JPH0787994A

JPH0787994A - Ｔ細胞抗原受容体Ｖβ２２に対するモノクローナル抗体及びその製造方法

Info

Publication number: JPH0787994A
Application number: JP6014873A
Authority: JP
Inventors: Takehiko Sasazuki; 健彦笹月; Taiji Nishimura; 泰治西村; Yasuhiro Okamoto; 安弘岡本
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 1995-04-04

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】ヒトのＴ細胞抗原受容体の多様性を識別する
ことができるモノクローナル抗体及びその製造方法の提
供。【構成】ヒトのＴ細胞抗原受容体β鎖のＶ領域２２に
対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメン
ト。ヒトの溶連菌細胞抗原特異的Ｔ細胞で免疫した齧歯
類動物の脾細胞とマウスのミエローマ細胞とを常法に従
って融合し、抗体産生細胞とミエローマ細胞が融合した
ハイブリドーマを選別し、所望の抗体を生成するハイブ
リドーマを選択した後、限界希釈法により、単一のクロ
ーンにし、この単一クローンのハイブリドーマの培養上
清液からモノクローナル抗体を回収することを特徴とす
るヒトのＴ細胞抗原受容体β鎖のＶ領域２２に対するモ
ノクローナル抗体の製造方法。ヒトのＴ細胞抗原受容体
β鎖のＶ領域２２に対するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、モノクローナル抗体に
関し、さらに詳しくはヒトのＴ細胞抗原受容体β鎖のＶ
領域２２に特異的に反応するモノクローナル抗体、その
活性フラグメント、該モノクローナル抗体の製造方法、
及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに
関する。なお、本発明において、モノクローナル抗体の
活性フラグメントとは、抗原抗体反応活性を有するフラ
グメントを指称し、具体的には、Ｆ（ａｂ′）₂、Ｆａ
ｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ及び組み替えＦｖ体などである。

【０００２】

【従来の技術】Ｔ細胞受容体（Ｔ細胞レセプター：ＴＣ
Ｒ）とは、Ｔ細胞表面に存在し、種々の抗原を特異的に
認識し、その後に引き続いて起こる種々の免疫反応の引
金となる重要な分子である。ＴＣＲは、α鎖（５０ｋ
ｄ）、β鎖（４０ｋｄ）の２本のポリペプチド鎖がジス
ルフィド結合しており、それぞれ可変部と不変部の２つ
のドメインから成り、免疫グロブリン分子との相同性が
高い。なお、少数ではあるがγ及びδ鎖からなるＴＣＲ
も存在する。α及びβ鎖の可変部は、抗原認識に働く抗
原結合部を構成するが、この部が各Ｔ細胞で異なり、異
なった抗原決定基と結合するこの多様性は、遺伝子の再
構成で決定されている。

【０００３】このＴ細胞レパートリーの多様性は、Ｔ細
胞がもつ多様な抗原認識能と密接に関係しており、Ｔ細
胞の機能、免疫応答、及び免疫機能を考える上で、ＴＣ
Ｒレパートリーの機能解明を行うことは、極めて重要で
ある。即ち、癌、自己免疫疾患、アレルギー疾患等にお
いて、患部局所に存在するＴ細胞のＴＣＲレパートリー
解析の研究が進められ、疾患特異的なＴ細胞が解明され
つつある。しかし、そのＴ細胞上のＴＣＲ分子が、どの
ような働きをしているのかは、ＴＣＲ分子の単離等に問
題があり、詳細な解明が行われるには至っていない。

【０００４】また、溶連菌細胞壁抗原（ＳＣＷ）は、α
βＴ細胞やγδＴ細胞の活性化と増殖を誘導する。この
免疫応答は、低応答性がＨＬＡ（ヒト白血球抗原）と連
鎖した優性形質であること、さらには、低応答者におい
ては、ＨＬＡ−ＤＱｗ６に拘束されたＳＣＷ特異的Ｔ細
胞の存在が示唆されている。しかし、ＳＣＷは、複数の
タンパク質を含む粗抽出物であることから、ＳＣＷのど
の部分に対し、応答するのか同定することが必須であ
り、これを解析するため、合成ペプチドを用いてエピト
ープを同定する方法がとられるのが一般的である。一
方、抗原特異的Ｔ細胞については、その抗原特異性を決
めるレパートリーについて、抗体等を用いて解析を行う
が、現在までそのレパートリーを見分けることができる
抗体がないのが現状である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】Ｔ細胞のレパートリー
は、Ｔ細胞レセプターの可変領域により区別されるが、
現在までのところ、遺伝子レベルでの解析が一部の施設
で行われているのにすぎない。この解析方法は、Ｔ細胞
レセプターのｍＲＮＡを細胞から単離し、これを逆転写
酵素で相補的なＤＮＡした後、各可変領域に特異的なオ
リゴＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後、
電気泳動、サザンハイブリダイゼーションを行うもので
あり、操作が複雑である上、定量性がなく、結果が出る
まで３日間要し、一部の施設でしか行うことができなか
った。本発明の目的は、ヒトのＴ細胞抗原受容体の多様
性を識別することができるモノクローナル抗体、及びそ
の製造方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトＴ細
胞レセプターの多様性を識別する抗体を作製すれば、容
易にＴ細胞レセプターのレパートリーの解析ができるの
ではと考え、抗体の作製を試みた。即ち、ＳＣＷ低応答
者より樹立したＳＣＷ特異的ＤＲ４拘束性ＣＤ４⁺Ｔ細
胞を腹腔内免疫することにより、免疫原である細胞とは
反応するが、他の同じドナーで樹立したＳＣＷ特異的Ｄ
Ｑｗ６拘束性ＣＤ４⁺Ｔ細胞とは反応しないモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立することに成
功し、本発明を完成するに至った。かくして、本発明に
よれば、ヒトのＴ細胞抗原受容体β鎖のＶ領域２２（Ｖ
β２２）に対するモノクローナル抗体とその活性フラグ
メントが提供される。

【０００７】また、本発明によれば、（１）齧歯類動物
をヒトの溶連菌細胞抗原特異的Ｔ細胞で免疫感作し、
（２）免疫した齧歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞
の懸濁液を形成し、（３）該脾細胞懸濁液をマウスのミ
エローマ細胞と融合促進剤の存在下で混合して、両細胞
を融合し、（４）融合した細胞を未融合のミエローマ細
胞を支持しない媒質中で希釈して培養して、抗体産生細
胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを選別
し、（５）ハイブリドーマを含有する各培養穴中の上清
液について、免疫した細胞株との反応性を指標として、
抗体の存在を確認し、（６）所望の抗体を生成するハイ
ブリドーマを選択した後、限界希釈法により、単一のク
ローンにし、（７）この単一クローンのハイブリドーマ
の培養上清液からモノクローナル抗体を回収することを
特徴とするヒトのＴ細胞抗原受容体β鎖のＶ領域２２に
対するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。

【０００８】さらに、本発明によれば、ヒトのＴ細胞抗
原受容体β鎖のＶ領域２２に対するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマが提供される。本発明のハイ
ブリドーマは、例えば、工業技術院生命工学工業技術研
究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１４０２２として寄託さ
れているハイブリドーマＲ１−２１を挙げることがで
きる。

【０００９】以下、本発明について詳述する。本発明に
係るＴ細胞抗原受容体β鎖のＶ領域２２に対するモノク
ローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマは、以下のようにして製造することができ
る。（１）ＳＣＷ低応答者より樹立したＳＣＷ特異的ＤＲ４
拘束性ＣＤ４⁺Ｔ細胞株を抗原としてマウスを免疫し、
免疫したマウスから脾細胞を調製し、これとマウスのミ
エローマ細胞とを融合させて、前記細胞株と反応するモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、
（２）（１）で得たハイブリドーマを適当な条件下で培
養してモノクローナル抗体を回収し、このモノクローナ
ル抗体を用いて、ＳＣＷ特異的ＤＱｗ６拘束性ＣＤ４⁺
Ｔ細胞株やＳＣｗ高応答者由来のＳＣｗ特異的ＤＲ４拘
束性ＣＤ４⁺Ｔ細胞とは、反応しないことを確認し、最
終的にＴ細胞抗原受容体β鎖のＶ領域２２に対するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、
（３）（２）で得たハイブリドーマを培養することによ
り該モノクローナル抗体を回収する。本発明のモノクローナル抗体は、以下の実施例に示す特
異性を有している。

【００１０】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明する。

【００１１】［実施例１］１．モノクローナル抗体の作製（Ａ）免疫感作ＳＣｗ低応答者より樹立したＳＣｗ特異的ＤＲ４拘束性
ＣＤ４⁺Ｔ細胞を８週齢の（ＤＱｗ６トランスジェニッ
クＢ６×Ｃ３Ｈ）Ｆ₁雄の腹腔内に１×１０⁷個接種し
た。３週間後、同細胞を用い、追加免疫した。

【００１２】（Ｂ）融合上記で免疫感作したマウスから脾臓を取り出した。取り
出した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰＭＩ１６
４０培地に浮遊させ、脾細胞１×１０⁸個を得た。この
脾細胞をマウス由来の８−アザグアニン耐性株（ヒポキ
サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠
損株）Ｐ３Ｕ１（２×１０⁷個）と約５：１の割合で混
合し、遠心した（１５００ｒｐｍ、５分）。得られた細
胞のペレットに、融合促進剤として５０％ポリエチレン
グリコール４０００（メルク製）／ＲＰＭＩ１６４０溶
液２ｍｌを３７℃の温水中で撹拌しながら６分間を要し
て加え、細胞融合を行った。融合後、大量（約４０ｍ
ｌ）のＲＰＭＩ１６４０液を加え、遠心分離して上清を
除去した。次いで、ヒポキサンチン（１００μＭ），ア
ミノプテリン（０．４μＭ）、チミジン（１０μＭ）を
含む１０％ＦＢＳ−ＲＭＰＩ１６４０培地（ＨＡＴ）培
地にて、脾細胞が１×１０⁶個／ｍｌになるように調製
した。

【００１３】（Ｃ）ハイブリドーマの選択上記Ｂで調製した細胞浮遊液を９６ウェル（培養穴）・
マイクロプレート５枚に２００μｌずつ分注し、３７℃
５％ＣＯ₂下にあるＣＯ₂インキュベータで細胞を培養し
た。２週間後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形
成して、増殖していることが確認できた。

【００１４】（Ｄ）抗体の検出ハイブリドーマが十分に増殖していることが確認された
ので、その培養上清を用い、以下に示すＳＣｗ特異的Ｄ
Ｒ拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＳＣｗ特異的ＤＱｗ６拘束ＣＤ
４⁺Ｔ細胞との反応性をＥＬＩＳＡ法にて検出すること
により、抗体の検出を行った。９６ウェル・マイクロプ
レートに、これらの細胞株を２×１０⁵個／ｍｌで２０
０μｌずつ１０％ＦＢＳ・ＤＭＥＭ培地で分注し、２日
間培養したものを抗原プレートとした。この培養上清を
吸引後、ＰＢＳで洗浄した。その後１％ＢＳＡ・ＰＢＳ
を２００μｌを加えブロッキングを行った。ブロッキン
グ後、ハイブリドーマの培養上清を１００μｌずつ加え
反応させた。１時間後の反応後、ＰＢＳで洗浄を行い、
２次抗体（ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ）を
加え、さらに１時間後反応した。その後、ＰＢＳで洗浄
し、オルトーフェニレンジアミン、過酸化水素液を基質
として発色反応を行った。その後、イムノリーダーで発
色しているウェルの吸光疫を測定した。その後、免疫し
たＳＣｗ特異的ＤＲ４拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞とは反応する
が、ＳＣｗ特異的ＤＱｗ６拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞とは反応
しないウェルの細胞を選別した。

【００１５】（Ｅ）クローニング抗体産生細胞を限界希釈法により、１個／ウェルとなる
ように９６ウェル・マイクロプレートに分注し、培養し
た。１０日間の培養後シングルコロニーの増殖が確認で
きたため、再び（Ｄ）の抗体検出の操作を施した。その
結果、ＳＣｗ特異的ＤＲ４拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞に特異的
に反応するクローンが得られた。得られたクローンは、
ＩｇＧ₁型のモノクローナル抗体であり、これをＲ１−
２１と命名した。

【００１６】２．モノクローナル抗体の特異性（１）各種細胞株との反応性得られたモノクローナル抗体Ｒ１−２１の各種細胞株と
の反応性をフローサイトメーターを用い測定した。即
ち、細胞株１×１０⁷個／ｍｌ１００μｌに対し、モ
ノクローナル抗体Ｒ１−２１を１μｇ添加し、４℃で３
０分反応させた。ＰＢＳで２度洗浄した後、ＦＩＴＣ−
標識マウスＩｇｓを加え、さらに、４℃で３０分反応し
た。ＰＢＳで２度洗浄後、フローサイトメーターにて測
定した。その結果、免疫に用いたＳＣｗ特異的ＤＲ拘束
性ＣＤ４⁺Ｔ細胞株の５０％に反応するものの、それ以
外の細胞とは、反応しないことが判明した。

【００１７】（２）免疫沈降得られたモノクローナル抗体Ｒ１−２１を用いて、ＳＣ
ｗ特異的ＤＲ４拘束性ＣＤ４⁺Ｔ細胞から免疫沈降を行
った。常法により、免疫沈降した結果、非還元下にて８
０ｋｄ、還元下で４５ｋｄと４０ｋｄの分子であること
がわかった。

【００１８】（３）抗体による増殖反応モノクローナル抗体Ｒ１−２１を９６ウエル・マイクロ
プレートに１０μｇ／ｍｌでコーティングした。このプ
レートに、抹消血Ｔリンパ球を１×１０⁶個／ｍｌで１
００μｌずつ分注した。約１週間の培養後、 ³Ｈ−チ
ミジン１μＣｉ／ｗｅｌｌ分注してＤＮＡ合成を検討し
たところ、抗体の刺激によりＲ１−２１抗体に特異的に
反応する細胞が増殖していることがわかった。なお、前
記のハイブリドーマは、工業技術院生命工学工業技術研
究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１４０２２として寄託さ
れているハイブリドーマＲ１−２１である。

【００１９】

【発明の効果】本発明のＴ細胞抗原受容体β鎖のＶ領域
２２に対するモノクローナル抗体は、Ｔ細胞レセプター
の多様性を識別することから、以下に述べるような種々
の用途が考えられる。Ｔ細胞抗原受容体β鎖のＶ領域２
２を持つＴ細胞の分布が判明するとともに、ＳＣｗのＴ
細胞の認識機序の解析に利用できる免疫反応におけるＴ
ＣＲｖβ２２Ｔ細胞の挙動の追跡が可能となり、様々の
免疫反応におけるｖβ２２の機能を把握することができ
る。また、本発明のモノクローナル抗体を用いることに
より、ＳＣｗに対する免疫応答の結果生じる疾患を治療
することが可能となる。さらに、本発明のモノクローナ
ル抗体は、免疫学の基礎研究から治療への利用まで多く
の効果が期待できる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトのＴ細胞抗原受容体β鎖のＶ領域２
２に対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメ
ント。
【請求項２】ＩｇＧ₁型である請求項１記載のモノク
ローナル抗体またはその活性フラグメント。
【請求項３】（１）齧歯類動物をヒトの溶連菌細胞抗
原特異的Ｔ細胞で免疫感作し、（２）免疫した齧歯類動
物から脾臓を摘出して、脾細胞の懸濁液を形成し、
（３）該脾細胞懸濁液をマウスのミエローマ細胞と融合
促進剤の存在下で混合して、両細胞を融合し、（４）融
合した細胞を未融合のミエローマ細胞を支持しない媒質
中で希釈して培養して、抗体産生細胞とミエローマ細胞
が融合したハイブリドーマを選別し、（５）ハイブリド
ーマを含有する各培養穴中の上清液について、免疫した
細胞株との反応性を指標として、抗体の存在を確認し、
（６）所望の抗体を生成するハイブリドーマを選択した
後、限界希釈法により、単一のクローンにし、（７）こ
の単一クローンのハイブリドーマの培養上清液からモノ
クローナル抗体を回収することを特徴とするヒトのＴ細
胞抗原受容体β鎖のＶ領域２２に対するモノクローナル
抗体の製造方法。
【請求項４】さらに、回収したモノクローナル抗体
が、他の溶連菌細胞抗原特異的Ｔ細胞とは反応せず、Ｔ
細胞抗原受容体の多様性を識別するという特徴を備えて
いることを確認する請求項３記載の製造方法。
【請求項５】齧歯類動物が（ＤＱｗ６トランスジェニ
ックＢ６×Ｃ３Ｈ）Ｆ₁マウスであり、かつ、マウスの
ミエローマ細胞がＰ３Ｕ１である請求項３記載の製造方
法。
【請求項６】ヒトのＴ細胞抗原受容体β鎖のＶ領域２
２に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ。