CN104159925B - 双特异性接头 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及将病毒重新导向至非病毒特异性宿主细胞的双特异性接头，涉及包含具有编码这样的双特异性接头的核苷酸序列的DNA分子的表达盒，涉及包含这样的表达盒的重组冠状病毒并且涉及它们作为药物的用途和它们在肿瘤治疗中的用途。

Description

双特异性接头
本发明涉及将病毒重新导向非病毒特异性宿主细胞的双特异性接头(adapter)，涉及包含具有编码这种双特异性接头的核苷酸序列的DNA分子的表达盒，涉及包含这种表达盒的重组冠状病毒并且涉及它们作为药剂的用途和它们在肿瘤治疗中的用途。
溶瘤病毒用于肿瘤治疗已被研究多年(最近的综述文章参见参考文献[1、2、3、4、5])。它们在摧毁癌症细胞上的成功取决于其选择性地感染和杀死这些细胞的能力。虽然一些溶瘤病毒看起来对肿瘤细胞具有天然的趋向性，但大部分病毒则需要以某种方式被改造以在这些细胞中实现感染和/或溶解活性。实现肿瘤细胞特异性感染的方式之一是将病毒重新导向表达于这样的细胞上的表位。由此，针对各种病毒探索了不同的靶向方法。这些包括假分型、改造病毒表面蛋白和使用双特异性接头(参见下文及[6、7、8])。所有这些方法要求病毒的生存力不受到妨碍并且靶向部分(moiety)适宜地暴露以允许定向感染。所述方法的成功是由基因改造特定病毒的能力，连同合适靶向表位的可用性决定的。
目前为止，仅有几则描述基于冠状病毒的溶瘤剂在癌症治疗中的潜在应用的报道。冠状病毒为由核壳体组成的正义链RNA病毒，其包含大约30 kb的基因组和核壳体(N)蛋白，并且被携带三种膜蛋白：刺突(S)、被膜(E)和基质(M)的被膜所包围。这些蛋白中，刺突糖蛋白S负责病毒进入及合胞体的形成，由于其结合细胞受体并诱导膜融合[9、10、11]。
如由刺突-受体相互作用所决定的，大多数冠状病毒表现出严格的物种特异性[12、13、14]。
例如，冠状病毒猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)通过其受体猫氨基肽酶N (fAPN)选择性地感染并且在猫科细胞中诱导合胞体形成[15]。同样地，重组猫源化(felinized)小鼠肝炎病毒(fMHV) [16]，一种携带嵌合刺突(其胞外域是FIPV刺突蛋白)的小鼠肝炎病毒(MHV)的衍生物，也通过fAPN分子仅仅感染和融合猫科细胞。由于其物种限制趋向性，FIPV和MHV对非猫科细胞或非鼠科细胞分别为非病原性的。然而，一旦趋向性屏障减弱，冠状病毒则可在不同物种的细胞内复制[16、17]。因此，如果其刺突蛋白可识别肿瘤细胞上的受体，FIPV和MHV则可潜在地被转变为用于癌症治疗的特异性溶瘤剂。
非人冠状病毒鼠肝炎病毒(MHV)是研究得最多的冠状病毒，并且更重要的是，一般对于冠状病毒，可获得便利的反向遗传操作系统以改造冠状病毒基因组[16、18]。
像其它冠状病毒一样，MHV具有几个吸引人的特点，可使其适合作为溶瘤病毒。
首先，它具有窄的宿主范围，这是由它的刺突(S)糖蛋白和细胞受体mCEACAM1a之间的相互作用决定的[19]。
由于mCEACAM1a不在非鼠科细胞上表达，MHV不能在正常或者癌变的非鼠科细胞中建立感染。
其次，MHV感染诱导大的多核合胞体形成，其意味着：被感染细胞与周边未感染细胞的融合[11]。因此，还由于其相对较短的复制周期(6至9小时)，一旦它们被感染，MHV就迅速破坏这些细胞群。
再次，MHV的趋向性可通过取代病毒刺突胞外域或使用双特异性接头而改造[20、21、22、23]。
这些双特异性接头为包含病毒结合部分和靶细胞结合部分的蛋白。这种蛋白一方面特异性结合于冠状病毒并且另一方面它们特异性结合于靶细胞上的特异性受体。因此，它们充当了冠状病毒和靶细胞之间的中介物，并因此可将特异冠状病毒重新导向通常不会被该冠状病毒所感染的特异靶细胞。用这种双特异性接头进行的研究揭示，一旦宿主细胞趋向性屏障减弱，比如MHV能够在非鼠科细胞中建立感染。
对于冠状病毒，这种双特异性接头已特别地由Wurdinger描述[22]。这篇论文描述了双特异性单链抗体作为双特异性接头将非人冠状病毒靶向人癌症细胞的用途。这篇论文所用的病毒结合部分源自于针对FIP刺突蛋白产生的抗体而靶细胞结合部分则源自于针对人表皮生长因子受体(EGFR)所产生的抗体。
在Wurdinger的另一篇论文中[21]，描述了另一种双特异性接头，其包含所谓的可溶受体(soR)的MHV细胞受体CEACAM1a的N末端部分(受体突出细胞表面部分的N末端结构域)作为MHV结合部分以及针对人表皮生长因子受体(EGFR)所产生的抗体作为靶细胞结合部分。
然而，使用这种双特异性接头将病毒导向(肿瘤)细胞具有两个弊端：1)双特异性接头必须单独提供并且必须与病毒一同施用于宿主，优选地结合于病毒，并且2)每次病毒完成一个复制周期并且产生了新的病毒颗粒时需要将其重新施用于宿主。这对于重新导向从头产生的病毒颗粒以感染其它(肿瘤)细胞是必要的。
理论上来讲，为了克服这些障碍，可将编码双特异性接头的遗传信息引入病毒基因组以允许病毒在被感染细胞内自行产生接头，从而创造出自身靶向子代病毒。
该理念的理论可行性已通过将编码由soR和His标签组成的双特异性接头的表达盒插入到MHV基因组而被证实[20]。
这种自身靶向重组冠状病毒显示能够感染表达人工His标签受体的重组人细胞。
在[23]中显示了具有可比性，但是现在编码由soR和人表皮生长因子(EGF)所组成的双特异性接头的重组MHV能够在表达EGF受体的细胞中进行多轮感染，造成大量的细胞-细胞融合及靶胶质母瘤细胞的有效杀伤。在裸鼠中使用侵袭性U87ΔEGFR胶质母细胞瘤的原位颅内肿瘤模型，Verheije [23]首次表明被重新导向的重组冠状病毒确实具有溶瘤潜力。
然而，由于以下原因，这种方法具有非常有限的适用性；
1) 在待插入的表达盒的特征方面，冠状病毒基因组天然具有非常有限的耐受性。编码soR和18个核酸的His标签或者159个核酸的EGF的表达盒可以被插入到冠状病毒基因组，但是编码比如soR和单链抗体的表达盒则不被耐受[20、21]。
2)该方法不是通用的方法，由于1)中的原因以及由于下述事实，即对于病毒的每个溶瘤应用都要找到、开发并克隆新的靶细胞结合部分，并且这样的新靶细胞结合部分的大小和/或基因特征通常超出了冠状病毒基因组的插入耐受性。
因此，需要更加通用的溶瘤重组冠状病毒。
本发明的目标之一是提供这样的溶瘤重组冠状病毒。
目前令人惊讶地发现虽然冠状病毒基因组对外源序列耐受性非常有限，包含冠状病毒结合部分和骆驼科VHH抗体的双特异性接头可以成功地在冠状病毒中表达。
如本文中所用，“包含冠状病毒结合部分和骆驼科VHH抗体部分的双特异性接头”应理解为如下：这种接头为一端能够结合冠状病毒(此为冠状病毒结合部分)并且另一端能够结合细胞组分的蛋白，由此，因为所述另一端包含针对所述细胞组分的所谓骆驼科VHH抗体(此为骆驼科VHH抗体部分)，而实现所述另一端与所述细胞组分的结合。特别地，根据本发明的双特异性接头为其中冠状病毒结合部分位于VHH抗体部分N末端一侧，或者为其中冠状病毒结合部分位于VHH抗体部分C末端一侧的蛋白。不绝对需要冠状病毒结合部分或VHH抗体部分位于双特异性接头的C末端或N末端。
这种双特异性接头的重要优势之一是由于骆驼科VHH抗体部分的使用，其可以被容易地调整成与每个肿瘤特异性蛋白结合。这就将这样的双特异性接头转变为用于将冠状病毒导向肿瘤细胞的非常通用的工具。
这样的双特异性接头的另外一个重要优势是表达这种接头的盒总会被冠状病毒所耐受。这特别是由于此盒实际上总是具有相同(小)的大小，因为盒中编码骆驼科VHH抗体部分的部分实际上总是具有相同的大小。这也是由于VHH蛋白总是具有相同的基本结构的事实；针对一种蛋白或另一种蛋白所产生的VHH抗体之间的氨基酸序列的差异相对微小。并且主要优势为将这样的表达盒插入到冠状病毒中允许病毒在被感染细胞内自行产生接头，从而创造出自身靶向子代病毒。
因此，本发明的第一个实施方式涉及一种双特异性接头，其特征在于所述双特异性接头包含冠状病毒结合部分和骆驼科VHH抗体部分。
骆驼科VHH抗体在本领域已熟知20年以上。现在，它们经常被称为Nanobodies®。VHH抗体被定义为存在于骆驼科(其中有羊驼(Llama glama))的仅有重链的抗体的可变区域。仅有重链抗体的存在发现于在20多年前，并且从那以后已开发了来自这些抗体的可变区域在不同方向的应用。
这样的Nanobodies在将病毒特异靶向至细胞的双特异性接头中的用途尚不知晓，更不必说提出将表达这样双特异性接头的表达盒并入到病毒中。
通过用靶细胞的细胞表面蛋白免疫骆驼科动物诸如单峰驼或美洲驼，而容易地诱导适合用作根据本发明的双特异性接头中的骆驼科VHH抗体部分的骆驼科VHH抗体。这样的靶细胞可为肿瘤细胞。并且在那种情况下，细胞表面蛋白发挥肿瘤特异性细胞表面蛋白的功能。肿瘤特异性抗原为特定类型肿瘤所产生的抗原并且不出现于或以少得多的数量出现于发生肿瘤的组织的正常细胞上。许多人肿瘤特异性抗原为本领域已知，诸如属于生长因子家族的受体，例如Erb，其包括表皮生长因子受体(EGRF)和人表皮生长因子受体2(HER2)。EGFR在所有肿瘤的60-70%中过表达，而Her2为乳腺癌特异性标记。
其他肿瘤特异性抗原的实例为癌胚抗原(CEA)、细胞表面相关粘蛋白1 (MUC-1)、上皮肿瘤抗原(ETA)、肝细胞生长因子受体、IGF样生长因子受体1 (IGF-1R)、血管内皮生长因 (VEGF)、碳酸酐酶IX (CA-IX)和葡萄糖转运蛋白1 (Glut1)。
见于狗中的肿瘤特异性抗原的实例为，例如，皮肤癌特异性蛋白Ki67、乳腺癌特异性c-kit原癌基因(PDGF受体)、IX型胶原蛋白和淋巴瘤特异性蛋白AgNOR以及来自ErbB家族的受体(EGFR和Her2)。在这些肿瘤标记物中，Her2受体常常在狗骨肉瘤中(过)表达。
接下来从免疫动物中分离并克隆抗原结合片断的储库(repertoire)至噬菌体展示载体中以及通过淘选法选择抗原特异性克隆，在十多年来已成为选择抗原特异性分子的常规方法[24、25]。
这种方法被调整以适用于Nanobodies，由此，Nanobodies的单链性质极大简化了该方法[26]。就常规抗体(例如以单链可变片断(scFv)的形式)的储库克隆而言，筛选免疫单峰驼或美洲驼重链抗体的抗原结合储库复杂度较低，由于完整的抗原结合位点由单个基因片断编码。
一般来说，从分离自免疫单峰驼或美洲驼的外周血淋巴细胞中制备cDNA。由于所有的Nanobodies都属于一个单基因家族，它们由具有同源边界序列的单个外显子编码。因此，单个免疫动物的完整体内成熟的Nanobody储库可以用单套引物扩增。然后进行使用嵌套引物的二次聚合酶链式反应以产生更多的材料并且将用于克隆目的的限制性内切酶位点包括进来。将所扩增的Nanobody基因片断克隆到合适的表达载体中后，得到包含完整的体内成熟抗原结合位点的储库的Nanobody文库[26]。由于VHH的体内成熟，约107至108单个Nanobody基因的文库常规地导致对其抗原有纳摩尔级亲和力的Nanobodies的分离[26、27、28]。
可通过直接克隆筛选或淘选筛选存在抗原特异性结合物的Nanobody文库。通过淘选寻回结合物是优选的方法，因为淘选允许选择具有高亲和力的结合物[29]。
在以下实施例部分显示了将编码期望Nanobody的DNA克隆到编码双特异性接头的表达盒中，并且将这样的表达盒引入到冠状病毒基因组中的实例。
Nanobodies、其用途及其产生方式特别描述在[30-33]的综述中。
对于人的应用，如果需要的话，可以将Nanobodies人源化，特别如[34]中所述。
关于双特异性接头的冠状病毒结合部分，选择冠状病毒刺突蛋白作为冠状病毒结合部分是非常有利的。如果MHV为所选的溶瘤病毒，则刺突蛋白细胞受体CEACAM1a为所选的细胞受体。CEACAM1a已描述于上文(参见上文)。
对于几种其它冠状病毒，也已知冠状病毒刺突蛋白受体。对于传染性胃肠炎病毒(TGEV)，细胞受体为猪氨基肽酶N [35、36]。对于猫传染性腹膜炎病毒(FIP)，其为猫氨基肽酶N [37]。有趣的是，FIP刺突蛋白细胞受体结合多种I类冠状病毒诸如人冠状病毒HCV-229E并结合于TGEV，并且因此可以作为对I类冠状病毒更为通用的受体使用。
因此，此实施方式一个优选的形式涉及根据本发明的双特异性接头，其中所述冠状病毒结合部分包含冠状病毒刺突蛋白受体。
原则上，优选CEACAM1a的N末端部分，即所谓的可溶受体(soR)，该受体突出于细胞表面部分的结构域，或者可选地猪氨基肽酶N或猫氨基肽酶N的刺突结合结构域作为冠状病毒结合部分。仅使用受体的可溶部分确保维持结合刺突蛋白的能力，而同时消除了由于存在疏水区域而引起的双特异性接头不正确翻译和加工的风险。
因此，此实施方式的一个更优选的形式涉及根据本发明的双特异性接头，其特征在于所述冠状病毒结合部分仅包含冠状病毒刺突蛋白受体的可溶部分。
如果冠状病毒刺突蛋白受体被选为冠状病毒结合部分，则所述冠状病毒刺突蛋白受体优选地为MHV刺突蛋白受体、FIP刺突蛋白受体或TGEV刺突蛋白受体。
因此，此实施方式一个更加优选的形式涉及根据本发明的双特异性接头，其中所述冠状病毒刺突蛋白受体选自MHV刺突蛋白受体、FIP刺突蛋白受体和TGEV刺突蛋白受体、特别是这些受体的可溶部分。
如上所示，根据本发明的双特异性接头最重要用途之一在于将溶瘤冠状病毒的宿主细胞特异性靶向肿瘤细胞。
因此，此实施方式又一个更加优选的形式涉及根据本发明的双特异性接头，其中所述骆驼科VHH抗体部分针对肿瘤特异性抗原。
如上所述，双特异性接头可比如通过表达包含双特异性接头的遗传密码的核苷酸序列产生。这段核苷酸序列优选地附加包含影响/改变双特异性接头表达的调节序列。
编码根据本发明的双特异性接头的核苷酸序列优选地被置于功能性转录调节序列(TRS)的控制下。在正义链RNA (冠状)病毒中，转录调节序列发挥细胞启动子等同物的功能以调节病毒基因组中下游基因的表达。如果根据本发明的表达盒被整合于病毒基因组中，其通常包含转录调节序列(TRS)和/或整合于TRS的下游。优选地，此为冠状病毒TRS。这样的TRS的实例和适宜的插入位点特别在de Haan (2002)和(2003)中给出[48、51]。
因此，本发明的另一实施方式涉及包含处于TRS控制下，含有编码根据本发明的双特异性接头的核苷酸序列的RNA或DNA分子的表达盒。在病毒内，所述表达盒可为RNA形式，但在表达盒的克隆阶段，所述盒可为DNA形式。这图示说明于实施例部分(参见下文)。表达盒理解为处于TRS控制下包含编码根据本发明的双特异性接头的遗传信息的一段RNA或DNA。
如上所述，令人惊讶地发现虽然冠状病毒基因组对于插入表达盒耐受性非常有限，包含编码含有冠状病毒结合部分和骆驼科VHH抗体部分的双特异性接头的表达盒的重组冠状病毒仍可存活。
因此，本发明的另一实施方式涉及重组冠状病毒，其特征在于所述冠状病毒包含根据本发明的表达盒。
本发明的又另一实施方式涉及根据本发明的重组冠状病毒，其作为药剂使用。
此实施方式的一个优选形式涉及根据本发明的重组冠状病毒，其在肿瘤的治疗(根除)中使用。
对于根据本发明的重组冠状病毒的用途，可作如下叙述：病毒以活体形式施用并且已经携带结合于其刺突的接头，所以施用后病毒立即靶向展示针对其产生VHH的特异性肿瘤特异抗原的肿瘤细胞。并且由于根据本发明的重组冠状病毒能够在被感染细胞中自行产生接头，其产生了自身靶向子代病毒。该子代病毒反过来能够感染新的肿瘤细胞。因此即便少量的病毒颗粒，也能够最终清除大量肿瘤细胞。
因此，原则上预计低至103个病毒的量能够最终清除肿瘤。然而，由于根据本发明的重组冠状病毒仅仅结合于展示肿瘤特异蛋白的细胞，其对非肿瘤细胞是基本无毒的。因此，原则上能够应用多达108个病毒颗粒的更高剂量而无不良反应。
对于所施用的病毒颗粒的量，应该记得宿主免疫系统将病毒识别为外来物(foreign)并且通过产生免疫反应作应答。免疫应答诱导以一定速度发生。因此，施用低量病毒颗粒的一个弊端为宿主中的病毒滴度足够高到攻击所有肿瘤细胞之前可能要经过几轮复制。并且在此期间，免疫系统成熟并开始中和病毒。这个问题可通过施用更大量的病毒而容易地避免。因此，这样在宿主中的病毒滴度足够高到攻击所有肿瘤细胞之前，所需的复制轮次较少。在这样的情况下，介于105和108个病毒颗粒之间的剂量可为优选的剂量。
逃避免疫诱导影响的一个优良选择如下：可用根据本发明的第一冠状病毒进行第一次攻击。一旦针对此病毒的免疫应答达到导致冠状病毒去除的水平，可将靶向相同细胞(并且优选地靶向相同特异性受体)的根据本发明的第二冠状病毒用于第二次攻击。只要该第二冠状病毒与第一冠状病毒没有显著的免疫交叉反应，第二冠状病毒不会受到针对第一冠状病毒诱导的免疫反应的妨碍。仅作为一个实例：在这个方法中，根据本发明的第一冠状病毒可以为MHV，并且根据本发明的第二冠状病毒可为FIPV。
如果有理由相信肿瘤特异抗原并非完全肿瘤特异的并且因此可能也存在于非肿瘤细胞上尽管以低得多的量，则施用较低剂量的病毒颗粒将是安全的。在这样的情况下，介于104和106个病毒颗粒之间的剂量可为优选剂量。
优选地通过注射完成根据本发明的重组冠状病毒的施用。病毒优选地在药学可接受的溶液中诸如生理盐溶液或缓冲液中施用。
由于肿瘤通常得到良好灌注，病毒可例如被直接施用至血流中。但对于治疗实体瘤，在肿瘤里或周围施用病毒可能也是有利的。依赖于所施用病毒的量，可能需要在多位点和/或时间点的多剂量。
本发明的再另一实施方式涉及包含根据本发明的双特异性接头的药学组合物。
本发明的又另一实施方式涉及包含根据本发明的表达盒的药学组合物。
并且本发明的又另一实施方式涉及包含根据本发明的重组冠状病毒的药学组合物。
以下的实施例提供了关于如何在体内情况下施用本发明的重组冠状病毒的足够信息。
附图说明
图1：(A) 常规抗体(左)和仅有重链抗体(中)的示意图。CH、VH:重链的恒定域和可变域；CHH、VHH: 来自仅有重链抗体的重链的恒定域和可变域；(B) 结合HER2的VHH的11A4及1C8的氨基酸序列。
图2：基于soR的靶向构建体的示意图。soR: mCEACAM1a的N末端结构域；Igκ:信号序列；myc: myc标签；His: 6个组氨酸残基的标签；Ala: 3个丙氨酸残基的标签；VHH:来自仅有重链抗体序列的重链的可变域；T7: T7启动子。
图3：使用基于VHH的接头蛋白将MHV靶向人卵巢癌细胞。将在基于T7的牛痘表达系统中产生的接头蛋白与MHV温育并且随后用于接种(A) 对照CHO-scFv.His、(B) 人卵巢MCF7和(C) 人卵巢SKOV3细胞。在感染后20小时固定细胞并用针对MHV的抗体染色。
实施例
实施例1：
用MCF7细胞免疫羊驼
为了诱导针对人卵巢癌细胞的细胞表面蛋白的体液免疫应答，用MCF7细胞的完整人细胞制剂注射美洲驼(每次注射约108个细胞)。每只动物以一周的间隔接受7剂皮下施用的抗原。在0天(免疫之前)，和免疫4周和6周后收集免疫前和免疫血清。最后一次抗原注射后4天，收集血液，并且通过在Ficoll-Paque™ PLUS梯度(Amersham Biosciences, LittleChalfont, UK)上的密度梯度离心纯化外周血淋巴细胞(PBLs)，产生大约108个PBL的分离。
噬菌体VHH储库的构建
如所描述的那样(50)，从这些PLBs中提取总RNA并且使用oligo-dT引物和用于RT-PCR的SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)依照生产商的流程将其转录为cDNA。然后，用RNAse H处理cDNA以便在用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，荷兰芬络)纯化之前除尽残余RNA。然后将纯化的cDNA用作模板使用两个比例为4：1的正向框架区1 (FR1)特异性引物：5'-GGCTGAGCTGGGTGGTCCTGG-3'和5'-GGCTGAGTTTGGTGGTCCTGG-3'以及反向CH2片断引物5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'扩增编码Ig重链的基因片断的储库。此扩增步骤产生了大约700 bp的PCR片断(代表了从FR1到CH2的仅有重链的抗体)和900bp的片断(代表了从FR1到CH2的常规抗体)。然后在琼脂糖凝胶中按大小分离这两类重链编码基因并且用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，荷兰芬络)纯化编码仅有重链的IgG的基因。在下一步中，将纯化DNA作为模板用于嵌套式PCR，其中通过正向FR1特异性引物5'-CATTTGAGTTGGCCTAGCCGGCCATGGCAGAGGTGCAGCTG GTGGAGTCTGGGGG-3'在仅有重链的抗体片断的5'端引入了SfiI位点。由于BstEII限制酶切位点天然存在于大约90%的VHH基因的FR4中，用SfiI和BstEII切割PCR扩增的基因储库并且通过凝胶电泳纯化产生的400 bpcDNA片断。最后将cDNA片断连接到用于在丝状噬菌体上展示的噬菌粒载体pUR8100中(52)并且电转化到大肠杆菌TG1 (K12, Δ(lac-pro), supE, thi, hsdD5/F'traD36, proA +B + , lacIq, lacZΔM15)中。这样产生了106个各转化子的“免疫”VHH储库。
抗HER2 VHH片断的噬菌体展示选择
为了选择结合于人HER2受体的抗体，进行了多次噬菌体展示选择。在第一种方法中，在捕获的重组纯化HER2胞外域(ECD) (R&D Systems, Oxon, UK)上选择抗HER2噬菌体。将Maxisorp平板(Nunc, Rochester, MN, USA)用以1/500稀释的多克隆兔抗人IgG抗体(DakoCytomation, Glostrup, Denmark)在4℃包被过夜，然后用PBS清洗平板3次并且与渐减量的PBS中的重组纯化HER2-ECD (0.5 μg/孔；0.1 μg/孔；0.05 μg/孔；0.01 μg/孔)在室温下温育2小时。用PBS洗去未结合的HER2-ECD并且用PBS中的4%奶粉在室温下封闭被包被的孔1小时。然后，对从“免疫”文库制备并在室温下用4%奶粉在反复颠倒(head-over-head)下预封闭30分钟的噬菌体进行淘选，寻找与固定的HER2-ECD相结合的噬菌体。用PBS/0.05%Tween-20充分清洗后，用PBS中的1 mg/ml胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)洗脱噬菌体30分钟，然后通过加入MilliQ (Sigma-Aldrich)中的2 mg/ml胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶。被置换的噬菌体用于在37℃感染呈指数生长的大肠杆菌TG1 30分钟。将细菌涂布于含有2% (w/v)葡萄糖和100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。在这种设置下，基于其以高亲和力结合HER2-ECD胞外域的能力选择出VHH-噬菌体1C8。
在第二种方法中，分两步淘选从“免疫”文库制备的噬菌体：第一轮在溶液中BT474活细胞上并且第二轮在生物素化的HER2-ECD上。简要地，将噬菌体与不同量的BT474细胞(从4*105个细胞至4*103个细胞)在HybriCare培养基(具有胎牛血清、青霉素、链霉素和谷氨酰胺)中室温下旋转温育2小时。在随后的3个用PBS的清洗步骤中，通过在500xg离心5分钟，去除未结合的噬菌体。在最后一个清洗步骤后将细胞重悬于溶于PBS的1 mg/ml胰蛋白酶中并且在室温下温育30分钟。加入胰蛋白酶抑制剂(2mg/ml，MQ中)中和酶并且在500xg将细胞旋落5分钟。洗脱的噬菌体被用来在37℃感染指数生长的大肠杆菌TG1 30分钟。将被感染的细菌加入到补充有100 μg氨苄青霉素和2%葡萄糖的LB培养基中并且在摇床中在37℃生长过夜。将这次选择的产出用于第二轮，其中将用PBS中的2% BSA预封闭30分钟的噬菌体与10nM-10 pM生物素化的HER2-ECD在室温下置于颠倒旋转器(head-over-head rotor)中温育2小时。用EZ-Link® NHS-Biotin根据生产商的流程将HER2-ECD用5倍摩尔过量的生物素(ThermoScientific, Rockford, USA)生物素化。将未结合的生物素在Zeba脱盐离心柱(ThermoScientific, Rockford, USA)上去除。用PBS清洗Dynabeads® M-270链霉亲和素(Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)一次，用溶于PBS的2% BSA在室温下封闭30分钟并且然后在室温下加入到噬菌体和生物素化HER2-ECD的溶液中，进行1小时。在颠倒旋转器上温育后，用PBS中的0.05% Tween-20清洗珠子10次并在PBS中清洗2次。结合的噬菌体用胰蛋白酶洗脱并且如上所述用来感染大肠杆菌TG1。在这种设置下，基于其高亲和力结合HER2胞外域的能力选择出VHH-噬菌体11A4。
使用Qiagen Midiprep DNA分离方法(Qiagen，荷兰芬络)从1C8和11A4克隆的细菌细胞培养物中分离DNA。
最后，通过进行序列分析鉴定VHH 1C8和11A4的编码序列。VHH 1C8和11A4的氨基酸序列描述于图1中。
编码VHH的接头构建体的构建
编码mCEACAM1a受体(soR)的氨基末端D1结构域的基因的构建之前已有所描述(20)。简言之，用正向引物5'-CATGGGCCCAGCCGGCCGAGCTGGCCTCAGCACAT-3'和反向引物5'-CATGGCGGCCGCGGGGTGTACATGAAATCG-3'在质粒pCEP4:sMHVR-Ig (由T. Gallagher惠赠)上进行PCR。所产生的DNA片断soR含有5' SfiI位点和3' NotI位点(在引物中以下划线表示)并且随后用这些限制性内切酶克隆到表达载体pSecTag2中，产生表达载体pSTsoR-x-mychis以允许soR-VHH表达盒的生成(20)。
为了生成表达盒VHH-soR，首先向表达载体pSecTag2提供在NotI位点下游含有额外HpaI位点的连接头。soR基因替代为更小的soR，其缺失其天然信号序列，通过使用分别带有NotI和HpaI位点(下划线表示)的正向引物5'-CAGTGCGGCCGCCGAAGTCACCATT GAGGCTGT-3'和5'-ACTGGTTAACGGGGTGTACATGAAATCGC-3'的PCR生成。这样产生了表达载体pST-x-soRmychis。
二者都针对人HER2的1C8和11A4的VHH序列通过使用正向引物5'-GCGGCCGC CGAGGTGCAGCTGGTGGAG-3'和反向引物5'-GCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTG-3'的PCR而获得。所产生的PCR片断用NotI (在引物中以下划线表示)酶切并随后克隆到两个表达载体中的此限制性内切酶位点。插入物的正确定向和序列通过测序确认。
构建体的示意图在附图2中给出。所有构建体编码与VHH序列融合(C末端融合为soR-VHH或N末端融合为VHH-soR)的mCEACAM1a N末端结构域。它们之前是氨基末端Igκ信号序列并且随后是羧基末端myc-His标签，同时处于T7启动子控制下。在soR和VHH片断之间存在3个丙氨酸的连接头。
接头蛋白的产生。为了生产基于soR的接头蛋白，用表达T7聚合酶(vTF7-3)的牛痘病毒以感染复数5接种亚汇合的单层Ost7-1细胞(时间= 0小时)并且使用Lipofectin(Life Technologies, Ltd., Paisley, United Kingdom)以pST-soR、pST-soR-VHH或pST-VHH-soR进行转染(时间=1小时)。在时间=4.5小时更新培养基、在时间=20小时收集培养基并在3,000 rpm离心10分钟清除细胞碎片。将含有soR蛋白的上清加载到20%蔗糖垫层上并在13,000 rpm离心90分钟以去除vTF7-3病毒。成批蛋白保存于−20℃。
细胞和病毒。鼠Ost7-1细胞(53) (获得自B. Moss)、仓鼠CHO-His.scFv (54) (获得自T. Nakamura)、人卵巢癌细胞系SKOV3 (ATCC HTB-77)和MCF7 (ATCC HTB-22)都维持于含有10%胎牛血清(FCS)、100 IU青霉素/ml和100 µg/ml 庆大霉素(所有均来自LifeTechnologies, Ltd., Paisley, United Kingdom)的Dulbecco's改良的Eagle培养基(DMEM; Cambrex Bio Science, Verviers, Belgium)中。如之前所述(51)，培养MHV-A59毒种并测定滴度。
细胞培养物的免疫过氧化物酶染色。将在接头蛋白存在或不存在时接种MHV的细胞在接种后20小时用含有37%多聚甲醛的PBS固定。将细胞用含有1% Triton X-100的PBS透化，并且随后与以1：300稀释的k134抗MHV血清温育，然后与以1：300稀释的猪抗兔过氧物酶(DAKO, Glostrup, Denmark)温育，二者皆稀释于含有5%胎牛血清的PBS中。根据生产商的流程，用AEC (Brunschwig，荷兰阿姆斯特丹)对细胞染色并用光学显微镜分析。
结果
接头蛋白的功能性。
为研究soR-VHH接头蛋白的靶向能力，首先通过检验其感染对照细胞系CHO-scFv.His细胞(持续表达人工His受体)的能力来检验这些蛋白是否适当地产生。将MHV-A59与soR-1C8、soR-11A4、1C8-soR、11A4-soR或含有无靶向装备的soR的对照上清预温育并且并行地将这些混合物接种到这些细胞上，进行2小时。接种后20小时固定细胞并且使用针对MHV的多克隆抗体进行免疫染色。数据显示所有接头蛋白都能够将MHV重新导向至CHO-His.scFv细胞(图3A)，由于在所有情况下都观察到了染色。此外，可以观察到合胞体的形成，这是冠状病毒感染的标志。用来自假转染细胞的细胞培养物上清接种的细胞则正如预期地保持为阴性(未显示)。有趣的是，soR-VHH和VHH-soR二者皆能够重新导向MHV，显示VHH的N末端和C末端延伸皆被耐受并且对其靶向能力无害。
可溶受体介导的人HER2表达细胞的MHV感染。
接下来，进行类似的靶向实验，其中使用MHV-接头蛋白混合物接种表达HER2的人卵巢癌细胞。为此目的，使用了分别具有低和高HER2表达的MCF7和SKOV3细胞二者。感染后20小时，被接种细胞的免疫染色显示两种细胞系皆可以被由含VHH 的接头蛋白重新导向的MHV所感染，但使用对照蛋白则没有感染(图3B和3C)。被感染的MCF7细胞数目远远少于阳性SKOV3细胞的数目，有可能是由于这些细胞HER2-受体表达中的差异所致。此外，对于SKOV3可观察到清晰的合胞体形成，但对于MCF7细胞则观察不到。总之，感染既依赖于特异性VHH所代表的靶向部分也依赖于HER2受体表达。
实施例2：
用于靶向重组的载体的构建。为了允许从MHV-A59病毒基因组中额外的表达盒表达接头蛋白，首先将编码VHH-soRmychis和soR-VHH-mychis的基因，包括上游转录调控序列(TRS) (20)克隆到pXH1802 (48)中，其含有融合于MHV-A59 S基因的复制酶基因1b的3'端的大约1,200 bp。为此目的，通过用EcoRV和PmeI酶切载体得到插入物，并且将纯化片断克隆到pXH1802中经Klenow处理的HindIII位点。然后，用RsrII和AvrII酶切所产生的质粒并且将得到的片断克隆到经相同酶处理的pMH54 (16)中。这样产生了适合靶向重组的转录载体pMH-soR-VHH-mycHis和pMH-VHH-soR-mycHis。
靶向重组。通过如前所述的靶向RNA重组(48、16、49、20)，将接头基因VHH-soR-mycHis和soR-VHH-mycHis作为额外的表达盒引入MHV基因组。简要地，通过电穿孔将从经PacI线性化的质粒pMH-VHH-soR-mycHis和pMH-soR-VHH-mycHis体外转录的供体RNA转染至4小时前以感染复数(MOI)0.5感染有fMHV的猫FCWF-4细胞内。然后将这些细胞涂布于培养瓶中，并且24小时后收集培养物上清。空斑纯化子代病毒并且将病毒毒种培养于LR7细胞上。通过用来自这些病毒毒种的纯化病毒RNA反转录(RT)-PCR确认额外表达盒的存在后，通过在LR7细胞上的终点稀释确定毒种的病毒滴度。这些2代病毒毒种随后用于实验。对于每种病毒，生成两个独立的重组体作为对由病毒基因组其它部分计划外突变所造成影响的对照。
病毒RNA分离和RT-PCR。首先，使用QIAGEN病毒RNA分离试剂盒(根据生产商)从140μl含有病毒的培养物上清中分离病毒RNA。然后使用位于MHV基因组(GenBank 登录号NC001846)的第24,110至24,128个核苷酸的反向引物1127 (5'-CCAGTAAGCAATA ATGTGG-3')用所分离的RNA进行反转录。使用与含有插入表达盒的区域重叠的引物1173 (5'-GACTTAGTCCTCTCCTTGATTG-3'，第21650至21671个核苷酸)和1260 (5'-CTTCAACGGTCTCAGTGC-3'，第24,041至24,058个核苷酸)进行PCR。所产生的片断随后被测序以确认插入物的序列。
靶细胞的接种。用0.5 × 105 TCID50接种数目为1 × 105的CHO-His.scFv、SKOV3和 MCF7细胞。接种后(p.i.) 16小时，固定细胞并且进行使用MHV抗血清的免疫过氧化物酶染色(如上所述)以分析细胞是否表达病毒蛋白，而由此被重组MHV所感染。

Claims (5)

1.重组冠状病毒，其特征在于所述重组冠状病毒包含表达盒，所述表达盒包含含有编码双特异性接头的核苷酸序列的RNA或DNA分子，其中所述双特异性接头为包含冠状病毒刺突蛋白受体部分的可溶部分和针对肿瘤特异性抗原的骆驼科VHH抗体部分的蛋白，并且其中所述编码双特异性接头的核苷酸序列处于转录调控序列(TRS)的控制下，并且其中所述冠状病毒能够表达所述双特异性接头。
2.根据权利要求1的重组冠状病毒，其特征在于所述冠状病毒刺突蛋白受体选自鼠肝炎病毒(MHV)刺突蛋白受体、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)刺突蛋白受体和传染性胃肠炎病毒(TGEV)刺突蛋白受体。
3.根据权利要求1或2的重组冠状病毒，其作为药物使用。
4.根据权利要求1或2的重组冠状病毒，其在肿瘤的治疗中使用。
5.药物组合物，其包含根据权利要求1-2中任一项的重组冠状病毒。
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Granted publication date: 20180424

Termination date: 20190312