PT97574B

PT97574B - Processo de obtencao de proteinas de superficie cd44 variaveis, sequencias do dna que as codificam, anticorpos destas proteinas, bem como a sua utilizacao no diagnostico e na terapia

Info

Publication number: PT97574B
Application number: PT97574A
Authority: PT
Inventors: Peter Herrlich; Helmut Ponta; Ursula Gunthert; Siegfried Matzku; Achim Wenzel
Original assignee: Deutsches Krebsforsch; Kernforschungsz Karlsruhe; Univ Karlsruhe
Priority date: 1990-05-07
Filing date: 1991-05-06
Publication date: 1998-08-31
Also published as: IE911526A1; DE4014510A1; DE59101889D1; IL134982A0; NO20001668D0; ZA913389B; IE62096B1; PT97574A; CA2082382A1; CA2082382C; EP0531300A1; IL134982A; AU646858B2; US5506119A; BR1100650A; YU79491A; NO20001668L; NO310661B1; NO317154B1; HU218905B

Description

O presente invento diz respeito a um processo de obtenção de proteínas de superfície CD44 variáveis, de anticorpos de determinante variável destas proteínas, e ainda às sequências C-DNA, codificadoras destes elementos proteicos variáveis, bem como a utilização destas proteínas ou parte delas e dos seus anticorpos no diagnóstico e na terapia de metástases tumorais.

objecto da presente invenção diz respeito a um processo de obtenção de proteínas de superfície CD44 variáveis, anticorpos da determinante variável destas proteínas, e ainda às sequências DNA codificadoras destes sectores das proteínas variáveis, e a utilização destas proteínas ou partes delas e os seus anticorpos no diagnóstico e na terapia de metástases tumorais.

A capacidade de formar metástases constitui a verdadeira caracteristica mortífera das células tumorais malignas.

As células tumorais primárias de origem adquirem esta característica provavelmente ao longo de toda uma série de mutações durante o processo progressivo do tumor.

Como resultado deste processo separam-se continuamente variantes das células cancerosas da massa tumoral primária que penetram na matriz extracelular e entram no sistema linfático ou na circulação sanguínea.

Agarradas, muitas vezes, umas às outras, as células tumorais metastatizantes são transportadas dentro do sistema sanguíneo ou linfático e abandonam o sistema vascular noutros pontos, a fim de ali penetrarem no tecido secundário e formarem tumores secundários (quadro sinóptico de Hart et al. 1989; Nicolson, 1987) .

A formação de metástases requer toda uma série de interacções das células tumorais com a matriz intercelular ou outras células.

Quase todas estas interacções necessitam de componentes da superfície celular como, por exemplo, os receptores de matriz e lâmina, enzimas proteolíticas vinculadas à superfície, bem como moléculas celular-adesivas, incluindo aquelas que pressupõem uma aderência organo-específica e, deste modo, uma preferência de orgãos na formação de metástases, e ainda factores de crescimento e receptores do factor de crescimento.

É conhecido o facto de as proteínas de membrana das células tumorais metastatizantes do tumor BSp73 em ratos serem diferentes das de células não metastatizantes, o que foi provado pela reacção dos anticorpos (Matzku et al., 1983 e 1989).

Recentemente fez-se a descoberta de que as células tumorais BSp73ASML metastatizantes contêm uma proteína de superfície que, em parte, corresponde a uma glicoproteína que, por sua vez, colabora na aderência linfocitária e na acção recíproca entre células e entre célula e matriz (designação da glicoproteína normal no homem: CD44, Hermes-1, no rato morganho: Ppg-1 e no rato: HEBFLN). A nova proteína de superfície variável CD4 distingue-se destas sequências conhecidas

através de uma área extracelular (EZB) de 334 (rato) e 338 (homem) aminoácidos que se encontra introduzida ao nível do 222° aminoácido da sequência CD44 humana e ao nível do 223° aminoácido tratando~se da sequência em ratos (FIG. 3b), respectivamente. Esta nova glicoproteína parece ter um papel importante na formação de metástases no que se refere à ligação entre célula e matriz e/ou entre células, respectivamente. A obtenção e a caracterização desta área proteica (EZB) (EZB = Área extracelular) constitui, por isso, um dos objectivos desta invenção.

Através da imunização de ratos morganhos, feita com proteínas de membrana obtidas a partir de BSp73ASML, foram criadas células esplénicas que produzem os anticorpos da EZB da proteína de superfície variável CD44.

Segundo o método de Kohler (1981), através de polietilenglicol procedeu-se à fusão destas com células de mieloma a fim de obter culturas resistentes.

Através da clonagem e selecção das culturas com produção de anticorpos que reagem com BSp73ASML, mas não com a forma original não metastatizante de BSp73AS e também não com outras células não tumorais de ratos, é possível obter anticorpos específicos do novo elemento proteico EZB.

A fim de se proceder à ulterior investigação foi seleccionado um anticorpo monoclonal que, quando submetido ao teste de imunofluorescência, deixa as células BSp73ASML com uma cor particularmente intensiva, e que recebeu a designação de mAbl.lASML (mAb: anticorpo monoclonal).

Através do teste Westernblot, podem ser determinadas, a partir de um hidrolisato proteico de células BSp73ASML, 4 bandas proteicas com mAbl.lASML com pesos moleculares de 120.000, 150.000, 180.000 e 200.000, enquanto os extractos de fibrócitos de ratos e células tumorais não metastatizantes de ratos não conduziram a uma reacção significativa. Ainda não foi possível determinar, se estas diferenças se baseiam numa sequência originalmente diferente dos aminoácidos ou numa modificação posterior das proteínas, na sua intensidade variável. Em qualquer dos casos, todos os 4 tipos de proteínas contêm o protótipo identificado pelo anticorpo, mas não as proteínas das células não metastatizantes BSp73AS ou das células normais de ratos que servem para o controlo.

ISOLAMENTO DE SEQUÊNCIAS C-DNA CODIFICADORES DA EZB DA PROTEÍNA DE SUPERFÍCIE

O anticorpo monoclonal mAbl.lASML foi utilizado com o objectivo de isolar as sequências c-DNA codificadores da EZB numa estrutura de expressão bacteriana. A estrutura foi construída através de PoliA⁺ RNA de células BSp73ASML e do sistema vectorial pEX (Stanley & Luzio, 1984).

Os produtos codificados pelas sequências c-DNA são identificados através dos anticorpos como proteínas de fusão -galactosidase. Um clone c-DNA isolado desta forma e positivo em relação ao anticorpo monoclonal 1.1ASML, com a designação de pEX34, suporta uma sequência parcial c-DNA de 167 nucleótidos .

Esta parte de c-DNA foi utilizada agora com o objectivo de investigar uma estrutura c-DNA maior no vector pSP65, também de BSp73ASML RNA. Um destes clones, isolado desta forma e com a designação de pM66, foi utilizado então para proceder ao isolamento de cadeias completas do clone c-DNA pMeta-1, isto com a ajuda de um chamado prolongamento primer (oligonucleótidos de arranque) e da reacção em cadeia de polimerase (PCR). A prova da cadeia completa foi obtida através do prolongamento primário (3207 nucleótidos). A colinearidade com um RNA do tumor BSp73ASML foi documentada pela RNase e pela análise de protecção Sl.

isolamento dos c-DNA através da multiplicação de genes em bactérias e da identificação pelo anticorpo prova que o anticorpo identifica a sequência primária do aminoácido na EZB da proteína de superfície.

Α ΕΖΒ CODIFICADA PELO RNA MENSAGEIRO TORNA-SE EXPRESSIVA

NAS CÉLULAS BSp73ASML, MAS NÃO NAS CÉLULAS BSp73AS

Com o objectivo de detectar através da hibridação RNA mensageiros específicos, foram produzidas a partir dos clones c-DNA três amostras de sequências diferentes. A amostra A cobre a área c-DNA codificadora de EZB (posições 941-1108).

A amostra B representa sequências entre as posições 1403 e 1572, e a amostra C suporta as sequências desde o início até à posição 794 de pMeta-1 (FIG. 1). Procedeu-se à separação electroforética do poli A⁺ RNA das cadeias de células tumorais BSp73 e à análise através da transferhibridação dos RNA.

Quatro das cadeias celulares não metastatizantes não contêm RNA, homólogo em relação à amostra A, enquanto os RNA das células tumorais metastatizantes BSp73ASML apresentam uma forte reacção.

A amostra A identifica neste preparado RNA uma mistura heterogénea, em que o RNA aparece em várias dimensões, entre

2,2 e 3,3 kb, e um tipo maior do RNA de 4,9 kb. A expressão exclusiva das proteínas específicas de membrana na variante metastatizante da célula tumoral, identificadas pelo anticorpo monoclonal 1.1ASML, é obviamente baseada na expressão exclusiva dos respectivos RNA mensageiro que codificam a EZB. Ao que parece, o clone c-DNA pMeta-1 completo com 3,2 kb não é capaz de representar todas as sequências destes tipos de RNA. Ele pode representar apenas um tipo de dimensão do RNA dentro da mistura heterogénea. Na separação do RNA de BSp73ASML, as amostras B e C mostram como resultado o mesmo padrão de hibridação como a amostra A, pelo menos tanto quanto isso pode ser verificado tendo em conta a heterogeneidade, isto é, estes tipos do RNA suportam sequências que são complementares em todas as três amostras, A, B e

C.

Ao contrário da amostra A, as amostras B e C identificam também tipos de RNA mensageiro nas cadeias celulares não metastatizantes. No entanto, as dimensões do RNA distinguem-se nitidamente das que se encontram na BSp73ASML. Na realidade, estão identificados quatro tipos de RNA mensageiro claramente distintos com as dimensões de 1,5, 2,0, 2,9 e

4,3 kb. Embora estes tipos do RNA pudessem estar escondidos na mistura heterogénea dos RNA da BSp73ASML, não há dúvida nenhuma que eles existem em igual quantidade na BSp73ASML. É decisivo que sequências do RNA com complementaridade em relação à amostra A estão, ao que parece, totalmente ausentes nas células não metastatizantes. Por isso, nós podemos concluir cautelosamente que as sequências das amostras A, B e C estão presentes nos mesmos RNA no tumor metastatizante, e isto de forma tal como se as sequências da amostra A tivessem sido entrançadas nos RNA positivos de B e C, e como se este processo alternativo de entrançamento apenas acontecesse na linha celular metastatizante.

A fim de provar a colinearidade entre RNA e c-DNA e para analisar a diferença dos RNA entre as células BSp73AS e BSp73ASML, foram realizadas as análises de protecção Sl-nuclease e RNase.

Os fragmentos protegidos do DNA ou do RNA apenas podem ser mais pequenos do que o comprimento total porque as 5' extremidades contêm sequências vectoriais que não podem efectuar a hibridação com os RNA provenientes de células tumorais.

Primeiro observamos a transferência no lado 3': a transferência de sequências com homologia em relação à amostra A para as sequências em relação à amostra B.

Ambas as técnicas indicam um único tipo de RNA em células BSp73AS que apresenta extensa colinearidade com as amostras. Mais 5' destes diferem na amostra c-DNA e RNA, respectivamente, que correspondem às sequências RNA de BSp73ASML, do RNA proveniente de células BSp73AS. Os RNA de BSp73ASML contêm sobretudo sequências que protegem fragmentos maiores das amostras. Os fragmentos maiores correspondem ao compri10 mento total dos elementos de DNA e RNA, respectivamente, à disposição para a realização da análise de protecção. Também são identificáveis fragmentos mais pequenos. Como os transferhibridações do RNA já puseram a descoberto uma mistura heterogénea de várias dimensões de RNA, é possível, que estes fragmentos protegidos mais pequenos indiquem tipos de RNA que em outros pontos divergem do c-DNA, isto é, em locais que se situam entre o ponto de divergência acima demonstrado e a 5' extremidade das amostras à disposição. Estes tipos de RNA também não são identificáveis nas células BSp73AS.

Observemos agora o ponto de divergência no lado 5', portanto a transferência de sequências que efectuam a hibridação com a amostra C para as que fazem a hibridação com a amostra A, portanto a sequência codificadora da EZB. A análise produz resultados correspondentes para o 5' ponto de ruptura. Os RNA de células BSp73AS podem proteger as amostras apresentadas apenas numa área pequena. Os RNA mensageiros de células BSp73ASML protegem fragmentos mais compridos. Isto porque possuem colinearidade no comprimento total da amostra apresentada. É, portanto, possível concluir que o clone c-DNA pMeta-1 representa sequências que se manifestam nas células tumorais metastatizantes BSp73ASML. As áreas 3' e 5' são encontradas também em RNA de células BSp73AS. As sequências codificadoras da EZB com as transferências definidas que através das técnicas acima demonstradas podem ser cartografadas, demonstram que se deve tratar aqui de um mecanismo alternativo de entrançamento a fim de formar o RNA.

Os pontos de ruptura 5' e 3' que indicam a transferência para as sequências EZB são marcados na FIG. 1 por setas.

ANTICORPO MONOCLONAL 1.1ASML IDENTIFICA UMA VARIANTE DA

GLICOPROTEÍNA CD44

A fim de obter informações sobre a estrutura da proteína de superfície, todas as moléculas clonadas c-DNA foram sequenciadas.

A sequência nucleotídica do clone pMeta-1 na sua extensão total e as sequências de aminoácidos como as suas derivadas são representadas na FIG. 2. 0 clone c-DNA no seu comprimento total abrange 3207 nucleótidos. O terminal 3' suporta uma extremidade poliA. Os dois sinais adicionais de poliadenilização situam-se junto das posições 2288 e 1743. Ao primeiro codão ATG segue-se uma sequência inicial de consenso e abre um âmbito de leitura de 1509 nucleótidos, o que corresponde a 503 aminoácidos. Como se supõe em relação a uma proteína de membrana, os primeiros 21 aminoácidos são hidrofóbicos e representam um péptido de sinal. Nenhum elemento destas sequências pode ser encontrado até agora nos bancos de dados.

No entanto, encontrámos homologia sequencial em dados recentemente publicados sobre o receptor de linfócitos Homing CD44 (resp. Pgp-1) (Idzerda et al., 1989; Goldstein et al., 1989; Stamenkovic et al., 1989; Nottenburg et al., 1989; Zhou et al., 1989). As homologias são reduzidas estritamente aos elementos 5' e 3' dos c-DNA, incluindo regiões não transladadas, e terminam nos pontos de divergência já acima mencionados entre as sequências RNA de BSp73AS e de BSp73ASML. 0 trajecto total entre os pontos de divergência (na FIG. 2 marcado por setas), portanto, todo o trajecto da sequência codificadora da EZB de metástases específicas, não é representada nas sequências Pgpl ou CD44.

A glicoproteína de metástases específicas representa aparentemente uma variante das glicoproteínas CD44. Isto porque ela suporta um domínio extracelular adicional de 162 aminoácidos e, por conseguinte, uma área extracelular expandida de 412 aminoácidos (a descontar 21 aminoácidos péptido de sinal) em comparação a 250 aminoácidos (a descontar também o péptido de sinal) da glicoproteína CD44 inalterada. No entanto, as formas inalteradas desta família CD44 estão comprovadas nas células BSp73AS não metastatizantes. Sequências c-DNA destes RNA de BSp73AS também foram clonadas, e a identidade com os clones de metástases específicas fora do domínio extracelular é comprovada.

A EXPRESSÃO DAS CD44 VARIÁVEIS É CORRELATIVA AO POTENCIAL

METASTÁTICO

A fim de analisar se a expressão das glicoproteínas variáveis CD44 se efectua sem excepção nas células BSp73ASML e se está relacionada com o potencial metastático destas células ou o potencial metastático em geral, estudámos uma outra série de cadeias celulares isógenes de tumores de ratos, ou seja as cadeias celulares tumorais do carcinoma da mama, sistema 13762 NF (Neri et al., 1982). Aqui comparámos as cadeias celulares provenientes do tumor parentérico, ou seja, as células MTPa, MTC, MTF7 e MTA (grupo 1) com cadeias celulares estabelecidas a partir de nódulos linfáticos ou metástases pulmonares, ou seja, MTLy, MTLn2, MTLn3 (grupo

2). Ao proceder à hibridação com a amostra B, as células do grupo 1 exprimem no seu essencial o padrão CD44 normal, semelhante ao dos RNA das células BSp73AS. Ao contrário da amostra A que identifica uma quantidade diminuta de uma banda difusa de RNA com aproximadamente 2,5 kb. Por outro lado, as células do grupo 2 mostram um padrão RNA completamente diferente. Ambas as amostras, A e B, possuem capacidade de hibridação com tipos maiores de RNA. As dimensões são semelhantes aquelas que foram identificadas em BSp73ASML. A semelhança também é documentada através de RNAse e análises de protecção Sl. Baseado nestes dados concluímos que existe mna correlação entre uma alteração no padrão entrançado do RNA e a expressão do CD44 variável por um lado, e a formação de metástases por outro, e que o padrão resultante nestas células metastatizantes do carcinoma da mama corresponde em muito àquele que já conhecemos anteriormente em relação à cadeia celular BSp73ASML metastatizante. As proteínas com um elevado número de moléculas, identificadas pelo anticorpo, correspondem a ambos os tipos de proteínas com elevado número de moléculas que já foram identificadas nos extractos BSp73ASML. Nesta série de tumores da mama descobrimos, portanto, também uma expressão específica, no que se refere às metástases, de tipos de RNA e de proteínas com um elevado número molecular. 0 facto de no grupo 1, ou seja, nas chamadas cadeias celulares parentéricas, serem encontrados RNA com capacidade de hibridação com a amostra A, ou seja, com a sequência que codifica a EZB, e o facto de podermos observar uma fraca coloração de uma proteína de 100.000 dáltons em conjunto com o anticorpo, é atribuído ao facto de as células do grupo 1 possuírem também uma capacidade diminuta de formar metástases, ao contrário do que se passa com a nossa cadeia de células tumorais de origem BSp73AS que não demonstrava nenhuma atitude no que se refere à formação de metástases.

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O ANTICORPO MONOCLONAL 1.1ASML TRAVA A FORMAÇÃO DE METÁSTASES

EM RATOS

Numa série de ensaios acerca da formação de metástases da cadeia celular de tumores BSp73ASML em ratos isógenes procedeu-se à injecção subcutânea de células e à injecção intraperitorial do anticorpo monoclonal 1.1ASML, efectuada irregularmente, dois a três dias antes e depois da ministração do tumor. No âmbito deste protocolo imunológico também foi determinada a reacção do sistema imunológico do rato em relação ao anticorpo injectado. Também se formam imunoglobulinas anti-rato morganho e também anticorpos antiidiotípicos. 0 resultado desta série de ensaios consiste no facto de o crescimento do tumor e a formação de metástases serem fortemente atrasados pela injecção de 1.1ASML. A cinética deste atraso faz com que possamos concluir que o anticorpo interfere num processo primário de formação de metástases. 0 ensaio demonstra que a estrutura proteica na superfície das células metastatizantes, identificada pelo anticorpo, tem um papel no processo da formação de metástases e que são realistas os projectos de terapia e de diagnóstico.

ISOLAMENTO DA SEQUÊNCIA HUMANA QUE SE ENCONTRA EM HOMOLOGIA COM O ELEMENTO SEQUENCIAL DO c-DNA DO RATO CODIFICADORA

DA EZB

Naturalmente, no que se refere às células tumorais humanas em cultura, não existe, sem mais nem menos, como nos sistemas de rato, a possibilidade de demonstrar se elas também conservam ainda as suas propriedades metastatizantes. Experiências com ratos morganhos, apresentando deficiências no sistema imunológico, facilitam apenas pareceres muito limitados sobre o potencial metastático no homem. Por isso, foi preciso analisar uma quantidade relativamente grande de cadeias celulares tumorais, cultivadas há muito tempo em vários pontos do mundo, a fim de verificar se elas exprimem as sequências que pudemos identificar em relação às metástases do rato. Conseguiu-se encontrar uma cadeia celular tumoral deste tipo. Ela provém de um carcinoma pulmonar humano de células grandes e tem o numero LCLC97. Nesta cadeia celular tumoral podem ser identificados três tipos definidos de RNA (dimensões: 5,5; 3,4; e 2,8 kb), cujo comportamento corresponde aos RNA identificados nas cadeias celulares tumorais metastatizantes do rato. Na realidade, eles apresentam a capacidade de hibridação tanto com a amostra A como também com as amostras B e C, o que significa que também estes tipos de RNA humanos são idênticos em larga escala ao c-DNA pMeta-1 (85%) (FIG. 3a).

No entanto, o anticorpo monoclonal 1.1ASML não reagiu com esta célula tumoral, o que significa que na área da determinante do antigénio a parte da proteína identificada pelo anticorpo se deve distinguir das proteínas existentes na superfície da célula tumoral humana. Por causa da grande especificidade dos anticorpos bastam os mais pequenos desvios para se verificar a não-reactividade. A célula tumoral humana LCLC97 serviu então para a construção de uma estrutura c-DNA. Por causa da grande conformidade entre as sequências humanas e do rato foi possível isolar um clone c-DNA que demonstrava homologia em relação à amostra A. A c-DNA humana foi sequenciada. Na FIG. 3 (a, b) mostra-se a sequência primária e a sequência de aminoácidos dela derivada. É possível ver que existe uma ampla identidade entre a sequência humana e do rato que se estende sobre largas áreas. Assim, verificou-se que a área variável ainda é bastante maior: no homem um total de 338 aminoácidos, no rato um total de 334 aminoácidos, repartidos em cinco domínios (FIG. 4). Os domínios e 3 conduzem no rato à formação de metástases quando introduzidos em células não metastatizantes. Os domínios 2 e correspondem à área variável de pMeta-1. Esta sequência total humana e do rato, bem como também a sequência de aminoácidos daí derivada são objecto desta invenção.

EXEMPLOS DE EXECUÇÃO

CÉLULAS E ANTICORPOS:

Foram utilizadas para a análise as seguintes linhas celulares BSp clonadas: BSp73 14ASML-1 e 10AS-7 e mantidas em cultura como descrito em Matzku et al., (1983); e ainda as cadeias celulares do carcinoma da mama 13762NF, descritas em Neri et al., (1982).

Foram obtidos anticorpos monoclonais de proteínas de membrana BSp73ASML através da imunização de ratos morganhos Balbc. Depois do isolamento das células esplénicas de um rato morganho imunizado, procedeu-se à fusão destas com células de mieloma Ag8 a fim de se fazer a imortalização segundo o método de obtenção de anticorpos monoclonais desenvolvido por Kohler (1981). As células híbridas obtidas foram submetidas a um processo de Screening a fim de identificar aquelas que produzem anticorpos específicos de BSp73ASML, mas não de BSp73AS e de fibrócitos normais do rato. 0 procedimento é descrito com rigor em Wenzel (1986).

As células híbridas que com a respectiva especificidade produzem anticorpos monoclonais (mAK) foram tornadas expansivas na cultura de tecido, e os mAK introduzidos no meio foram fortemente enriquecidos através da precipitação de sulfato de amónio e da cromatografia em coluna (sefarose da proteína A e monoQ) e utilizados, nesta forma, nas análises. Um deles é o mAKl.lASML.

IMDNOFLUORESCÊNCIA

Com o objectivo de caracterizar a molécula variável CD44 em várias células tumorais, estas foram postas em cultura, e, a seguir, lavadas com uma solução salina, estabilizada com fosfato (PBS) e incubadas com 1.1ASML durante 30 minutos a uma temperatura de 4°C. A fim de comprovar a ligação foi utilizado como anticorpo secundário um IgG coelho anti-rato morganho acoplado a rodamina e preparado no microscópio de fluorescência.

CONSTRUÇÃO DAS ESTRUTURAS DE EXPRESSÃO cDNA E BARREIRA IMUNOLÓGICA

O PolyA⁺ RNA de células BSp73ASML foi iniciado com Oligo (dt) e hexanucleótidos de composições variadas, e através da transcritase reversa do AMV foi sintetizado o primeiro cordão de cDNA. 0 segundo cordão do cDNA foi obtido através de E.coli polimerase, RNaseH e E.coli ligase e, em seguida, o cDNA de cordão duplo foi rectificado nas suas extremidades através de T4DNA polimerase. Os vectores pEXl,2 e 3 (Stanley e Luzio, 1984) que proporcionam a leitura da fusão do cDNA em 3 dimensões reticulares diferentes, foram separados com a ajuda de Smal endonuclease restritiva e ligada com o cDNA (T4 DNA ligase). As bactérias competentes E.coli DH5 (pCl857) que produzem um repressor sensível a temperaturas, foram transferidas com os construtos pEX-cDNA e cultivadas em filtros de nylon. O gene para o repressor RCI857 sensível a temperaturas está no plasmido pcl857 compatível com os plasmidos pEX. O promotor Λ Pr que comanda a síntese das proteínas de fusão desliga a 28°C. O aumento da temperatura para 42°C faz com que o repressor CI fique inactivo e se inicie maciçamente a síntese de $ -galactosidade/proteínas de fusão ASML. As colónias de bactérias aquecidas são, em seguida, desnaturadas nos filtros através de vapor de clorofórmio, as quais são depois incubadas em PBS que contém 3% de leite em pó, lisozima e DNase. As proteínas bacterianas de fusão, fixadas no filtro de nylon, são agora incubadas com mAkl.lASML e depois da lavagem dos mAk não especificamente ligados, utilizadas como anticorpo secundário 125 J a fim de provar a ligação dos coelhos marcados com anti-rato IgG. A partir do filtro bacteriano de origem e depois da autoradiografia foram isolados clones positivos e analisados em seguida. Um clone que sintetizava uma proteína de fusão reagindo especificamente com 1.1ASML, foi o pEX34. O plasmido pEX contido no clone bacteriano suporta 167 nucleótidos cDNA que, entre outros, representam a codificação do protótipo (resp. da determinante antigénio), cuja <7-

especificidade suporta mAKl.lASML (áreas: ver FIG. 3a).

isolamento das cadeias completas de cDNA pMeta-1 efectuou-se segundo os métodos estandardizados.

IMUNIZAÇÃO DOS RATOS COM mAkl.lASML

Ratos BDX, singenes em relação às células tumorais BSp73, levaram injecções subcutâneas e intraperitoniais, respectivamente, de mAkl.lASML (acoplado a KLH Keyhole Limpet Haemocyanine), conjuntamente com o adjuvante completo de Freund. A primeira injecção foi dada 10, 7 e 3 dias antes da injecção das células BSpASML (na almofada de gordura no pé), as seguintes 3, 7, 11, 14 e 21 dias depois. Passado 28 dias os ratos foram mortos, os vários nódulos linfáticos foram preparados e pesados, e foram contadas as metástases pulmonares macroscopicamente visíveis.

RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE SUPERFÍCIE VARIÁVEIS CD44 E O POTENCIAL METASTÁTICO

A fim de verificar se a expressão de glicoproteínas variáveis CD44 é apenas uma característica da cadeia celular BSp73ASML analisada, ou se a expressão pode ser relacionada com o potencial metastático, foi investigada uma outra série de linhas celulares tumorais de ratos derivada do carcinoma da mama 13762NF (Neri et al., 1982). Entre estas foram comparadas cadeias celulares derivadas do tumor primário (MTPa, MTC, MTF7 e MTA (grupo 1)) com cadeias celulares derivadas de metástases linfáticas ou pulmonares (MTLy, MTLn2, MTLn3 (grupo 2)). 0 padrão do RNA derivado de CD44 é representado na FIG. 4, em que as amostras A, B e D correspondem às amostras descritas na página 4 da descrição e no quadro 1. As células do grupo 1 mostram todas um padrão normal CD44 com a amostra B. Ao contrário das células do grupo 2 que mostram um padrão diverso. As moléculas RNA são maiores do que as do grupo 1 e correspondem ao RNA de BSp73ASML. 0 padrão mostra a maior semelhança entre os dois sistemas tumorais em ratos. Os RNA mais pequenos perdem-se aquando da hibridação com a amostra D, porque estas sequências são identificadas a seguir a um primeiro sinal de terminação, e estes RNA diferem na sua terminação.

Também com a amostra A, o padrão do RNA do grupo 2 corresponde ao do BSp73ASML. Enquanto a amostra A não procede à hibridação com o RNA de BSp73AS, nas células do grupo 1 é visível uma pequena banda difusa de RNA de aproximadamente 2,5 kb. As análises de protecção RNase e nuclease SI mostram também a semelhança estrutural. Segundo estes resultados parece haver uma alternância entre o padrão de fendas (padrão entrançado) e a expressão dos RNA CD44 variáveis por um lado, e a formação de metástases por outro.

c.

TRANSFERÊNCIA DO POTENCIAL METASTÂTICO PARA CÉLULAS BSp73AS NÃO METASTATIZANTES ATRAVÉS DA SOBREEXPRESSÂO DE pMeta-1

A relação entre a expressão de tipos variáveis de CD44 e o potencial metastático em duas séries de tumores de rato aponta para um papel causal destas glicoproteínas no processo metastático. A fim de se proceder à sua investigação, o p-Meta-1 foi transferido para células BSp73AS, e foi analisado se este processo conduz à alteração do comportamento das células. A área total do pMeta-1, responsável pela codificação (FIG. 2), foi introduzida debaixo do promotor SV40, e este complexo (diagrama em FIG. 5) foi introduzido nas células BSp73AS conjuntamente com neoPSV2. Foram obtidas colónias isoladas, G418-resistentes e pMeta-l-expressivas (denominadas em seguida como transafectandas). 0 padrão de RNA de 2 destas colónias é representado na FIG. 5. A hibridação com a amostra A, específica para o CD44 variável, mostra um transcrito principal de aproximadamente 2,2kb, o que em dimensão corresponde ao RNA frequente mais pequeno, transcrito nas células BSp73ASML (FIG. 5). As células transafectadas contêm, no entanto, aproximadamente 10 vezes mais deste RNA do que as BSp73ASML.

Outras dimensões adicionais de RNA são observadas numa das células transafectadas (BSp73AS-psVMetal-14), o que poderia depender do local da integração dos plasmídos. Um clone de transferência simulada neopSV2 (não representado) e as células receptoras BSp73AS não contêm RNA que é um complemento da amostra A. A fim de descobrir nas transafectadas as transcrições CD44 normais endogénicas (sem o extradomínio de pSVMeta-1), procedeu-se ao stripping do filtro e à rehibridação com a amostra D. Esta parte da 3’ sequência não traduzida não está contida no clone de expressão (comparar FIG. 5). A amostra D identifica no RNA das duas transafectandas dois transcritos principais de 2,9 e 4,9 kb (FIG. 5, coluna direita), bem como no controlo BSp73AS e na cadeia celular transafectada com BSp73ASneopSV, que não se encontra representada. Quantificações aproximadas das várias hibridações análogas demonstram que as transafectandas exprimem aproximadamente 5 vezes mais os RNA CD44 variáveis, transcritos do plasmído de expressão, que os genetranscritos CD44 endogénicos.

A cDNA sobreexpressa é traduzida em proteínas. As duas transafectandas, representadas na FIG. 5, sintetizam proteínas das mesmas dimensões aparentes com capacidade de aceitar imuno-coloração através de mAbl.lASML, ou seja, um produto principal de 150 kDa e uma banda mais fraca de aproximadamente 100 kDA. Como a sequência cDNA codifica um produto primário de proteína de apenas 503 aminoácidos, todas as bandas visíveis devem representar formas modificadas. A banda de 150 kDa actua em conjunto com uma das formas modifi-

cadas de CD44 variável, expressa na célula metastatizante BSp73ASML, BSp73AS ou células BSp73ASneopSV transferidas por simulação não possuem esta proteína. Tal como nas células BSp73ASML, o protótipo das células expressas pelas transafectandas está a descoberto na superfície celular.

A fim de provar que a expressão de CD44 variável é o suficiente para proporcionar às células BSp73AS um potencial metastático, as transafectandas foram injectadas em ratos singenes BDX (protocolo metastático espontâneo). Em experiências anteriores as células tumorais metastáticas BSp73ASML propagaram-se rapidamente do local da injecção, e mais ou menos 10 dias depois da injecção elas estavam totalmente distribuídas (Matzku, 1984). Por isso, todos os tumores locais foram extirpados no 10 s. dia por amputação. Todos os portadores de células BSp73ASML e todos os animais injectados com uma das transafectandas sobreexpressas, desenvolveram metástases pulmonares (tabela 1). A evolução na formação das metástases foi relatívamente rápida, dentro de 5 - 8 semanas após a injecção. Animais que tinham recebido as células BSp73AS ou transafectandas de simulação, estavam após esse tempo totalmente saudáveis (além da amputação), e também após 5 meses não se verificaram metástases.

Apesar de uma semelhança surpreendente a formação acentuada de metástases, existem algumas diferenças interessantes.

As células BSp73ASML atingem em todos os animais os nódulos linfáticos e conduzem a um aumento maciço de vários nódulos na área da virilha e junto à aorta (tabela 1). Uma transafectanda (BSp73AS-pSVMetal-14) causa inchaços dos nódulos linfáticos em 3 a 8 animais, embora todos os animais desenvolvam metástases pulmonares múltiplas (tabela 1). Com a outra transafectanda (BSp73AS-pSVMetal-15) um inchaço dos nódulos linfáticos não é verificável. Assim, as transafectandas parecem ter a capacidade de formar colónias nos pulmões sem fase obrigatória de crescimento nos nódulos linfáticos.

A experiência segundo a tabela 1 aponta, além disso, para uma outra diferença entre as transafectandas BSp73AS e BSp73ASML. As metástases pulmonares individuais são macroscopicamente visíveis, enquanto as de BSp73ASML são pequenas e numerosas, no entanto, numa série mais alongada com BSp73ASML (Reber et al., 1990) desenvolvem-se em 11 de 20 animais também nódulos maiores por pulmão, semelhantes aos causados pelas transafectandas.

A fim de verificar se as metástases formadas foram provocadas realmente pelas transafectandas injectadas e para excluir a possibilidade improvável de uma mutação espontânea que gerasse um potencial metastático, foram determinadas também as proteínas protótipo-positivas nos extractos pulmonares completos e nos extractos de células metastatizantes recultivadas. Tanto no extracto pulmonar completo como nos extractos de um nódulo pulmonar específico provenientes de um animal que tinha recebido as transafectandas BSpASpSVMetal-15, a glicoproteína de 150 kDa pode ser detectada. A estirpe resistente a G418 forma no crescimento in vitro uma proteína do mesmo peso molecular aparente.

DIAGNÓSTICO E TERAPIA

1. Análise do material tumoral humano através de hibridações em situação natural (in situ) com sequências pMeta-1 humanas existentes. Estes ensaios representam ensaios preliminares, antes de existir um anticorpo que identifica a EZB humana.

2. Obtenção de anticorpos de EZB humana. Clonagem das sequências humanas pMeta-1 em vectores de expressão bacteriana, de modo a surgirem fusões com glutationa-S-transferase. Imunizações de coelhos com estas proteínas de fusão e com péptidos sintetizados, respectivamente, provenientes da EZB (acoplados a moléculas portadoras). Isolamento de anticorpos polivalentes e monoespecíficos, respectivamente. Imunização de ratos com preparados de membrana provenientes de células tumorais humanas e proteínas bacterianas, respectivamente, de fusão a fim de obterem anticorpos monoclonais.

POSSIBILIDADES DE UTILIZAÇÃO

- Análises imunohistológicas de material tumoral clínico (diagnóstico);

- Identificação da EZB solúvel no soro de doentes com o auxílio de testes ELISA (diagnóstico);

- Construção de anticorpos acoplados à toxina, a fim de introduzir através do anticorpo a toxina na área do tumor/das metástases (terapia);

- Construção de anticorpos com dois locais definidos de ligação antigénio. Através desta especificidade dupla devem ser provocadas reacçoes citotóxicas na área das metástases (p. ex. acoplamento anti-CD2 ou CD3) (terapia).

3. Produção de proteína hMeta-1 através da transafecta de células humanas ou do rato com um vector de expressão que suporta a completa sequência hMeta-1 cDNA; resp. lavagem de células LCLC97.

POSSIBILIDADES DE UTILIZAÇÃO

- Injecção da proteína ou partes dela a fim de bloquear os locais de ligação tissular das células tumorais;

- Após caracterização dos locais de ligação também seria pensável a utilização na terapia que poderia consistir na injecção de grandes quantidades de proteínas de ligação que então bloqueavam as células tumorais deambulantes.

TABELA 1

Propagação metastática de células BSp73AS que exprimem CD44 variável cDNA pMeta-1** ***

Células	Metástases na altura da autópsia
tumorais injectadas	Surgimento local
*LN ing	*LN par	pulmão
BSP73ASML	0/8	8/8	8/8	8/8
		1.5-2.5**	jzí 2.5-5.0	miliar
BSp73AS-	0/8	3/8	3/8	8/8
pSVMetal-14		φ 0.3-1.2	jzí 1.0-4.5	múltipla
				φ 0.3-5.0
BSp73AS-	0/8	0/8	0/8	8/8
pSVMetal-15				5-20,
				φ 0.3-10.0
BSp73AS	1/8	0/8	0/8	0/8
BSp73AS-pSVneo 0/8	0/8	0/8	0/8

** diâmetro médio em mm *** A tabela reproduz o estado 60 dias após a injecção das células indicadas * LN = nódulo linfático ing: inguinal par: para-aortal

12.

Claims

REIVINDICAÇÕES

Processo de obtenção de um fragmento DNA, responsável da codificação de uma proteína de superfície de células tumorais metastatizantes, caracterizado por ser seleccionado

a) das sequências nucleotídicas ...rMeta-1 ...

CCA ACT ACT CCA TGG GTT TCT CAG GAA CGG ACC CAG TGG AAC GAA GTA CTA CTT CAG ACA ACC GAC AGA AAC AGC ACC AGT GCT CAG GAA CCA CAG CCT CCT TTC GAT GAA GAG GAG ACC CCA CAT GCA GAT CCT AAT AGC ACA ACA AAG GAG AAG TGG TTT GAG AAT CGA CCC ACC CCA AGT GAA GAC ACA ACT GCC TCA GCC CAC AAC ATG ACA ACA CAG AGT CAA GAG TTC TTC GAC CCA ATC TCA CAT CAA ACA GAA . AGC AAG GAT e .. ,. hMeta- 1 TCA ACC ACA CCA CGG GCC TTT CAG GAC TGG ACC CAG TGG AAC GAA GTG CTA CTT CAG ACA ACC GAC AGA AAT GGC ACC AGT GCT

GCC CAC ACA AAA CAG AAC CCA ATC CAT TCA AAC CCA ACC AGG ATG ACT GAT ATA CAT GGA GAA AAC TGG ACC AAT AAC CAT GAG TAT CAG GCT ACA AGC ACA ACC TGG GAA GAA GGA GCT ACC CAG GAA TGT CAG GGG AAG AAC TCC CAT GTG ACA GAA GGG AAC CAT CCA AGT CAA AGA GAT GTT TCA TGG ACC GAT CCA ATG CGA CAA GGT CAT

GAC CAC ACA AAA CAG AAC CCA AGC CAT TCA AAT CCG ACA AGG ATG ACT GAT GTA TAT GAA GGA AAC TGG AAC

CCA GAA CCA CAG CCT CCC CTC ATT CAC CAT GAG CAT CAT

GAG GAA GAA GAG ACC CCA CAT TCT ACA AGC ACA ATC CAG GCA ACT CCT AGT AGT AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT ACC CAG AAG GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGT CAT GAG GGA TAT CGC CAA ACA CCC A.GA, GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT CCA GCC TCA GGT CAT ACC AGC CAT CCA ATG CAA GGA AGG ACA ACA CCA AGC CCA GAG GAC AGT TCC TGG ACT GAT TTC TTC AAC CCA ATC TCA CAC CCC ATG CGA CGA

GGT CAT CAA GCA GGA AGA AGG ATG GAT

b) das sequências nucleotídicas que hibridam com uma sequência nucleotídica indicada em a) e responsáveis da codificação de uma glicoproteína de superfície de células tumorais metastatizantes;

c) das sequências nucleotídicas que em relação às sequências DNA indicadas em a) e b) são degeneradas e/ou representam variações alelas.

2².— Processo de obtenção de um fragmento DNA, segundo a reivindicação 1, caracterizado por hibridar com uma sequência nucleotídica que apresenta no mínimo 85% de homologia em relação ao parceiro de reacção.

32,- Processo de obtenção de uma molécula DNA recombinada, caracterizado por consistir numa sequência nucleotídica vectorial e num fragmento DNA segundo as reivindicações 1 ou 2.

42.- Processo de obtenção de uma molécula DNA recombinada, segundo a reivindicação 3, caracterizado por ser um vector de produção de novos genes.

52,- Processo de obtenção de uma célula hospedeira transformada caracterizado por conter um fragmento DNA segundo as reivindicações 1 ou 2 ou uma molécula DNA segundo as reivindicações 3 ou 4.

62.- Processo de obtenção de um polipéptido caracterizado por ser codificado por um fragmento DNA segundo as reivindicações 1 e 2.

72.- Processo de obtenção de um polipéptido, caracterizado por ser possível obter-se através de uma molécula DNA recombinada segundo as reivindicações 3 ou 4.

82.- Processo de obtenção de um polipéptido segundo as reivindicações 6 e 7, caracterizado por abranger as sequências de aminoâcidos

... r-proteína ...

STESNTNPTGWKPNEENEDETDKYPN

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MTDIDRNSTSAHGENWTQEPQPPFNN

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VGDSNSNVNRSLS produtos de glicosilação.

9².- Processo de obtenção de anticorpos poli e monovalentes caracterizado por reagirem com um protótipo de um polipéptido segundo as reivindicações 6 até 8.

102.- Processo de utilização de um fragmento DNA obtido segundo as reivindicações 1 ou 2, de cordões complementares, derivados e partes dele para a identificação, obtenção ou isolamento de uma sequência nucleotídica ou partes dela, caracterizado por ser o responsável da codificação de uma glicoproteína de superfície de células tumorais metastatizantes.

112,- Processo de utilização de um anticorpo obtido segundo a reivindicação 9, caracterizado por ser utilizado na identificação, obtenção ou isolamento de um polipéptido segundo as reivindicações 7 até

9.

122.- Processo de utilização como meio para o diagnóstico de tumores metastatizantes e/ou de metástases caracterizado por conter, no mínimo, um anticorpo obtido segundo a reivindicação 9.

132,- Processo de utilização como meio para o diagnóstico de tumores metastatizantes e/ou de metástases, segundo a reivindicação 12, caracterizado por ser acoplado a uma enzima e marcado por um corante e/ou por um radioisótopo.

142,- Processo de utilização como meio para o diagnóstico de tumores metastatizantes e/ou de metástases, segundo as reivindicações 12 e 13, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo híbrido com pelo menos dois pontos de ligação de antigénios.

152,- Processo de obtenção de um anticorpo de proteínas segundo a reivindicação 6, caracterizado por ser obtido através da utilização de DNA segundo a reivindicação 1 ou proteínas segundo a reivindicação

6.

162,- Processo de utilização de anticorpos e proteínas ou partes delas segundo as reivindicações 15 e 6 caracterizado por serem empregues na obtenção de medicamentos utilizados na terapia de tumores.

172,- Processo de utilização de anticorpos segundo a reivindicação 15, caracterizado por serem acoplados a agentes citotóxicos a fim de obter medicamentos para a terapia de tumores.

182,- Processo de utilização de anticorpos como meio de diagnóstico, segundo as reivindicações 15 - 17, ca-4 racterizado por o anticorpo ser um anticorpo híbrido com pelo menos dois pontos de ligação de antigénios.