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A B 經濟部中央》準為印製 五、發明説明i f) 本發明是關於CD44表面蛋白質，對抗逭種蛋白質 的變異決定簇的抗體，及其製造方法，並且也包括具有此 種變異蛋白質片段密碼的DNA片段，以及這些蛋白質或 其部份和其抗體在轉移性腫瘤的診斷和治療方面的用途。 惡性腫瘤産生的轉移能力是威脅生命的關鍵。原發性 的腫瘤在發展的過程中會經過一糸列的改變，從而獲得這 種能力。發展過程的結果，癌細胞變異體仍然不斷從原發 性腫瘤中釋放出來，然後侵入細胞外基質和移轉至淋巴糸 統或血液循環中。常見的是，癌細胞互相黏連在一起，這 些轉移性腫瘤細胞經血液循環和淋巴糸统蓮送一段路程後 ，可以離開血管或淋巴管，進入其他組織，並形成轉移性 腫瘤（綜述論文見Hart e t a 1 . , 1 9 8 9； Ni c〇 1 son, 1987)。要形成轉移性腫瘤，需 要腫瘤細胞與細胞間基質或其他細胞之間的一条列相互作 用。幾乎所有相互作用均需要細胞表面物質的參與，例如 ,除了生長因子和生長因子的受體外，也包括基質和組織 層的受體，依附於表面的蛋白質分解酶，及細胞黏附分子 ,和那些能促進器官待異性黏附作用的物質，藉著這些持 異性物質，轉移性腫瘤便有器官選擇性。 已知的是，會形成轉移性腫瘤的細胞與那些不會形成 轉移性腫瘤的B S p 7 3大鼠腫瘤細胞上的膜蛋白質可以 .利用抗體反應加以分辨（Mat zku e t a 1 ., 1983 和 1989)。 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) .裝· .打· •綠· 甲 4 (210X297 公沒） 212202 蛆濟部中央搮準Λ印敦 A6 B6 五、發叼說明d) 現在已發現的是，能形成轉移性腫瘤的BSp73A sml腫瘤細胞上含有一種糖蛋白質，這種蛋白質中有一 部份區域與淋巴細胞黏附作用和，細胞一細胞，和，細胞 —基質’相互作用有關的已知糖蛋白相似（人類正常糖蛋 白：_.CD44、He rme s _ 1 ;小鼠正常糖蛋白：P PS — 1 ;和大鼠正常糖蛋白：HEBFLN)。但是， 新穎的變異C D44表面蛋白質與那些已知序列的蛋白質 不同。那些已知序列的蛋白質在位於細胞外的部份有3 3 4 (大鼠）和338 (人類）锢胺基酸，這些胺基酸是插 於人類CD44序列第222値胺基酸，或大鼠蛋白質序 列第223個胺基酸處（圖3b)。這種糖蛋白似乎在轉 移性腫瘤形成過程中的’細胞/基質，和’細胞/細胞’ 结合扮演著極重要角色。因此，本發明提供製備這種蛋白 質區域（EZB)和找出它的待性。從已接受BSp73 ASML膜蛋白質注射的小鼠中取得脾臓細胞，這些脾臓 細胞會産生對抗C D44變異種表面蛋白E Z B的抗驩。 依照Koh 1 er* (19 8 1)的方法，可利用聚乙烯 二醇把這些能産生抗體的細胞與骨链瘤細胞融合在一起。 利用克隆（C丨on i ns)和選殖技術，把能産生對抗 BS p 73ASML但不對抗非轉移性腫瘤B S p 73 AS和非腫®性大鼠細胞的抗體的細胞分離出來。這些細 胞能産生對抗新穎蛋白EZB片段的抗體。為了進一步研 究，選殖一種單源抗體，這種單源抗體能在免疫螢光試驗 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) *裴· •綠· 甲 4(210X297公沒） 212202 A6 B6 姓濟部中央樣準局印敦 五'發明説明（β ) 中與B S p 7 3ASML細胞结合而産生帶螢光的細胞。 這種抗體名為mAbl. 1ASML (mAb:單源抗體 )〇 在西方點跡法（Wes t ern B 1 o t)試驗中 ，利用mAbl.1ASML抗體可測出BSp73AS ML細胞蛋白質水解物中有四條蛋白帶，分別代表120 K , 1 5 0 K , 180K,和200K分子最的蛋白質。 反觀大鼠成纖維細胞和不會産生轉移性腫瘤的腫瘤細胞卻 不會産生顯著的反應。到現在為止，仍不知這些结果在程 度上差別是否由蛋白質修飾作用程度上不同所致。無論如 何，該四種蛋白質皆含有此抗體所能辨認的Ep i t op e。可是，那些不會形成轉移性腫瘤的BSp73AS細 胞或正常大鼠細胞的蛋白質卻沒有此抗髏能辨認的Ep i t o p e 〇 E Z B表面蛋白質之c DNA序列的分離 可以利用mAb1.1ASML單源抗髏在細菌表 達基因庫中分離出EZB之c DNA序列。該表達基因庫 是用從BSp73ASML細胞中取得的P〇1yA+ RNA 和 pEX 載體（Vector)条統（Stanl e y & L u z i o , 1984)建立。由該 cDNA 産生的産物可以利用抗體测出，測試的對象是與卢一半乳 糖酶結合的蛋白質。一種名為PEX34的cDNA克隆 可以利用上述之方法分離出，且與1. 1ASML單源 {請先聞讀背面之注意事項再填·"本页) •裴· •訂· .緣· 甲 4(210X297公沒） 212202 班濟部中央揉準局印裂 A6 B6 五、發叼說明ί y ) 抗體有陽性反應。此c DNA具有一段含有1 6 7個核登 酸序列。這段序列是由BSp73ASML的RNA衍生 而來，現在已用於以p SP 6 5為載髏的重要c DMAS 因庫的篩選掃瞄工具。PM66是其中一値分離出的克睡 ,可用來分離金長度之pMe t a — 1的c DNA克隆。 此分離方法霹要使用一级延長（起始寡核苷酸）和聚合酶 連鎖反應（PCR)。利用一级延長可以證明已得到金長 之序列（3207傾核苷酸長）。與BSp73ASML· 腫瘤衍生而來之RNA的相闋的序列可以使用RNa s e 和S 1核酸酶保護性分析法測出。 以細菌内基因表達和抗體辨別方法所分離出的c DN A可以證明抗膳能辨別表面蛋白質E Z B的一级胺基酸序 列。 EZB之mRNA可在BSp73ASML細胞中表達， 但不能在B S p 7 3AS細胞中表達 從cDNA克隆中産生三種不同的序列樣本，目的是 利用雜交法測出持異性的m R N A。樣本A與E Z B (位 置：941-1 1〇8)之cDNA區域重β。樣本B代 表位置1403—1572之間的序列。樣本C含有從Ρ Me t a- 1最前的位置至第794位置的序列（圖1) 。BSp73腫瘤细胞株的Po1yA+ RNA可以利 用電泳方法分離出，和利用RNA轉移雜交法進行分析。 不會形成轉移性腫瘤的四種細胞株皆不具有與樣本A相似 甲 4(210X297 公簷) (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁) ，装· •打· 212202 A6 B6 五、發明説明ί f) 經濟部中央採準局印裝 的RNA,但從會形成轉移性腫瘤的BSP73ASML 細胞取得的RΝΑ則有強烈的反應。樣本a能從各種不同 長度的RNA混合物中辨認出其中2. 2至3. 3kb和 較長的4. 9kb的RNA。利用1.ia$mL單源 抗函可以辨認能形成轉移性腫瘤的細胞所獨有的膜蛋白質 。這種蛋白質毫無疑問是由EZB的mRNA表逹而産生 。含有3. 2k_b的核酸之p.Meta — 1的cDNA克 隆似乎不能代表全部RNA。它只能代表含有不同長短的 RNA混合物中之一種RNA而已。樣本B和樣本c能産 生與樣本A在BS p 7 3ASML之RNA中所得到的雜 交楔式相同。其相似程度至少可以看出其多樣性，卽這些 RNA序列含有與全部三種樣本（A, b,和的序列 有互補性質。與樣本A不同，樣本B和C亦能辨認那些不 會形成轉移性腫瘤細胞株的mRNA。但是，有四種與B Sp73ASML之RNA不同的mRNA,它們的長度 是 1. 5, 2. 0, 2. 9, 4. 3kb。雖然這些 RN A理論上能夠皤藏在B S p 7 3A SML之RNA混合物 中，但是它們不會在BSp73ASML中有相等的數量 。其中一餹關鍵是，與樣本A序列互補的RNA不存在於 不會形成轉移性腫瘤的細胞中。因此，我們可以小心的得 出结論，那些會形成轉移性腫瘤的RNA中含有與樣本A 、B和C相同的序列。更明確地說，在那些會形成轉移性 腫瘤細胞中，只有含有與樣本B和C序列互補的RNA才 (請先聞績背面之注意事項再填穽本页} •裝. .打· .線. 甲 4(210X297 公尨) 212202 as
五、發明說明ί石） 經濟部中央樣準局印裂 有樣本Α的序列，或才有這種基因剪接過程發生。 為了證明RNA和cDNA有共線性（Col ine ar i ty)和為 了分析 BSp73AS 與 BSp73A SML細胞的RNA差別之處，可以把核酸片段保護後再 進行S 1核酸藤及RNa s e消化。所保護的DNA或R NA片段加起來一定少於金長度，因為5’終端含有載臁 序列，此載體序列不能與腫瘤細胞的RNA雜交。我們可 先考廉3’终端的轉珍：（Trans i t i on),由與 樣本A類似的序列轉$至與樣本B類似的序列。结果顯示 ,—種存在於BSp73AS細胞中的RNA有相當大程 度的共線性。過了 5’終端，cDNA的序列與BSp7 3AS細胞的RNA並不相同。該cDNA的序列是與B Sp73ASML細胞中的RNA相對應。BSp73A SML細胞所含有的RNA包括以上全部保護樣本中較長 片段的序列。最大的幾艏片段與DNA全長度相當，各代 表核酸酶保護性分析所得的片段。較短的片段亦可測出。 由這些事實來看，RNA雜交可能産生不同大小的RNA 所組成的混合物。可能這些受保護且較短之RNA片段是 在cDNA其他位置的分技演化現象所致。這些位置是在 分技點與樣本的5’终端之間。同樣的，這些RNAH段 在B S P 7 3 A S細胞找不到。 我們可以看看5’終端的分技演化現象，即由與樣本 C雜交的序列演變成能與樣本A雜交的序列（EBZ序列 -8- {請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) •装· •打· •線. 甲 4(210X 297公沒） 212202 Α6 Β6 五、發明説明ί/> (請先聞讀背面之注意事項再瑱寫本百} )。這種分析方法可找出5’分裂點。由BSP73AS 細胞取得的RNA可以保護較短的片段，而從B S p 7 3 ASML細胞取得的mRNA則能夠保護較長的片段。這 痼現象是因為它們與所提供樣本的全長有共線性。人們可 以下一値結論，此cDNA克隆代表pMeta — 1序列 。此序列存在於會形成轉移性腫瘤的BSP73ASML 細胞中。在BSp73ASML細胞中可以找到RNA的 3*和5’ E域。EZB序列的轉換現象可以利用上述的 技術得到一幅示意圖，顯示有別於一般的剪接機制。轉換 成EZB序列的5’和3’轉读點（P o i n t s of Trans i t i ons)如圖1中以箭頭所指的位置 Ο 1. 1ASML單源抗體能鑒定CD44糖蛋白變異形式 為了獲得表面蛋白質的結構資料，所有以克隆技術取 得的cDNA分子的序列皆已進行分析。圖2是pMet a — 1克隆的全長核苷酸序列與此核苷酸序列所能産生的 胺基酸序列。此cDNA全長有3207痼核苷酸，它的 3’終端有聚腺苷（Po 1 y A)末端，且有兩値額外 聚腺苷化作用的訊息位於第2 2 8 8和1 7 4 3位置上。 第一値ATG密碼子位於c ο n ce n s u s起始序列之 組濟部中央橾準局印裂 此為 ， ，質性 區白特 讀蛋的 閲該水 的於疏 成由有 組。具 所肽酸 酸多基 苷的胺 核酸値 僑基 19-9 胺 2 -ο 値首 5 3 此 1 ο 因 段 5 , 1 生偽 了産闊 立以的 建可質 其區白 ，讀蛋 後閲膜 甲 4(210X2971'潑） 212202 A6 B6 — _
經濟部中央揉準局印$L 五、發明説明) 且 代 表 一 値 訊 號 肽 ( S i S η a 1 P e P t » 1 d e ) 0 這 些 序 列 的 任 何 部 份 到 百 前 為 止 均 沒 有 在 資 料 庫 中 找 到 0 但 是 9 我 們 在 最 近 已 找 到 此 序 列 的 同 源 現 象 » 參 考 文 獻 為 有 關 淋 巴 細 胞 h 〇 m i η S 受 體 C D 4 4 ( 與 P S P — 1 ) 的 出 販 物 ( I d Z e Γ d a e t a 1 • » 1 9 8 9 1 G 〇 1 d S t e i η e t a 1 • 9 1 9 8 9 • » S t a m e η k ο ν i C e t a 1 • » 1 9 8 9 > N 0 t t e η b u Γ 8 e t a 1 « % 1 9 8 9 > Z h ο u e t a 1 # 9 1 9 8 9 ) 0 這 些 同 源 現 象 只 駸 格 限 於 c D Ν A 的 5 t 和 3 9 部 份 » 包 括 不 被 翻 譯 的 部 份 t 且 其 末 端 為 前 述 B s Ρ 7 3 A S 和 B S P 7 3 A S Μ L 之 R N A 演 化 分 技 點 〇 各 演 化 分 歧 點 之 間 的 全 長 距 離 ( 圖 2 中 箭 頭 所 指 者 ) t 即 與 轉 移 性 腫 瘤 有 關 的 E Z B 序 列 全 部 長 度 t 在 Ρ g P — 1 或 C D — 4 4 序 列 中 皆 沒 有 找 到 0 與 轉 移 性 腫 廇 有 關 的 糖 蛋 白 顯 然 是 代 表 種 C D 4 4 糖 蛋 白 的 變 異 體 0 此 蛋 白 質 含 有 一 段 長 度 為 1 6 2 値 胺 基 酸 之 位 於 細 胞 外 的 官 能 區 ( D 〇 m a i η ) 〇 因 此 細 胞 外 區 域 增 長 為 4 1 2 値 胺 基 酸 ( 已 減 去 2 1 値 胺 基 酸 的 訊 息 肽 ) 0 而 原 來 沒 有 修 飾 過 的 C D 4 4 糖 蛋 白 的 長 度 為 2 5 0 値 胺 基 酸 ( 亦 已 減 去 訊 息 肽 ) .〇 在 不 會 形 成 轉 移 性 腫 瘤 的 B S P 7 3 A S 細 胞 中 * 已 發 琨 设 有 被 修 飾 過 的 C D 4 4 分 子 糸 列 0 這 些 與 B S P 7 3 A S 的 R N A 互 補 的 C D Ν A 序 列 已 能 利 用 克 隆 技 術 製 備 0 位 於 額 外 官 能 區 之 外 -10- ......................................................装..............................ir...................................^ {請先«I讀背面之注意事項再填寫本百) 甲 4(210X297 公尨） 212202 A6 B6 經濟部中央搮準局印製 五、發明説明ί1 ) 且具有轉移性腫瘤持異性的克隆的性質亦已知道。 C D4 4變異種的表達與形成轉移性腫瘤的潛力有閼 為了測試是否C D44變異種糖蛋白只在B S p 7 3 ASML細胞中表達，又是否與這些細胞或一般細胞形成 轉移性腫瘤的潛力有關，我們研究了不同種類的i sos en i c大鼠腫瘤细胞株，如乳癌1 3762NF細胞株 (Neri e t a 1 . , 1982)。朝這儸方向 研究，我們比較了從親代腫瘤衍生而來的細胞株，如MT Pa, MTC, MTF7,和 MTA 細胞（第一組），與 由淋巴結或肺轉移性腫瘤所建立的細胞株，如MTLy, Μ T L η 2 , Μ T L η 3 (第二組）.。與 BSp73AS 細胞的RNA相同，當與樣本B進行雜交時，第一組細胞 主要表逹出正常的CD44模式。另一方面，與樣本A進 行雜交，只見有一較少童且擴散的RNA區帶，其分子大 小約為2 . 5 k b。第二组細胞則顯示完全不同的R N A 模式。樣本A與樣本B皆能與較大之RNA雜交。其大小 與在BSP73ASML中所顏示的相同。這種相似程度 亦可見於RNa s e和S 1核酸酶保護性分析結果中。從 這些結果看來，RNA剪接模式的改變和CD44變異種 的基因表達與産生轉移性腫廇有關。這些在會形成轉移性 腫瘤的乳癌細胞改變的棋式與上逑那些會形成轉移性腫瘤 的BSp73ASML細胞株改變模式相似。抗體所能辨 認的蛋白質與在B S p 7 3ASML細胞中的蛋白質相當 {請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) _裝· •打· •綠. 甲 4(210X297公沒） 212202 A6 B6 五、發明説明ί/^) 。在這糸列的乳癌研究中，我們也發現RNA和蛋白質與 轉移性腫瘤有持異性關偽的基因表達。事實上，在能與樣 本Α雜交的核酸（所讚ΕΒΖ序列）中都可找到第一組（ 所諝親代細胞株）中的RNA。而且，利用抗體，可以测 出一種分子量為1 00000道爾頓的蛋白質。從這些發 現可知，第一組細胞具有些撤會形成轉移性腫瘤的能力。 而原來的腫瘤細胞株B S p 7 3A S則完全沒有顯示任何 會形成轉移性腫瘤的能力。 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 鲺濟部中央搮準扃印级 成 注間以，果移形辨而色 形移下時可示結轉擾能，角 的轉皮段驗顯的成干所面要 瘤關以 一試果驗形能體表重 腫有是隔種結試胞饈抗胞極 性列胞每這。列細抗此細箸 移条細，。應条癌該示的演 。 轉 一 L 後内反這制示顯瘤扮用 鼠了 Μ 前腔疫。抑顯亦腫程有 大行 S 胞腹免了 以果驗性過分 制進 Α 細入生生可結試移成十 抑鼠 3 癌射産産體學些轉形法 以大 7 種注體確抗力這成的方 可 CP 接髏抗的 L 動。形瘤斷 醱 i S.在抗的體 Μ 的程會腫診 抗 ηΒ 。源入抗 S 用過於性和 源 e 。内單射的 A 作步位移療 單 S 驗體把注白 1 制初是轉治 LO 試物} 對蛋 .抑的構在展 M S 的動天何球 1 種瘤結質發 s i 成進三如疫射這腫質白究 A 用形輸至鼠免注 。性白蛋研 1 利瘤式天大鼠現瘤移蛋些對 . 腫方兩驗小發腫轉的這且 1 性射丨测抗是性成認且 ， 中 4 (210X297公沒） 212202 級濟部中央橾準馬印製 A6 B6 五、發明説明ί丨1 ) 分離與大鼠E BZ之c DNA序列片段同源之人類核酸序 列 酋然，從人類癌细胞的培養中測試是否具有轉移性腫 瘤的形成待戡，並沒有像大鼠細胞培養中那樣容易。從一 些免疫缺乏小鼠的實驗中可以得到人類轉移性腫瘤形成研 究的一些结論。為了進一步研究，也得把以前建立的培餐 成功的細胞株拿來測試，試驗的目的是看看這種核酸序列 在其他細胞中是否也有表達。結果顯示，已找到有其他細 胞也會表達這些核酸序列。例如，從一種人類大型肺癌細 胞而來的細胞株（名為LCLC97)中找到三種RNA (大小分别是5 . 5 , 3.4. 和2 . 8 k b )。這 些序列與在大鼠細胞中發現的轉移性腫瘤形成特戡完全相 同。它們能與樣本A、樣本B、和樣本C雜交。這些人類 RNA與pMeta — 1的cDNA序列有很多地方（8 5 % )皆相同（見圖3a)。 可是，1. 1ASML單源抗體並不與造種臛瘤细胞 反應。抗鱧所辨認出的蛋白質片段一定與人類腫瘤細胞表 面蛋白質抗原決定基不同。由於抗體具有高度特異性的關 偽，些撤的差異便會造成沒有反應的結果。人類的LCL C97腫廇細胞可以用作裂備cDNA基因庫。由於大鼠 與人類核酸序列高度相似的關偽，可以分離出與樣本A同 源的cDNA克隆。此人類cDNA克隆的核酸序列已經 测出。臛3 ( a , b )為所得到的核酸序列和由此核酸序 -13- {請先閲讀背面之注意事項再填穽本頁) •裝· .打· •線· 甲 4(210X297公寒） A6 B6 212202 五、發明説明ί |y) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 列所産生的蛋白質序列◊由此可見，從人類與大鼠所得的 這些序列大部份均相同。所不同的區域（稱為變異區）在 人類序列中有330掴胺基酸，在大鼠序列中有334個 胺基酸，此段區域可分成五値官能區（do n?a i η)， 其位置分佈如豳4所示。把官能區2和3引入非轉移性腫 瘤細胞中能導致大鼠轉移性腫瘤的形成。官能區2和3相 當於pMe t a — 1中的變異區域。這些人類和大鼠核酸 序列與由其産生胺基酸序列皆為本發明的内容。 實施例 細胞與抗體： 以下的選殖細胞株是供作下面的試驗： B S p 7 3 14ASML-1 和 10AS — 7 細胞 株以 Matzku e t a 1 . , (1983)的方法 培餐。而13762NF乳癌細胞株則以Ner i e t a 1 . , (1982)的方法培養。 •綠. 經濟部中央搞準局印裝 對抗BSP73 ASML膜蛋白質的單源抗髏可以 利用經免疫處理的Ba 1 be小鼠製備。根據Koh 1 e r (198 1)的方法，把那些小鼠的脾臟細胞分離後， 將之與As 8骨銶瘤細胞融合，變成不死的細胞。從所得 的融合廇細胞中可以篩選出特殊的細胞，那些細胞能産生 對抗BS p 73ASML但不對抗BS p 73AS和正常 大鼠成纖維細胞的待異性抗髏。詳細的操作程序如We η zel (1986)所述。 -1 4 _ 甲 4 (210X 297 公廣) Α6 Β6 212202 » 五'發明説明（ 利用细胞培養方法，可把那些能産生具有特異性的單 源抗體（mAK)的融合瘤細胞增殖。利用硫酸銨沉澱法 和柱層析法（蛋白質A — Sepharose和Mono Q)可以分離及濃缩被细胞釋放於培餐液中的單源抗鼸。 分離出的單源抗體可用於本發明中的試驗。其中一種單源 抗鱧是 mAkl. 1ASML。 免疫螢光法 為了在各種腫瘤細胞中産生CD44變異分子，先把 那些腫瘤細胞培養好，然後以磷酸缓衝的氨化鈉溶液.（P BS)冲洗，並在4TC溫度下與1. 1ASML培育30 分鐘。利用帶螢光偶合分子的第二種抗體與之反應，並在 螢光顯徹鏡下觀察結果。此第二種抗體是由兔子所産生的 抗小鼠IgG,且與rhodamine螢光原厲合。 建立c DN A表達基因庫和利用免疫方法進行筛選 利用寡核酸d T和含有六値核苷酸組成不一致的核苷 酸鏈分離BSp73ASML細胞中的Po 1 yA+ R ΝΑ。利用AMV逆轉錄酶合成與RNA互補之cDNA 第一條鍵。cDNA的第二條鐽則利用大腸桿菌DNA聚 合酶I、RNaseH和連结酶製備。然後利用T4 DN Α聚合酶把製得之雙鐽cDNA末端處理形成接口。利用 Smal限制酶切開載體ρΕχι, 2和3 ( S t a η 1 ey和 Luzi〇, 1984)，然後利用T4連結 -1 5 _ 甲 4 (210X297 公沒) (請先聞讀背面之注意事項再填來本页) •裝· .*τ· ί. 經濟部中央搞準局印裝 2ί2202 Α6 Β6 經濟部中央》準局印製 五、發明說明γ) 酶把載醭與c DNA連结在一起。這些載鑤有三傾不同的 閲讀匾域可以插入cDNA。適用的大腸捍菌DH5 ( p C 18 5 7)細菌能産生一種對溫度敏感的抑制子（R e P r* e s s o r)。把這些細菌與pEX-cDNA進行 轉染（Transfect)作用，並在尼龍濂片上培餐 。那值對溫度敏戚的抑制子的基因位於質ISpC I 857 之上，此質體與pEX質體相容。在281下，控制结合 蛋白合成的λΡΙΪ 促進子（Promo tor)被闋閉。 CI抑制子也會在溫度昇高至4 2C時受到抑制。因此， 在這種情況下，/3 -半乳糖酶/ ASML结合蛋白的合成 不會受到抑制，並且大量的産生，發生作用。随後會利用 氣仿蒸氣把在濾片上由熱力的關偽而産生的《落處理，將 其活性消滅。那些濾片放於含3%奶汁、溶菌酶、和DN a s e的PBS中溫育。細薗所産生的結合蛋白會固定在 尼龍濾片之上，再將其與mAkl. 1ASML結合。把 非持異性結合的mAk洗除後，再與第二種抗饉結合，此 種抗體是具有1 2 5 I樣記之兔子抗小鼠I s G ,可用來 測出是否有結合作用。在放射自顯影方法得到陽性結果後 ,把陽性克隆從原來的細菌濾片上分離出來，並作進一步 分析。其中一痼克隆能夠合成與1·1ASML進行特異 性反應的結合蛋白，己取名為PEX34。此pEX質髏 在細菌中帶有1 6 7個核苷酸的c DNA,能夠産生所需 的epitope (各抗原決定基），具有mAkl. 1 -1 6- {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· •打_ -綠· 甲 4(210X297 公尨） A6 B6 212202 五、發明説明qf) ASML有待異性（其位置區域可參考圖3a)。 {請先閱讀背面之注意事項再琪寫本页) 依照標準的方法，可以分離全長的pMe t a — 1之 c D N A 〇 大鼠進行mAkl. 1ASML免疫注射 把mAkl. 1ASML (與KLH辑合）以皮下方 式注射至那些準備接受B S p 7 3腫瘤細胞的BDX大鼠 龌内。抗匿製劑是與Freund s佐劑諏和的。注射入 抗體的時間是在接受腫瘤细胞前的10天、7天、3天， 和接受腫瘤細胞後的第3天、7天、11天、14天、和 2 1天。而腫瘤細胞則是利用注射方式接種於大鼠體内， 注射的部位是脚掌的脂肪層。28天後，把大鼠殺死，取 出不同位置的淋巴結，稱重，並記錄肉眼能見的肺部轉移 性腫瘤的數目。 (註：KLH 為 Keyhole Limpet Η aemocyan ί ne 的縮寫） 變異C D44表面蛋白質的表達與形成轉移性腫瘤的潛力 之關偽 經濟部中央搮準局印装 為了測試變異CD44表面蛋白質的表達是否只是BS p 73ASML細胞株的一種待性而已，或是與形成轉移性 腫瘤的潛力存有密切關傷，於是進一步研究由1 3 7 6N F —乳癌（Neri e t a 1 . 1982)衍生而 來的其他大鼠腫瘤細胞株。在這些細胞株中，比較由原發 -17- 甲 4(210X 297公寒)
A B 2122G2 五、發明説明（〔l) 性腫瘤所衍生而來的第一組細胞（MTPa, MTC, Μ TF7和ΜΤΑ)與由淋巴結和肺轉移性腫瘤衍生而來的 第二組細胞株（MTLy, MTLn2, MTLn3)。 由圖4中可看到由CD44衍生而來的RNA,其中樣本 A、B和D與圖1和說明窨前面提及的相同。第一組細胞 株與樣本B反應皆可得到正常的CD44模式。相反的， 第二组細胞株則産生不同的棋式。那些RNA比較第一組 細胞株的RNA稍大，且與BSP73ASML的RNA 相當。這種模式顯示兩類腫瘤具有最大的相似性。較小的 RNA會在與樣本D雜交時丢失，因為辨認區域位於第一 個终結訊號之後，而且各RNA的终結訊號有所不同。 利用樣本A所顯示出的RNA棋式，為BSp73A SML的第二組細胞株。由於樣本A不與BSp73AS 細胞的RNA雜交，第一組細胞株的雜交模式中有一小小 的擴散RNA區帶，該區帶中的RNA大小約為2. 5k b。 RNase和S1核酸酶保護性分析試驗中可顯示结 構上的相似性。由這些結果看來，切割模式（剪接模式） 的改變和變異C D44的RNA是否表達與轉移性腫瘤形 成有醏。 過度表達pMe t a — 1可把形成轉移性腫瘤的潛力轉移 至非轉移性腫瘤的BS p 7 3AS細胞 從兩類腫瘤细胞株的研究中，變異CD44的表達與 形成轉移性腫瘤的潛力之間的闢俗可以看出這些糖蛋白在 -1 8 - 肀 4(210Χ297公寿） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) ，裝· •綠* 經濟部中央搮準局印製 212202 五、發明説明f 形成轉移性腫瘤的過程中有一定的角色。為了檢核這艏结 果，把pMeta — 1轉移至BSp73AS細胞中，並 測試該細胞是否會因此受影辙而改變細胞持性。把PMe ta_l的完整序列（見圔2)插入於SV40 —促進子 之後，再把這種結構（見圖5)與PSV2ne〇 —起插 入於BSP73AS細胞。其後，可得到値別具G418 抗拒性的菌落和能表達pMe t a — 1的菌落。下面以受 轉染體代表這些菌種。這些菌落中有兩個的RNA棋式如 圖5所示。與樣本A (與變異CD4)雜交後，得到一値 大小為2 · 2 k b的主要的轉錄序列，其大小與常見最小 的RNA相當。此轉錄序列是在BSP73ASML細胞 中被轉錄的（見圖5)。可是，在受轉染（Transf ected)的細胞中的含置約為在BSp73ASML 中的1 0倍之多。 經濟部中央採準局印^ {請先聞讀背面之注竟事項再填宵本頁} 從其中一種||染細胞（BSP73AS-pSVMe t a 1 — 14)發現有不同大小的RNA。這種情況可能 是由於質體整合的位置所致。一種PSV2neo克隆和 BSp73AS接受細胞並無與樣本A互補的RNA。為 了可以鑒定内源性正常CD44 (沒有額外的pSVNle ta — 1官能區）在受轉染駸（Transfectan t)内的轉錄作用，把濾片浸於溶液中並與樣本〇進行雜 交。非翻譯3，序列的部份並沒有在這値表達克隆中（見 圖5)。樣本D可以提供長度為2. 9和4. 9kb的轉 -19- 甲4(210Χ 297公廣） A6 B6 2122C2 五、發明說明, 錄體均存在於此兩種轉染體RNA中（見圖5的右方）。 但在控制组的BS p 73AS细胞和受BS p 73AS p SVn e 〇轉染的細胞中卻找不到。不同雜交試驗的量化 结果可以顯示從質醱上轉錄之變異CD44的RNA的表 達置約為内源性C D44基因轉錄髏的表達量的5倍、 過度表達的cDNA會經翻譁作用産生蛋白質。圖5 中所顯示的兩種受轉染體（Transfectant) 都會合成大小相當的mAb 1 . 1 ASML可免疫染色蛋 白霣（Immune Stainable Prote i ns)。此種蛋白質為一主要為150kDa的産物和 一個位於lOOkDa的較弱匾帶的蛋白質。由於cDN A序列産生原發性蛋白質産物，約為583値胺基酸，所 有可見的匾帶必定會産生修飾過的形式。該150kDa 區帶與變異CD44的修飾形式之一匯聚，在會形成轉移 性腫瘤的BSp73ASML细胞中表逹。BSp73A S或BSp73ASpSVneo细胞皆不含有此蛋白質 。在BSp73ASML細胞中，在受轉染體細胞表達的 (請先聞猜背面之注意事項再蜞寫本頁) •装. •打· 經濟部中央榡準為印裝 轉源驗速 a 成同實快 Μ 形入的位 ί 有射述部内 具注前射體· 生 Β 在注於 産染。在佈 力轉} 胞散 。能受法細全 上有把方 L 完 面逹，瘤Μ右 表表胞ats 左 · 胞的细性 <:天-20 细4S 移 3 ο -於4A 轉71 露 D 3 性 P 後 暴 C 7 發 S 射 是異 P 自 B 注 e 變 S ί 瘤約 Ρ 示 Β 中腫在 〇 顯的鼠性且 t 了瘤大移而 i 為腫 X 轉 ， P 性 D 把佈 e 移 B , 散 •線. 甲 4(210X297 公沒） 2122C3__Be_ 五、發明説明r.j) t z k u , 1984)。在第十天時，把所有局部性腫 瘤切除。所有搛帶BSP73ASML細胞的動物和所有 接受一種過度表達的受轉染醱的動物都發展成肺轉移性腫 瘤（見表1)。形成轉移性腫瘤的遇程相當快速，在注射 後5至8星期之内。那些接受BSP73AS细胞注射或 類似受轉染醱注射的動物在這段時間後絶對健康（除了切 除手術患處），甚至五値月後仍没有轉移性腫瘤形成。 儘管轉移性腫瘤形成過程有相似之處，但仍有一些有 趣的差異。在所有的動物中，BSp73ASML細胞都 會到達淋巴結，並且會導致淋巴结腫大，這些淋巴结的位 置在腹股溝部位和接近大動脈處（見表1)。在接受其他 受轉染體（BSp73AS — pSVMetal — 15) 注射的動物中的淋巴結沒有腫大。因此，這些受轉染B似 乎能夠在肺形成群落而無須在淋巴結中生長。 根據表1實驗中進一步可以看出B S p 7 3AS和B SP73ASML之間的另一痼差別。値別的肺轉移性腫 瘤可以用肉眼看到，B S p 7 3 A SML所産生的瘤結髏 積小而數目多。但在較大条列的BSP73ASML細胞 中（Reber e t a 1 . , 1990)大約 20 隻動物中有1 1隻會發展成較大的瘤结。 經濟部中央橾準局印製 {請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) 為了證實轉移性腫瘤是由注射入的受轉染體所造成的 ，以及排除因自發性突變而引致轉移性腫廇的可能性，持 別測定全肺萃取液和會形成轉移性腫瘤的細胞萃取液中的 -2 1- 甲 4 (210X297 公廣） A6 B6 04 9/202 五、發明説明ίν0) ep i tope陽性蛋白質。在曾經注射入65?六3 — p SVMe t a 1 _ 1 5受轉染暖的動物全肺萃取液及特 異性肺腫瘤結萃取液中含有150kDa的糖蛋白。G4 1 8抗性品種在體外生長琛境中會有表達一相同分子量的 蛋白霣。 診斷與治療方法 1. 利用現存人類pMeta — 1序列進行原位雜交 方法分析人類腫瘤。逭些試驗在人類EZB抗醱未有供應 前可以作為初步試驗之用。 2. 製備對抗人類EZB的抗《。把人類pMe t a 一 1序列以克隆技術置於细菌表達載髏上，以便産生具有 麩胺基硫一S轉移酶的結合性蛋白質。把這些結合蛋白質 ，及EZB合成肽（偶合至載龌分子上），以免疫接種於 兔子中。分離出多效價，及單一持異性，的抗體。把人類 腫瘤細胞膜製備物，及細菌結合蛋白質，以免疫方式注射 入小鼠中以製備單源抗體。 應用範圍
一臨床腫瘤物質的免疫組織學檢驗（診斷方法）。 一利用EL I SA試驗檢測病人血清中的可溶性EZ B (診斷方法）。 -製備與赛素偶合的抗髏。籍抗體之助，可把毒素帶 至轉移性腫瘤區域去（治療方法）。 -22- 甲 4(210X297 公发） ..................................................其..............................ir..................................^ {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页} 鮏濟部中央搮準局印裝 A6 B6 cy\) 212202 五、發明·说明 一製備含有雙抗原结合部位的抗體。利用這種雙特異 性可以在轉移性腫瘤區域進行細胞毒性反應（例如，抗C D2或CD3偶合作用）。（治療方法）。 3.利用帶有完整的hMe t a_l cDNA序列 的表逹載鼸與人類或大鼠細胞進行轉染作用，以製備hM e t a_ 1蛋白霣；及從LC LC9 7细胞中將其除去。 應用範圃 一把這種蛋白質或其一部份注射入身體内，以阻斷腫 瘤細胞的組織結合部位。 —在找出結合部位的性質後，可以把結合蛋白質注射 入身體内，以阻斷移動中的腫瘤細胞。 {請先閲讀背面之注意事項再填窵本頁) ，打· 煺濟部中央橾準扃印製 甲 4 (210X297 公沒) 212202 地濟部中央搮準為印裝 A6 B6 •5·、發明説明（v^ 參考文獻 Goldstein, L. A ., Zhou, D.F.H., Picker, L.J., Minty, C.N., Bargatze, R.F . , Ding, J . F . and Butcher, E.C. (1989) A human lymphocyte booing receptor, the bernes antigen, is related .to cartilage proteoglycan core and link proteins. Cell 56:1063-1072. Hart, I.E., Goode, N.T. and Wilson, R.E. (1989) Molecular aspects of the metastatic cascade. Biochim. Biophys. Acta 989:65-84. Idzerda, R.L., Carter, W.G., Nottenburg, C., Wayn e r, E.A., Gallatin, W.M. and St. John, T . (1989) Isolation adn DNA sequence of a cDNA clone encoding a lymphocyte adhesion receptor for high endothelium. P r o c. Natl, Acad. Sci. U . S . A . , 86: 4659-4663. Kohler, G. (1981) In: I.Lefkovits and B.Pernis (eds). Immunological Methods. Vo. 2 p. 285. N.Y. Academic Press. M a t z u, S., Komitowski, Mildenberger and Zoller, M. (1983) Characterization of B*p73, a spontaneous rat tumor and its in vivo selected variants showing different metastasizing capacities. Inv. Met. (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· •打· •線· 甲 4 (210X297 公沒） 212202 A6B6 五 發明説明 3:109-123.- m Matzku, S., Wenzel, A., Liu, S. and Zoller, M. ( 1 9 8 9 ) . Anti-genic differences between metastatic and nonmetastatic BS p 7 3 rat tumor variatns characterized by nonoclonal antibodies. Cancer Res. 43: 1294-1299. H e r i, A., Welch, D., Kawaguchi , T. and Nicolson, G.L. (1982) Developnent and biologic properties of malignant cell sublines and clones of spontaneously metastasizing rat naDmary adenocarcinoma. J. Natl. Cancer Inst. 68: 507-517. Nicolson, G.L. (1987) Tumor cell instability, phenotype: from oncogene to oncofetal expression. Cancer Res； 47: 1473-1487. Nottenburg, C. Rees and St. John T. ( 1 9 8 9 ) Isolation of mouse C D 4 4: structural features are distinct from the primate c D N A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 8621-8525. Stamenkovic, I ., A a i o r M. P e s a n d o . J. M . and Seed. B. (1989) A lymphocyte molecule implicated in lyaph node homing is a n e m b e r of the cartilage link protein family: Cell 56: 1057-1062. -yf- {請先M讀背面之注意事項再瑱寫本页} .裝· •打· .綠· 甲 4(210X297 公沒） i 2122G2 蛆濟部中央抹準局印¾ A6 B6 五、發明説明ί>% Stanley K.K. and Luzio, J.P. (1984), Construction of a new family of high efficiency bacterial expression vectors; identification of c DN A * clones coding for human liver proteins. EMBO J. 3: 1429-1434. Wenzel, A. ( 1 9 8 6 ) Charakteris ierung von Differenzierungsantigenen auf den Rattentunor Bsp 7 3 m i t H i1f e aonoklonaler Ant ikorper. (M Characteriziation of differentiation antigens on the rat tumor Bsp 73 with the aid of monoclonal antibodies”）. Diploma thesis. University of Karlsruhe. Zhou, D.F.H., Ding, J . F . , Picker L . F ., Bargatze, R.F., Butcher, E.C. and Goeddel, D.V. (1989) Molecular cloning and expression of Pgp-i. The oouse homolog of the human H-CAM (Hermes) lymphocyte homing receptor. J. Immunol. 143: 3390-3395. Mat zku, S. ( 1 9 84 ) , Natural cytotoxicity in lymphatic metastatsis. II. In vivo studies with BS p 7 3 variatns differing in netastiatic cape i ty. Cancer Inmunol. I π πuηother . 17, 106-111. Reber，S. , Ma t z k u, S . , Gunthert, U . , Ponta , H ., -xi- {請先閱讀背面之注意事項再填薄本頁) •装. *打· .綠. 甲 4(210X 297 公发） 212202 A6 B6 五、發明説明 Μ f ο {請先聞讀背面之注意事項再蜞寫本页) ，裝. .打. 經濟部中央棣準局印裂 甲 4(210Χ 297 公沒） >?- - 212202 表2 能表達變異性CD44 eDNA pMeta- 1之BSP73AS的轉移性腫瘤 散佈* * 的 射瘤胞 注踵細 局部發生 在屍檢中發現的 轉移性腫瘤 LNina LN par 肺部 BSp73ASML 0/8 8/8 0 1.5-2.5** 8/8 0 2.5-5.0 8/8 粟粒狀V BSp73AS- pSVMetal-14 0/8 3/8 0 0.3-1.2 3/8 ¢1.0-4.5 8/8 -多處 ：，0 0 · 3-5 · 0 BSp73AS- psVMetal-15 0/8 0/8 0/8 8/8 5-20, φ 0.3-10.0 BSp73AS 1/8 0/8 0/8 0/8 BSp73AS—pSVneo 0/8 0/8 0/8 0/8 平均直徑以毫米計算 本表顯示所述細胞在注射後60天時的狀態。 LN =淋巴結 ~ ing:腹股溝 par:大動脈旁