。
以下、本明細書中、単に抗Ｆas抗体というときは、本発
明のマウス細胞表面抗原に特異的なハムスターモノクロ
ーナル抗体を指すものとする。本発明のモノクローナル
抗体はマウスミエローマ細胞とマウス細胞表面抗原を発
現するＷ４形質転換細胞で免疫された哺乳類の脾臓細胞
とを融合させ、目的の抗体を生産する融合細胞をクロー
ン化することにより得られるハイブリドーマＪｏ２を培
養することにより製造される。
【０００９】本発明の抗Ｆas抗体は以下の特性を有す
る。 （１）マウス細胞表面抗原を発現する形質転換細胞に対
して用量依存性の細胞溶解作用を示すが、マウス細胞表
面抗原を発現しない細胞には細胞溶解作用を示さず、
（２）マウス胸腺細胞のサブセットの内ＣＤ４+ＣＤ
８+、ＣＤ４+ＣＤ８-およびＣＤ４-ＣＤ８+を免疫化学
的に認識するがＣＤ４-ＣＤ８-を認識せず、（３）マウ
スに腹腔内投与した時、正常なマウスの胸腺および肝臓
の細胞の細胞表面抗原を免疫化学的に認識し、アポトー
シスに基づく肝細胞の死をもたらし、数時間以内にマウ
スを死に至らしめるが、細胞表面抗原を発現しないＭＲ
Ｌ−lpr／lprマウスに腹腔内投与した時には、そのよう
な細胞死および個体死をもたらさない。
る。 （１）マウス細胞表面抗原を発現する形質転換細胞に対
して用量依存性の細胞溶解作用を示すが、マウス細胞表
面抗原を発現しない細胞には細胞溶解作用を示さず、
（２）マウス胸腺細胞のサブセットの内ＣＤ４+ＣＤ
８+、ＣＤ４+ＣＤ８-およびＣＤ４-ＣＤ８+を免疫化学
的に認識するがＣＤ４-ＣＤ８-を認識せず、（３）マウ
スに腹腔内投与した時、正常なマウスの胸腺および肝臓
の細胞の細胞表面抗原を免疫化学的に認識し、アポトー
シスに基づく肝細胞の死をもたらし、数時間以内にマウ
スを死に至らしめるが、細胞表面抗原を発現しないＭＲ
Ｌ−lpr／lprマウスに腹腔内投与した時には、そのよう
な細胞死および個体死をもたらさない。
【００１０】本発明のモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマはＦＥＲＭ Ｐ−１３６３５の下で茨城県
筑波市の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されているハイブリドーマＪｏ２を培養すること
により得られる。
イブリドーマはＦＥＲＭ Ｐ−１３６３５の下で茨城県
筑波市の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されているハイブリドーマＪｏ２を培養すること
により得られる。
【００１１】本発明のハイブリドーマは、免疫原として
マウスＦas抗原を発現するＷ４形質転換細胞で免疫化し
た哺乳類（ホスト）から得た抗体産生細胞とミエローマ
細胞とを常法に従って融合させ、目的のモノクローナル
抗体を産生するハイブリッド融合細胞をクローン化する
ことにより得られる。Ｗ４細胞は、ＷＲ１９Ｌ細胞（Ａ
ＴＣＣ，ＴＩＢ５２）を、マウスＦas抗原ｃＤＮＡ［ワ
タナベ-フクナガ(Watanabe-Fukunaga, R., J.Immunol.1
48, 1274-1279(1992)］を保持するｐＥＦ−ＢＯＳ発現
ベクター［ミズシマとナガタ(Mizushima and Nagata),
Nucleic.Acids Res. 18, 5322(1990)］で形質転換して
得られる。
マウスＦas抗原を発現するＷ４形質転換細胞で免疫化し
た哺乳類（ホスト）から得た抗体産生細胞とミエローマ
細胞とを常法に従って融合させ、目的のモノクローナル
抗体を産生するハイブリッド融合細胞をクローン化する
ことにより得られる。Ｗ４細胞は、ＷＲ１９Ｌ細胞（Ａ
ＴＣＣ，ＴＩＢ５２）を、マウスＦas抗原ｃＤＮＡ［ワ
タナベ-フクナガ(Watanabe-Fukunaga, R., J.Immunol.1
48, 1274-1279(1992)］を保持するｐＥＦ−ＢＯＳ発現
ベクター［ミズシマとナガタ(Mizushima and Nagata),
Nucleic.Acids Res. 18, 5322(1990)］で形質転換して
得られる。
【００１２】免疫動物（ホスト）としてはハムスター、
ラットなどの哺乳類が使用可能である。ホスト動物を免
疫するには、免疫原であるＷ４細胞の懸濁液（好ましく
は２０００rad照射処理したもの）を動物の皮下あるい
は腹腔内に注射する。接種量は動物、目的とする免疫化
の程度によって異なるが、通常、１回あたり１０6〜１
０7細胞／動物で、１〜２週間ごとに数回、好ましくは
１週間ごとに６回行う。最終感作の１〜５日後に脾臓を
摘出し、抗体産生細胞として用いる。抗体産生細胞と融
合させる骨髄腫細胞も当業者に既知であり、マウス、ラ
ット、ヒトなどに由来するものを用いることができる。
そのようなミエローマ細胞は市販されており、例えばＰ
３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ.１がある。
ラットなどの哺乳類が使用可能である。ホスト動物を免
疫するには、免疫原であるＷ４細胞の懸濁液（好ましく
は２０００rad照射処理したもの）を動物の皮下あるい
は腹腔内に注射する。接種量は動物、目的とする免疫化
の程度によって異なるが、通常、１回あたり１０6〜１
０7細胞／動物で、１〜２週間ごとに数回、好ましくは
１週間ごとに６回行う。最終感作の１〜５日後に脾臓を
摘出し、抗体産生細胞として用いる。抗体産生細胞と融
合させる骨髄腫細胞も当業者に既知であり、マウス、ラ
ット、ヒトなどに由来するものを用いることができる。
そのようなミエローマ細胞は市販されており、例えばＰ
３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ.１がある。
【００１３】細胞融合は文献記載の周知の方法［サンチ
ェ−マドリードら（Sanchez-Madrid,F.） J. Immunol.
130: 309-312 (1983)；ヒラタら（Hirata,Y),J.Immuno
l. 143: 2900-2906 (1989)等］に従って行うことができ
る。通常、融合促進剤として５０％ポリエチレングリコ
ールを含有するＲＰＭＩ １６４０等の培地で融合さ
せ、細胞融合によって得られた細胞を選択し、クローニ
ングし、目的のハイブリドーマを得る。通常、細胞をＨ
ＡＴ等の選択培地を含むマイクロタイタープレート内で
培養し、適宜選択培地を交換して培養を続け、骨髄腫細
胞を死滅させる。ハイブリドーマが成育したウエルの上
清における抗体の存在をスクリーニングするには、様々
な方法が使用可能であるが、本明細書の実施例では、マ
ウスＦas抗原を発現するＪ６細胞の細胞表面のマウスＦ
as抗原との結合活性をＦＡＣＳ（Fluorescent Activate
d Cell Sorter)分析法で調べて該スクリーニングを行っ
ている。しかし、これに限定されるものではない。最後
に抗体産生の認められたウエルの細胞を限界希釈法等で
クローニングを行い、目的のモノクローナル抗体を生産
する安定なハイブリドーマを得る。このハイブリドーマ
によるモノクローナル抗体の製造は、当業者既知のイン
ビトロまたはインビボの方法で行うことができる。
ェ−マドリードら（Sanchez-Madrid,F.） J. Immunol.
130: 309-312 (1983)；ヒラタら（Hirata,Y),J.Immuno
l. 143: 2900-2906 (1989)等］に従って行うことができ
る。通常、融合促進剤として５０％ポリエチレングリコ
ールを含有するＲＰＭＩ １６４０等の培地で融合さ
せ、細胞融合によって得られた細胞を選択し、クローニ
ングし、目的のハイブリドーマを得る。通常、細胞をＨ
ＡＴ等の選択培地を含むマイクロタイタープレート内で
培養し、適宜選択培地を交換して培養を続け、骨髄腫細
胞を死滅させる。ハイブリドーマが成育したウエルの上
清における抗体の存在をスクリーニングするには、様々
な方法が使用可能であるが、本明細書の実施例では、マ
ウスＦas抗原を発現するＪ６細胞の細胞表面のマウスＦ
as抗原との結合活性をＦＡＣＳ（Fluorescent Activate
d Cell Sorter)分析法で調べて該スクリーニングを行っ
ている。しかし、これに限定されるものではない。最後
に抗体産生の認められたウエルの細胞を限界希釈法等で
クローニングを行い、目的のモノクローナル抗体を生産
する安定なハイブリドーマを得る。このハイブリドーマ
によるモノクローナル抗体の製造は、当業者既知のイン
ビトロまたはインビボの方法で行うことができる。
【００１４】例えば、血清不含培地（ＡＬＭ−Ｖ培地、
Gibco)などの適当な培地で培養し、その上清から精製マ
ウス抗Ｆas抗体を得ることができる。精製は、例えば、
培養培地または腹水に硫安を加えて分画し、プロテイン
Ａ−アガロース（Pharmacia)を用いた、アフィニティー
クロマトグラフィー等を用いて行う。
Gibco)などの適当な培地で培養し、その上清から精製マ
ウス抗Ｆas抗体を得ることができる。精製は、例えば、
培養培地または腹水に硫安を加えて分画し、プロテイン
Ａ−アガロース（Pharmacia)を用いた、アフィニティー
クロマトグラフィー等を用いて行う。
【００１５】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。実施例１ マウスＦas抗原に対するハムスターモノクロ
ーナル抗体の製造 １. 材料 免疫動物（ホスト）:８週令雌性アルメニア（Armenia
n）ハムスター（日本クレア） 骨髄腫細胞：Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ １ 免疫原:Ｗ４細胞 免疫原である、マウスＦａｓ抗原を発現する形質転換体
（Ｗ４）の調製は以下の方法で行う。
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。実施例１ マウスＦas抗原に対するハムスターモノクロ
ーナル抗体の製造 １. 材料 免疫動物（ホスト）:８週令雌性アルメニア（Armenia
n）ハムスター（日本クレア） 骨髄腫細胞：Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ １ 免疫原:Ｗ４細胞 免疫原である、マウスＦａｓ抗原を発現する形質転換体
（Ｗ４）の調製は以下の方法で行う。
【００１６】１）発現ベクターｐＥＦＭＦ１の構築
２μｇのプラスミドｐＭＦ１［ワタナベ−フクナガら，
（Watanabe-Fukunaga,R. J.Immunol. 148, 1274-1279(1
992)］からＦａｓｃＤＮＡを含有する１．５kbＸｈｏＩ
断片を調製し、それを哺乳類発現プラスミドｐＥＦ−Ｂ
ＯＳ［ミズシマ（Mizusima)およびナガタ(Nagata) Nucl
eic Acids Res. 18: 5322 (1990)]のＢｓｔＸＩサイト
にＢｓｔＸＩアダプターを用いて導入し、ヒトペプチド
鎖延長因子１α遺伝子のプロモーターのコントロール下
にＦａｓをコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクター
ｐＥＦＭＦ１を構築した。
（Watanabe-Fukunaga,R. J.Immunol. 148, 1274-1279(1
992)］からＦａｓｃＤＮＡを含有する１．５kbＸｈｏＩ
断片を調製し、それを哺乳類発現プラスミドｐＥＦ−Ｂ
ＯＳ［ミズシマ（Mizusima)およびナガタ(Nagata) Nucl
eic Acids Res. 18: 5322 (1990)]のＢｓｔＸＩサイト
にＢｓｔＸＩアダプターを用いて導入し、ヒトペプチド
鎖延長因子１α遺伝子のプロモーターのコントロール下
にＦａｓをコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクター
ｐＥＦＭＦ１を構築した。
【００１７】２）形質転換
マウスＴ−細胞リンパ腫ＷＲ１９Ｌ細胞の形質転換は以
下の方法で行った。１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０
培地で増殖させたＷＲ１９Ｌ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ５
２）［キネブチ（T. Kinebuchi) Tokyo Institute for
Immunopharmacology, Inc. より供与］１×１０7個
（０．８ｍｌ中）を、ネオマイシン耐性付与遺伝子を含
有するｐＳＴｎｅｏＢ（０．２μｇ）およびＡｐａＬＩ
消化ｐＥＦＭＦ１（２５μｇ／ｍｌ）で、電気穿孔法
［ポッターら（Potter et al.) Proc. Natl.Acad. Sci.
USA 81: 7161-7165(1984)］により同時形質転換した。
[２９０ボルト、キャパシタンス：９５０μ Ｆ；Gene
Pulser(Bio-Rad)]。 細胞を９６ウエルのマイクロタイタ
ープレートを用い増殖培地（０．１ｍｌ／ウエル）で２
日間培養し、最終濃度９００μｇ／ｍｌでＧ−４１８を
含有する培地でネオマイシン耐性クローンを選択した。
９日後、個々のＧ−４１８耐性形質転換体におけるＦａ
ｓ抗原の発現をウサギ抗マウスＦａｓポリクロナール抗
体（後述）を用いてサイトフルオロメーターで分析し、
Ｆａｓ陽性細胞株（Ｗ４）を限界希釈法でクローン化し
た。
下の方法で行った。１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０
培地で増殖させたＷＲ１９Ｌ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ５
２）［キネブチ（T. Kinebuchi) Tokyo Institute for
Immunopharmacology, Inc. より供与］１×１０7個
（０．８ｍｌ中）を、ネオマイシン耐性付与遺伝子を含
有するｐＳＴｎｅｏＢ（０．２μｇ）およびＡｐａＬＩ
消化ｐＥＦＭＦ１（２５μｇ／ｍｌ）で、電気穿孔法
［ポッターら（Potter et al.) Proc. Natl.Acad. Sci.
USA 81: 7161-7165(1984)］により同時形質転換した。
[２９０ボルト、キャパシタンス：９５０μ Ｆ；Gene
Pulser(Bio-Rad)]。 細胞を９６ウエルのマイクロタイタ
ープレートを用い増殖培地（０．１ｍｌ／ウエル）で２
日間培養し、最終濃度９００μｇ／ｍｌでＧ−４１８を
含有する培地でネオマイシン耐性クローンを選択した。
９日後、個々のＧ−４１８耐性形質転換体におけるＦａ
ｓ抗原の発現をウサギ抗マウスＦａｓポリクロナール抗
体（後述）を用いてサイトフルオロメーターで分析し、
Ｆａｓ陽性細胞株（Ｗ４）を限界希釈法でクローン化し
た。
【００１８】２．検出
マウスＦas抗原を高発現するＪurkat形質転換細胞(Ｊ６
細胞）を用いて行う。ヒトＴ−細胞リンパ腫 Jurkat細
胞の形質転換は以下の方法で行った。１０％ＦＣＳ含有
ＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させたＪｕｒｋａｔ細胞
（ＡＴＣＣ ＴＩＢ１５２） １×１０7個（０．８ｍｌ
中）を、ネオマイシン耐性付与遺伝子を含有するｐＳＴ
ｎｅｏＢ（０．２μｇ）およびＡｐａＬＩ消化ｐＥＦＭ
Ｆ１（２５μｇ／ｍｌ）で、電気穿孔法［ポッターら
（Potter et al.) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 81: 716
1-7165(1984)］により同時形質転換した。２９０ボル
ト、キャパシタンス：９５０μ Ｆ；Gene Pulser(Bio-
Rad)。 細胞を９６ウエルのマイクロタイタープレート
を用い、増殖培地（０．１ｍｌ／ウエル）で２日間培養
し、最終濃度９００μｇ／ｍｌでＧ−４１８を含有する
培地でネオマイシン耐性クローンを選択した。９日後、
個々のＧ−４１８耐性形質転換体におけるＦａｓ抗原の
発現をウサギ抗マウスＦａｓポリクロナール抗体（後
述）を用いてサイトフルオロメーターで分析し、Ｆａｓ
陽性細胞株（Ｊ６）を限界希釈法でクローン化した。
細胞）を用いて行う。ヒトＴ−細胞リンパ腫 Jurkat細
胞の形質転換は以下の方法で行った。１０％ＦＣＳ含有
ＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させたＪｕｒｋａｔ細胞
（ＡＴＣＣ ＴＩＢ１５２） １×１０7個（０．８ｍｌ
中）を、ネオマイシン耐性付与遺伝子を含有するｐＳＴ
ｎｅｏＢ（０．２μｇ）およびＡｐａＬＩ消化ｐＥＦＭ
Ｆ１（２５μｇ／ｍｌ）で、電気穿孔法［ポッターら
（Potter et al.) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 81: 716
1-7165(1984)］により同時形質転換した。２９０ボル
ト、キャパシタンス：９５０μ Ｆ；Gene Pulser(Bio-
Rad)。 細胞を９６ウエルのマイクロタイタープレート
を用い、増殖培地（０．１ｍｌ／ウエル）で２日間培養
し、最終濃度９００μｇ／ｍｌでＧ−４１８を含有する
培地でネオマイシン耐性クローンを選択した。９日後、
個々のＧ−４１８耐性形質転換体におけるＦａｓ抗原の
発現をウサギ抗マウスＦａｓポリクロナール抗体（後
述）を用いてサイトフルオロメーターで分析し、Ｆａｓ
陽性細胞株（Ｊ６）を限界希釈法でクローン化した。
【００１９】ウサギ抗マウスＦas抗体（マウスＦas抗原
に対する抗ペプチド抗体）は以下の方法で作成した。Ｎ
−末端に余分のシステイン残基を有するマウスＦas抗原
配列（アミノ酸番号８−２１）［ワタナベ−フクナガら
（J.Immunol. 148, 1274-1279(1992)］を含有するＣ−
末端がアミド形のペプチドを合成した。ｍ−マレイミド
ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｍ
ＢＳ）を用い、ペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）にカップリングさせた。ペプチドの合成およびその
ＢＳＡへの結合はMultiple Peptide Systems Co.,（サ
ンディエゴ）により行った。雌性ニュージランドウサギ
にペプチドを皮下注射した。条件：フロインドの完全ア
ジュバント中ＢＳＡコンジュゲート（０.５mg／注射）
を１４日間隔で２回。さらに、ウサギにペプチド２５μ
gを静注した。条件：ＰＢＳ中ＢＳＡコンジュゲートを
３日間隔で３回。最終注射の３日後にウサギの全血清を
採取し、抗ペプチド抗体（抗−ｍＦＡＳＰ）をペプチド
とコンジュゲートしたＴＳＫゲル上でのアフィニティー
クロマトグラフィーで精製した。簡単に述べると、ＭＢ
Ｓを用いてペプチド（２mg）をＡＦ Amino Toyopearl
650 (東ソー) (充填容量：０.８ml）にカップリング
し、未反応部位を、ゲルを１Ｍ Ｔris−Ｈcl（pＨ８.
５）により洗浄してブロックした。血清（１.５ml）を
カラム（０.５ml）に負荷し、０.００５％Ｔween２０お
よび水で広範囲に洗浄した後、０.１Ｍ グリシンーＨ
Ｃl（ｐＨ２.２）で特異抗体をゲルから溶離した。
に対する抗ペプチド抗体）は以下の方法で作成した。Ｎ
−末端に余分のシステイン残基を有するマウスＦas抗原
配列（アミノ酸番号８−２１）［ワタナベ−フクナガら
（J.Immunol. 148, 1274-1279(1992)］を含有するＣ−
末端がアミド形のペプチドを合成した。ｍ−マレイミド
ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｍ
ＢＳ）を用い、ペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）にカップリングさせた。ペプチドの合成およびその
ＢＳＡへの結合はMultiple Peptide Systems Co.,（サ
ンディエゴ）により行った。雌性ニュージランドウサギ
にペプチドを皮下注射した。条件：フロインドの完全ア
ジュバント中ＢＳＡコンジュゲート（０.５mg／注射）
を１４日間隔で２回。さらに、ウサギにペプチド２５μ
gを静注した。条件：ＰＢＳ中ＢＳＡコンジュゲートを
３日間隔で３回。最終注射の３日後にウサギの全血清を
採取し、抗ペプチド抗体（抗−ｍＦＡＳＰ）をペプチド
とコンジュゲートしたＴＳＫゲル上でのアフィニティー
クロマトグラフィーで精製した。簡単に述べると、ＭＢ
Ｓを用いてペプチド（２mg）をＡＦ Amino Toyopearl
650 (東ソー) (充填容量：０.８ml）にカップリング
し、未反応部位を、ゲルを１Ｍ Ｔris−Ｈcl（pＨ８.
５）により洗浄してブロックした。血清（１.５ml）を
カラム（０.５ml）に負荷し、０.００５％Ｔween２０お
よび水で広範囲に洗浄した後、０.１Ｍ グリシンーＨ
Ｃl（ｐＨ２.２）で特異抗体をゲルから溶離した。
【００２０】３. 方法
８週令雌性アルメニアンハムスターにＷ４細胞（１ｘ１
０7、２８００rads照射処理）を１週間間隔で６回接種
した。最終免疫の３日後にハムスターから脾臓を摘出
し、脾細胞を調製し、１０％のウシ胎児血清を含むダル
ベッコ変法イーグル培地に懸濁して細胞浮遊液を調製し
た。上記の脾細胞浮遊液（６×１０7）とマウス骨髄腫
細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（１．２×１０7）とを５
０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ベー
リンガー）を用いて融合させた。最後に４００ｘｇで５
分間遠心して得られた細胞塊を７個の９６ウエルプレー
トに分注した後、ＨＡＴ培地で培養し、光学顕微鏡でハ
イブリドーマの成長を監視した［サンチェーマドリード
ら（Sanchez-Madrid,F.） J. Immunol. 130:309-312 (1
983)；ヒラタ(Hirata,Y.),J.Immunol. 143: 2900-2906
(1989)］。
０7、２８００rads照射処理）を１週間間隔で６回接種
した。最終免疫の３日後にハムスターから脾臓を摘出
し、脾細胞を調製し、１０％のウシ胎児血清を含むダル
ベッコ変法イーグル培地に懸濁して細胞浮遊液を調製し
た。上記の脾細胞浮遊液（６×１０7）とマウス骨髄腫
細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（１．２×１０7）とを５
０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ベー
リンガー）を用いて融合させた。最後に４００ｘｇで５
分間遠心して得られた細胞塊を７個の９６ウエルプレー
トに分注した後、ＨＡＴ培地で培養し、光学顕微鏡でハ
イブリドーマの成長を監視した［サンチェーマドリード
ら（Sanchez-Madrid,F.） J. Immunol. 130:309-312 (1
983)；ヒラタ(Hirata,Y.),J.Immunol. 143: 2900-2906
(1989)］。
【００２１】培地をＨＴ培地に代えて培養を続け、その
間、培養上清における抗Ｆasモノクローナル抗体の産生
を、Ｊ６細胞表面のマウスＦas抗原との結合活性をＦＡ
ＣＳ分析法で調べることにより、スクリーニングした。
目的の抗マウスＦasモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマＪｏ２を選択し、３ユニット／ｍｌのヒトイ
ンターロイキン６（ＩＬ−６），１０％のウシ胎児血清
を含む、ＲＰＭＩ １６４０培地による制限希釈法で継
代を繰り返してハイブリドーマクローンＪｏ２を確立し
た。このＪｏ２を血清不含培地（ＡＬＭ−Ｖ培地、Gibc
o)で培養すると、培地にモノクローナル抗体が分泌され
た。
間、培養上清における抗Ｆasモノクローナル抗体の産生
を、Ｊ６細胞表面のマウスＦas抗原との結合活性をＦＡ
ＣＳ分析法で調べることにより、スクリーニングした。
目的の抗マウスＦasモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマＪｏ２を選択し、３ユニット／ｍｌのヒトイ
ンターロイキン６（ＩＬ−６），１０％のウシ胎児血清
を含む、ＲＰＭＩ １６４０培地による制限希釈法で継
代を繰り返してハイブリドーマクローンＪｏ２を確立し
た。このＪｏ２を血清不含培地（ＡＬＭ−Ｖ培地、Gibc
o)で培養すると、培地にモノクローナル抗体が分泌され
た。
【００２２】培地に５０％硫酸アンモニウムを加えて沈
澱させ、プロテインＡ−アガロース法（Pharmacia)［ク
リガンら(Cligan,J.E.) Current Protocols in Immunol
ogy,Willey Interscience (1991)］によってハムスター
抗マウスＦasモノクローナル抗体（Ｊｏ２抗体）を精製
した。
澱させ、プロテインＡ−アガロース法（Pharmacia)［ク
リガンら(Cligan,J.E.) Current Protocols in Immunol
ogy,Willey Interscience (1991)］によってハムスター
抗マウスＦasモノクローナル抗体（Ｊｏ２抗体）を精製
した。
【００２３】実験例１ Ｊｏ２抗体とマウス胸腺細胞の
細胞表面抗原との反応 野生型マウス由来の胸腺細胞およびＦas抗原を殆ど発現
しないlprマウス（リンパ増殖変異体）由来の胸腺細胞
と、Ｊｏ２抗体との免疫化学的反応を以下の方法で検討
した。 （１）フローサイトメトリー ３−４週令のマウス（Ｂalb／ｃ、ＭＲＬ−＋／＋およ
びＭＲＬ−lpr/lpr）の胸腺から単一細胞浮遊液を調製
し、１ｘ１０6細胞をＪｏ２抗体、次いでフィコエリス
リン（ＰＥ）−結合ヤギ抗ハムスターＩｇＧ（Ｆ（ab')
2）フラクション，ＣＡＴＡＬＯＧ）により染色した
（図１における斜線部分）。図１の空白部分は、第２抗
体のみで染色された胸腺のＦＡＣＳ像である。図１から
明らかに、野生型マウスの胸腺から得た細胞の殆どがＦ
as抗原陽性であるのに対し、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマ
ウスの胸腺由来の細胞にはＦas抗原が殆ど検出されな
い。
細胞表面抗原との反応 野生型マウス由来の胸腺細胞およびＦas抗原を殆ど発現
しないlprマウス（リンパ増殖変異体）由来の胸腺細胞
と、Ｊｏ２抗体との免疫化学的反応を以下の方法で検討
した。 （１）フローサイトメトリー ３−４週令のマウス（Ｂalb／ｃ、ＭＲＬ−＋／＋およ
びＭＲＬ−lpr/lpr）の胸腺から単一細胞浮遊液を調製
し、１ｘ１０6細胞をＪｏ２抗体、次いでフィコエリス
リン（ＰＥ）−結合ヤギ抗ハムスターＩｇＧ（Ｆ（ab')
2）フラクション，ＣＡＴＡＬＯＧ）により染色した
（図１における斜線部分）。図１の空白部分は、第２抗
体のみで染色された胸腺のＦＡＣＳ像である。図１から
明らかに、野生型マウスの胸腺から得た細胞の殆どがＦ
as抗原陽性であるのに対し、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマ
ウスの胸腺由来の細胞にはＦas抗原が殆ど検出されな
い。
【００２４】（２）３色フローサイトメトリー
Ｂalb／ｃおよびＭＲＬ−lpr/lprマウスの胸腺細胞のサ
ブセット［ＣＤ４+ＣＤ８+（ＤＰ）、ＣＤ４+ＣＤ８
-（ＣＤ４ＳＰ）、ＣＤ４-ＣＤ８+（ＣＤ８ＳＰ）およ
びＣＤ４-ＣＤ８-（ＤＮ）］の細胞各５０００個を用
い、これらサブセットにおけるＦas抗原の発現状態を、
ＦＡＣＳcan（Beckton Dickinson）によるＣＤ４、ＣＤ
８およびＦas抗原に対する３色フローサイトメトリーで
分析した。用いたモノクローナル抗体はビオチン−標識
抗ＣＤ４（ＲＭ−４−５，PharMingen）およびStreptav
idin ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ（ＣＡＴＡＬＯＧ）、蛍光性
イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）−標識抗ＣＤ８／Ｌｙ
ｔ−２（５３−６.７，Beckton Dickinson)、本発明の
Ｊｏ２抗Ｆas抗体およびＰＥ−標識ヤギ抗ハムスターＩ
ｇＧである。結果を図２に示す。左側パネルにＣＤ４お
よびＣＤ８発現のためのマウス胸腺を二次元的に示し
た。 右側パネルには、Ｆas抗原の発現状態を示す。図
２から明らかに、Ｂalb／ｃマウスの胸腺細胞の内、２
重陽性の胸腺細胞サブセット（ＣＤ４+ＣＤ８+）、単一
陽性の胸腺細胞サブセット（ＣＤ４+ＣＤ８-およびＣＤ
４-ＣＤ８+）はＦas抗原を発現しているが、２重陰性の
胸腺細胞サブセット（ＣＤ４-ＣＤ８-）の大多数はＦas
抗原を発現していないことが分かる。他方、ＭＲＬ−lp
r/lprマウスの胸腺細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８抗原の
分布はＢalb／ｃマウスと同様であるが、どの胸腺細胞
サブセットもＦas抗原を発現していない。
ブセット［ＣＤ４+ＣＤ８+（ＤＰ）、ＣＤ４+ＣＤ８
-（ＣＤ４ＳＰ）、ＣＤ４-ＣＤ８+（ＣＤ８ＳＰ）およ
びＣＤ４-ＣＤ８-（ＤＮ）］の細胞各５０００個を用
い、これらサブセットにおけるＦas抗原の発現状態を、
ＦＡＣＳcan（Beckton Dickinson）によるＣＤ４、ＣＤ
８およびＦas抗原に対する３色フローサイトメトリーで
分析した。用いたモノクローナル抗体はビオチン−標識
抗ＣＤ４（ＲＭ−４−５，PharMingen）およびStreptav
idin ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ（ＣＡＴＡＬＯＧ）、蛍光性
イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）−標識抗ＣＤ８／Ｌｙ
ｔ−２（５３−６.７，Beckton Dickinson)、本発明の
Ｊｏ２抗Ｆas抗体およびＰＥ−標識ヤギ抗ハムスターＩ
ｇＧである。結果を図２に示す。左側パネルにＣＤ４お
よびＣＤ８発現のためのマウス胸腺を二次元的に示し
た。 右側パネルには、Ｆas抗原の発現状態を示す。図
２から明らかに、Ｂalb／ｃマウスの胸腺細胞の内、２
重陽性の胸腺細胞サブセット（ＣＤ４+ＣＤ８+）、単一
陽性の胸腺細胞サブセット（ＣＤ４+ＣＤ８-およびＣＤ
４-ＣＤ８+）はＦas抗原を発現しているが、２重陰性の
胸腺細胞サブセット（ＣＤ４-ＣＤ８-）の大多数はＦas
抗原を発現していないことが分かる。他方、ＭＲＬ−lp
r/lprマウスの胸腺細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８抗原の
分布はＢalb／ｃマウスと同様であるが、どの胸腺細胞
サブセットもＦas抗原を発現していない。
【００２５】実験例２ Ｊｏ２抗体のマウス細胞および
個体に対する致死作用 （１）細胞溶解作用 ９６ウエルマイクロタイタープレート上でＦas抗原を発
現するＷ４形質転換細胞（２ｘ１０4）または非形質転
換細胞ＷＲ１９Ｌ細胞（２ｘ１０4）を、種々の濃度
（０.１−１０００ng／ml）のＪｏ２抗体と混合し、３
７℃で１６時間インキュベーションした。次いでウエル
あたり０.５μＣｉ［3Ｈ］チミジン（比活性：７４ＧＢ
ｑ／ｍｍｏｌ）を加え、４時間インキュベーションした
後、収穫した。Ｊｏ２抗体による細胞溶解作用を、Ｊｏ
２抗体不在下での［3Ｈ］チミジンの取り込みに対する
割合（％）で示した。結果を図３に示す。図中、Ｗ４細
胞は（白丸）、ＷＲ１９Ｌ細胞は（黒丸）で表されてい
る。図３から明らかに、Ｊｏ２抗体はＦas抗原を発現す
る形質転換細胞Ｗ４を用量依存的に、１６時間以内に溶
解するが、親細胞ＷＲ１９Ｌには作用しない。これは、
Ｊｏ２抗体がＦas抗原を発現する細胞を認識し、細胞溶
解作用を表すことを示すものである。
個体に対する致死作用 （１）細胞溶解作用 ９６ウエルマイクロタイタープレート上でＦas抗原を発
現するＷ４形質転換細胞（２ｘ１０4）または非形質転
換細胞ＷＲ１９Ｌ細胞（２ｘ１０4）を、種々の濃度
（０.１−１０００ng／ml）のＪｏ２抗体と混合し、３
７℃で１６時間インキュベーションした。次いでウエル
あたり０.５μＣｉ［3Ｈ］チミジン（比活性：７４ＧＢ
ｑ／ｍｍｏｌ）を加え、４時間インキュベーションした
後、収穫した。Ｊｏ２抗体による細胞溶解作用を、Ｊｏ
２抗体不在下での［3Ｈ］チミジンの取り込みに対する
割合（％）で示した。結果を図３に示す。図中、Ｗ４細
胞は（白丸）、ＷＲ１９Ｌ細胞は（黒丸）で表されてい
る。図３から明らかに、Ｊｏ２抗体はＦas抗原を発現す
る形質転換細胞Ｗ４を用量依存的に、１６時間以内に溶
解するが、親細胞ＷＲ１９Ｌには作用しない。これは、
Ｊｏ２抗体がＦas抗原を発現する細胞を認識し、細胞溶
解作用を表すことを示すものである。
【００２６】（２）致死作用
マウスへのＪｏ２抗体の腹腔内投与が及ぼす致死作用を
検討した。結果を図４に示す。即ち、１０匹の３週令の
雌性Ｂalb／ｃマウス（黒丸、白丸、黒三角）およびＭ
ＲＬ−lpr/lprマウス（黒四角）に、ＰＢＳ２００μl中
の、精製Ｊｏ２抗体１００μｇ（黒丸、黒四角）または
１０μｇ（白丸）、あるいは正常なハムスターＩｇＧ
（黒三角）を腹腔内投与し、以後の生死を観察した。図
４から明らかに、Ｊｏ２抗体１００μｇを投与されたＢ
alb／ｃマウスの９０％（９／１０）が投与後３時間以
内に死亡した。１０μｇを投与されたマウスにおいても
８時間以内に５０％（５／１０）が死亡した。他方、ハ
ムスターＩｇＧを投与された対照群のマウスには死亡例
がない。なお、エンドトキシンの致死作用に対して極め
て高い耐性を有するＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスもＪｏ２抗体
によって死亡した（データ示さず）。このことは、Ｆas
抗原に対する抗体の致死作用がエンドトキシンによるも
のでないことを示唆している。
検討した。結果を図４に示す。即ち、１０匹の３週令の
雌性Ｂalb／ｃマウス（黒丸、白丸、黒三角）およびＭ
ＲＬ−lpr/lprマウス（黒四角）に、ＰＢＳ２００μl中
の、精製Ｊｏ２抗体１００μｇ（黒丸、黒四角）または
１０μｇ（白丸）、あるいは正常なハムスターＩｇＧ
（黒三角）を腹腔内投与し、以後の生死を観察した。図
４から明らかに、Ｊｏ２抗体１００μｇを投与されたＢ
alb／ｃマウスの９０％（９／１０）が投与後３時間以
内に死亡した。１０μｇを投与されたマウスにおいても
８時間以内に５０％（５／１０）が死亡した。他方、ハ
ムスターＩｇＧを投与された対照群のマウスには死亡例
がない。なお、エンドトキシンの致死作用に対して極め
て高い耐性を有するＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスもＪｏ２抗体
によって死亡した（データ示さず）。このことは、Ｆas
抗原に対する抗体の致死作用がエンドトキシンによるも
のでないことを示唆している。
【００２７】
（３）血清中の生化学的パラメーターの変化
ＰＢＳ２００μl中の精製Ｊｏ２抗体１００μｇを３週
令の雌性Ｂalb／ｃマウスに腹腔内投与し、様々な時期
に血液試料を採取した。血清の生物学的パラメーターを
標準的な自動臨床分析装置（日立、７１５０型）で検査
した。検査した生物学的パラメーターは以下の通りであ
る。ＧＯＴ：グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナ
ーゼ；ＧＰＴ：グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ；ＡＬＰ：アルカリホスホターゼ；ＡＭＹ：アミラ
ーゼ；ＣＰＫ：クレアチンホスホキナーゼ；ＨＢＤ：α
−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ；ＢＵＮ：血中尿素
窒素；Ｔ−ＢＩＬ：総ビリルビン。結果を表１に示す。
令の雌性Ｂalb／ｃマウスに腹腔内投与し、様々な時期
に血液試料を採取した。血清の生物学的パラメーターを
標準的な自動臨床分析装置（日立、７１５０型）で検査
した。検査した生物学的パラメーターは以下の通りであ
る。ＧＯＴ：グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナ
ーゼ；ＧＰＴ：グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ；ＡＬＰ：アルカリホスホターゼ；ＡＭＹ：アミラ
ーゼ；ＣＰＫ：クレアチンホスホキナーゼ；ＨＢＤ：α
−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ；ＢＵＮ：血中尿素
窒素；Ｔ−ＢＩＬ：総ビリルビン。結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
表１から明らかに、血清中のＧＯＴ、ＧＰＴ、ＨＢＤお
よびＴ−ＢＩＬは抗体の注射から３時間後に劇的に増加
し、基準値の２００、１０００、５０および１０倍に達
したが、ＡＬＰ、ＡＭＹおよびＢＵＮの増加は僅かであ
った。ヘマトクリット値、血球数およびＮａ+、Ｋ+およ
びＣｌ-等のイオン濃度には有意な変化を認めなかっ
た。ハムスターのＩｇＧを投与されたマウスでは同様の
変化を認めなかった。これらの結果は、マウスに投与さ
れたＦas抗体が、肝臓および心臓の細胞を特異的に損傷
することを示唆している。
よびＴ−ＢＩＬは抗体の注射から３時間後に劇的に増加
し、基準値の２００、１０００、５０および１０倍に達
したが、ＡＬＰ、ＡＭＹおよびＢＵＮの増加は僅かであ
った。ヘマトクリット値、血球数およびＮａ+、Ｋ+およ
びＣｌ-等のイオン濃度には有意な変化を認めなかっ
た。ハムスターのＩｇＧを投与されたマウスでは同様の
変化を認めなかった。これらの結果は、マウスに投与さ
れたＦas抗体が、肝臓および心臓の細胞を特異的に損傷
することを示唆している。
【００２９】実験例３ マウス肝臓および胸腺細胞にお
けるＪｏ２誘導アポプトーシス （１）Ｊｏ２抗体のマウス肝細胞に対する作用 ３週令のＢalb／ｃマウスにＪｏ２抗体１００μｇまた
は対照としてハムスターＩｇＧを投与した。２時間後、
死亡したマウスの肝臓を摘出し、厚さ５μmの切片を
得、１０％ホルムアルデヒドで固定化し、ヘマトキシリ
ンおよびエオシンで染色して組織の変化を調べた。結果
を図５に示す。図中、パネルＡおよびＢは対照（ハムス
ターＩｇＧ）、パネルＣおよびＤはＪｏ２抗体１００μ
ｇを投与されて２時間以内に死亡したマウスの肝臓組織
であり、パネルＡおよびＣは１０倍、パネルＢおよびＤ
は４０倍の写真である。図から明らかに、Ｊｏ２抗体を
投与されたマウスの肝臓には多くの病巣出血と壊死が認
められる。この領域には正常な肝細胞は少ししか残って
おらず、大多数の損傷した細胞の特徴は細胞質濃縮と核
濃縮（ピクノーゼ）であり、これら細胞の死がアポトー
シスによることを示唆している。肝細胞に誘導されたア
ポトーシスは、ヒトの激症肝炎の動物モデルとなると考
えられる。このような出血性病巣および細胞壊死領域は
ハムスターのＩｇＧを投与された対照群マウスの肝臓切
片には認められなかった。
けるＪｏ２誘導アポプトーシス （１）Ｊｏ２抗体のマウス肝細胞に対する作用 ３週令のＢalb／ｃマウスにＪｏ２抗体１００μｇまた
は対照としてハムスターＩｇＧを投与した。２時間後、
死亡したマウスの肝臓を摘出し、厚さ５μmの切片を
得、１０％ホルムアルデヒドで固定化し、ヘマトキシリ
ンおよびエオシンで染色して組織の変化を調べた。結果
を図５に示す。図中、パネルＡおよびＢは対照（ハムス
ターＩｇＧ）、パネルＣおよびＤはＪｏ２抗体１００μ
ｇを投与されて２時間以内に死亡したマウスの肝臓組織
であり、パネルＡおよびＣは１０倍、パネルＢおよびＤ
は４０倍の写真である。図から明らかに、Ｊｏ２抗体を
投与されたマウスの肝臓には多くの病巣出血と壊死が認
められる。この領域には正常な肝細胞は少ししか残って
おらず、大多数の損傷した細胞の特徴は細胞質濃縮と核
濃縮（ピクノーゼ）であり、これら細胞の死がアポトー
シスによることを示唆している。肝細胞に誘導されたア
ポトーシスは、ヒトの激症肝炎の動物モデルとなると考
えられる。このような出血性病巣および細胞壊死領域は
ハムスターのＩｇＧを投与された対照群マウスの肝臓切
片には認められなかった。
【００３０】
（２）Ｊｏ２抗体のマウス胸腺細胞に対する作用
Ｂalb／ｃマウスにＪｏ２Ｆas抗体を注射し、少なくと
も５時間生存したマウスから、胸腺ＤＮＡを調製して
０.５μｇ／mlの臭化エチジウムを含有するＴＢＥバッ
ファー中の１％アガロースゲルによる電気泳動にかけ、
分析した。結果を図６に示す。ＤＮＡは、投与前（レー
ン１）、０.５時間後（レーン２）、１時間後（レーン
３）、２時間後（レーン４）、３時間後（レーン５）ま
たは５時間後（レーン６）に調製した。対照として、ハ
ムスターＩｇＧの投与から５時間後のマウスから調製し
た胸腺ＤＮＡを用いた（レーン７）。胸腺組織は、肝臓
組織と異なり、明確な異常を呈していなかったが（デー
タ示さず）、その染色体ＤＮＡは明らかにアポトーシス
に特徴的な分解を示した。即ち、３時間後に得た胸腺Ｄ
ＮＡははしご状に分離するアポトーシスに典型的なフラ
グメンテーション（切断）を示した。ＤＮＡの切断は後
になる程増加し、抗体投与から５時間後には、全染色体
ＤＮＡの８０％以上が分解された。対照マウスでは染色
体ＤＮＡの分解を認めなかった。これらの結果は、Ｆas
抗原を発現する胸腺細胞がインビボで、抗Ｆas抗体によ
り誘導されるアポトーシスの影響を受け易いことを示唆
している。
も５時間生存したマウスから、胸腺ＤＮＡを調製して
０.５μｇ／mlの臭化エチジウムを含有するＴＢＥバッ
ファー中の１％アガロースゲルによる電気泳動にかけ、
分析した。結果を図６に示す。ＤＮＡは、投与前（レー
ン１）、０.５時間後（レーン２）、１時間後（レーン
３）、２時間後（レーン４）、３時間後（レーン５）ま
たは５時間後（レーン６）に調製した。対照として、ハ
ムスターＩｇＧの投与から５時間後のマウスから調製し
た胸腺ＤＮＡを用いた（レーン７）。胸腺組織は、肝臓
組織と異なり、明確な異常を呈していなかったが（デー
タ示さず）、その染色体ＤＮＡは明らかにアポトーシス
に特徴的な分解を示した。即ち、３時間後に得た胸腺Ｄ
ＮＡははしご状に分離するアポトーシスに典型的なフラ
グメンテーション（切断）を示した。ＤＮＡの切断は後
になる程増加し、抗体投与から５時間後には、全染色体
ＤＮＡの８０％以上が分解された。対照マウスでは染色
体ＤＮＡの分解を認めなかった。これらの結果は、Ｆas
抗原を発現する胸腺細胞がインビボで、抗Ｆas抗体によ
り誘導されるアポトーシスの影響を受け易いことを示唆
している。
【００３１】
【発明の効果】本発明のハイブリドーマを培養すること
により得られるマウス細胞表面抗原に特異的なハムスタ
ーモノクローナル抗体Ｊｏ２は、抗Ｆas抗体の臨床適用
を安全かつ効果的に行うための研究開発に大きく貢献す
るのみならず、肝臓、胸腺、心臓等の細胞のアポトーシ
スの研究、並びに激症肝炎等の疾患の動物モデルの開発
に有用である。
により得られるマウス細胞表面抗原に特異的なハムスタ
ーモノクローナル抗体Ｊｏ２は、抗Ｆas抗体の臨床適用
を安全かつ効果的に行うための研究開発に大きく貢献す
るのみならず、肝臓、胸腺、心臓等の細胞のアポトーシ
スの研究、並びに激症肝炎等の疾患の動物モデルの開発
に有用である。
【図１】マウス胸腺から得た細胞におけるＦas抗原の発
現を表すフローサイトメトリーの結果を示すグラフ。
現を表すフローサイトメトリーの結果を示すグラフ。
【図２】マウスの胸腺由来の細胞サブセット［ＣＤ４+
ＣＤ８+（ＤＰ）、ＣＤ４+ＣＤ８-（ＣＤ４ＳＰ）、Ｃ
Ｄ４-ＣＤ８+（ＣＤ８ＳＰ）およびＣＤ４-ＣＤ８-（Ｄ
Ｎ）］におけるＦas抗原の発現を表す３色フローサイト
メトリーの結果を示すグラフ。
ＣＤ８+（ＤＰ）、ＣＤ４+ＣＤ８-（ＣＤ４ＳＰ）、Ｃ
Ｄ４-ＣＤ８+（ＣＤ８ＳＰ）およびＣＤ４-ＣＤ８-（Ｄ
Ｎ）］におけるＦas抗原の発現を表す３色フローサイト
メトリーの結果を示すグラフ。
【図３】Ｆas抗原を発現するＷ４形質転換細胞または非
形質転換細胞ＷＲ１９Ｌ細胞に対するＪｏ２抗体の細胞
溶解作用を、Ｊｏ２抗体不在下での［3Ｈ］チミジンの
取り込みに対する割合（％）で示したグラフ。
形質転換細胞ＷＲ１９Ｌ細胞に対するＪｏ２抗体の細胞
溶解作用を、Ｊｏ２抗体不在下での［3Ｈ］チミジンの
取り込みに対する割合（％）で示したグラフ。
【図４】Ｊｏ２抗体を腹腔内投与されたマウスの生存率
を示すグラフ。
を示すグラフ。
【図５】Ｊｏ２抗体を投与されて死亡したマウスの肝臓
組織の変化を示す写真の模写図。
組織の変化を示す写真の模写図。
【図６】Ｊｏ２抗体を投与されたマウスの胸腺細胞の染
色体ＤＮＡの変化を示すアガロースゲルによる電気泳動
の泳動パターンの模写図。
色体ＤＮＡの変化を示すアガロースゲルによる電気泳動
の泳動パターンの模写図。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（1992）Ｖｏ
ｌ．148，Ｎｏ．４，ｐ．1274−1279
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12P 21/08
C07K 16/28
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 マウスミエローマ細胞とマウス細胞表面
抗原を発現するＷ４形質転換細胞で免疫されたハムスタ
ーの脾臓細胞とを融合させて得られるハイブリドーマに
より産生される、マウス細胞表面抗原に特異的なモノク
ローナル抗体であって、 （１）マウス細胞表面抗原を発現する形質転換細胞に対
して用量依存性の細胞溶解作用を示すが、マウス細胞表
面抗原を発現しない細胞には細胞溶解作用を示さず、 （２）マウス胸腺細胞のサブセットの内ＣＤ４+ＣＤ
８+、ＣＤ４+ＣＤ８-およびＣＤ４-ＣＤ８+を免疫化学
的に認識するがＣＤ４-ＣＤ８-を認識せず、 （３）マウスに腹腔内投与した時、正常なマウスの胸腺
および肝臓の細胞の細胞表面抗原を免疫化学的に認識
し、アポトーシスに基づく肝細胞の死をもたらし、数時
間以内にマウスを死に至らしめるが、細胞表面抗原を発
現しないＭＲＬ−lpr／lprマウスに腹腔内投与した時に
は、そのような細胞死および個体死をもたらさないこと
を特徴とする抗体。 - 【請求項２】 ＦＥＲＭ Ｐ−１３６３５の下で寄託さ
れているハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体
である請求項１記載のモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12390593A JP3447322B2 (ja) | 1993-05-26 | 1993-05-26 | マウス細胞表面抗原に対するハムスターモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12390593A JP3447322B2 (ja) | 1993-05-26 | 1993-05-26 | マウス細胞表面抗原に対するハムスターモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06327491A JPH06327491A (ja) | 1994-11-29 |
| JP3447322B2 true JP3447322B2 (ja) | 2003-09-16 |
Family
ID=14872249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12390593A Expired - Lifetime JP3447322B2 (ja) | 1993-05-26 | 1993-05-26 | マウス細胞表面抗原に対するハムスターモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3447322B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09124509A (ja) * | 1995-10-27 | 1997-05-13 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 肝炎治療剤 |
| JP5688699B2 (ja) | 2009-02-27 | 2015-03-25 | 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ | がん細胞を用いた免疫方法 |
| EP2444484B1 (en) | 2010-08-25 | 2019-02-06 | Order-made Medical Research Inc. | Method for producing antibodies using cancer cells |
-
1993
- 1993-05-26 JP JP12390593A patent/JP3447322B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）Ｖｏｌ．１４８，Ｎｏ．４，ｐ．１２７４−１２７９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06327491A (ja) | 1994-11-29 |
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