JP2020532307A - カンナビノイド産物の生合成のためのＥ．Ｃｏｌｉの代謝工学 - Google Patents

カンナビノイド産物の生合成のためのＥ．Ｃｏｌｉの代謝工学 Download PDF

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Abstract

本明細書では、宿主細胞においてテルペノイド類を生産するための方法、及び、組成物を提供する。一部の事例では、当該テルペノイド類は、カンナビノイド類である。【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／５５４，４９４号の優先権を主張しており、その全内容を、本明細書の一部を構成するものとして、また、あらゆる目的のために援用する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含んでおり、そして、その全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１０月１７日に作成したものであり、ＮＭＤ−００３＿ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔの名称を付けており、そして、サイズは、１０９，６９１バイトである。
植物Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａの腺毛は、様々なテルペノフェノール化合物（カンナビノイド）を蓄積する。これらの植物に由来する天然物は、動物、及び、人体の全体に認められるカンナビノイド受容体（ＣＢ１、及び、ＣＢ２）と、直接に相互作用することができる。ＣＢ−１受容体は、主に、神経系で認められるものであり、また、ＣＢ−２受容体は、主に、免疫系、または、免疫由来細胞で認められる。
カンナビノイド類、及び、その誘導体は、治療の可能性を秘めた幾つかの特性を有する。カンナビノイドが、ＣＢ−１、及び／または、ＣＢ−２受容体を、活性化、または、ブロッキングすると、下流のシグナル伝達、及び、代謝経路が調節され、その後、末梢での疼痛やその他の感覚シグナルの伝達、免疫応答、及び、炎症などのシナプス伝達に影響を及ぼす。したがって、治療目的での天然または合成のカンナビノイドの使用に、関心が寄せられている。しかしながら、抽出収率が低く、また、分離コストも高いので、自然由来のカンナビノイド類の使用は不経済であった。同様に、カンナビノイド生産の完全合成法は、これらの化合物の複雑さが故に、未だ実現に至っていない。
当該技術分野で公知のカンナビノイド類の生産のための異種システムは、カンナビノイドシンターゼを、生産、及び、分泌するための真核生物宿主生物に依存しており、そして、同システムを、インビトロ酵素触媒反応で、カンナビノイド産物を生産するために使用している。例えば、米国特許第９，５８７，２１２号；第９，５１２，３９１号；第９，３９４，５１２号；第９，５２６，７１５号；第９，３５９，６２５号は、それぞれ、ＴＨＣＡシンターゼまたはＣＢＤＡシンターゼを分泌する組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｌｏｒｉｓを使用してカンナビノイド類を作り出すための方法と組成物、それに、バイオリアクターについて説明をしている。しかしながら、残念なことに、このシステムは、分泌酵素に適した基質を生産するためのさらなる手段を必要としている。したがって、長きにわたって、インビボでカンナビノイド類を生産するための費用対効果の高い異種システムの開発が待望されており、未だ、その実現には至っていない。
本明細書では、カンナビノイド類、及び、テルペノイド類の生産のための方法、組成物、及び、宿主細胞を記載している。
ある態様では、本発明は、二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセットを提供する。一部の実施形態では、当該発現カセットは、当該発現カセットが存在する宿主細胞内のＭＥＰ経路を通るフラックスを増加させる。ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加は、ゲラニルリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、テルペノイド類、イソプレン、リコピン、カンナビノイド（例えば、ＣＢＧＡ）、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、及び／または、カロテノイドの下流での生産を高めるのに適したイソプレノイド前駆体の生産を高めることができる。したがって、一部の実施形態では、当該発現カセットは、リコピン合成経路の成分（例えば、ｃｒｔＥ、ｃｒｔ１、及び／または、ｃｒｔＢ）、イソプレンシンターゼ、ＧＰＰシンターゼ（例えば、ｉｓｐＡ、または、植物由来のＧＰＰシンターゼ）、モノテルペンシンターゼ、及び／または、カンナビノイドシンターゼを任意に含む。
一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素は、以下のｉｓｐＤＦ酵素；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ Ｊ９９ ｊｈｐ０４０４、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰＡＧ１ ＨＰＡＧ１＿０４２７、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ ＨＨ１５８２、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ ｓｔ．Ｓｈｅｅｂａ Ｈａｃ＿１１２４、Ｗ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ １７４０ ＷＳ１９４０、Ｓ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １２５１ Ｓｕｄｅｎ＿１４８７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８Ｃｊ１６０７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＲＭ１２２１ ＣＪＥ１７７９、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ８１−１７６ ＣＪＪ８１１７６＿１５９４、及び、Ｃ．ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｅｔｕｓ ８２−４０ ＣＦＦ８２４０＿０４０９と、少なくとも１つのアミノ酸が異なる。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素は、以下のｉｓｐＤＦ酵素；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ Ｊ９９ ｊｈｐ０４０４、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰＡＧ１ ＨＰＡＧ１＿０４２７、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ ＨＨ１５８２、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ ｓｔ．Ｓｈｅｅｂａ Ｈａｃ＿１１２４、Ｗ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ １７４０ ＷＳ１９４０、Ｓ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １２５１ Ｓｕｄｅｎ＿１４８７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８Ｃｊ１６０７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＲＭ１２２１ ＣＪＥ１７７９、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ８１−１７６ ＣＪＪ８１１７６＿１５９４、及び、Ｃ．ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｅｔｕｓ ８２−４０ ＣＦＦ８２４０＿０４０９のいずれか１つと、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または、９５％未満が同一である。一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素は、デフォルトＢＬＡＳＴ２．７．０タンパク質：タンパク質アライメント設定を使用して、ＣＪ−ｉｓｐＤＦと、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、または、２５％未満が同様である。
一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能的に連結したプロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能的に連結したプロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素は、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３のアミノ酸と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、９９％が同一であるアミノ酸配列、または、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３の２５個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、または、３００個の連続したアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素は、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、９９％が同一である、または、同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸を、コドン最適化する。一部の実施形態では、当該発現カセットは、ｄｘｓ、ｉｄｉ、及び、ｉｓｐＥからなる群から選択した、１つ以上、２つ以上、または、すべての酵素をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、当該発現カセットは、ｄｘｓ、及び、ｉｄｉをコードする核酸、及び、任意に、ＧＰＰシンターゼ（例えば、ｉｓｐＡ、または、植物由来のＧＰＰシンターゼ）、モノテルペンシンターゼ、及び／または、カンナビノイドシンターゼをさらに含む。一部の実施形態では、当該発現カセットは、ｄｘｓ、ｉｄｉ、及び、ｉｓｐＥをコードする核酸、及び、任意に、ＧＰＰシンターゼ（例えば、ｉｓｐＡ、または、植物由来のＧＰＰシンターゼ）、モノテルペンシンターゼ、及び／または、カンナビノイドシンターゼをさらに含む。一部の実施形態では、当該カンナビノイドシンターゼは、ＣＢＧＡシンターゼ、好ましくは、Ｃａｎｎａｂｉｓ ＣＢＧＡシンターゼである。
一部の実施形態では、当該カンナビノイドシンターゼは、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群より選択した切断したカンナビノイドシンターゼであり、当該切断は、シグナルペプチドの全部または一部の欠失である。
ある態様では、本発明は、本明細書に記載した発現カセットの態様、実施形態、事例、または、実施例のいずれかにしたがった、少なくとも１つ、２つ、３つ、または、それ以上の個数の発現カセット、または、その断片（複数可）を含むプラスミドを提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載した発現カセットの態様、実施形態、事例、または、実施例のいずれか１つにしたがった、少なくとも２つ、３つ、４つ、または、それ以上の個数の発現カセット、または、その断片（複数可）を含む複数のプラスミドを提供する。
一部の実施形態では、当該プラスミド（複数可）は、イソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）をコードする核酸を含む発現カセットを含む。一部の実施形態では、当該プラスミド（複数可）は、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸を含む発現カセットを含む。一部の実施形態では、当該ＧＰＰシンターゼは、真核生物に由来するＧＰＰシンターゼである。一部の実施形態では、当該ＧＰＰシンターゼは、植物由来のＧＰＰシンターゼである。一部の実施形態では、当該ＧＰＰシンターゼは、例えば、当該宿主細胞での発現のために、コドン最適化している。
一部の実施形態では、当該プラスミド（複数可）は、リコピン合成経路（例えば、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＩ、及び／または、ｃｒｔＢ）、ジテルペンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、または、モノテルペンシンターゼの１つ以上の成分をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、当該プラスミド（複数可）は、カレンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、または、リモネンシンターゼをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、当該プラスミド（複数可）は、カンナビノイドシンターゼをコードする核酸を含む。
一部の事例では、当該カンナビノイドシンターゼを、ＣＢＧＡシンターゼ、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群から選択する。一部の実施形態では、当該カンナビノイドシンターゼを、Ｃａｎｎａｂｉｓ ＣＢＧＡシンターゼ、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群から選択する。一部の実施形態では、当該カンナビノイドシンターゼは、例えば、Ｃａｎｎａｂｉｓ、ＣＢＧＡシンターゼである。一部の実施形態では、一部の実施形態では、当該カンナビノイドシンターゼは、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群から選択した切断したカンナビノイドシンターゼであり、当該切断は、シグナルペプチドのすべてまたは一部の欠失である。
ある態様では、本発明は、本明細書に記載した当該発現カセットの１つ以上、及び／または、本明細書に記載したプラスミドの１つ以上を含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、当該宿主細胞の１つ以上の発現カセットの１つ以上、または、すべてを、１つの遺伝子座、または、複数の遺伝子座で宿主細胞のゲノムに組み込む。
ある態様では、本発明は；ａ）二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセット；及び、ｂ）テルペノイドシンターゼをコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセット、を含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では：ｉ．）カンナビノイドシンターゼ、当該ｉｓｐＤＦ、または、当該プロモーターの一方または両方が、当該宿主細胞に対して異種である；ｉｉ．）当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸は、機能的に連結した当該プロモーターに対して異種である；及び／または、ｉｉｉ．）当該カンナビノイドシンターゼをコードする核酸は、機能的に連結した当該プロモーターに対して異種である。
一部の実施形態では、当該テルペノイドシンターゼは、イソプレンシンターゼである。一部の実施形態では、当該テルペノイドシンターゼは、リコピンシンターゼ経路の構成要素（例えば、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＥ、または、ｃｒｔＢ）である。一部の実施形態では、リコピン合成経路の成分をコードする核酸を含む宿主細胞は、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＥ、及び、ｃｒｔＢをコードする１つ以上の核酸を含み、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＥ、及び、ｃｒｔＢは、同じ、または、異なる発現カセットにある。
一部の実施形態では、当該テルペノイドシンターゼは、カンナビノイドシンターゼである。一部の実施形態では、当該カンナビノイドシンターゼを、ＣＢＧＡシンターゼ、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群から選択する。一部の実施形態では、当該カンナビノイドシンターゼを、Ｃａｎｎａｂｉｓ ＣＢＧＡシンターゼ、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群から選択する。一部の実施形態では、当該カンナビノイドシンターゼは、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａカンナビノイドシンターゼである。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ＣＢＧＡシンターゼをコードする核酸、及び、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群から選択する別のカンナビノイドシンターゼをコードする核酸、または、それらの２つ、または、すべてをコードする１つ以上の核酸の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、当該宿主細胞が、カンナビノイドシンターゼをコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含んでいると、当該カンナビノイドシンターゼは、ＣＢＧＡシンターゼである。一部の事例では、ＣＢＧＡシンターゼ発現カセットを含む当該宿主細胞は、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び／または、ＣＢＣＡシンターゼをコードする核酸をさらに含み、それぞれのカンナビノイドシンターゼは、同じ、または、異なる発現カセット内のプロモーターに、独立して、機能的に連結している。
一部の実施形態では、当該カンナビノイドシンターゼ、または、少なくとも１つのコードしたカンナビノイドシンターゼは、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群から選択した切断したカンナビノイドシンターゼであり、当該切断は、シグナルペプチドのすべて、または、一部の欠失である。一部の実施形態では、当該カンナビノイドシンターゼは、膜貫通、または、膜関連領域のすべて、または、一部の欠失を含み、当該カンナビノイドシンターゼは、膜関連のものではない。
一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセットを含む。一部の実施形態では、ａ）またはｂ）の当該発現カセットは、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、または、それらの組み合わせ、または、それらのすべてをコードする異種核酸を含まない。一部の実施形態では、では、当該宿主細胞は、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、それらの組み合わせ、または、それらすべてをコードする異種核酸を含まない。
一部の実施形態では、当該宿主細胞は、原核生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐａｎｔｅｏａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、または、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の原核生物である。一部の実施形態では、当該細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ． ｃｏｌｉ）、Ｐａｎｔｅｏａ ｃｉｔｒｅａ、Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、または、Ｌ． ｌａｃｔｉｓである。
一部の実施形態では、ａ）及び／またはｂ）の当該発現カセットを、当該宿主細胞のゲノムに組み込む。一部の実施形態では、ａ）の当該発現カセットを、当該宿主細胞のゲノムに組み込み、ｂ）の当該発現カセットは組み込まず、または、当該宿主細胞のゲノムの異なる遺伝子座に組み込む。一部の実施形態では、ｂ）の当該発現カセットを、当該宿主細胞のゲノムに組み込み、ａ）の当該発現カセットは組み込まず、または、当該宿主細胞のゲノムの異なる遺伝子座に組み込む。一部の実施形態では、ａ）の当該発現カセット、及び、ｂ）の当該発現カセットを、同じ、または、異なる遺伝子座で、宿主細胞のゲノムに組み込む。
一部の実施形態では、ａ）及び／またはｂ）の当該発現カセットは、当該宿主細胞内のプラスミドに存在する。一部の実施形態では、ａ）の当該発現カセット、及び、ｂ）の当該発現カセットは、当該宿主細胞内のプラスミドに存在する。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ａ）及び／またはｂ）の当該発現カセットを含むプラスミドを含む。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ａ）の当該発現カセットを含むプラスミド、及び／または、ｂ）の当該発現カセットを含むプラスミドを含む。一部の実施形態では、ａ）の当該発現カセット、及び、ｂ）の当該発現カセットは、同じプラスミドにある。一部の実施形態では、ａ）の当該発現カセットは、ｂ）の当該発現カセットとは異なるプラスミドにある。
一部の実施形態では、二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能的に連結した当該プロモーターを含む当該発現カセットは、カンナビノイドシンターゼをコードする核酸に機能的に連結した同じプロモーターも含む。一部の事例では、当該カンナビノイドシンターゼは、ＣＢＧＡシンターゼである。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、構成的プロモーターに機能的に連結したカンナビノイドシンターゼ（例えば、ＣＢＧＡシンターゼ）をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、誘導性プロモーターに機能的に連結したカンナビノイドシンターゼ（例えば、ＣＢＧＡシンターゼ）をコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする当該核酸に機能的に連結したプロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする当該核酸に機能的に連結したプロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、当該宿主細胞が、異なるカンナビノイドシンターゼを含む２つ以上の発現カセットを含んでいると、各発現カセットは、カンナビノイドシンターゼに機能的に連結した構成的プロモーターを含み、各発現カセットは、カンナビノイドシンターゼに機能的に連結した誘導性プロモーターを含み、または、１つ以上の発現カセットは、カンナビノイドシンターゼに機能的に連結した構成的プロモーターを含み、及び、１つ以上の発現カセットは、カンナビノイドシンターゼに機能的に連結した誘導性プロモーターを含む。
一部の実施形態では、当該宿主細胞が、異なるカンナビノイドシンターゼを含む２つ以上の発現カセットを含んでいると、それぞれの発現カセットは、カンナビノイドシンターゼに機能的に連結した誘導性プロモーターを含む。一部の実施形態では、当該宿主細胞が、異なるカンナビノイドシンターゼを含む２つ以上の発現カセットを含んでいると、少なくとも１つの発現カセットは、カンナビノイドシンターゼに機能的に連結した誘導性プロモーターを含む。一部の実施形態では、当該宿主細胞が、異なるカンナビノイドシンターゼを含む２つ以上の発現カセットを含んでいると、少なくとも１つの発現カセットは、カンナビノイドシンターゼに機能的に連結した構成的プロモーターを含む。
一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素は、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、９９％が同一であり、または、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３の２５個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、または、３００個の連続したアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、９９％が同一であり、または、同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素は、以下のｉｓｐＤＦ酵素；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ Ｊ９９ ｊｈｐ０４０４、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰＡＧ１ ＨＰＡＧ１＿０４２７、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ ＨＨ１５８２、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ ｓｔ．Ｓｈｅｅｂａ Ｈａｃ＿１１２４、Ｗ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ １７４０ ＷＳ１９４０、Ｓ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １２５１ Ｓｕｄｅｎ＿１４８７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８Ｃｊ１６０７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＲＭ１２２１ ＣＪＥ１７７９、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ８１−１７６ ＣＪＪ８１１７６＿１５９４、及び、Ｃ．ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｅｔｕｓ ８２−４０ ＣＦＦ８２４０＿０４０９と、少なくとも１つのアミノ酸が異なる。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素は、以下のｉｓｐＤＦ酵素；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ Ｊ９９ ｊｈｐ０４０４、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰＡＧ１ ＨＰＡＧ１＿０４２７、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ ＨＨ１５８２、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ ｓｔ．Ｓｈｅｅｂａ Ｈａｃ＿１１２４、Ｗ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ １７４０ ＷＳ１９４０、Ｓ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １２５１ Ｓｕｄｅｎ＿１４８７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８Ｃｊ１６０７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＲＭ１２２１ ＣＪＥ１７７９、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ８１−１７６ ＣＪＪ８１１７６＿１５９４、及び、Ｃ．ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｅｔｕｓ ８２−４０ ＣＦＦ８２４０＿０４０９のいずれか１つと、５０％、８０％、９０％、または、９５％未満が同一である。
一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及び、ｉｄｉからなる群から選択する１つ以上のＭＥＰ経路酵素をコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む、または、さらに含む。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む発現カセットは、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及び、ｉｄｉからなる群から選択する１つ以上のＭＥＰ経路酵素をコードする核酸をさらに含む。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む当該発現カセットは、ｄｘｓ、及び、ｉｄｉをコードする核酸をさらに含む。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む当該発現カセットは、ｉｓｐＥをコードする核酸をさらに含む。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む当該発現カセットは、ｄｘｓ、ｉｄｉ、及び、ｉｓｐＥをさらに含む。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む当該発現カセットは、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、または、ｉｓｐＨの１つ以上、または、すべてをコードする核酸配列を含まない。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む当該発現カセットは、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、または、ｉｓｐＨの１つ以上、または、すべてをコードする核酸配列を含まない。
一部の事例では、当該宿主細胞は、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む当該発現カセットを含まないコントロール細胞と比較して、１つ以上のＭＥＰ経路遺伝子の高レベルの発現を含む。一部の事例では、当該宿主細胞は、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む当該発現カセットを含まないコントロール細胞と比較して、ｄｘｓ、及び、ｉｄｉの高レベルの発現を含む。一部の事例では、当該宿主細胞は、本明細書に記載した１つ以上の発現カセット、及び／または、１つ以上のプラスミドの少なくとも１つを含まないコントロール細胞と比較して、ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加を示す。
一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む。一部の事例では、ａ）の当該発現カセットは、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸をさらに含む。一部の事例では、ｂ）の当該発現カセットは、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸をさらに含む。一部の事例では、ａ）の当該発現カセットと、ｂ）の当該発現カセットとは、異なる発現カセットである。一部の事例では、ａ）の当該発現カセットと、ｂ）の当該発現カセットとは、同じ発現カセットである。
一部の実施形態では、当該宿主細胞は、オリベトール酸（ＯＡ）をさらに含む。一部の事例では、当該オリベトール酸は、宿主細胞に対して外因性のものである。例えば、当該ＯＡは、宿主細胞を培養する培養培地に対して外因的に適用することができる。
一部の実施形態では、当該宿主細胞は、１つ以上のグリコシル化経路遺伝子をコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含み：ａ）当該グリコシル化経路遺伝子は、当該宿主細胞に対して異種である；ｂ）当該プロモーターは、当該宿主細胞に対して異種である；ｃ）当該プロモーターは、１つ以上のグリコシル化経路遺伝子の１つ以上に対して異種である；または、ｄ）当該発現カセットは、当該宿主細胞に対して異種である。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｌｄｈＡ、ｄｌｄ、ａｄｈＥ、ｐｐｓ、及び、ａｔｏＤＡからなる群から選択した遺伝子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または、すべてに欠失を含む。
第２の態様では、本発明は、二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセットを含む宿主細胞を提供しており、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素は、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３のアミノ酸と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、９９％が同一であり、または、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３の２５個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個の連続するアミノ酸と同一であるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、当該二官能性ｉｓｐＤＦ酵素は、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、９９％が同一である、または、同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及び、ｉｄｉからなる群から選択した１つ以上のＭＥＰ経路酵素をコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットをさらに含み：ａ）当該プロモーターは、１つ以上のＭＥＰ経路酵素に対して異種であり；または、ｂ）当該プロモーター、または、１つ以上のＭＥＰ経路酵素は、宿主細胞に対して異種である。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ｄｘｓ、及び、ｉｄｉをコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットをさらに含む。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ｄｘｓ、ｉｄｉ、及び、ｉｓｐＥをコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットをさらに含む。
一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ｉｓｐＳ酵素をコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットをさらに含む。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ＧＰＰシンターゼ酵素をコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットをさらに含む。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｌｄｈＡ、ｄｌｄ、ａｄｈＥ、ｐｐｓ、及び、ａｔｏＤＡからなる群から選択した遺伝子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または、すべてに欠失を含む。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、カンナビノイドシンターゼをさらに含む。
一部の実施形態では、当該宿主細胞は、原核生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐａｎｔｅｏａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、または、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の原核生物である。一部の実施形態では、当該細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ． ｃｏｌｉ）、Ｐａｎｔｅｏａ ｃｉｔｒｅａ、Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、または、Ｌ． ｌａｃｔｉｓである。
別の態様では、本発明は、標的代謝産物（例えば、テルペノイド、または、カンナビノイド）を得る方法を提供しており、当該方法は、本明細書に記載した態様、実施形態、事例、または、実施例のいずれか１つに従って宿主細胞を、１つ以上の宿主細胞発現カセットで発現を誘導するのに適した条件下で、適切な培養培地で培養を行い、次いで、当該培養細胞、または、使用済培地を回収し、それにより、標的代謝産物を得ることを含む。一部の実施形態では、当該方法は、本明細書に記載した態様、実施形態、事例、または、実施例のいずれか１つに従って宿主細胞を培養することを含み、かつ、当該代謝産物は、カンナビノイドである。一部の実施形態では、当該カンナビノイドは、ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ、ＣＢＮ、ＴＨＣ、ＣＢＤ、または、ＣＢＣ、または、それらの１つ以上の混合物である。
一部の実施形態では、当該方法は、本明細書に記載した態様、実施形態、事例、または、実施例のいずれか１つに従って宿主細胞を培養することを含み、かつ、当該代謝産物は、テルペノイド、または、イソプレンである。一部の実施形態では、当該方法は、培養細胞を、回収、及び、溶解し、それにより、細胞溶解物を生産することを含む。一部の実施形態では、当該方法は、当該細胞溶解物から当該標的代謝産物を精製し、それにより、精製した標的代謝産物を製造することを含む。一部の実施形態では、当該方法は、当該使用済培地から標的代謝産物を精製し、それにより、精製した標的代謝産物を製造することを含む。
一部の実施形態では、精製した当該標的代謝産物は、カンナビノイドであり、かつ、当該方法は、医薬組成物にカンナビノイドを製剤することを含む。一部の実施形態では、精製した当該標的代謝産物は、カンナビノイドであり、かつ、当該方法は、精製した当該カンナビノイドの塩、プロドラッグ、または、溶媒和物を形成することを含む。
文献の援用
本明細書で言及したすべての刊行物、特許、及び、特許出願を、個々の刊行物、特許、及び、特許出願の内容を援用することを個別かつ具体的に明示しているのと同然のものとして、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
Ｃａｎｎａｂｉｓ Ｓａｔｉｖａでのカンナビノイド合成の概略を示す図である。 Ｅ．ｃｏｌｉでのイソプレノイド前駆体の生合成のためのメバロン酸非依存性（ＭＥＰ）経路を例示する図である。上部に示した基質と産物は、以下の通りである：Ｇ３Ｐ（グリセルアルデヒド ３−リン酸）、ＤＯＸＰ（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸）、ＭＥＰ（２−Ｃ−メチルエリトリトール ４−リン酸）、ＣＤＰ−ＭＥ（４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリトリトール）、ＣＤＰ−ＭＥＰ（４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール ２−リン酸）、ＭＥＣＰＰ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール ２，４−シクロ二リン酸）、ＨＭＢＰＰ（（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブト−２−エニルピロリン酸）、ＩＰＰ（イソペンテニル二リン酸）、ＤＭＡＰＰ（ジメチルアリル二リン酸）、ＧＰＰ（ゲラニルピロリン酸）。下部に示した対応する酵素は、以下の通りである：ｄｘｓ（ＤＯＸＰシンターゼ）、ｉｓｐＣ（ＤＯＸＰレダクターゼ）、ｉｓｐＤ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール ４−リン酸シチジルトランスフェラーゼ）、ｉｓｐＥ（４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ）、ｉｓｐＦ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ）、ｉｓｐＧ（ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ）、ｉｓｐＨ（ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼ）、及び、ｉｄｉ（イソペンテニル／ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼ）。 図３Ａ−Ｂは、宿主細胞でのＭＥＰ経路の過剰発現のための２つの異なる発現カセットの図である。 宿主細胞でのｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｄｉ、及び、ｉｓｐＦの異種発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 宿主細胞でのカンナビゲロール酸シンターゼ（ＣＢＧＡＳ）の異種発現のための発現カセットを示す。 ポリヒスチジン（６ｘ−Ｈｉｓ）タグを付けた芳香族プレニルトランスフェラーゼ（「６ｘ−Ｈｉｓ」、配列番号４３として開示した）のＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞での発現、及び、精製を示すＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを示す。清澄化した細胞溶解物を、精製せずにロードした。ａ：非誘導細胞溶解物。ｂ〜ｆ：１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した細胞溶解物。ｃ〜ｆ：画分を通るニッケル−ＮＴＡカラムの流れ。 カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）のインビトロ生産を示すクロマトグラムである。ａ線は、０．０６２５μｇ／ｍＬのＣＢＧＡ標準のクロマトグラムである；ｂは、ＣＢＧＡＳ誘導細胞溶解物、オリベトール酸（ＯＡ）、及び、ＧＰＰを含有する反応混合物であり、ｃは、ＧＰＰを含まない同じ反応混合物である。 Ｅ．ｃｏｌｉでのカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）のインビボ生産を示すクロマトグラムである。ａ線は、０．５μｇ／ｍＬのＣＢＧＡ標準のクロマトグラムである；ｂは、ＣＢＧＡＳを発現するＥ．ｃｏｌｉを増殖させた使用済培養培地であり、ＯＡとＧＰＰを添加している、ｃは、ＯＡを含まない同反応混合物である。 Ｅ．ｃｏｌｉでのΔ（９）−テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＴＨＣＡＳ）の生産のための発現カセットを例示する図である。 ＴＨＣＡＳ発現カセット、及び、シャペロン共発現カセットを含む宿主細胞を例示する図である。 ＴＨＣＡＳ発現カセット、及び、異種グリコシル化システムのための発現カセットを含む宿主細胞を例示する図である。 低コピー数のＣＢＧＡＳ発現カセットを例示する図である。 メバロン酸非依存性経路発現カセット、ならびに、ＧＰＰシンターゼ（ＧＰＰＳ）、及び、ＣＢＧＡＳ発現カセットを含む宿主細胞を例示する図である。 Ｅ．ｃｏｌｉにおいて示した発現構築物の最適化した誘導物質濃度の表を示す。 異なる誘導物質濃度下でのＥ．ｃｏｌｉのＯＤ測定を示す。株Ｂ〜Ｄは、ＧＰＰＳ ＣＢＧＡＳ発現カセットｐＢＡＤ３３＿ＧＰＰＳ＿ＣＢＧＡＳを含む。図１３に例示したように、株Ｆ〜Ｊは、ｐＢＡＤ３３＿ＧＰＰＳ＿ＣＢＧＡＳ発現カセットと、ＭＥＰ経路発現カセットｐＴＲＣ＿ＲＤＥの両方を含む。 ｐＢＡＤ３３＿ＧＰＰＳ＿ＣＧＧＡＳの発現、または、ｐＢＡＤ３３＿ＧＰＰＳ＿ＣＢＧＡＳとｐＴＲＣ＿ＲＤＥとの共発現の後の細胞溶解物のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析の結果を示す。 そこに示した誘導物質濃度を有する誘導発現培養物からの細胞溶解物での異なるタンパク質濃度を示す。株Ａ〜Ｄ株は、プラスミドｐＢＡＤ３３＿ＧＰＰＳ＿ＣＢＧＡＳを含む。株Ｅ〜Ｊは、プラスミドｐＢＡＤ３３＿ＧＰＰＳ＿ＣＢＧＡＳ、及び、ｐＴＲＣＲＤＥを含む。 ｐＴＲＣ＿ＲＤＥ*発現構築物を含む株でｉｓｐＤＦを発現した後の細胞溶解物のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析の結果を示す。 ネイティブｉｓｐＤ、及び、ｉｓｐＦ（ｉｓｐＤ−ｉｓｐＦ）（配列番号４２）、及び、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｉｓｐＤＦ（ＣＪ−ｉｓｐＤＦ）（配列番号４１）を用いて、メタゲノミクススクリーニングアッセイ（ｉｓｐＤＦ１）（配列番号１）から同定した二官能性ｉｓｐＤＦ酵素のタンパク質配列アライメントを例示する。 ｐＴＲＣ＿ＲＤＥＥ、及び、ｐＴＲＣ＿ＲＤＥ*Ｅの発現構築物を示す。ｐＴＲＣ＿ＲＤＥ*Ｅは、ｉｓｐＤ、及び、ｉｓｐＦ酵素の代わりに、二官能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む。 ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加について試験した構築物、及び、株の概要を示す。 イソプレン生産のための構築物とデータを示す。構築物ＳＡ０４は、ｉｓｐＤＦをコードする核酸をコドン最適化していること以外は、構築物ＳＡ０３と同一である。 Ｅ．ｃｏｌｉの４つの異なる株でのリコピン生産を示す。ＳＡ０１：ｐＡＣ−ＬＹＣ；ＳＡ０２：ｐＡＣ−ＬＹＣ、及び、ｐＴＲＣ−ＲＤＥ；ＳＡ０３：ｐＡＣ−ＬＹＣ、及び、ｐＴＲＣ−ＲＤＥＥ；ＳＡ０４：ｐＡＣ−ＬＹＣ、及び、ｐＴＲＣ−ＲＤＥ*；及び、ＳＡ０５：ｐＡＣ−ＬＹＣ、及び、ｐＴＲＣ−ＲＤＥ*Ｅ。 リコピンの生産を例示する。 モノテルペンカレンの生産のための構築物、及び、データを示す。 二官能性酵素ｉｓｐＤＦ１、ｉｓｐＤＦ２、及び、ｉｓｐＤＦ３のペプチド配列を示す。
本明細書では、メバロン酸非依存性（ＭＥＰ）経路を改変して、テルペノイド類の生産を増加させる代謝工学的戦略を記載している。ＭＥＰ経路、または、テルペノイド経路は、商業的に価値のあるテルペノイド類や、その他の化合物を生産するための様々な下流プロセスで使用可能な産物である、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を生産する。
また、本明細書では、ネイティブのＥ．ｃｏｌｉ ｉｓｐＤ、及び、ｉｓｐＦが引き起こす両方の反応を触媒することができる二官能性酵素ｉｓｐＤＦも記載している。この二官能性酵素は、様々なインビトロまたはインビボのイソプレン、テルペノイド、または、カンナビノイド生産システムで使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載した代謝工学的戦略は、ｉｓｐＤＦの有無に関係なく、異種宿主細胞におけるイソプレン、ＧＰＰ、または、下流のテルペノイドの生産を増加させるために使用することができる。
ＧＰＰは、カンナビノイド経路の最初の酵素である、カンナビゲロール酸シンターゼ（ＣＢＧＡＳ）、芳香族プレニルトランスフェラーゼ酵素の基質である（図１）。ＣＢＧＡＳは、基質ＧＰＰと、オリベトール酸（ＯＡ）とを使用して、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を生産する。一部の事例では、ＣＢＧＡは、さらなるインビトロまたはインビボの酵素触媒反応のための基質、例えば、ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）が触媒した反応を介してΔ9−テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）、または、ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）が触媒した反応を介してカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）を生産するための基質として使用することができる。カンナビノイドの生産のためのさらなる経路として、Ｔｈａｋｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、７８（２００５）４５４−４６６に記載されたものがあるが、これらに限定されない。Ｔｈａｋｕｒ ｅｔ ａｌ．の文献を、本明細書の一部を構成するものとして、そこに記載された、酵素、産物、酵素基質、経路、及び、それらの一部、ならびに、合成スキームに限らず、その全内容を、すべての目的で援用する。
一部の実施形態では、基質ＣＢＧＡ、ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ、ＴＨＣＶＡ、ＣＢＣＶＡ、ＣＢＤＶＡ、及び、これらの組み合わせが関与する下流の酵素触媒反応の産物は、化学的、酵素的、または、熱的手段を使用して、インビトロ、または、インビボで、脱カルボキシル化して、例えば、図１に示した様々なカンナビノイドを生産することができる。
定義
本明細書では、以下の略語を使用する：「Ｇ３Ｐ」は、グリセルアルデヒド ３−リン酸を意味する；「ＤＯＸＰ」は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸を意味する；「ＭＥＰ」は、２−Ｃ−メチルエリトリトール ４−リン酸を意味する；「ＣＤＰ−ＭＥ」は、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリトリトールを意味する；「ＣＤＰ−ＭＥＰ」は、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール ２−リン酸を意味する；「ＭＥＣＰＰ」は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール ２，４−シクロ二リン酸を意味する；「ＨＭＢＰＰ」は、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブト−２−エニルピロリン酸を意味する；「ＩＰＰ」は、イソペンテニル二リン酸を意味する；「ＤＭＡＰＰ」は、ジメチルアリル二リン酸を意味する；「ＧＰＰ」は、ゲラニルピロリン酸を意味する。
「ＤＸＰ経路」及び「ＭＥＰ経路」は、非メバロン酸経路、別名、メバロン酸非依存性経路のことを指す。ＭＥＰ経路の遺伝子は、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及び、ｉｄｉである。ＤＸＰまたはＭＥＰ経路遺伝子、または、遺伝子産物、または、それらをコードする核酸に関して、当該遺伝子を、例えば、異種核酸が存在する宿主細胞のネイティブ遺伝子、そのコドン最適化バージョン、異なる生物に由来する（例えば、コドン最適化した）遺伝子、または、それらのオルソログとすることができる。
「ｄｘｓ」は、ＤＯＸＰシンターゼのことを指す；「ｉｓｐＣ」は、ＤＯＸＰレダクターゼのことを指す；「ｉｓｐＤ」は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼのことを指す；「ｉｓｐＥ」は、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼのことを指す；「ｉｓｐＦ」は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼのことを指す；「ｉｓｐＧ」は、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼのことを指す；「ｉｓｐＨ」は、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼのことを指す；「ｉｄｉ」は、イソペンテニル／ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼのことを指す；「ｉｓｐＡ」は、ファルネシル二リン酸シンターゼ、別名、「ＧＰＰシンターゼ」のことを指し、このものは、ＤＭＡＰＰ＋ＩＰＰを、ＧＰＰに、そして、ＧＰＰ＋ＩＰＰを、ファルネシルピロリン酸に変換することができる。
用語「ｉｓｐＤＦ」は、２つの異なる活性部位を有しており、かつ、ｉｓｐＤ活性（ＥＣ２．７．７．６０）、及び、ｉｓｐＦ活性（ＥＣ４．６．１．１２）を示す、二官能性一本鎖酵素のことを指す。一般的に、ｉｓｐＤＦは、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または、置換などの１つ以上の修飾を有する天然の二官能性酵素、または、天然の二官能性酵素の誘導体である。一部の事例では、当該遺伝子は、植物由来のものであり、または、Ｃａｎｎａｂｉｓ遺伝子である。一部の事例では、当該遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子、または、そのオルソログである。
「ＯＡ」は、オリベトール酸のことを指す；「ＣＢＧＡ」は、カンナビゲロール酸のことを指す；「ＣＢＮＡ」は、カンナビネロール酸のことを指す；「カンナビノール」または「ＣＢＮ」は、６，６，９−トリメチル−３−ペンチルベンゾ［ｃ］クロメン−１−オールのことを指す；「ＣＢＧＶＡ」は、カンナビゲリバリン酸のことを指す；「ＴＨＣＡ」は、テトラヒドロカンナビノール酸のことを指し、Δ9異性体を含む：「ＣＢＤＶ」は、カンナビジバリンのことを指す；「ＣＢＣ」は、カンナビクロメンのことを指す；「ＣＢＣＡ」は、カンナビクロム酸のことを指す；「ＣＢＣＶ」は、カンナビクロメバリンのことを指す；「ＣＢＧは、カンナビゲロールのことを指す；「ＣＢＧＢ」は、カンナビゲロバリンのことを指す；「ＣＢＥ」は、カンナビエルソリンのことを指す；「ＣＢＬ」は、カンナビシクロルのことを指す；「ＣＢＶ」は、カンナビバリンのことを指す；「ＣＢＴ」は、カンナビトリオールのことを指す；「ＴＨＣＶ」は、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）のことを指し；「ＴＨＣ」は、テトラヒドロカンナビノールのことを指し、及び、「Δ9−ＴＨＣ」は、Δ9−テトラヒドロカンナビノールのことを指し；「ＣＢＤＡ」は、カンナビジオール酸のことを指す。
本明細書で使用する「ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加」とは、ＩＰＰ、及び／または、ＤＭＡＰＰの生産の増加のことを指す。通常、ＩＰＰ、及び／または、ＤＭＡＰＰの生産は、ＩＰＰ、及び／または、ＤＭＡＰＰを反応物として利用するレポーター酵素の作用を受けて形成される産物を検出することで、間接的に決定している。例えば、レポーターとしてイソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）を使用することで、ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加が、イソプレン生産の増加として検出することができる。別の例として、ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加は、レポーターとしてＧＰＰシンターゼを使用することで、ＧＰＰ生産の増加として検出することができる。一部の事例では、レポーター酵素を使用してＧＰＰ生産を検出する。例えば、ＧＰＰシンターゼ酵素とリコピンシンターゼレポーター酵素とを使用して、リコピン生産の増加を検出し、それにより、ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加を検出することで、ＧＰＰ生産の増加を検出することができる。別の例として、ＧＰＰシンターゼ酵素と、モノテルペン（例えば、リモネン、カレン、ミルセン）シンターゼレポーター酵素とを使用して、モノテルペン（例えば、リモネン、カレン、ミルセン）の増加を検出し、それにより、ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加を検出することで、ＧＰＰ生産の増加を検出することができる。別の例として、ＧＰＰシンターゼ酵素と、カンナビノイド（例えば、ＣＢＧＡ）シンターゼレポーター酵素とを使用して、カンナビノイド（例えば、ＣＢＧＡ）生産の増加を検出し、それにより、ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加を検出することで、ＧＰＰ生産の増加を検出することができる。一般的には、試験株での１つ以上の異種発現カセットを欠いたコントロール株と比較して、少なくとも１０％の増加である。一部の事例では、試験株での１つ以上の異種発現カセットを欠いたコントロール株と比較して、少なくとも２倍の増加である。
本明細書で使用する用語「カンナビジオール」、「ＣＢＤ」、または、「カンナビジオール」とは、特定のその他の立体異性体を特定しない限りは、以下の化合物の１つ以上のことを指し、そして、化合物「Δ2−カンナビジオール」を含む。これらの化合物は：（１）Δ5−カンナビジオール（２−（６−イソプロペニル−３−メチル−５−シクロヘキセン−１−イル）−５−ペンチル−１，３−ベンゼンジオール）；（２）Δ4−カンナビジオール（２−（６−イソプロペニル−３−メチル−４−シクロヘキセン−１−イル）−５−ペンチル−１，３−ベンゼンジオール）；（３）Δ3−カンナビジオール（２−（６−イソプロペニル−３−メチル−３−シクロヘキセン−１−イル）−５−ペンチル−１，３−ベンゼンジオール）；（４）Δ3,7−カンナビジオール（２−（６−イソプロペニル−３−メチレンシクロヘクス−１−イル）−５−ペンチル−１，３−ベンゼンジオール）；（５）Δ2−カンナビジオール（２−（６−イソプロペニル−３−メチル−２−シクロヘキセン−１−イル）−５−ペンチル−１，３−ベンゼンジオール）；（６）Δ1−カンナビジオール（２−（６−イソプロペニル−３−メチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−５−ペンチル−１，３−ベンゼンジオール）；及び、（７）Δ6−カンナビジオール（２−（６−イソプロペニル−３−メチル−６−シクロヘキセン−１−イル）−５−ペンチル−１，３−ベンゼンジオール）である。
これらの化合物は、後述するように、１つ以上のキラル中心と、２つ以上の立体異性体とを有する：（１）（１）Δ5−カンナビジオールは、２つのキラル中心と、４つの立体異性体とを有する；（２）Δ4−カンナビジオールは、３つのキラル中心と、８つの立体異性体とを有する；（３）Δ3−カンナビジオールは、２つのキラル中心と、４つの立体異性体とを有する；（４）Δ3,7−カンナビジオールは、２つのキラル中心と、４つの立体異性体とを有する；（５）Δ2−カンナビジオールは、２つのキラル中心と、４つの立体異性体とを有する；（６）Δ1−カンナビジオールは、２つのキラル中心と、４つの立体異性体とを有する；及び（７）Δ6−カンナビジオールは、１つのキラル中心と、２つの立体異性体とを有する。好ましい実施形態では、カナビジオールは、具体的には、Δ2−カンナビジオールである。特に断りのない限り、上記した「カンナビジオール」、「ＣＢＤ」、または、「カンナビジオール」、または、特定のカンナビジオール化合物（１）〜（７）のいずれかについての言及は、援用して取り込むすべての化合物での可能なすべての立体異性体を含む。ある実施形態では、「Δ2−カンナビジオール」は、異種システムで部分的または全体的に生産される、Δ2−カンナビジオールの立体異性体の混合物とすることができる。
用語「イソプレノイド」または「テルペノイド」とは、直鎖、及び、環状テルペノイド類を含む、１つ以上の五炭素イソプレン構成要素を含む、あらゆる化合物のことを指す。本明細書で使用する用語「テルペン」とは、テルペノイド、及び、イソプレノイドと互換可能である。炭素鎖の酸化または転位などでテルペンが化学的に修飾を受けると、得られる化合物は、一般的には、テルペノイド、別名、イソプレノイドと称されている。
テルペノイド類は、存在する炭素原子の個数に応じて、５個、及び、１０個の炭素のグループを参照として使用して、名称を付与することができる。例えば、ヘミテルペノイド（Ｃ５）には、１つのイソプレン単位（半分のテルペノイド）があり；モノテルペノイド（Ｃ１０）には、２つのイソプレン単位（１つのテルペノイド）があり；セスキテルペノイド（Ｃ１５）には、３つのイソプレン単位（１．５テルペノイド）があり；及び、ジテルペノイド（Ｃ２０）には、４つのイソプレン単位（または、２つのテルペノイド）がある。通常、モノテルペノイドは、Ｃ１０テルペノイド前駆体ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）から自然に生産される。同様に、「環状モノテルペン」とは、環状、または、芳香族テルペノイド（すなわち、環構造を含む）のことを指す。それは、２つのイソプレン構成要素、通常は、ＧＰＰから作られている。線状モノテルペン類として、ゲラニオール、リナロール、オシメン、及び、ミルセンなどがあるが、これらに限定されない。環状モノテルペン（単環式、二環式、及び、三環式）として、リモネン、ピネン、カレン、テルピネオール、テルピノレン、フェランドレン、ツジェン、トリシクレン、ボルネオール、サビネン、及び、カンフェンがあるが、これらに限定されない。
「テルペノイドシンターゼ」とは、あるテルペノイドまたはテルペノイド前駆体から、別のテルペノイドまたはテルペノイド前駆体への変換を触媒できる酵素のことを指す。例えば、ＧＰＰシンターゼとは、例えば、テルペノイド前駆体ＩＰＰ、及び、ＤＭＡＰＰからＧＰＰの形成を触媒する酵素である。同様に、ＦＰＰシンターゼとは、例えば、ＧＰＰ、及び、ＩＰＰからＦＰＰの生産を触媒する酵素である。テルペンシンターゼとは、プレニル二リン酸（ＧＰＰなど）を、イソプレノイド、または、イソプレノイド前駆体への変換を触媒する酵素である。この用語は、線形、及び、環状テルペンシンターゼの両方を含む。
「環状テルペノイドシンターゼ」とは、テルペノイド、または、テルペノイド前駆体を修飾する反応を触媒して、環構造を提供することができる酵素のことを指す。例えば、環状モノテルペノイドシンターゼとは、基質として線状モノテルペンを使用して、環状または芳香族（環含有）モノテルペノイド化合物を生産できる酵素のことを指す。一例は、サビネンシンターゼであり、このものは、線状モノテルペン前駆体ＧＰＰから環式モノテルペンサビネンの形成を触媒することができる。本明細書で使用する用語「テルペンシンターゼ」は、テルペノイドシンターゼと互換可能である。
プレニルトランスフェラーゼ、または、イソプレニルトランスフェラーゼ酵素、別名、プレニル、または、イソプレニルシンターゼは、テルペノイド、または、イソプレノイド化合物のピロリン酸前駆体の生産を触媒できる酵素である。例示的なプレニルトランスフェラーゼ、または、イソプレニルトランスフェラーゼ酵素は、ｉｓｐＡであり、このものは、適切な基質の存在下で、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、または、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の形成を触媒することができる。
「カンナビノイドシンターゼ」とは、以下の活性：ＣＢＧＡを、ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡ、または、ＣＢＣＡへと環化すること；ＣＢＧＶＡを、ＴＨＣＶＡ、ＣＢＣＶＡ、ＣＢＤＶＡへと環化すること、オリベトール酸をプレニル化して、ＣＢＧＡを形成すること、及び、それらの組み合わせ、の１つ以上を触媒する酵素のことを指す。例示的なカンナビノイドシンターゼとして、Ｃａｎｎａｂｉｓ属の植物に普通に認められるもの、例えば、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａのＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼがあるが、これらに限定されない。
例示的なイソプレノイド、テルペノイド、カンナビノイド、ならびに、ＭＥＰ経路のポリペプチド、及び、核酸として、ＫＥＧＧデータベースに記載されているものがある。このＫＥＧＧデータベースは、多数の例示的なイソプレノイド、テルペノイド、カンナビノイド、ならびに、ＭＥＰ経路のポリペプチド、及び、核酸のアミノ酸、及び、核酸配列を保存している（例えば、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、世界的ウェブ「ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ／ｍａｐ／ｍａｐ００１００．ｈｔｍｌ」、及び、そこにある配列、特に、イソプレノイド、テルペノイド、カンナビノイド、ならびに、ＭＥＰ経路のポリペプチド、及び、核酸についてのアミノ酸、及び、核酸配列に関して、参照をされたい）。シグナルペプチドを含む本明細書に記載のポリペプチド、及び、それらをコードする核酸は、シグナルペプチドを除去したもの、または、それが存在しない切断型をさらに説明しているものと理解できる。
本明細書で使用する用語「異種」は、自然界では一緒に見受けることのない、あらゆる２つの構成要素のことを指す。例えば、機能的に連結したプロモーターに対して異種である遺伝子をコードする核酸とは、特定のゲノムにおいて、機能的に連結したプロモーターによって、その自然状態（例えば、非遺伝的改変細胞内）で、制御を受けない発現を有する核酸である。本明細書で示したように、自然界に存在しないプロモーターに機能的に連結したすべての遺伝子を、「異種」として考慮する。同様に、宿主細胞に対して「異種」である遺伝子とは、特定の生物の非遺伝的改変細胞では見受けられない遺伝子、または、異なるゲノム、あるいは、非ゲノム（例えば、プラスミド）位置で認められる遺伝子、または、非遺伝的改変細胞内の異なるプロモーターに機能的に連結している遺伝子である。加えて、宿主細胞に対して「異種」であるプロモーターとは、特定の生物の非遺伝的改変細胞では見受けられないプロモーター、または、異なるゲノム、あるいは、非ゲノム（例えば、プラスミド）位置で認められるプロモーター、または、非遺伝的改変細胞内の異なる核酸に機能的に連結しているプロモーターである。
本明細書で使用する「発現カセット」とは、少なくとも１つの標的遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列のことを指しており、当該プロモーターは、少なくとも１つの機能的に連結した遺伝子に対して異種であり、当該プロモーターは、それが存在する宿主細胞に対して異種であり、または、少なくとも１つの機能的に連結した遺伝子、または、それらの組み合わせは、宿主細胞に対して異種である。
「塩」とは、本発明の方法で使用する化合物の酸塩、または、塩基塩のことを指す。医薬として許容可能な塩を例示すると、鉱酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸などの）塩、有機酸（酢酸、プロピオン酸、グルタミン酸、クエン酸などの）塩、四級アンモニウム（ヨウ化メチル、ヨウ化エチルなどの）塩がある。医薬として許容可能な塩は、非毒性であると理解されている。医薬として許容可能な適切な塩に関するさらなる情報は、本明細書の一部を構成するものとして援用する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８５から得ることができる。
本明細書で使用する用語「溶媒和物」とは、溶媒和（溶媒分子と、溶質の分子またはイオンとの組み合わせ）によって形成される化合物、または、溶質イオン、または、分子、すなわち、本発明の化合物からなる、１つ以上の溶媒分子を有する凝集体のことを意味する。水が溶媒の場合、対応する溶媒和物は「水和物」である。水和物の例として、半水和物、一水和物、二水和物、三水和物、六水和物、及び、その他の含水種があるが、これらに限定されない。当業者であれば、医薬として許容可能な化合物の塩、及び／または、プロドラッグも、溶媒和物の形態で存在し得ることを理解する。当該溶媒和物は、一般的には、化合物の調製の一部である水和を介して、または、本発明の無水化合物による水分の自然吸収により形成する。一般的に、すべての物理的形態を、本発明の範囲内とするように意図している。
したがって、本発明の方法で作り出した治療活性剤、または、カンナビノイド、または、テルペノイドなど、これらに限定されない、本発明の組成物に含まれる治療活性剤が、十分に酸性、十分に塩基性、または、十分に酸性と十分に塩基性の官能基の両方を有していれば、これらの基（複数可）は、多数の無機または有機塩基、及び、無機及び有機酸のいずれかと自ずと反応して、医薬として許容可能な塩を形成するこができる。例示的な医薬として許容可能な塩として、薬理学的に活性な化合物と、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキシン−１，６−ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、β−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、及び、マンデル酸塩などの鉱酸、または、有機酸、または、無機酸との反応で調製した塩がある。薬理学的に活性な当該化合物が、１つ以上の塩基性官能基を有しておれば、医薬として許容可能な所望の塩は、当該技術分野で利用可能なあらゆる適切な方法、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、または、酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、グルクロン酸またはガラクツロン酸などのピラノシジル酸、クエン酸、または、酒石酸などのアルファ−ヒドロキシ酸、アスパラギン酸、または、グルタミン酸などのアミノ酸、安息香酸、または、ケイ皮酸などの芳香族酸、ｐ−トルエンスルホン酸、または、エタンスルホン酸などのスルホン酸などの有機酸を用いた遊離塩基の処理を行って、調製することができる。薬理学的に活性な当該化合物が、１つ以上の酸性官能基を有しておれば、医薬として許容可能な所望の塩は、当該技術分野で利用可能なあらゆる適切な方法、例えば、アミン（１級、２級、または、３級）、アルカリ金属水酸化物、または、アルカリ土類金属水酸化物などの無機または有機塩基を用いた遊離酸の処理を行って、調製することができる。適切な塩の例として、グリシン及びアルギニンなどのアミノ酸、アンモニア、１級、２級、及び、３級アミン、ならびに、ピペリジン、モルホリン、及び、ピペラジンなどの環状アミン、ならびに、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム、及び、リチウムから誘導する無機塩から誘導した有機塩がある。
本明細書で使用する「組成物」は、特定の量の特定の成分を含む産物、ならびに、特定の量の特定の成分の組み合わせから得られるあらゆる産物を含むことを意図している。「医薬として許容可能な」とは、担体、希釈剤、または、賦形剤が、製剤でのその他の成分と適合するものでなくてはならず、そのレシピエントに対して有害でない、ことを意味する。
「医薬として許容可能な賦形剤」とは、対象への活性剤の投与、及び、対象による吸収を補助する物質のことを指す。本発明において有用な医薬賦形剤として、結合剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、甘味料、香味料、及び、着色料などがあるが、これらに限定されない。当業者であれば、その他の医薬賦形剤が、本発明において有用であることを認識する。
一部の事例では、保護基を、本発明による方法で使用する化合物、または、本発明の組成物に含めることができる。このような保護基を使用すると、インビボで発生が認められ、かつ、化合物を分解することができる後続の加水分解、または、その他の反応を防ぐ。保護可能な基として、アルコール、アミン、カルボニル、カルボン酸、リン酸塩、及び、末端アルキンがある。アルコールを保護する上で有用な保護基として、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、β−メトキシエトキシエチルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシメチルエーテル、メトキシトリチル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラン、トリチル、シリルエーテル、メチルエーテル、及び、エトキシエチルエーテルがあるが、これらに限定されない。アミンを保護する上で有用な保護基として、カルボベンジルオキシ、ｐ−メトキシベンジルカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｐ−メトキシフェニル、トシル、トリクロロエチルクロロホルメート、及び、スルホンアミドがあるが、これらに限定されない。カルボニルを保護する上で有用な保護基として、アセタール、ケタール、アシラル、及び、ジチアンがある。カルボン酸を保護する上で有用な保護基として、メチルエステル、ベンジルエステル、ｔ−ブチルエステル、２，６−二置換フェノールのエステル、シリルエステル、オルトエステル、及び、オキサゾリンがある。リン酸基を保護する上で有用な保護基として、２−シアノエチル、及び、メチルがある。末端アルキンを保護する上で有用な保護基として、プロパルギルアルコール、及び、シリル基がある。その他の保護基は、当該技術分野で公知である。
本明細書で使用する用語「プロドラッグ」とは、投与の後に、一部の化学的または生理学的プロセスを介して、インビボで生物学的に活性な化合物を放出する前駆体化合物（例えば、生理学的ｐＨに到達すること、または、酵素作用を受けることで、生物学的に活性な化合物へと変換するプロドラッグ）のことを指す。プロドラッグそれ自体は、所望の生物学的活性を欠いており、または、持ち合わせ得る。したがって、用語「プロドラッグ」とは、医薬として許容可能な生物学的に活性な化合物の前駆体のことを指す。特定の事例では、プロドラッグは、当該プロドラッグが由来する親化合物よりも、改善した物理的、及び／または、送達特性を有する。当該プロドラッグは、哺乳類生物において、溶解性、組織適合性、または、遅延放出の利点を提供することがよくある（Ｈ． Ｂｕｎｄｇａｒｄ， Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， １９８８）， ｐｐ． ７−９， ２１−２４）。プロドラッグについての議論が、Ｔ． Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｒｏ−Ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，” ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｖｏｌ． １４ ａｎｄ ｉｎ Ｅ．Ｂ． Ｒｏｃｈｅ， ｅｄ．， Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ＆ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８７）で行われている。プロドラッグの例示的な利点として、長期保存のための薬物安定性の改善などの物理的特性があるが、これらに限定されない。
用語「プロドラッグ」とは、当該プロドラッグを対象に投与すると、インビボで活性化合物を放出する、共有結合したあらゆる担体を含むことも意味する。本明細書に記載した治療活性化合物のプロドラッグは、カンナビノイド類、テルペノイド類、及び、本発明の方法で使用する、または、本発明の組成物に含まれる、その他の治療活性化合物を含む当該治療活性化合物に存在する１つ以上の官能基を、通常の操作、または、インビボのいずれかで切断をして、治療的に活性な親化合物を得るような方法で修飾して調製することができる。プロドラッグは、ヒドロキシ、アミノ、または、メルカプト基が、あらゆる基に共有結合している化合物を含み、当該活性化合物のプロドラッグを、対象に投与すると、開裂を受けて、それぞれ、遊離ヒドロキシ、遊離アミノ、または、遊離メルカプト基を形成する。プロドラッグの例として、アルコール、または、アセトアミドのギ酸塩、または、安息香酸塩誘導体、反応に利用可能なアミン官能基を有する治療用活性剤のホルムアミド、または、ベンズアミド誘導体などがあるが、これらに限定されない。
例えば、治療活性剤、または、治療活性剤の医薬として許容可能な形態が、カルボン酸官能基を含んでいると、プロドラッグは、カルボン酸基の水素原子を、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-12アルカノイルオキシメチル、４〜９個の炭素原子を有する１−（アルカノイルオキシ）エチル、５〜１０個の炭素原子を有する１−メチル−１−（アルカノイルオキシ）エチル、３〜６個の炭素原子を有するアルコキシカルボニルオキシメチル、４〜７個の炭素原子を有する１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、５〜８個の炭素原子を有する１−メチル−１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、３〜９個の炭素原子を有するＮ−（アルコキシカルボニル）アミノメチル、４〜１０個の炭素原子を有する１−（Ｎ−（アルコキシカルボニル）アミノ）エチル、３−フタリジル、４−クロトノラクトニル、ガンマ−ブチロラクトン−４−イル、ジ−Ｎ、Ｎ（Ｃ1−Ｃ2）アルキルアミノ（Ｃ2−Ｃ3）アルキル（（３−ジメチルアミノエチル）、カルバモイル−（Ｃ1−Ｃ2）アルキル、Ｎ、Ｎ−ジ（Ｃ1−Ｃ2）アルキルカルバモイル−（Ｃ1−Ｃ2）アルキル、及び、ピペリジノ−、ピロリジノ−、または、モルホリノ（Ｃ2−Ｃ3）アルキルなど、の基で交換して形成したエステルを含むことができる。
同様に、開示した化合物、または、当該化合物の医薬として許容可能な形態が、アルコール官能基を含んでいると、当該アルコール基の水素原子を、（Ｃ1−Ｃ6）アルカノイルオキシメチル、１−（（Ｃ1−Ｃ6））アルカノイルオキシ）エチル、１−メチル−１−（（Ｃ1−Ｃ6）アルカノイルオキシ）エチル（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシカルボニルオキシメチル、Ｎ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシカルボニルアミノメチル、スクシノイル、（Ｃ1−Ｃ6）アルカノイル、α−アミノ（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル、アリールアシル、及び、α−アミノアシル、または、α−アミノアシル−α−アミノアシル、式中、それぞれのα−アミノアシル基は、自然界で認められるＬ−アミノ酸、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル）2、または、グリコシル（炭水化物のヘミアセタール形態のヒドロキシル基を除去すると生じるラジカル）から独立して選択する、などの基で交換してプロドラッグを形成することができる。
開示した化合物、または、当該化合物の医薬として許容可能な形態が、アミン官能基を含んでいると、当該アミン基の水素原子を、Ｒ−カルボニル、ＲＯ−カルボニル、ＮＲＲ’−カルボニル、式中、Ｒ、及び、Ｒ’が、それぞれ、独立して、（Ｃ1−Ｃ10）アルキル、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキル、ベンジルであり、または、Ｒ−カルボニルは、天然α−アミノアシル、または、天然α−アミノアシル−天然α−アミノアシル、Ｃ（ＯＨ）Ｃ（Ｏ）ＯＹ1であり、式中、Ｙ1は、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、または、ベンジル、Ｃ（ＯＹ2）Ｙ3であり、式中、Ｙ2は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり、及び、Ｙ3は、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、カルボキシ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、アミノ（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または、モノ−Ｎ、または、ジ−Ｎ、Ｎ（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノアルキル、Ｃ（Ｙ4）Ｙ5であり、式中、Ｙ4は、Ｈ、または、メチルであり、Ｙ5は、モノ−Ｎ、または、ジ−Ｎ、Ｎ（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノ、モルホリノ、ピペリジン−１−イル、または、ピロリジン−１−イルである、などの基で交換してプロドラッグを形成することができる。
プロドラッグシステムの使用は、Ｔ． Ｊａｒｖｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ” ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ （Ｓ．Ｃ． Ｇａｄ， ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ， ２００５）， ｃｈ． １７， ｐｐ． ７３３−７９６に記載されている。プロドラッグの構築及び使用のためのその他の代替手段は、当該技術分野で公知である。本発明の方法または医薬組成物が、カンナビノイド、テルペノイド、または、その他の治療活性剤のプロドラッグを使用し、または、含んでいると、化合物のプロドラッグ、及び、活性代謝物は、当該技術分野で公知の通常の技術を使用して特定することができる。例えば、Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ４０， ２０１１−２０１６ （１９９７）；Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ８６ （７）， ７６５−７６７；Ｂａｇｓｈａｗｅ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ．， ３４， ２２０−２３０ （１９９５）；Ｂｏｄｏｒ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．， １３， ２２４−３３１ （１９８４）；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ １９８５）；Ｌａｒｓｅｎ， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９１）；Ｄｅａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ， ７４８， ２８１−２９３ （２０００）；Ｓｐｒａｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ， １０， ６０１−６０５ （１９９２）；及び、Ｐｒｏｘ ｅｔ ａｌ．， Ｘｅｎｏｂｉｏｌ．， ３， １０３−１１２ （１９９２）を参照されたい。
カンナビノイド類
カンナビノイド類は、皮膚など、人体全体の細胞のカンナビノイド受容体を活性化することが知られている化学物質のグループである。フィトカンナビノイド類は、大麻植物に由来するカンナビノイド類である。それらは、植物から単離するか、あるいは、合成的に生産することができる。内因性カンナビノイド類は、人体に認められる内因性のカンナビノイド類である。標準的なフィトカンナビノイド類は、ベンゾピラン部分を担持しているＡＢＣ三環式テルペノイド化合物である。
カンナビノイド類は、細胞の表面に存在するカンナビノイド受容体と相互作用することで効果を発揮する。現在までに、ＣＢ１受容体、及び、ＣＢ２受容体の２種類のカンナビノイド受容体が同定されている。これらの２つの受容体は、約４８％のアミノ酸配列同一性を共有し、また、異なる組織に分布しており、そして、異なるシグナル伝達機構も備えている。また、アゴニスト、及び、アンタゴニストに対する感受性も異なる。
したがって、本明細書では、カンナビノイド類のインビボ生産のための遺伝子、プロモーター、及び、発現カセットをスクリーニングし、そして、同定するためのインビトロ、及び、インビボの方法を記載している。
一般的に、本明細書に記載の方法、及び、組成物は、宿主細胞におけるカンナビノイド類などの１つ以上のテルペノイド類の生産もしくは増産、または、宿主細胞における１つ以上のテルペノイドまたはカンナビノイド前駆体の生産のために使用することができる。一部の事例では、テルペノイド類、または、カンナビノイド類、または、それらの前駆体を精製、誘導体化して（例えば、プロドラッグ、溶媒和物、または、塩を形成して、または、当該前駆体から当該標的テルペノイドまたはカンナビノイドを形成して）、及び／または、医薬組成物を製剤することができる。
当該方法、及び／または、本発明の組成物を使用して生産することができるカンナビノイド類として、フィトカンナビノイド類があるが、これに限定されない。一部の事例では、当該カンナビノイド類として、カンナビノール、カンナビジオール、Δ9−テトラヒドロカンナビノール（Δ9−ＴＨＣ）、合成カンナビノイドＨＵ−２１０（６ａＲ、１０ａＲ）−９−（ヒドロキシメチル）−６，６−ジメチル−３−（２−メチルオクタン−２−イル）−６Ｈ、６ａＨ、７Ｈ、１０Ｈ、１０ａＨ−ベンゾ［ｃ］イソクロメン−１−オール）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビクロメバリン（ＣＢＣＶ）、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビゲロバリン（ＣＢＧＶ）、カンナビエルソイン（ＣＢＥ）、カンナビシクロル（ＣＢＬ）、カンナビバリン（ＣＢＶ）、及び、カンナビトリオール（ＣＢＴ）があるが、これらに限定されない。さらにその他のカンナビノイド類として、テトラヒドロカンニビバリン（ＴＨＣＶ）、及び、カンナビゲロールモノメチルエーテル（ＣＢＧＭ）がある。さらなるカンナビノイド類として、カンナビクロム酸（ＣＢＣＡ）、Δ9−テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）；及び、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）があり；これらのさらなるカンナビノイド類は、それらの構造に、カルボン酸基が存在していることが特徴である。
さらにその他のカンナビノイド類として、ナビロン、リモナバント、ＪＷＨ−０１８（ナフタレン−１−イル−（１−ペンチルインドール−３−イル）メタノン）、ＪＷＨ−０７３ ナフタレン−１−イル−（１−ブチルインドール−３−イル）メタノン、ＣＰ−５５９４０（２−［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシプロピル）シクロヘキシル］−５−（２−メチルオクタン−２−イル）フェノール）、ジメチルヘプチルピラン、ＨＵ−３３１（３−ヒドロキシ−２−［（１Ｒ）−６−イソプロペニル−３−メチル−シクロヘクス−２−エン−１−イル］−５−ペンチル−１，４−ベンゾキノン）、ＳＲ１４４５２８（５−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−１−［（４−メチルフェニル）メチル］−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−１，３，３−トリメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド）、ＷＩＮ ５５，２１２−２（（１１Ｒ）−２−メチル−１１−［（モルホリン−４−イル）メチル］−３−（ナフタレン−１−カルボニル）−９−オキサ−１−アザトリシクロ［６．３．１．０4，12］ドデカ−２，４（１２）、５，７−テトラエン）、ＪＷＨ−１３３（（６ａＲ，１０ａＲ）−３−（１，ｌ−ジメチルブチル）−６ａ、７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−６，６，９−トリメチル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン）、レボナトラドール、及びＡＭ−２２０１（１−［（５−フルオロペンチル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−（ナフタレン−１−イル）メタノン）がある。その他のカンナビノイド類として、Δ8−テトラヒドロカンナビノール（Δ8−ＴＨＣ）、１１−ヒドロキシ−Δ9−テトラヒドロカンナビノール、Δ11−テトラヒドロカンナビノール、及び、１１−ヒドロキシ−テトラカンナビノールがある。
別の代替手段では、これらのカンナビノイド類の類似体または誘導体を、カンナビノイド前駆体の生産、及び、さらなる誘導体化、例えば、合成手段で得ることができる。合成カンナビノイドとして、Ａｔｔａｌａ ｅｔ ａｌ．の米国特許第９，３９４，２６７号；Ｈｅｒｋｅｎｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．の米国特許第９，３７６，３６７号；Ｇｉｊｓｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第９，２８４，３０３号；Ｔｒａｖｉｓの米国特許番号９，１７３，８６７号；Ｆｕｌｐ ｅｔ ａｌ．の米国特許第９，１３３，１２８号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第８，７７８，９５０号；Ａｄａｍ−Ｗｏｒｒａｌｌ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，７００，６３４号；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，５０４，５２２号；Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，２９４，６４５号；Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，１０９，２１６号；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，８２５，２０９号；及び、Ｍｉｔｔｅｎｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，２８４，７８８号に記載されたものがあるが、これらに限定されない。
別の代替手段では、当該カンナビノイドを、エンドカンナビノイド、または、その誘導体または類似体とすることができる。エンドカンナビノイドとして、アナンダミド、２−アラキドノイルグリセロール、２−アラキドニルグリセリルエーテル、Ｎ−アラキドノイルドーパミン、及び、ビロダミンがあるが、これらに限定されない。７，１０，１３，１６−ドコサテトラエノイルエタノールアミド、オレアミド、ステアロイルエタノールアミド、及び、ホモ−γ−リノレノイルエタノールアミンなど、数多くのエンドカンナビノイドの類似体が公知である。
本発明の方法で生産されるカンナビノイド類、及び、組成物は、ＣＢ１カンナビノイド受容体、または、ＣＢ２カンナビノイド受容体のいずれかに結合する、ＣＢ２カンナビノイド受容体に対して選択的、または、２つのカンナビノイド受容体に対して非選択的のいずれかにすることができる。一部の事例では、本発明の方法で生産されるカンナビノイド類、及び、組成物は、ＣＢ２カンナビノイド受容体に対して選択的である。一部の事例では、当該カンナビノイド類、または、カンナビノイド類の混合物での１つのカンナビノイドは、ＣＢ２のアンタゴニスト（例えば、選択的、または、非選択的アンタゴニスト）である。一部の事例では、本発明の方法で生産されるカンナビノイド類、及び、組成物は、ＣＢ２カンナビノイド受容体に対して選択的である。一部の事例では、当該カンナビノイド類、または、カンナビノイド類の混合物での１つのカンナビノイドは、ＣＢ１のアンタゴニスト（例えば、選択的、または、非選択的アンタゴニスト）である。
発現カセット
本明細書では、宿主細胞において、１つ以上の標的遺伝子を発現するのに適した発現カセットを記載している。本明細書に記載した発現カセットは、プラスミドの成分とすることができ、または、宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。単一のプラスミドは、本明細書に記載した１つ以上の発現カセットを含むことができる。本明細書での使用では、２つ以上の発現カセットを記載しており、代替的に、２つ以上の発現カセットの少なくとも２つを組み合わせて、発現カセットの数を減らすことができる、と理解する。同様に、複数の標的遺伝子を、単一のプロモーターに機能的に連結していると記載しており、したがって、単一の発現カセットの成分として記載してあると、当該単一の発現カセットが、説明をした単一の発現カセットの重複または非重複のサブセットを含む２つ以上の発現カセットに細分できる、と理解する。
本明細書に記載した発現カセットは、当該技術分野で公知の適切なプロモーターを含むことができる。一部の事例では、当該プロモーターは、構成的プロモーターである。その他の事例では、当該プロモーターは、誘導性プロモーターである。好ましい実施形態では、当該プロモーターは、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔｒｃプロモーター、Ｌａｃプロモーター、Ｔａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、先端プロモーター、λＰLプロモーター、λＰRプロモーター、λＰRＰLプロモーター、アラビノースプロモーター（ａｒａＢＡＤ）などである。一部の実施形態では、当該プロモーターは、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、Ｚａｓｌａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６ Ａｕｇ；３（８）：６２３−８に記載されているＥ．ｃｏｌｉプロモーター、特に、そこに記載されている、目的の核酸、標的遺伝子、宿主細胞、及び、それらの組み合わせの発現のためのプラスミドを含む、プロモーター、発現カセットからなる群から選択する。様々な宿主細胞で１つ以上の標的遺伝子の発現を駆動する上で有用なプロモーターは数多くあり、当業者に周知である（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６；ＵＳ８，５０７，２３５；ＵＳ８，７１５，９６２；及び、ＷＯ２０１１／０１７７９８、及び、そこで引用された参考文献を参照されたい、特に、目的の核酸、標的遺伝子、宿主細胞、及び、そこに記載されたそれらの組み合わせの発現のためのプラスミドを含む、プロモーター、発現カセットなどに関して、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する。
本明細書に記載した方法、及び、組成物は、適切な宿主細胞におけるＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子の発現、及び／または、当該ＭＥＰ経路の１つ以上の産物の生産のために使用することができる。一部の実施形態では、ＭＥＰ経路のフラックスを、遺伝子コピー数の増幅、及び／または、内因性遺伝子（または、そのコピー）を強力な構成的または誘導性異種プロモーターに機能的に連結することで、宿主細胞の１つ以上の内因性成分を過剰発現して増加させる。したがって、ある実施形態では、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを提供する。Ｅ．ｃｏｌｉでは、内因性ＭＥＰ経路遺伝子は、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及び、ｉｄｉである。
一部の事例では、当該発現カセットのプロモーターを、ＭＥＰ経路の２つ以上の遺伝子をコードする核酸に機能的に連結する。一部の事例では、当該発現カセットのプロモーターを、ＭＥＰ経路の３つ以上の遺伝子をコードする核酸に機能的に連結する。一部の事例では、当該発現カセットのプロモーターを、ＭＥＰ経路の４つ、５つ、６つ、または、８つすべての遺伝子をコードする核酸に機能的に連結する。一部の事例では、当該発現カセットで提供するＭＥＰ経路の遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子である。その他の事例では、当該発現カセットで提供するＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉとは異種の遺伝子である。一部の事例では、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子を、第１の発現カセットに提供し、そして、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子を、第２の発現カセットに提供する。好ましい実施形態では、ｄｘｓ及びｉｄｉに機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを提供する。
一部の事例では、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードし、そして、ＧＰＰシンターゼ、カンナビノイドシンターゼ、または、イソプレンシンターゼをさらにコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを提供する。一部の事例では、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードし、そして、ＴＨＣＡシンターゼをさらにコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを提供する。一部の事例では、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードし、そして、ＣＢＧＡシンターゼをさらにコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを提供する。一部の事例では、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードし、そして、ＣＢＣＡシンターゼをさらにコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを提供する。一部の事例では、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードし、そして、ＣＢＤＡシンターゼをさらにコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを提供する。
一部の実施形態では、二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを提供する。このｉｓｐＤＦ遺伝子は、宿主細胞でのネイティブｉｓｐＤ、及び／または、ｉｓｐＦの過剰発現に加えて、または、その代わりに、使用することができる。一部の事例では、当該核酸は、以下のアミノ酸配列（配列番号１）を有するｉｓｐＤＦタンパク質をコードする：
ＭＩＡＬＱＲＳＬＳＭＨＶＴＡＩＩＡＡＡＧＥＧＲＲＬＧＡＰＬＰＫＱＬＬＤＩＧＧＲＳＩＬＥＲＳＶＭＡＦＡＲＨＥＲＩＤＤＶＩＶＶＬＰＰＡＬ
ＡＡＡＰＰＤＷＩＡＡＳＧＲＶＰＡＶＨＶＶＳＧＧＥＲＲＱＤＳＶＡＮＡＦＤＲＶＰＡＱＳＤＶＶＬＶＨＤＡＡＲＰＦＶＴＡＥＬＩＳＲＡＩ
ＤＧＡＭＱＨＧＡＡＩＶＡＶＰＶＲＤＴＶＫＲＶＤＰＤＧＥＨＰＶＩＴＧＴＩＰＲＤＴＩＹＬＡＱＴＰＱＡＦＲＲＤＶＬＧＡＡＶＡＬＧＲＳＧ
ＶＳＡＴＤＥＡＭＬＡＥＱＡＧＨＲＶＨＶＶＥＧＤＰＡＮＶＫＩＴＴＳＡＤＬＤＱＡＲＱＲＬＲＳＡＶＡＡＲＩＧＴＧＹＤＬＨＲＬＩＥＧＲ
ＰＬＩＩＧＧＶＡＶＰＣＤＫＧＡＬＧＨＳＤＡＤＶＡＣＨＡＶＩＤＡＬＬＧＡＡＧＡＧＮＶＧＱＨＹＰＤＴＤＰＲＷＫＧＡＳＳＩＧＬＬＲＤ
ＡＬＲＬＶＱＥＲＧＦＴＶＥＮＶＤＶＣＶＶＬＥＲＰＫＩＡＰＦＩＰＥＩＲＡＲＩＡＧＡＬＧＩＤＰＥＲＶＳＶＫＧＫＴＮＥＧＶＤＡＶＧＲＧＥ
ＡＩＡＡＨＡＶＡＬＬＳＥＳ．
その他の実施形態では、当該ｉｓｐＤＦ核酸は、配列番号１に関して、少なくとも３２％、４０％、４５％、５０％、５２％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、９９％の同一性を有するｉｓｐＤＦタンパク質をコードする。さらにその他の実施形態では、当該ｉｓｐＤＦ核酸は、配列番号１の少なくとも３００個の連続したアミノ酸に関して、少なくとも３２％、４０％、４５％、５０％、５２％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、９９％の同一性を有するｉｓｐＤＦタンパク質をコードする。
一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ Ｊ９９ ｊｈｐ０４０４、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰＡＧ１ ＨＰＡＧ１＿０４２７、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ ＨＨ１５８２、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ ｓｔ．Ｓｈｅｅｂａ Ｈａｃ＿１１２４、Ｗ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ １７４０ ＷＳ１９４０、Ｓ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １２５１ Ｓｕｄｅｎ＿１４８７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８Ｃｊ１６０７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＲＭ１２２１ ＣＪＥ１７７９、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ８１−１７６ ＣＪＪ８１１７６＿１５９４、及び、Ｃ．ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｅｔｕｓ ８２−４０ ＣＦＦ８２４０＿０４０９の少なくとも３００個の連続したアミノ酸に対して７５％以下の同一性を有する一次アミノ酸配列を有する。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ Ｊ９９ ｊｈｐ０４０４、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰＡＧ１ ＨＰＡＧ１＿０４２７、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ ＨＨ１５８２、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ ｓｔ．Ｓｈｅｅｂａ Ｈａｃ＿１１２４、Ｗ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ １７４０ ＷＳ１９４０、Ｓ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １２５１ Ｓｕｄｅｎ＿１４８７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８Ｃｊ１６０７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＲＭ１２２１ ＣＪＥ１７７９、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ８１−１７６ ＣＪＪ８１１７６＿１５９４、及び、Ｃ．ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｅｔｕｓ ８２−４０ ＣＦＦ８２４０＿０４０９ではない。
当該二官能性ｉｓｐＤＦは、プラスミド内の核酸でコードすることができる。あるいは、当該二官能性ｉｓｐＤＦは、異種宿主細胞のゲノムに組み込まれた核酸でコードすることができる。一部の事例では、異種プロモーターは、当該二官能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸に対して機能的に連結する。さらに、または、代替的に、宿主細胞は、当該二官能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸に対して異種とすることができる。
当該二官能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸を、ＭＥＰ経路遺伝子をコードする核酸を含む上記した発現カセットのいずれか１つなどのＭＥＰ経路発現カセットに含めることができる。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸を、カンナビノイドシンターゼをコードする核酸を含む発現カセットに含めることができる。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸を、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸を含む発現カセットに含めることができる。一部の事例では、当該二官能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸は、イソプレンシンターゼをコードする核酸を含む発現カセットに含めることができる。
本明細書に記載の方法及び組成物は、適切な宿主細胞でのＭＥＰ経路で生産される前駆体由来のＧＰＰの生産に使用することができる。したがって、一部の実施形態では、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを提供する。このＧＰＰシンターゼは、ＭＥＰ経路の遺伝子をコードする核酸も含む発現カセットに含めることができる。さらに、または、代替的に、このＧＰＰシンターゼは、カンナビノイドシンターゼをコードする核酸も含む発現カセットに含めることができる。一部の事例では、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸に機能的に連結している発現カセットのプロモーターも、カンナビノイドシンターゼに機能的に連結する。さらに、または、代替的に、このＧＰＰシンターゼは、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸も含む発現カセットに含めることができる。さらに、または、代替的に、このＧＰＰシンターゼは、イソプレンシンターゼをコードする核酸も含む発現カセットに含めることができる。
本明細書に記載の方法及び組成物は、宿主細胞におけるカンナビノイドの生産のために使用することができる。したがって、一部の実施形態では、カンナビノイドシンターゼをコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを提供する。当該カンナビノイドシンターゼは、Ｃａｎｎａｂｉｓ属の植物に対して内因性のカンナビノイドシンターゼ、または、そのオルソログとすることができる。一部の事例では、当該カンナビノイドシンターゼは、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ、または、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｉｎｄｉｃａに対して内在性のカンナビノイドシンターゼ、または、そのオルソログである。一部の事例では、当該カンナビノイドシンターゼは、ＣＢＧＡシンターゼ、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、または、ＣＢＣＡシンターゼである（例えば、Ｃａｎｎａｂｉｓ属の植物に対して内在性であり、または、そのオルソログである）。
当該カンナビノイドシンターゼは、宿主での発現のために修飾することができる。例えば、１つ以上の膜貫通、または、シグナルペプチドドメインを切断することができる。さらに、または、代替的に、１つ以上のグリコシル化部位を、（例えば、一次アミノ酸配列の突然変異で）削除することができる。同様に、そのネイティブ宿主でのネイティブタンパク質での分子内ジスルフィド結合に認められる１つ以上の、または、すべてのシステインを、例えば、セリンに変異させることができる。同様に、そのネイティブ宿主でのネイティブタンパク質での分子間ジスルフィド結合に認められる１つ以上の、または、すべてのシステインを、例えば、セリンに変異させることができる。
宿主細胞
上記した発現カセットのいずれか、及び、それらの組み合わせを、適切な宿主細胞に導入し、そして、標的テルペノイド、または、カンナビノイドの生産のために使用することができる。適切な宿主細胞として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ， Ｐａｎｔｅｏａ， Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ，または、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の原核生物などがあるが、これらの原核生物に限定されない。好ましい原核生物宿主細胞として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ． ｃｏｌｉ）， Ｐａｎｔｅｏａ ｃｉｔｒｅａ， Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，及び、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載した発現カセットは、１つ以上の標的遺伝子（例えば、ＭＥＰ経路遺伝子、カンナビノイドシンターゼ遺伝子、ｉｓｐＡ、ｉｓｐＳ、ｉｓｐＤＦ、または、ＧＰＰシンターゼ）をコードする核酸に機能的に連結したプロモーター（例えば、異種プロモーター）を含み、１つ以上の標的遺伝子をコードする当該核酸が、発現カセットを含む宿主細胞に最適化したコドンである。
一部の事例では、当該宿主細胞は、ＤＭＡＰＰ、及び／または、ＩＰＰなどのＭＥＰ経路の１つ以上の産物を含む。例えば、本明細書に記載したＭＥＰ経路発現カセットを含む宿主細胞は、ＭＥＰ経路発現カセットを含まない宿主細胞と比較して、ＤＭＡＰＰ、及び／または、ＩＰＰなどのＭＥＰ経路産物の量を増加させることができる。
一部の事例では、当該宿主細胞は、当該ＭＥＰ経路の下流にある１つ以上の産物を含むことができる。例えば、ＧＰＰシンターゼ発現カセットを含む宿主細胞は、当該ＧＰＰシンターゼ発現カセットを欠いた宿主細胞と比較して、増加した量のＧＰＰを含むことができる。別の例として、イソプレンシンターゼ発現カセットを含む宿主細胞は、当該イソプレンシンターゼ発現カセットを欠いた宿主細胞と比較して、増加した量のイソプレンを含むことができる。
さらに別の例として、カンナビノイドシンターゼ発現カセットを含む宿主細胞は、カンナビノイドシンターゼ発現カセットを欠いた宿主細胞と比較して、増加した量のカンナビノイドを含むことができる。一部の事例では、当該カンナビノイドは、ＣＢＧＡである。一部の事例では、当該カンナビノイドは、ＣＢＣＡである。一部の事例では、当該カンナビノイドは、ＣＢＤＡである。一部の事例では、当該カンナビノイドは、ＴＨＣＡである。一部の事例では、当該カンナビノイドは、ＣＢＮである。一部の事例では、当該カンナビノイドは、ＣＢＤである。一部の事例では、当該カンナビノイドは、ＴＨＣである。一部の事例では、当該カンナビノイドは、ＣＢＣである。一部の事例では、当該カンナビノイドは、ＴＨＣＶである。一部の事例では、当該カンナビノイドは、ＣＢＤＶである。一部の事例では、当該カンナビノイドは、ＣＢＣＶである。
同様に、当該宿主細胞を、非誘導条件と比較して、当該発現カセットから発現を誘導するのに適した条件下で宿主細胞を培養すると、当該宿主細胞での発現カセットがコードする１つ以上の酵素の産物の量を増加させることができる。例えば、誘導因子の非存在下（例えば、ＩＰＴＧ、アラビノースなどの非存在下）で培養した同じ宿主細胞と比較して、誘導を行うと、当該宿主細胞は、ＤＭＡＰＰ、及び／または、ＩＰＰの増加を示することができる。別の例として、誘導因子の非存在下（例えば、ＩＰＴＧ、アラビノースなどの非存在下）で培養した同じ宿主細胞と比較して、誘導を行うと、当該宿主細胞は、ＧＰＰの増加を示することができる。別の例として、誘導因子の非存在下（例えば、ＩＰＴＧ、アラビノースなどの非存在下）で培養した同じ宿主細胞と比較して、誘導を行うと、当該宿主細胞は、イソプレンの増加を示すことができる。別の例として、誘導因子の非存在下（例えば、ＩＰＴＧ、アラビノースなどの非存在下）で培養した同じ宿主細胞と比較して、誘導を行うと、当該宿主細胞は、カンナビノイドの増加を示すことができる。
一部の実施形態では、当該宿主細胞は、オリベトール酸（ＯＡ）を含む。ＯＡを含有する培地で宿主細胞を培養することで、ＯＡを当該宿主細胞に導入することができる。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、ジバリン酸（ＤＶＡ）を含む。ＤＶＡを含有する培地で宿主細胞を培養することで、ＤＶＡを当該宿主細胞に導入することができる。
一部の実施形態では、当該宿主細胞を、ＭＥＰ経路を通るフラックスを減少させる内因性酵素をコードする１つ以上の遺伝子の発現を削除または減少するように遺伝的に改変する。一部の実施形態では、当該宿主細胞を、ＭＥＰ経路を通るフラックスを減少させる内因性酵素の量または活性を、削減または減少するように遺伝的に改変する。例えば、ピルビン酸塩、及び、グリセルアルデヒド−３リン酸塩（Ｇ３Ｐ）は、ＭＥＰ経路ｄｘｓの初期酵素の基質である。ピルビン酸塩とＧ３Ｐとを消費する内因性経路を改変して、ピルビン酸塩とＧ３Ｐの量を増やし、そうして、ＭＥＰ経路を通るフラックスを増加することができる。一部の事例では、ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｌｄｈＡ、ｄｌｄ、ａｄｈＥ、ｐｐｓ、及び、ａｔｏＤＡからなる群から選択した１つ以上の宿主細胞内因性遺伝子、または、遺伝子産物を修飾して、ピルビン酸塩、または、Ｇ３Ｐレベルを増加させる。
培養方法
本発明は、誘導条件下、適切な培地で本発明の宿主細胞を培養して、標的代謝産物を生産するプロセスをさらに提供する。当該標的代謝産物を、カンナビノイド、テルペノイド、または、それらの前駆体とすることができる。この方法は、使用済培地、及び／または、当該宿主細胞において、当該代謝産物を濃縮することを含むことができる。
生産した微生物は、所望の有機化合物を生産する目的で、例えば、ＷＯ ０５／０２１７７２に記載されているようにして連続的に、または、回分プロセス（回分培養）、または、流加培養、または、反復流加培養プロセスで不連続に培養することができる。公知の培養方法に関する一般的な性質の概要は、Ｃｈｍｉｅｌのテキスト（ＢｉｏｐｒｏｚｅＢｔｅｃｈｎｉｋ． １ ： Ｅｉｎｆｉｉｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ （Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， １９９１）、または、Ｓｔｏｒｈａｓのテキスト（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ （Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ， １９９４）から得ることができる。
使用する培養培地、または、発酵培地は、それぞれの株の要求事項を満足する適切な方法で扱わなければならない。様々な微生物の培地の説明は、”Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ” ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡ， １９８１）に記載されている。培養培地の用語と、発酵培地の用語とは、互換可能である。
炭素源として、糖類、及び、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、甜菜、または、サトウキビ加工物由来のスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物、及び、セルロースなど；油脂、例えば、大豆油、向日葵油、ピーナッツ油、及び、ココナッツ油脂など；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及び、リノール酸など；アルコール、例えば、グリセロール、メタノール、及び、エタノール；及び、有機酸、例えば、酢酸または乳酸など、を使用することができる
窒素源として、有機窒素含有化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、尿素など；または、無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び、硝酸アンモニウムなどを使用することができる。当該窒素源は、個別に、または、混合物として使用することができる。
リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウム、または、リン酸水素二カリウム、または、対応するナトリウム含有塩を使用することができる。
培養培地は、増殖に必要である、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、及び、鉄などの金属の塩化物または硫酸塩の形態の塩、例えば、硫酸マグネシウム、または、硫酸鉄などをさらに含み得る。最後に、アミノ酸、例えば、ホモセリン、及び、ビタミン、例えば、チアミン、ビオチン、または、パントテン酸などの必須の成長因子を、上記した物質に加えて使用し得る。
当該出発材料を、単一回分の形態で当該培養物に対して添加することができ、または、培養中に適切な方法で供給し得る。
当該培養物のｐＨを、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、または、アンモニア水などの塩基性化合物；または、リン酸や硫酸などの酸性化合物を使用して、適切な方法で制御できる。このｐＨは、一般的には、６．０〜８．５、好ましくは、６．５〜８の値に調整する。発泡を制御するために、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、例えば、抗生物質などの適切な選択物質を培地に加えることができる。この培養は、好ましくは、好気的条件下で行う。これらの条件を維持するために、酸素、または、例えば、空気などの酸素含有ガス混合物を、培養物に導入する。同様に、過酸化水素が豊富な液体を使用することもできる。この培養は、適切であれば、高圧で、例えば、０．０３〜０．２ＭＰａの高圧で行う。当該培養物の温度は、通常は、２０℃〜４５℃、好ましくは、２５℃〜４０℃、特に好ましくは、３０℃〜３７℃である。回分または流加プロセスでは、好ましくは、回収するのに十分な量の所望の有機化学化合物が形成されるまで、培養を継続する。この目的は、通常であれば、１０時間〜１６０時間以内に達成される。連続プロセスでは、さらに長時間の培養ができる。当該微生物の活性は、発酵培地、及び／または、当該微生物の細胞にて、有機化学化合物を濃縮（蓄積）する。
適切な培地の例は、特に、特許ＵＳ５，７７０，４０９、ＵＳ５，９９０，３５０、ＵＳ５，２７５，９４０、ＷＯ２００７／０１２０７８、ＵＳ５，８２７，６９８、ＷＯ２００９／０４３８０３、ＵＳ５，７５６，３４５、及び、ＵＳ７，１３８，２６６に認められる。
培養を行っている間の１つ以上の時間での濃度を決定するための標的代謝産物の分析を、クロマトグラフィー、好ましくは、逆相クロマトグラフィーで代謝物を分離することで行うことができる。
検出は、光度的（吸収、蛍光）に行うことができる。
本発明の１つ以上の発現カセットを含む宿主細胞を使用する培養方法の実施は、濃度（単位体積あたりで形成した標的代謝産物）、収率（消費した単位炭素源あたりで形成した標的代謝産物）、形成（単位体積及び時間あたりで生産した標的代謝産物）、及び、特定の形成（単位乾燥細胞物質または乾燥バイオマス及び時間あたりの標的代謝産物、または、単位細胞タンパク質及び時間あたりで形成した化合物）、または、その他のプロセスパラメーター、及び、それらの組み合わせからなる群から選択した１つ以上のパラメーターに関して、本発明の発現カセットを含まない宿主細胞を使用する培養方法に基づいて、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または、少なくとも１００％増加させることができる。これは、大規模な工業プロセスの観点から非常に価値があるものと考えられる。
次いで、当該標的代謝産物を含む産物を、液体または固体の形態で、提供、または、生産、または、回収することができる。
使用済培地とは、宿主細胞を、特定の時間、及び、特定の温度で培養した培地のことを意味する。培養に使用する培養培地または培地は、所望の標的代謝産物の生産、及び、一般的には、増殖及び生存能力を確保するすべての物質または成分を含む。培養が完了すると、得られる使用済培地は：ａ）当該微生物のバイオマス（細胞塊）であって、当該バイオマスは、当該微生物の細胞の増殖に起因して生じたものである；ｂ）培養中に形成した所望の標的代謝産物；ｃ）培養中に形成した可能性のある有機副産物；及び、ｄ）使用した培養培地の成分、または、例えば、ビオチンなどのビタミン、または、硫酸マグネシウムなどの塩類など、培養で消費されなかった出発材料の成分を含む。
当該有機副産物は、特定の所望の化合物に加えて、培養に使用した微生物が生産し、かつ、任意に分泌した物質を含む。当該使用済培地を、培養容器、または、発酵タンクから取り出し、必要に応じて回収し、そして、液体または固体の形態で標的代謝産物を含む産物を提供するために使用することができる。最も単純な事例では、当該発酵タンクから取り出した標的代謝産物を含む使用済培地それ自体が、回収した産物を構成する。
一部の事例では、当該標的代謝産物（例えば、テルペノイド、カンナビノイド、または、それらの前駆体）の回収として、ａ）一部（＞０％〜＜８０％）〜完全（１００％）、または、実質的に完全（＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、または、＞９９％）な水の除去；ｂ）一部（＞０％〜＜８０％）〜完全（１００％）、または、実質的に完全（＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、または、＞９９％）なバイオマスの除去であって、後者は、除去する前に任意に不活性化する；ｃ）一部（＞０％〜＜８０％）〜完全（１００％）、または、実質的に完全（＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、＞９９％、＞９９．３％、または、＞９９．７％）な培養中に形成した有機副産物の除去；及び、ｄ）一部（＞０％）〜完全（１００％）、または、実質的に完全（＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、＞９９％、＞９９．３％、または、＞９９．７％）な使用した発酵培地の成分の除去、または、所望の標的代謝産物の濃縮または精製を達成する、培養で消費しなかった使用済培地由来の出発物質の成分の除去からなる群から選択した１つ以上の評価基準があるが、これらに限定されない。当該標的代謝産物を所望の含有量で含む組成物を、このようにして単離する。
一部（＞０％〜＜８０％）〜完全（１００％）、または、実質的に完全（＞８０％〜＜１００％）の水の除去（評価基準ａ））は、乾燥とも称する。
当該プロセスのある変形では、水、バイオマス、有機副産物、及び、使用した発酵培地の未消費成分の完全または実質的に完全な除去は、所望の標的代謝産物の純粋な（＞８０重量％、＞９０重量％）、または、高純度の（＞９５重量％、＞９７重量％、または、＞９９重量％）の産物形態をもたらす。手段ａ）、ｂ）、ｃ）、及び、ｄ）についての豊富な技術的指導を、先行技術から得ることができる。
必要に応じて、当該バイオマスを、例えば、遠心分離、濾過、デカンテーション、または、それらの組み合わせなどの分離方法で、使用済培地から完全に、または、一部を除去するか、または、そこに完全に残存させることができる。適切であれば、当該バイオマス、または、当該バイオマス含有使用済培地を、適切なプロセスステップにおいて、例えば、熱処理（加熱）、または、アルカリまたは酸を添加して不活性化する。
ある手順では、調製した産物に、バイオマスが全く無い（０％）、または、最大で３０％、最大で２０％、最大で１０％、最大で５％、最大で１％、または、最大で０．１％だけが残存するなど、当該バイオマスは、完全に、または、実質的に完全に除去される。さらなる手順では、調製した産物に、バイオマスが全部残存している（１００％）、または、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または、９９．９％を超えるバイオマスが残存するなど、当該バイオマスは、除去されず、または、わずかな割合しか除去されない。したがって、本発明のあるプロセスでは、バイオマスを、＞０％〜＜１００％の割合で除去する。最後に、発酵後に得た発酵培養液は、バイオマスの完全な、または、一部の除去の前または後に、無機酸、例えば、塩酸、硫酸、または、リン酸など；または、有機酸、例えば、プロピオン酸などで酸性ｐＨに調整して、最終製品の取り扱い特性を改善する（ＧＢ１，４３９，７２８、または、ＥＰ１３３１２２０）。同様に、バイオマスの全内容物で、発酵培養液を酸性化することもできる。最後に、重硫酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３、ＧＢ１，４３９，７２８）、または、別の塩、例えば、亜硫酸のアンモニウム、アルカリ金属、または、アルカリ土類金属塩を加えることで、ブロスを安定化することもできる。
当該バイオマスを除去する間に、使用済培地に存在するあらゆる有機または無機固形物を、部分的に、または、完全に除去することができる。使用済培地に溶解した有機副産物、及び、発酵培地に溶解した非消費成分（出発物質）は、少なくとも一部（＞０％）を残存させることができ、一部の事例では、当該産物での少なくとも２５％程度、一部の事例では、少なくとも５０％程度、及び、一部の事例では、少なくとも７５％程度を残存させることができる。適切であれば、それらは、当該産物に全部（１００％）が、または、実質的に全部、すなわち、＞９５％、または、＞９８％、または、＞９９％が残存する。
続いて、例えば、回転蒸発器、薄膜蒸発器、流下膜蒸発器を使用して、逆浸透で、または、ナノ濾過などの公知の方法で、使用済培地から水を除去し、または、使用済培地を、濃化または濃縮することができる。次いで、この濃縮した使用済培地を、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧造粒の方法、または、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６６５５での実施例の記載にあるような循環流動床などのその他のプロセスによって、自由流動性産物、特に、微粉、または、好ましくは、粗粒に仕上げることができる。
医薬組成物
当該標的代謝産物を、医薬組成物に製剤することができる。一部の事例では、使用済培地、または、濃縮使用済培地、または、当該使用済培地に由来する一部または全体を精製した標的代謝産物、または、本明細書に記載の培養方法で得たバイオマスを、医薬組成物に製剤する。
本発明の医薬組成物は、１つ以上の賦形剤を含むことができる。皮膚への適用を目的とする局所用組成物での使用に適したこのような賦形剤として；防腐剤；増粘剤；緩衝剤；液状担体；等張剤；湿潤剤；可溶化剤、及び、乳化剤；酸性化剤；抗酸化剤；抗酸化剤；アルカリ化剤；担持剤；キレート剤；錯化剤；溶剤；懸濁剤、または、増粘剤；油脂；浸透促進剤；ポリマー；硬化剤；タンパク質；炭水化物；及び、増量剤があるが、これらに限定されない。
医薬製剤の技術分野で一般的に周知のように、賦形剤の濃度、組成物でのその他の賦形剤、当該組成物での物理的形態、当該組成物での活性剤の濃度、当該組成物の意図した投与経路、及び、その他の要因に応じて、特定の賦形剤は、特定の医薬組成物において、これらの機能の１つ以上を満足することができる。以下のカテゴリーの特定の賦形剤の記述は、別のカテゴリー（複数可）での賦形剤の使用の可能性を排除することは意図していない。
当該液状担体を、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グリセロール、及び、エタノールからなる群から選択した液状担体とすることができるが、これらに限定されない。
増粘剤を、グリセロール、及び、プロピレングリコールからなる群から選択した増粘剤とすることができるが、これらに限定されない。
等張剤を：マンニトール、及び、ソルビトールからなる群から選択した多価アルコール；塩化ナトリウム；及び、塩化カリウムとすることができるが、これらに限定されない。
湿潤剤、可溶化剤、または、乳化剤は、一般的に、界面活性剤である。通常、界面活性剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドキュセートナトリウム、ノノキシノール９、ノノキシノール１０、オクトキシノール９、ポロキサマー、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０、硬化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシル５０、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０、セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、チロキサポール、アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンアルコール、レシチン、モノ−、及び、ジ−グリセリド、モノエタノールアミン（補助剤）、オレイン酸（補助剤）、オレイルアルコール（安定剤）、ポロキサマー、ステアリン酸ポリオキシエチレン５０、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０硬化ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、二酢酸プロピルグリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トリエタノールアミン、乳化ワックス、セトマクロゴール、及び、セチルアルコールからなる群から選択する。
局所適用のための医薬組成物は、皮膚軟化剤を含むことができる。本明細書で使用する用語「皮膚軟化剤」とは、皮膚、または、その他の粘膜を柔軟にし、滑らかにし、そして、脂質含有量を改善する疎水性作用物質のことを指す。使用に適した皮膚軟化剤の例として、イソステアリン酸誘導体、パルミチン酸イソプロピル、ラノリン油、ダイマー酸ジイソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル、ジメチルイソソルビド、マレイン酸塩化大豆油、パルミチン酸オクチル、イソステアリン酸イソプロピル、セチルアルコール、乳酸セチル、リシノール酸セチル、酢酸トコフェリル、アセチル化ラノリンアルコール、酢酸セチル、フェニルトリメチコン、オレイン酸グリセリル、リノレン酸トコフェリル、小麦胚芽グリセリド、プロピオン酸アラキジル、乳酸ミリスチル、オレイン酸デシル、リシノール酸プロピレングリコール、ラノリン脂肪酸イソプロピル、テトラステアリン酸ペンタエリスリチル、二カプリル酸／二カプリン酸ネオペンチルグリコール、水素化ココ−グリセリド、イソノナン酸イソノニル、イソノナン酸イソトリデシル、ミリスチン酸ミリスチル、クエン酸トリイソセチル、ドデカノールオクチル、ヒドロキシステアリン酸オクチル、グレープ種子油、１つ以上のセラミド、シクロメチコン、及び、これらの混合物がある。その他の適切な皮膚軟化剤のその他の例は、ｔｈｅ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｂｅｎｃｈ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ｐｐ． １．１９ １．２２ （１９９６）でも認めることができる。当業者であれば、その他の皮膚軟化剤が、本発明において有用であることを理解する。
当該防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム溶液、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、デヒドロ酢酸、ジアゾリジニル尿素、エチルパラベン、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピルパラベン、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール、及び、チモールからなる群から選択することができる。
当該組成物は、酢酸、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、クエン酸カリウム、メタリン酸カリウム、リン酸一水素カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム溶液、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）、ＡＣＥＳ（２−［（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノ］エタンスルホン酸）、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）２−イミノ二酢酸）、ＡＭＰＳＯ（３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチルアミノ］−２−プロパンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチルグリシン）、ビス−トリス（ビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、ＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン）−Ｎ’−（３−プロパンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ν−モルホリノ）エタンスルホン酸）、トリエタノールアミン、イミダゾール、グリシン、エタノールアミン、リン酸塩、ＭＯＰＳＯ（３−（Ν−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、トリシン（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、及び、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールからなる群から選択する緩衝剤を含むことができる。
一般的に、当該酸性化剤は、酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、希塩酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、希リン酸、硫酸、及び、酒石酸からなる群から選択する。
一般的に、当該抗酸化剤は、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、及び、トコフェロールからなる群から選択する。
一般的に、当該アルカリ化剤は、強アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、及び、トロラミンからなる群から選択する。
当該担持剤は、コーン油、鉱油、ピーナッツ油、胡麻油、静菌性塩化ナトリウム、及び、静菌性水からなる群から選択することができる。
当該キレート剤は、エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、クエン酸、及び、サリチル酸塩からなる群から選択することができる。
当該錯化剤は、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸の塩、ゲンチシン酸エタノールアミド、及び、オキシキノリン硫酸塩からなる群から選択することができる。
当該溶媒は、アセトン、エタノール、希釈アルコール、アミレン水和物、安息香酸ベンジル、ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロホルム、コーン油、綿実油、酢酸エチル、グリセロール、ヘキシレングリコール、イソプロピルアルコール、メチルイソブチルケトン、鉱油、オレイン酸、ピーナッツ油、ポリエチレングリコール、プロピレンカーボネート、プロピレングリコール、胡麻油、水、滅菌水、及び、精製水からなる群から選択することができる。
一般的に、当該懸濁剤、及び／または、増粘剤は、アカシア、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、精製ベントナイト、マグマベントナイト、カルボマー、カルボマー９３４ｐ、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム１２、カラギーナン、微結晶、及び、カルボキシメチルセルロースナトリウムセルロース、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、プロピレングリコールアルギン酸塩、二酸化ケイ素、二酸化ケイ素コロイド、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、ビーガム、及び、キサンタンガムからなる群から選択する。
一般的には、当該油脂は、落花生油、鉱油、オリーブ油、胡麻油、綿実油、ベニバナ油、トウモロコシ油、及び、大豆油からなる群から選択する。
一般的に、当該浸透促進剤は、モノヒドロキシ、または、ポリヒドロキシアルコール、一価−、または、多価アルコール、飽和、または、不飽和脂肪アルコール、飽和、または、不飽和脂肪エステル、飽和、または、不飽和ジカルボン酸、エッセンシャルオイル、ホスファチジル誘導体、セファリン、テルペン類、アミド類、エーテル類、ケトン類、及び、尿素からなる群から選択する。
一般的には、当該ポリマーは、酢酸セルロース、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、アクリルポリマー、及び、コポリマー、ポリエステル、ポリカーボネート、及び、ポリ無水物からなる群から選択する。
一般的に、当該硬化剤は、硬化ヒマシ油、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、セチルエステルワックス、硬質脂肪、パラフィン、ポリエチレン賦形剤、ステアリルアルコール、乳化ワックス、ホワイトワックス、及び、イエローワックスからなる群から選択する。
一般的に、当該タンパク質は、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、及び、カゼインからなる群から選択する。
一般的に、当該炭水化物は、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、マンニトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール、及び、ミオイノシトールからなる群から選択する。
一般的には、当該増量剤は、ポリペプチド、及び、アミノ酸からなる群から選択する。
当該組成物は、皮膚用の局所鎮静剤、局所抗炎症剤、局所抗菌剤、局所抗真菌剤、局所ステロイド、及び、局所抗酸化剤をさらに含むことができる。
皮膚用の局所鎮静剤として、一般的には、カモミールとアロエがあり；その他の局所鎮静剤は、当該技術分野で公知であり、かつ、使用することができる。
局所抗炎症剤として、一般的には、ジクロフェナク、ケトプロフェン、イブプロフェン、ピロキシカム、及び、インドメタシンがあり；その他の局所抗炎症剤は、当該技術分野で公知であり、かつ、使用することができる。
局所抗菌剤として、一般的には、バシトラシン、ポリミキシンＢ、エリスロマイシン、スルファセタミドナトリウム、スルファジアジン銀、レタパムリン、ムピロシン、ネオマイシン、及び、プラモキシンがあり；その他の局所抗菌剤は、当該技術分野で公知であり、かつ、使用することができる。
局所抗真菌剤として、一般的には、安息香酸、サリチル酸、ウンデシレン酸、ケトコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィン、トルナフテート、ミコナゾール、エコナゾール、シクロピロックス、オキシコナゾール、セルタコナゾール、エフィナコナゾール、テルビナフィン、タバボロール、クロトリマゾール、スルコナゾール、及び、ブテフィナゾールがあり；その他の局所抗真菌剤は、当該技術分野で公知であり、かつ、使用することができる。
局所ステロイドとして、一般的には、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、フルオシノロン、プレドニカーベート、デソニド、ベタメタゾン、ハルシノニド、ジフロラゾン、フルオシノロン、クロベタゾール、デソキシメタゾン、モメタゾン、クロコルトロン、フルチカゾン、フルオシノニド、フルランドレノリド、アクロメタゾン、及び、ハロベタゾールがあり；その他の局所ステロイドは、当該技術分野で公知であり、かつ、使用することができる。
局所酸化防止剤として、一般的には、ビタミンＣ、ビタミンＥ、及び、Ｌ−セレノメチオニンがあり；その他の局所酸化防止剤は、当該技術分野で公知であり、かつ、使用することができる。
その他の活性剤を含めることができる。代替手段では、局所抗炎症剤、局所抗菌剤、局所抗真菌剤、局所ステロイド、及び、局所抗酸化剤などの数多くのこのようなさらなる作用物質を含む、上記した１つ以上の賦形剤を含む１つ以上のさらなる医薬組成物などを、個別に投与することができる。
上記したプロドラッグの使用を含む一部の代替手段では、カンナビノイド類、及び、テルペノイド類など、これらに限定されない、本発明の方法及び組成物で使用した治療活性化合物を、１つ以上のコンジュゲーションパートナーと、治療的に活性な化合物とを共有結合で架橋することで形成する。官能基の数多くの組み合わせを架橋させるのに適した試薬は、当該技術分野で公知である。
例えば、求電子基は、タンパク質、または、ポリペプチドに存在する同求電子基を含む数多くの官能基と反応することができる。反応性アミノ酸と求電子剤との様々な組み合わせは、当該技術分野で公知であり、かつ、使用することができる。例えば、チオール基を含むＮ末端システインは、ハロゲン、または、マレイミドと反応することができる。チオール基は、ハロゲン化アルキル、ハロアセチル誘導体、マレイミド類、アジリジン類、アクリロイル誘導体、ハロゲン化アリールなどのアリール化剤など、数多くのカップリング剤と反応する、ことが知られている。これらのことは、Ｇ． Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９６）， ｐｐ． １４６−１５０で説明されている。
システイン残基の反応性は、隣接するアミノ酸残基を適切に選択することで、最適化することができる。例えば、システイン残基に隣接するヒスチジン残基は、当該システイン残基の反応性を高める。反応性アミノ酸と求電子試薬とのその他の組み合わせは、当該技術分野で公知である。例えば、マレイミドは、特に、高いｐＨ範囲で、リジンの側鎖のε−アミノ基などのアミノ基と反応することができる。ハロゲン化アリールも、そのようなアミノ基と反応することができる。ハロアセチル誘導体は、ヒスチジンのイミダゾリル側鎖窒素、メチオニンの側鎖のチオエーテル基、及び、リジンの側鎖のイプシロン−アミノ基と反応することができる。リジンの側鎖のε−アミノ基と反応する数多くのその他の求電子試薬が公知であり、同試薬として、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、塩化スルホニル、エポキシド、オキシラン、炭酸塩、イミドエステル、カルボジイミド、及び、無水物があるが、これらに限定されない。これらのことは、Ｇ．Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９６）， ｐｐ． １３７−１４６で説明されている。
加えて、ジアゾアルカン、及び、ジアゾアセチル化合物、カルボニジルミダゾール、及び、カルボジイミドなどのアスパラギン酸塩、及び、グルタミン酸塩などのカルボキシレート側鎖と反応する求電子試薬は公知である。これらのことは、Ｇ． Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９６）， ｐｐ． １５２−１５４で説明されている。さらに、反応性ハロアルカン誘導体を含んでいる、セリン及びトレオニンの側鎖のヒドロキシル基などのヒドロキシル基と反応する求電子試薬が公知である。これらのことは、Ｇ． Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９６）， ｐｐ． １５４−１５８で説明されている。別の代替実施形態では、求電子剤と求核剤との相対位置（すなわち、求電子剤と反応する分子）が逆になり、当該タンパク質は、求核剤と反応する求電子基を有するアミノ酸残基と、そこに求核基を有する標的分子とを有している。これには、上記したアルデヒド（求電子剤）とヒドロキシルアミン（求核剤）との反応を含んでいるが、その反応よりも一般的であり；その他の基は、求電子剤、及び、求核剤として使用することができる。適切な基は、有機化学において周知であり、なので、さらに詳細を説明するまでもない。
架橋のための反応性基のあらゆる組み合わせは、当該技術分野で公知である。例えば、アミノ基は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アルキル化剤、イミドエステル、カルボジイミド、及び、無水物と反応させることができる。チオール基は、酸化、及び、混合ジスルフィドの形成により、ハロアセチルまたはアルキルハライド誘導体、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アシル化剤、または、その他のチオール基と反応することができる。カルボキシ基は、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、カルボニルジイミダゾール、カルボジイミドと反応することができる。ヒドロキシル基は、エポキシド、オキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート、過ヨウ素酸塩（酸化用）、アルキルハロゲン、または、イソシアネートと反応することができる。アルデヒド及びケトン基は、ヒドラジン、シッフ塩基を形成する試薬、及び、還元的アミノ化反応、または、マンニッヒ縮合反応でのその他の基と反応することができる。架橋反応に適したさらにその他の反応は、当該技術分野で公知である。そのような架橋試薬、及び、反応は、Ｇ．Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９６）で説明されている。
本発明の医薬組成物の単位用量に含まれる、上記したカンナビノイド、または、テルペノイドなど、これらに限定されない、所与の治療活性剤の量は、特定の化合物、疾患病態、及び、その重篤度、処置を必要とする対象の状態（例えば、体重）などの要因に応じて変化するが、当業者であれば、それにもかかわらず、いつも通りに決定することができる。選択した投与レベルは、特定の治療薬の活性、投与経路、投与時間、使用した特定の化合物の排泄速度、病態の重篤度、当該患者に影響を及ぼすその他の健康上の考慮事項、及び、当該対象の肝臓と腎臓の機能状態を含む、様々な薬物動態因子に基づいたものである。
また、それは、処置の期間、使用した特定の治療剤と組み合わせて使用したその他の薬物、化合物、及び／または、物質、ならびに、処置を受ける対象の年齢、体重、病態、全般的な健康状態、及び、従前の病歴、及び、同様の要因などに基づく。最適な投与量を決定するための方法は、当該技術分野、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， ２０th ｅｄ．， ２０００で説明されている。所与の一連の病態に対する最適な投与量は、当業者であれば、作用物質の実験データを考慮して、従来の投与量決定試験を使用して、確認することができる。
本発明の組成物、または、本発明に従って使用する組成物は、医薬組成物を調製するための公知の技術を用いて、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、空中浮揚、乳化、カプセル化、封入、または、凍結乾燥などの従来の技術で製造し得る。医薬組成物は、活性化合物を製剤に加工することを促す賦形剤、及び、助剤から選択し得る１つ以上の生理学的に許容可能な担体を使用して、従来の方法で製剤し得る。
本発明による医薬組成物は、通常は、複数回、対象に投与する。単回投与の間隔は、週１回、月１回、または、年１回である。間隔は、治療応答、または、当該技術分野で周知のその他のパラメーターが示すように不規則なものとすることができる。あるいは、当該医薬組成物は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、投与頻度を抑える必要がある。投与量と頻度は、医薬組成物に含まれる薬理活性物質の当該対象での半減期に応じて変化する。投与の用量と頻度は、当該処置が、予防的である、または、治療的であるかの別で変えることができる。
予防的用途では、比較的低用量を、長期間にわたって比較的に稀な間隔で投与する。一部の対象は、生涯にわたって治療を受け続け得る。治療用途では、当該疾患の進行が、軽減または終了するまで、そして、好ましくは、当該対象が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で、比較的に高用量を必要とすることが往々にしてある。その後に、当該対象に対して、予防レジメンを投与することができる。
本明細書の一部を構成するものとして、その内容を援用するＮａｒｄｅｌｌａの米国特許第６，５７３，２９２号、Ｎａｒｄｅｌｌａの米国特許第６，９２１，７２２号、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，３１４，８８６号、及び、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，４４６，１２２号は、様々な薬理学的活性剤、及び、がんを含む数多くの疾患、及び、病態の処置における医薬組成物の使用方法、及び、そのような薬理学的活性剤、及び、医薬組成物の治療的有効性を決定する方法を開示している。
参考文献
以下の刊行物を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。本明細書では、これらの刊行物を以下の番号で示す。この刊行物のリストに、あらゆる刊行物を含めることは、本明細書に記載したあらゆる刊行物が、先行技術であることを承認するものではない。
・ＪＡＭＡ． ２００６；２９５（７）： ７６１−７７５
・Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ， ２０１２， ３， １−１１
・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００４ ８８， ９０９−９１５．
・Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２， ２９８ （５５９９）， １７９０−３．
実施例１
Ｅ．ｃｏｌｉでのＭＥＰ経路の遺伝子操作
当該ＭＥＰ経路は、その熱力学的な都合の良さと、適切な細菌宿主システムの利用可能性に関して選択した。当該ＭＥＰ経路は、宿主Ｅ．ｃｏｌｉに固有である。この実験では、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を発現宿主として選択した。当該ＭＥＰ経路の律速酵素をコードする遺伝子を、カンナビノイド前駆体の生産を最大化するために過剰発現した。
ＭＥＰ経路の４つのステップが、最も遅いので、フラックスも少なくなっている。これらの律速段階を触媒する酵素の過剰発現は、ＭＥＰ経路を通るフラックスを改善し、そして、下流のテルペノイド生合成を増加させる、と報告されている。カンナビノイド（図１）、リコピン、モノテルペン、または、イソプレン経路の前駆体であるイソペンテニル二リン酸（ＩΡΡ）、及び、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の生産を最大化するために、したがって、非メバロン酸塩経路を遺伝子操作して、４つの異なる律速遺伝子、ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び、ｉｄｉの余分なコピーを導入した（図２）。
このプロセスを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で段階的に行い、そして、Ｔ７プロモーターとｐ１５Ａ複製起点とを有するベクターバックボーンに、制限消化とライゲーションを介してクローニング行って、適切な向きの遺伝子カセットを構築した。次いで、当該遺伝子カセット全体を、ＴｒｃプロモーターとｐＢＲ３２２複製起点とを含む、ｐＴｒｃ−ｔｒＧＰＰＳ（ＣＯ）−ＬＳプラスミド（図３）にサブクローニングして、遺伝子発現、ひいては、イソプレノイド前駆体の生産を制御するための幅広いウィンドウを得た。次いで、この遺伝子カセットを、当該ｐＴｒｃプロモーター、及び、選択マーカー遺伝子と共に、誘導性の余分なコピーとしてＥ．ｃｏｌｉ染色体に組み込んで、イソプレノイド前駆体を過剰生産した。ＭＥＰ経路発現カセットの概略図を図３に示す。律速酵素の過剰発現を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で確認する（図４）。
同様に、ＧＰＰシンターゼは、例えば、植物源からクローニングし、そして、Ｅ．ｃｏｌｉで発現して、ＧＰＰ、カンナビノイドシンターゼＣＢＧＡシンターゼの基質、及び、カレン、ミルセン、または、リモネンシンターゼなどのモノテルペンシンターゼの基質を生産する。さらに、ＣＢＧＡシンターゼの基質であるオリベトール酸の合成のためのポリケチド経路をクローニングし、そして、Ｅ．ｃｏｌｉで発現し、または、オリベトール酸を外部から供給する。したがって、ＣＢＧＡの生産のための経路を、原核宿主細胞で再現する。
実施例２
Ｅ．ｃｏｌｉでの下流経路カンナビノイドシンターゼ遺伝子のクローニング及び発現
序論：
カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）は、その他のカンナビノイド類の合成のための親化合物である。ＣＢＧＡは、ＣＢＧＡシンターゼ（芳香族プレニルトランスフェラーゼファミリーの酵素）が触媒した、オリベトール酸（ＯＡ）とゲラニルピロリン酸塩（ＧＰＰ）との酵素反応で生産される。このプレニル化産物（ＣＢＧＡ）を環化すると、３つの異なるオキシドシクラーゼが触媒して、３つの異なるカンナビノイド生産物がさらに得られる。Δ9−テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）シンターゼ、カンナビジオール（ＣＢＤＡ）シンターゼ、及び、カンナビクロム酸（ＣＢＣＡ）シンターゼは、Δ9−テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、及び、カンナビクロム酸（ＣＢＣＡ）のそれぞれの形成を触媒する。微生物宿主（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのこれらのカンナビノイド産物の生合成には、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＧＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、これらの組み合わせのクローニング、発現、及び、活性決定が関与する。一般的に、カンナビノイド産物は、少なくともＣＢＧＡシンターゼを発現する微生物宿主で、任意に、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼ、及びＣＢＤＡシンターゼの１つ以上と組み合わせて生産する。
ＣＢＧＡシンターゼ
Ｅ．ｃｏｌｉに対してコドン最適化したＣａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ由来のＣＢＧＡシンターゼ遺伝子を、強力なＩＰＴＧ誘導性Ｔ５プロモーターに機能的に連結したプラスミドベクターに首尾良くクローニングした。このプラスミドは、高コピーのｐＵＣ複製起点を含んでおり、かつ、カナマイシン耐性である。ＣＢＧＡシンターゼのためのプラスミド構築物を、図５に示す。Ｅ．ｃｏｌｉでの当該ＣＢＧＡシンターゼの発現を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で確認した（図６）。ＣＢＧＡＳの発現を確認した後に、酵素溶液に対して、当該基質（ＯＡ及びＧＰＰ）を外部から加えて酵素の活性を決定し、そして、自社開発のＨＰＬＣ法を使用して産物プロファイリングを行った。清澄化した細胞溶解物を、３７℃で、ＯＡとＧＰＰとの混合物に対して加えて当該プレニル化反応を行い、そして、当該反応混合物を、酢酸エチルで抽出し、そして、ＨＰＬＣを実行して当該産物の形成を測定した（図７）。これらの結果は、ＣＢＧＡＳが、Ｅ．ｃｏｌｉで発現することができ、かつ、基質ＯＡ及びＧＰＰからＣＢＧＡへのプレニル化反応を触媒できることを示した。
別の実験では、当該ＣＢＧＡ活性を、インビボで試験した。この実験では、ＣＢＧＡＳ発現プラスミドを含む宿主細胞を培養し、そして、ＩＰＴＧを添加して、対数増殖（ＯＤ600＝０．６）に到達次第に誘導した。誘導期の間に、細胞に対してＧＰＰ及びＯＡを与え、そして、一晩増殖させた。次に、当該細胞懸濁液を、遠心分離し、そして、当該上清を、ＨＰＬＣに注入してＣＢＧＡの形成を確認した。図８は、Ｅ．ｃｏｌｉで生産したＣＢＧＡを検出するためのＨＰＬＣクロマトグラムを示す（低コピープラスミド、ｐＢＡＤ３３を使用している）。生産したＣＢＧＡの濃度は、５ｍＬの培養物で、おおよそ１．２μｇ／ｍｌであると計算された。
ＴＨＣＡシンターゼ（ＴＨＣＡＳ）
当該ＴＨＣＡシンターゼ遺伝子は、強力なＩＰＴＧ誘導性Ｔ５プロモーターの制御下で、高コピーのカナマイシン耐性プラスミドにもクローニングした。この遺伝子挿入は、ＰＣＲ、及び、遺伝子配列決定で確認した。得られたＴＨＣＡシンターゼ遺伝子の発現カセットの概略図を、図９に示す。ＴＨＣＡシンターゼの発現を、ＩＰＴＧ誘導によって行い、そして、細胞溶解物を、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析して、発現を確認した。しかしながら、当該ＴＨＣＡシンターゼは、Ｅ．ｃｏｌｉでは首尾良く発現しなかった。
当該ＴＨＣＡシンターゼ遺伝子は、８つのグリコシル化部位と、Ｎ末端の２８アミノ酸のシグナルペプチドとを有するフラビニル化オキシダーゼクラスのタンパク質をコードする。グリコシル化膜貫通タンパク質の生産に関するＥ．ｃｏｌｉのこれらの制限が、ＴＨＣＡシンターゼクラスのタンパク質の活性型を発現させることを難しくしている。この制限を克服するために、シグナルペプチドを持たない遺伝子を発現させて、タンパク質の発現をサイトゾルで確実に行い、遺伝子をモジュラーシャペロニンと共発現させてタンパク質の折り畳みを補助し、そして、活性タンパク質の生産を高め（例えば、図１０）、次いで、グリコシル化機構と共発現させて、タンパク質の折り畳みを補助する（例えば、図１１）という多因子戦略をデザインしている。ＣＢＤＡシンターゼ（ＣＢＤＡＳ）も、同じクラスのタンパク質ファミリーに分類されるため、ＣＢＤＡシンターゼの発現にも同じ戦略を適用する。同様に、ＣＢＣＡシンターゼ（ＣＢＣＡＳ）は、ネイティブシグナル配列を有するグリコシル化タンパク質であるので、ＣＢＣＡシンターゼの発現にも同じ戦略を適用する。研究のこの部分は、現在も進行しており、そして、ＴＨＣＡＳに関して以下の手順が考慮されており、また、当業者であれば、これらの手順が、ＣＢＤＡＳ及びＣＢＣＡＳにも適用できることを理解する。
切断したＴＨＣＡＳ
ＴＨＣＡＳを、コードしたＮ末端（当該遺伝子配列の５’末端から８４ｂｐ）から２８個のアミノ酸を除去して切断する。
シャペロニンプラスミドとの共発現
ＴＨＣＡシンターゼ遺伝子を、ｐＴＲＣプロモーターの制御下で、アンピシリン耐性、ｐＢＲ３２２複製起点を有するプラスミドにクローニングして、シャペロニンシステムと、グリコシルシステムとを有するプラスミドで同時発現するために、異なる複製起点と、適合する複製起点とを有することを確認した（図１１）。ＴＨＣＡＳは、シグナルペプチドの有無に関係なく、Ｅ．ｃｏｌｉでのタンパク質の折り畳みにおいて、別個ではあるが、協同的に役割を果たす、Ｅ．ｃｏｌｉの２つの主要なシャペロン経路成分であるＤｎａＫ−ＤｎａＪ−ＧｒｐＥ、及び、ＧｒｏＥｌ−ＧｒｏＥＳと共発現する。Ｅ．ｃｏｌｉは、そのネイティブなシャペロンシステムを持ち合わせているが、組換えタンパク質の高レベルの生産は、内因性シャペロニンシステムを飽和させ、そして、非生産的な凝集を引き起こすことができる。これらの条件下で、折り畳みを制限している分子シャペロンの細胞内濃度を増加させると、封入体の形成を抑制することができる。日本のＴａｋａｈａｓｈｉ Ｙｕｒａのグループは、異なるプロモーター下で、２つのシャペロン経路を持ちあわせたｐＡＣＹＣ１８４をベースとしたプラスミドを構築した。このプラスミド（ｐＧ−ＫＪＥ８）、または、その誘導体は、宿主細胞における活性ＴＨＣＡシンターゼの生産条件を同定するために使用する。
グリコシル化システムを用いた共発現
Ｅ．ｃｏｌｉでのＴＨＣＡシンターゼの発現、折り畳み、プロセッシング、溶解度、及び／または、活性の増加には、グリコシル化が必要となり得る。残念ながら、Ｅ．ｃｏｌｉには、ネイティブなタンパク質グリコシル化システムが無い。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のＮグリコシル化システム、別名、ｐｇｌシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉでは首尾良く発現している。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｐｇｌ系遺伝子を含むプラスミドを提供する。このプラスミド、または、その誘導体は、宿主細胞における活性ＴＨＣＡシンターゼの生産条件を同定するために使用する（図１１）。
実施例３
カンナビノイド経路遺伝子の発現の最適化
Ｅ．ｃｏｌｉでのＣＢＧＡの内因性生産を最適化するために、ＣＢＧＡシンターゼを、ＭＥＰ経路、ＧＰＰシンターゼ、及び／または、ポリケチド経路成分と同時発現して、ＣＢＧＡの生産に必要な、基質ＧＰＰ及びＯＡを提供する。
共発現候補として：
・ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを生産するＭＥＰ経路との共発現
・ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからＧＰＰを内因的に供給するＧＰＰシンターゼとの共発現
・オリベトール酸（ＯＡ）を内因的に供給するポリケチド経路との共発現、がある。
Ｅ．ｃｏｌｉでの２つの異なるプラスミドを共発現するためには、細胞増殖に関する悪影響を減らすために、低コピー数、または、中コピー数のプラスミドを使用し、互換性の複製開始点を使用して、２つ以上のプラスミドを維持し、そして、それぞれのプラスミドのストリンジェントな選択のために、独立した抗生物質の選択を行った。したがって、ＣＢＧＡシンターゼ遺伝子は、低コピープラスミドｐＢＡＤ３３にクローニングした。当該低コピーＣＢＧＡシンターゼ発現プラスミドの概略図を（図１２）に示した。クローニングしたＣＢＧＡＳ遺伝子を、制限消化と配列決定とで検証した。ＭＥＰ経路を有するＣＢＧＡＳと、ＧＰＰシンターゼとの共発現のために、ＧＰＰシンターゼを、ｐＢＡＤ３３におけるＣＢＧＡＳの上流にクローニングし、そして、ｐＴＲＣ＿ＲＤＥで、同時形質転換した（図１３）。同時形質転換した後に、抗生物質選択で細胞を増殖させ、そして、ＯＤ600が０．６に達した時に、細胞を誘導した。誘導物質濃度の量を、図１４に示す。
誘導物質を添加した後に、それらの細胞を、一晩増殖させた。タンパク質生産時の細胞生存率を確認するために、ＯＤ600を測定した。異なる培養物についてのＯＤ600の比較を、図１５に示す。ｐＢＡＤ３３＿ＧＰＰＳ＿ＣＢＧＡＳを有する株を、１０、１５、及び、２０ｍＭの濃度のアラビノースで誘導した。ｐＢＡＤ３３＿ＧＰＰＳ＿ＣＢＧＡＳ、及び、ｐＴＲＣ＿ＲＤＥを有する株を、アラビノースとＩＰＴＧの異なる濃度の組み合わせで誘導した。当該タンパク質を、細胞溶解後に抽出し、そして、タンパク質の濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して測定した。タンパク質の誘導と発現は、ＳＤＳ ＰＡＧＥで確認した（図１６）。抽出した総タンパク質濃度を、プロットして（図１７）、ＳＤＳ ＰＡＧＥの発現データと比較した。当該総タンパク質濃度は、誘導物質濃度の増加とともに増加することが認められ、そして、細胞集団と成長とに関して反比例する。
Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，は、アラビノースの誘導に関するＩＰＴＧの干渉を発見した。ＣＢＧＡＳの発現は、アラビノースとＩＰＴＧ濃度の異なる組み合わせで確認した。当該総タンパク質濃度は、細胞を、１０ｍＭアラビノースと、０．５ｍＭ ＩＰＴＧとで誘導した場合に、さらに高くなることが認められた。複数のプラスミドを維持すると、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び、タンパク質合成から細胞が受ける代謝負担が大きくなり、ならびに、当該細胞が生産しなくてはならない抗生物質耐性タンパク質の総数も大きくなり、そして、所望の最終産物の低生産を招くことになる。また、異なる誘導物質間のバランスを維持すると、最終産物に関して、再現性のない生産レベルが得られる。この制限を克服するために、当該遺伝子カセット全体を、ＭＥＰ経路と、ＧＰＰＳ及びＣＢＧＡＳオペロンとを一緒に有する単一のプラスミドに構築する。さらに、または、代替的に、当該ＭＥＰ経路、ＧＰＰＳ、及び／または、ＣＢＧＡＳを、当該宿主細胞ゲノムに組み込む。
実施例４
ＭＥＰ経路での二官能性ｉｓｐＤＦ遺伝子のメタゲノムスクリーニング及びクローニング
土壌細菌の環境メタゲノムをスクリーニングして、代替ＭＥＰ経路遺伝子を特定した。対応するＥ．ｃｏｌｉオルソログよりも活性が非常に大きい非メバロン酸塩経路における新規の二官能性酵素を同定した。その新規の二官能性酵素は、ＩｓｐＤ及びＩｓｐＦの活性部位を、単一のポリペプチド足場に共局在させた。二官能性遺伝子の活性は、カンナビノイド合成を代理して、リコピン生産について評価した。この遺伝子は、ｉｓｐＤＦと称されており、そして、同じ強力なＲＢＳを使用して、ｉｓｐＤ、及び、ｉｓｐＦを、ｉｓｐＤＦで置き換えるｐＴｒｃ−ＲＤＥオペロンでクローニングした。この遺伝子操作したプラスミドを、ｐＴｒｃ−ＲＤＥ*と命名し、そして、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＥ３）で形質転換した。ｉｓｐＤ、及び、ｉｓｐＦの活性部位を共存させる２つのさらなるメタゲノム二官能性酵素を、それぞれを、ｉｓｐＤＦ２及びｉｓｐＤＦ３と称した。
タンパク質発現研究
プラスミドｐＴｒｃ−ＲＤＥ、及び、ｐＴｒｃ−ＲＤＥ*を含む株を、ＩＰＴＧを用いた誘導によるタンパク質発現について試験した。細胞を、３７℃で、ＬＢブロスにて、ΟＤ600が０．６に達するまで増殖させ、当該培養培地にＩＰＴＧを加えて誘導し、次いで、当該培養物を、３０℃で、一晩インキュベートした。培養物から回収した細胞を溶解し、そして、総タンパク質を抽出した。総タンパク質の濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で推定し、そして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。これらのゲルを、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０色素で染色して、視覚化した。発現時のｐＴｒｃ−ＲＤＥ、及び、ｐＴｒｃ−ＲＤＥ*プラスミドの両方は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの経路酵素に対応するバンドを示した。ｉｓｐＤＦ発現を、誘導した細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で示した（図１８）。
ｉｓｐＤＦのモデリング：
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来の二官能性ｉｓｐＤＦは、ＣＪ−ｉｓｐＤＦとして報告されている。我々の研究で報告したＩｓｐＤＦ（ｉｓｐＤＦｌ）を、スイスモデルを使用して、ＣＪ−ｉｓｐＤＦでモデル化した。約３１％の配列類似性がある。ＣＪ−ｉｓｐＤＦと、ネイティブｉｓｐＤ及びｉｓｐＦとのアラインメントは、異なるアミノ酸を示す（図１９）。このことは、ｉｓｐＤＦが、新規であり、また、未だに報告されていないことを示唆している。活性部位の共局在に関するさらなる分析を行っている。
プラットフォーム株の機能分析：
遺伝子操作したＥ．ｃｏｌｉ株を、Ｃ５イソプレノイド前駆体からリコピンへの変換のための下流遺伝子を含むプラスミドで形質転換した。リコピン生合成遺伝子を、構成的プロモーターの制御下でクローニングした。リコピン発現プラスミドは、低コピーであり、そして、共発現のための複製起点と互換可能であった。
ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び、ｉｓｐＥ酵素が、多成分複合体を形成して、３つの連続した触媒ステップを介して、チャンネル代謝物に導くことが報告されている。このことをさらに研究するために、両方のオペロンでのゲノムから増幅したネイティブｉｓｐＥ遺伝子をクローニングした。変異プラスミドを、それぞれ、ｐＴｒｃ−ＲＤＥ、及び、ｐＴｒｃ−ＲＤＥ*のｐＴｒｃ−ＲＤＥＥ、及び、ｐＴｒｃ−ＲＤＥ*Ｅと命名した（図２０）。これらの変異体は両方とも、以下に説明するように、リコピン生産についても機能面を試験した。
実施例５
ＭＥＰ経路の１つ以上の成分の異種発現を介したテルペノイド生合成の増加
テルペノイド生合成の増加を支持する能力について、様々な構築物を試験した（図２１）。
イソプレン合成
Ｅ．ｃｏｌｉの以下の株を用意した：親のコントロール株（ＢＬ２１）；アラビノースプロモーターに機能的に連結したイソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）をコードする発現カセットを含むコントロール株ＳＡ０１；ＳＡ０１での発現カセットと、Ｔｒｃプロモーターに機能的に結合したｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び、ｉｄｉをコードするＲＤＥ発現カセットとを含む株ＳＡ０２；及び、ＳＡ０１での発現カセットと、Ｔｒｃプロモーターに機能的に結合したｄｘｓ、ｉｓｐＤＦ１、及び、ｉｄｉをコードするＲＤＥ*発現カセットとを含むＳＡ０３株（図２２左）。ＳＡ０３では、ｉｓｐＤＦｌ−の名称は、ｉｓｐＤＦ１をコードする核酸が、異種宿主細胞での発現増加のためにコドン最適化がされておらず、一方で、ｉｓｐＤＦ＋（図２２に示さず）は、当該酵素をコードする核酸がコドン最適化されている、ことを示す。培養物を、２３０ｒｐｍ、３０℃で、密閉ガラス培養管内で増殖させた。ＯＤ６００が０．６に達した後に、培養物を誘導し、そして、さらに２０時間インキュベートした。誘導物質として、０．０５ｍＭ ＩＰＴＧ、及び、１０ｍＭアラビノースを使用した。培養物のヘッドスペースを、ＧＣ−ＭＳで分析した。試料を注入する前に、７０℃にまで加熱した。検量線を使用して、イソプレンを定量した。本明細書に記載した株によるイソプレン生産を、図２２の右に示した。
リコピン合成
プラスミドｐＡＣ−ＬＹＣ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃５３２７０）を得た。このプラスミドは、リコピン合成遺伝子ｃｒｔＥ、ｃｒｔＩ、及び、ｃｒｔＢに機能的に連結した構成的プロモーターを有する発現カセットを含む。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＦＸ Ｊｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． １９９４ Ａｕｇ；６（８）：１１０７−２１を参照されたい。Ｅ．ｃｏｌｉの以下の株を用意した：親コントロール株（ＢＬ２１（ＤＥ３））；プラスミドｐＡＣ−ＬＹＣと、上記したＲＤＥ発現カセットを含むプラスミドと、を含む株ＲＤＥ；プラスミドｐＡＣ−ＬＹＣと、上記したＲＤＥ*発現カセットを含むプラスミドと、を含む株ＲＤＥ*（ＤＦ１−）；プラスミドｐＡＣ−ＬＹＣと、コドン最適化したｉｓｐＤＦ１をコードする核酸を有するＲＤＥ*発現カセットを含むプラスミドとを含む株ＲＤＥ*（ＤＦ１＋）；プラスミドｐＡＣ−ＬＹＣと、コドン最適化したｉｓｐＤＦ２をコードする核酸を有するＲＤＥ*発現カセットを含むプラスミドと、を含む株ＲＤＥ*（ＤＦ２＋）；及び、プラスミドｐＡＣ−ＬＹＣと、コドン最適化したｉｓｐＤＦ３をコードする核酸を有するＲＤＥ*発現カセットを含むプラスミドと、を含む株ＲＤＥ*（ＤＦ３＋）。生産したさらなる株として、ｐＡＣ−ＬＹＣを含むＳＡ０１；ｐＡＣ−ＬＹＣ、及び、ｐＴｒｃ−ＲＤＥを含むＳＡ０２；ｐＡＣ−ＬＹＣ、及び、ｐＴｒｃ−ＲＤＥＥを含むＳＡ０３；ｐＡＣ−ＬＹＣ、及び、ｐＴｒｃ−ＲＤＥ*を含むＳＡ０４；及び、ｐＡＣ−ＬＹＣ、及び、ｐＴｒｃ−ＲＤＥ*Ｅを含むＳＡ０５がある。ｉｓｐＤＦ１、ｉｓｐＤＦ２、及び、ｉｓｐＤＦ３の配列を、図２６に示す。
リコピン生産のために、ＳＡ０１〜ＳＡ０５の種培養物を、ＬＢ培地で、３０℃で、一晩増殖させた。次に、これらの培養物を、新鮮な培地で、光学密度が０．２になるまで希釈し、そして、ＩＰＴＧで誘導した。当該生産培養物を、２５０ｒｐｍで暗所振盪しながら、３０℃で、２０時間インキュベートした。リコピン抽出は、４ｍＬの培養物を、２ｍＬのアセトンで抽出して行った。このアセトン抽出物を、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ法：カラム−Ｃ１８、移動相−メタノール：テトラヒドロフラン：水（６６：３０：４）、流量−１ｍＬ／分、フォトダイオードアレイ検出器とリコピンピークとを使用する４７２ｎｍ波長での検出を、社内リコピン標準で確認した。図２３は、ＩＰＴＧ誘導が、リコピン生産を増加させることを示す。最適な誘導レベルは、株によって異なる。
２番目の実験では、培養物を、ＬＢにて、３０℃で、一晩増殖させた。次に、これらの培養物を、ＬＢで、ＯＤ６００が０．２になるまで希釈した。それらをＩＰＴＧで誘導し、そして、３０℃で、２４時間増殖させた。２ｍＬの培養物を、８０００ｒｐｍで、５分間、遠心分離して、細胞ペレットを生産した。当該細胞ペレット由来のリコピンを、５５℃で、１５分間、１ｍＬのアセトンで抽出した。次いで、当該混合物を、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた上清を、メタノール、テトラヒドロフラン、及び、水の混合物（６６：３０：４）を、流速１ｍＬ／分で使用する、アイソクラチック溶出法を使用するＨＰＬＣで、Ｃ−１８カラムにて分析した。リコピンの収率を、リコピンのピークに対するＨＰＬＣ曲線下面積として測定した。ピークを、社内標準で検証した。この面積を、０μＭ ＩＰＴＧを使用して、ＲＤＥ株に関して正規化した。それらの結果を、図２４に示す。
モノテルペン合成
図２５の上部は、宿主細胞にてモノテルペンを生産するための構築物を示している。当該構築物は、Ｔ７プロモーターに機能的に連結した、ｄｘｓ、コドン最適化したｉｓｐＤＦ１（ＤＦ１＋）、及び、ｉｄｉをコードするＭＥＰ経路プラットフォームオペロン、及び、Ｔｒｃプロモーターに機能的に連結した、ＧＰＰシンターゼ、及び、モノテルペンシンターゼをコードするモノテルペンオペロンを含む。この実験では、当該モノテルペンシンターゼは、カレンシンターゼであった。
培養物を、ＬＢ＋０．５％酵母エキスで、３０℃で、一晩成長させる。次に、これらの培養物を、２ｍＭ塩化マグネシウムを加えた培地で、ＯＤ６００が０．２になるまで希釈し、３７℃でインキュベートし、次いで、ＯＤ６００が０．８になるまでＩＰＴＧで誘導した。培養物に、１０％ドデカンを重層した。モノテルペン濃度は、標準曲線を使用して、ＧＣ−ＭＳで分析した。それらの結果を、図２５の下部に示す。モノテルペン類のリモネンとミルセンの生産を、それぞれ、リモネンシンターゼとミルセンシンターゼを使用して、首尾良く達成した。ＩｓｐＤＦ２＋；ｉｓｐＤＦ３＋；ならびに、ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び、ｉｄｉは、モノテルペンの増加した生産を補助することもできた。
例示的配列
本出願で言及した例示的な配列として、以下の表に記載したものがあるが、これらに限定されない：
一部の遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから得たものであり、その他は、Ｃａｎｎａｂｉｓゲノムブラウザー（ｇｅｎｏｍｅ．ｃｃｂｒ．ｕｔｏｒｏｎｔｏ．ｃａ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）から得たものである。ＩＭ００００１．１とは、公開されたＣａｎｎａｂｉｓ ｍＲＮＡ、及び、ＥＳＴの配列から生成したデサチュラーゼに関する配列識別子のことである。
例示的な配列を、以下に示す。
＞ＡＢ０５７８０５．１｜ テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＴＨＣＡＳ）、完全ｃｄｓについてのＣａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ ｍＲＮＡ
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ＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＧＴＡＴＣＣＣＡＣＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＡ（配列番号４）
＞ ＡＢ２９２６８２．１｜ 輸送ペプチドを有するカンナビジオール酸シンターゼ（ＣＢＤＡＳ）についてのＣａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ ＣＢＤＡＳ ｍＲＮＡ
ＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＣＡＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＡＴＡＴＣＣ
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ＡＣＣＴＣＴＴＣＣＡＣＧＧＣＡＴＣＧＴＣＡＴＴＡＡ（配列番号５）
＞ＩＭ００００２．１｜ 輸送ペプチドを持たないカンナビジオール酸シンターゼＩＩ（ＣＢＤＡＳＩＩ）についてのＣａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ ＣＢＤＡＳ ｍＲＮＡ
ＡＴＧＡＡＴＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＣＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＡＴＧＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＣ
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ＧＧＣＡＴＣＧＴＣＡＴＴＡＡ（配列番号６）
＞ ＰＫ２８４３６．１ ｜ 芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）、または、ゲラニルピロリン酸オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ
ＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＴＡＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡＡＣＴＡＡＴＴＡＣＣＡＴＡＣＴＴＴＡＴＴＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＡ
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＞ ＪＮ６７９２２４．１｜ Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａオリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
ＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＴＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴ
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＞ ＡＢ１６４３７５．１｜ オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）についてのＣａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ ＯＬＳ ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
ＡＴＧＡＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＣＣＧＴＴＣＴＣＧＣＣＡＴＴＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＴＴＴ
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ＡＡＡＧＡＧＴＧＧＴＣＧＴＧＣＧＴＡＧＴＧＴＴＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡＡ（配列番号９）
＞ ＪＮ７１７２３３．１ ｜ ＰＫ０４７９７．１ ｜ アシル−活性化酵素１（ＡＡＥ１）
ＡＴＧＧＧＴＡＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＴＡＧＧＴＡＴＣＡＣＣＴＣＴＧ
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＞ ＪＮ７１７２３５．１ ｜ ＰＫ１３７１０．１｜ アシル−活性化酵素３（ＡＡＥ３）
ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＡＴＴＴＡＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＡＣＡ
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ＧＡＡＡＧＴＡＣＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＧＴＧＡ（配列番号１１）
＞ ＰＫ０４４１０．１ ｜ ヒドロペルオキシドリアーゼ（ＨＰＬ）
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＞ ＰＫ０８２７６．１ ｜ リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ１）
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＞ ＩＭ００００１．１ ｜ デサチュラーゼ（ＤＳ）コード配列
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ＡＣＡＡＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡ（配列番号１４）
＞ ＰＫ１０４４２．１ ｜ ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）シンターゼラージサブユニット ｜ ＧＰＰシンターゼｌｓｕ
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＞ ＰＫ１５９３５．１ ｜ ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）シンターゼスモールサブユニット ｜ ＧＰＰシンターゼｓｓｕ
ＡＴＧＧＣＧＧＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴＡＴＣＡＡＴＴＡＡＴＴＧＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＴＴＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＡＣＧＴＴＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡ
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ＡＣＴＴＡＧＡＧＣＣＡＴＴＴＴＣＡＡＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＡＴＡＧ（配列番号１６）
＞ ＰＫ１７９０３．１ ｜ ゲラニルピロリン酸（ＩＰＰ）イソメラーゼ
ＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＡＣＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＡＣＧＣＣＴＴＡＴＧＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＣＡＴＴＣ
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ＣＴＴＡＡ（配列番号１７）
＞ ＰＫ１６１２２．１ ｜ １−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ１（ＤＸＳ１）
ＡＴＧＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＣＡＴＴＡＴＣＡＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＴＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣ
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＞ ＰＫ２６４７３．１ ｜ １−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ２（ＤＸＳ２）
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＞ ＰＫ０４２１８．１ ｜ １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＸＤＲ）
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＞ ＰＫ０３５６９．１ ｜ ４−ジホスホシチジリル−メチルエリトリトール ２−リン酸シンターゼ（ＭＣＴ）
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＞ ＰＫ１９０７４．１ ｜ ４−ジホスホシチジリル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ（ＣＭＫ）
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＞ ＰＫ２５４３３．１ ｜ ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール ２：４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＤＳ）
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ＴＣＧＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号２３）
＞ ＰＫ２３０６８．１ ｜ ４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン−１−イル二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）
ＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＣＴＴＧＡＧＣＴＴＴＧＣＴＡ
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ＴＧＡＴＴＣＡＧＣＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＣＣＡＣＣＣＴＣＧＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＧＡ（配列番号２４）
＞ ＰＫ１３７２６．１ ｜ ４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エニル二リン酸レダクターゼ（ＨＤＲ）
ＡＴＧＴＣＧＡＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＣＧＧＡＴＴＣＣＡＡＴＣＣＧＴＡＣＣＧＡＣＣＴＣＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＧ
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ＣＡＡＧＡＴＧＣＡＡＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＴＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＣＴＣＴＡ
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ＴＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＣＣＴＴＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＧＴＴＧＣＴＴＡＧ（配列番号２５）
＞ ＡＡＯ７３８６３｜ カレンシンターゼＭｏｎｏＴＳ
ＭＳＶＩＳＩＬＰＬＡＳＫＳＣＬＹＫＳＬＭＳＳＴＨＥＬＫＡＬＣＲＰＩＡＴＬＧＭＣＲＲＧＫＳＶＭＡＳＫＳＴＳＬＴＴＡＶＳＤＤＧＶＱＲＲＩＧＤＨＨ
ＳＮＬＷＤＤＮＦＩＱＳＬＳＳＰＹＧＡＳＳＹＧＥＲＡＥＲＬＩＧＥＶＫＥＩＦＮＳＬＳＲＴＤＧＥＬＶＳＨＶＤＤＬＬＱＨＬＳＭＶＤＮＶＥＲＬＧＩＤＲ
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ＨＴＥＲＱＩＳＳＩＬＮＬＦＲＡＳＬＩＡＦＰＧＥＫＶＭＥＥＡＥＩＦＳＡＴＹＬＫＥＡＬＱＴＩＰＶＳＳＬＳＱＥＩＱＹＶＬＱＹＲＷＨＳＮＬＰＲＬＥＡ
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ＥＴＶＮＥＭＡＱＥＡＱＫＳＱＧＲＤＴＬＳＹＶＲＱＡＬＥＡＹＩＧＡＹＨＫＥＡＥＷＩＳＳＧＹＬＰＴＦＤＥＹＦＥＮＧＫＶＳＳＧＨＲＩＡＴＬＱＰＴＦ
ＭＬＤＩＰＦＰＨＨＶＬＱＥＩＤＦＰＳＫＦＮＤＦＡＣＳＩＬＲＬＲＧＤＴＲＣＹＱＡＤＲＡＲＧＥＥＡＳＣＩＳＣＹＭＫＤＮＰＧＳＴＱＥＤＡＬＮＨＩＮ
ＮＭＩＥＥＴＩＫＫＬＮＷＥＬＬＫＰＤＮＮＶＰＩＳＳＫＫＨＡＦＤＩＮＲＧＬＨＨＦＹＮＹＲＤＧＹＴＶＡＳＮＥＴＫＮＬＶＩＫＴＶＬＥＰＶＰＭ（配列番号２６）
＞ＥＦＦ１４２２８ １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼＤｘｓ ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ３５４］
１ ｍｍｓｆｄｉａｋｙｐ ｔｌａｌｖｄｓｔｑｅ ｌｒｌｌｐｋｅｓｌｐ ｋｌｃｄｅｌｒｒｙｌ ｌｄｓｖｓｒｓｓｇｈ ｆａｓｇｌｇｔｖｅｌ
６１ ｔｖａｌｈｙｖｙｎｔ ｐｆｄｑｌｉｗｄｖｇ ｈｑａｙｐｈｋｉｌｔ ｇｒｒｄｋｉｇｔｉｒ ｑｋｇｇｌｈｐｆｐｗ ｒｇｅｓｅｙｄｖｌｓ
１２１ ｖｇｈｓｓｔｓｉｓａ ｇｉｇｉａｖａａｅｋ ｅｇｋｎｒｒｔｖｃｖ ｉｇｄｇａｉｔａｇｍ ａｆｅａｍｎｈａｇｄ ｉｒｐｄｍｌｖｖｌｎ
１８１ ｄｎｅｍｓｉｓｅｎｖ ｇａｌｎｎｈｌａｑｌ ｌｓｇｋｌｙｓｓｌｒ ｅｇｇｋｋｖｆｓｇｖ ｐｐｉｋｅｌｌｋｒｔ ｅｅｈｉｋｇｍｖｖｐ
２４１ ｇｔｌｆｅｅｌｇｆｎ ｙｉｇｐｖｄｇｈｄｖ ｌｇｌｉｔｔｌｋｎｍ ｒｄｌｋｇｐｑｆｌｈ ｉｍｔｋｋｇｒｇｙｅ ｐａｅｋｄｐｉｔｆｈ
３０１ ａｖｐｋｆｄｐｓｓｇ ｃｌｐｋｓｓｇｇｌｐ ｓｙｓｋｉｆｇｄｗｌ ｃｅｔａａｋｄｎｋｌ ｍａｉｔｐａｍｒｅｇ ｓｇｍｖｅｆｓｒｋｆ
３６１ ｐｄｒｙｆｄｖａｉａ ｅｑｈａｖｔｆａａｇ ｌａｉｇｇｙｋｐｉｖ ａｉｙｓｔｆｌｑｒａ ｙｄｑｖｌｈｄｖａｉ ｑｋｌｐｖｌｆａｉｄ
４２１ ｒａｇｉｖｇａｄｇｑ ｔｈｑｇａｆｄｌｓｙ ｌｒｃｉｐｅｍｖｉｍ ｔｐｓｄｅｎｅｃｒｑ ｍｌｙｔｇｙｈｙｎｄ ｇｐｓａｖｒｙｐｒｇ
４８１ ｎａｖｇｖｅｌｔｐｌ ｅｋｌｐｉｇｋｇｉｖ ｋｒｒｇｅｋｌａｉｌ ｎｆｇｔｌｍｐｅａａ ｋｖａｅｓｌｎａｔｌ ｖｄｍｒｆｖｋｐｌｄ
５４１ ｅａｌｉｌｅｍａａｓ ｈｅａｌｖｔｖｅｅｎ ａｉｍｇｇａｇｓｇｖ ｎｅｖｌｍａｈｒｋｐ ｖｐｖｌｎｉｇｌｐｄ ｆｆｉｐｑｇｔｑｅｅ
６０１ ｍｒａｅｌｇｌｄａａ ｇｍｅａｋｉｋａｗｌ ａ（配列番号２７）
＞ＷＰ＿０７２９７２０９９ ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール ４−リン酸シチジジリルトランスフェラーゼＩｓｐＤ／ＭＣＴ
１ ｍａｔｔｈｌｄｖｃａ ｖｖｐａａｇｆｇｒｒ ｍｑｔｅｃｐｋｑｙｌ ｓｉｇｎｑｔｉｌｅｈ ｓｖｈａｌｌａｈｐｒ ｖｋｒｖｖｉａｉｓｐ
６１ ｇｄｓｒｆａｑｌｐｌ ａｎｈｐｑｉｔｖｖｄ ｇｇｄｅｒａｄｓｖｌ ａｇｌｋａａｇｄａｑ ｗｖｌｖｈｄａａｒｐ ｃｌｈｑｄｄｌａｒｌ
１２１ ｌａｌｓｅｔｓｒｔｇ ｇｉｌａａｐｖｒｄｔ ｍｋｒａｅｐｇｋｎａ ｉａｈｔｖｄｒｎｇｌ ｗｈａｌｔｐｑｆｆｐ ｒｅｌｌｈｄｃｌｔｒ
１８１ ａｌｎｅｇａｔｉｔｄ ｅａｓａｌｅｙｃｇｆ ｈｐｑｌｖｅｇｒａｄ ｎｉｋｉｔｒｐｅｄｌ ａｌａｅｆｙｌｔｒｔ ｉｈｑｅｎｔ（配列番号２８）
＞ＷＰ＿０８６５８９４８２ ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼＩｓｐＦ／ＭＤＳ
１ ｍｒｉｇｈｇｆｄｖｈ ａｆｇｇｅｇｐｉｉｉ ｇｇｖｒｉｐｙｅｋｇ ｌｌａｈｓｄｇｄｖａ ｌｈａｌｔｄａｌｌｇ ａａａｌｇｄｉｇｋｌ
６１ ｆｐｄｔｄｐａｆｋｇ ａｄｓｒｅｌｌｒｅａ ｗｒｒｉｑａｋｇｙｔ ｌｇｎｉｄｖｔｉｉａ ｑａｐｋｍｌｐｈｉｐ ｑｍｒｖｆｉａｅｄｌ
１２１ ｇｃｈｍｄｄｖｎｖｋ ａｔｔｔｅｋｌｇｆｔ ｇｒｇｅｇｉａｃｅａ ｖａｌｌｉｋａｔｋ（配列番号２９）
＞ＷＰ＿１１５９０３８８１ イソペンテニル−二リン酸シンターゼ デルタ−イソメラーゼＩｄｉ
１ ｍｑｔｅｈｖｉｌｌｎ ａｑｇｖｐｔｇｔｌｅ ｋｙａａｈｔａｄｔｒ ｌｈｌａｆｓｓｗｌｆ ｎａｋｇｑｌｌｖｔｒ ｒａｌｓｋｋａｗｐｇ
６１ ｖｗｔｎｓｖｃｇｈｐ ｑｌｇｅｓｎｅｄａｖ ｉｒｒｃｒｙｅｌｇｖ ｅｉｔｐｐｅｓｉｙｐ ｄｆｒｙｒａｔｄｐｓ ｇｉｖｅｎｅｖｃｐｖ
１２１ ｆａａｒｔｔｓａｌｑ ｉｎｄｄｅｖｍｄｙｑ ｗｃｄｌａｄｉｌｈｇ ｉｄａｔｐｗａｆｓｐ ｗｍｖｍｑａｔｎｒｅ ａｒｋｒｌｓａｆｔｑ
１８１ ｌｋ（配列番号３０）
＞ＡＦ５１３１１２．１ ゲラニル二リン酸シンターゼＧＰＰＳ
ＭＡＹＳＡＭＡＴＭＧＹＮＧＭＡＡＳＣＨＴＬＨＰＴＳＰＬＫＰＦＨＧＡＳＴＳＬＥＡＦＮＧＥＨＭＧＬＬＲＧＹＳＫＲＫＬＳＳＹＫＮＰＡＳＲＳＳＮＡＴＶＡＱＬＬＮＰＰＱＫＧＫＫＡＶＥＦＤＦＮＫＹＭＤＳＫＡＭＴＶＮＥＡＬＮＫＡＩＰＬＲＹＰＱＫＩＹＥＳＭＲＹＳＬＬＡＧＧＫＲＶＲＰＶＬＣＩＡＡＣＥＬＶＧＧＴＥＥＬＡＩＰＴＡＣＡＩＥＭＩＨＴＭＳＬＭＨＤＤＬＰＣＩＤＮＤＤＬＲＲＧＫＰＴＮＨＫＩＦＧＥＤＴＡＶＴＡＧＮＡＬＨＳＹＡＦＥＨＩＡＶＳＴＳＫＴＶＧＡＤＲＩＬＲＭＶＳＥＬＧＲＡＴＧＳＥＧＶＭＧＧＱＭＶＤＩＡＳＥＧＤＰＳＩＤＬＱＴＬＥＷＩＨＩＨＫＴＡＭＬＬＥＣＳＶＶＣＧＡＩＩＧＧＡＳＥＩＶＩＥＲＡＲＲＹＡＲＣＶＧＬＬＦＱＶＶＤＤＩＬＤＶＴＫＳＳＤＥＬＧＫＴＡＧＫＤＬＩＳＤＫＡＴＹＰＫＬＭＧＬＥＫＡＫＥＦＳＤＥＬＬＮＲＡＫＧＥＬＳＣＦＤＰＶＫＡＡＰＬＬＧＬＡＤＹＶＡＦＲＱＮ（配列番号３１）
＞ＷＰ＿０５３２８７２１５ ゲラニルトランスフェラーゼＩｓｐＡ
１ ｍｄｆｐｑｑｌｅａｃ ｖｋｑａｎｑａｌｓｒ ｆｉａｐｌｐｆｑｎｔ ｐｖｖｅｔｍｑｙｇａ ｌｌｇｇｋｒｌｒｐｆ ｌｖｙａｔｇｈｍｆｇ
６１ ｉｓｔｎｔｌｄａｐａ ａａｖｅｃｉｈａｙｓ ｌｉｈｄｄｌｐａｍｄ ｄｄｄｌｒｒｇｌｐｔ ｃｈｖｋｆｇｅａｎａ ｉｌａｇｄａｌｑｔｌ
１２１ ａｆｓｉｌｓｄａｄｍ ｐｅｖｓｄｒｄｒｉｓ ｍｉｓｅｌａｓａｓｇ ｉａｇｍｃｇｇｑａｌ ｄｌｄａｅｇｋｈｖｐ ｌｄａｌｅｒｉｈｒｈ
１８１ ｋｔｇａｌｉｒａａｖ ｒｌｇａｌｓａｇｄｋ ｇｒｒａｌｐｖｌｄｋ ｙａｅｓｉｇｌａｆｑ ｖｑｄｄｉｌｄｖｖｇ ｄｔａｔｌｇｋｒｑｇ
２４１ ａｄｑｑｌｇｋｓｔｙ ｐａｌｌｇｌｅｑａｒ ｋｋａｒｄｌｉｄｄａ ｒｑｓｌｋｑｌａｅｑ ｓｌｄｔｓａｌｅａｌ ａｄｙｉｉｑｒｎｋ（配列番号３２）
＞ＮＰ＿４１４７１５ １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーＩｓｐＣ／ＤＸＲ
１ ｍｋｑｌｔｉｌｇｓｔ ｇｓｉｇｃｓｔｌｄｖ ｖｒｈｎｐｅｈｆｒｖ ｖａｌｖａｇｋｎｖｔ ｒｍｖｅｑｃｌｅｆｓ ｐｒｙａｖｍｄｄｅａ
６１ ｓａｋｌｌｋｔｍｌｑ ｑｑｇｓｒｔｅｖｌｓ ｇｑｑａａｃｄｍａａ ｌｅｄｖｄｑｖｍａａ ｉｖｇａａｇｌｌｐｔ ｌａａｉｒａｇｋｔｉ
１２１ ｌｌａｎｋｅｓｌｖｔ ｃｇｒｌｆｍｄａｖｋ ｑｓｋａｑｌｌｐｖｄ ｓｅｈｎａｉｆｑｓｌ ｐｑｐｉｑｈｎｌｇｙ ａｄｌｅｑｎｇｖｖｓ
１８１ ｉｌｌｔｇｓｇｇｐｆ ｒｅｔｐｌｒｄｌａｔ ｍｔｐｄｑａｃｒｈｐ ｎｗｓｍｇｒｋｉｓｖ ｄｓａｔｍｍｎｋｇｌ ｅｙｉｅａｒｗｌｆｎ
２４１ ａｓａｓｑｍｅｖｌｉ ｈｐｑｓｖｉｈｓｍｖ ｒｙｑｄｇｓｖｌａｑ ｌｇｅｐｄｍｒｔｐｉ ａｈｔｍａｗｐｎｒｖ ｎｓｇｖｋｐｌｄｆｃ
３０１ ｋｌｓａｌｔｆａａｐ ｄｙｄｒｙｐｃｌｋｌ ａｍｅａｆｅｑｇｑａ ａｔｔａｌｎａａｎｅ ｉｔｖａａｆｌａｑｑ ｉｒｆｔｄｉａａｌｎ
３６１ ｌｓｖｌｅｋｍｄｍｒ ｅｐｑｃｖｄｄｖｌｓ ｖｄａｎａｒｅｖａｒ ｋｅｖｍｒｌａｓ（配列番号３３）
＞ＥＧＴ６７７８１ ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリトリトールキナーゼＩｓｐＥ／ＣＭＫ
１ ｍｒｔｑｗｐｓｐａｋ ｌｎｌｆｌｙｉｔｇｑ ｒａｄｇｙｈｔｌｑｔ ｌｆｑｆｌｄｙｇｄｔ ｉｓｉｅｌｒｄｄｇｄ ｉｒｌｌｔｐｖｅｇｖ
６１ ｅｈｅｄｎｌｉｖｒａ ａｒｌｌｉｋｔａａｄ ｓｇｒｌｐｔｇｓｇａ ｎｉｓｉｄｋｒｌｐｍ ｇｇｇｌｇｇｇｓｓｎ ａａｔｖｌｖａｌｎｙ
１２１ ｌｗｑｃｇｌｓｍｄｅ ｌａｅｍｇｌｔｌｇａ ｄｖｐｖｆｖｒｇｈａ ａｆａｅｇｖｇｅｉｌ ｔｐｖｄｐｐｅｋｗｙ ｌｖａｈｐｇｖｓｉｐ
１８１ ｔｐｖｉｆｋｄｐｅｌ ｐｒｎｔｐｋｒｓｉｅ ｔｌｌｋｃｅｆｓｎｄ ｃｅｖｉａｒｋｒｆｒ ｅｖｄａｖｌｓｗｌｌ ｅｙａｐｓｒｌｔｇｔ
２４１ ｇａｃｖｆａｅｆｄｔ ｅｓｅａｒｑｖｌｅｑ ａｐｅｗｌｎｇｆｖａ ｋｇｖｎｌｓｐｌｈｒ ａｍｌ（配列番号３４）
＞ＡＮＫ０２８１２ ４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン−１−イル二リン酸シンターＩｓｐＧ／ＨＤＳ
１ ｍｈｎｑａｐｉｑｒｒ ｋｓｔｒｉｙｖｇｎｖ ｐｉｇｄｇａｐｉａｖ ｑｓｍｔｎｔｒｔｔｄ ｖｅａｔｖｎｑｉｋａ ｌｅｒｖｇａｄｉｖｒ
６１ ｖｓｖｐｔｍｄａａｅ ａｆｋｌｉｋｑｑｖｎ ｖｐｌｖａｄｉｈｆｄ ｙｒｉａｌｋｖａｅｙ ｇｖｄｃｌｒｉｎｐｇ ｎｉｇｎｅｅｒｉｒｍ
１２１ ｖｖｄｃａｒｄｋｎｉ ｐｉｒｉｇｖｎａｇｓ ｌｅｋｄｌｑｅｋｙｇ ｅｐｔｐｑａｌｌｅｓ ａｍｒｈｖｄｈｌｄｒ ｌｎｆｄｑｆｋｖｓｖ
１８１ ｋａｓｄｖｆｌａｖｅ ｓｙｒｌｌａｋｑｉｄ ｑｐｌｈｌｇｉｔｅａ ｇｇａｒｓｇａｖｋｓ ａｉｇｌｇｌｌｌｓｅ ｇｉｇｄｔｌｒｖｓｌ
２４１ ａａｄｐｖｅｅｉｋｖ ｇｆｄｉｌｋｓｌｒｉ ｒｓｒｇｉｎｆｉａｃ ｐｔｃｓｒｑｅｆｄｖ ｉｇｔｖｎａｌｅｑｒ ｌｅｄｉｉｔｐｍｄｖ
３０１ ｓｉｉｇｃｖｖｎｇｐ ｇｅａｌｖｓｔｌｇｖ ｔｇｇｎｋｋｓｇｌｙ ｅｄｇｖｒｋｄｒｌｄ ｎｎｄｍｉｄｑｌｅａ ｒｉｒａｋａｓｑｌｄ
３６１ ｅａｒｒｉｄｖｑｑｖ ｅｋ（配列番号３５）
＞ＡＡＬ３８６５５ ４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エニル二リン酸レダクターゼＩｓｐＨ／ＨＤＲ
１ ｍｑｉｌｌａｎｐｒｇ ｆｃａｇｖｄｒａｉｓ ｉｖｅｎａｌａｉｙｇ ａｐｉｙｖｒｈｅｖｖ ｈｎｒｙｖｖｄｓｌｒ ｅｒｇａｉｆｉｅｑｉ
６１ ｓｅｖｐｄｇａｉｌｉ ｆｓａｈｇｖｓｑａｖ ｒｎｅａｋｓｒｄｌｔ ｖｆｄａｔｃｐｌｖｔ ｋｖｈｍｅｖａｒａｓ ｒｒｇｅｅｓｉｌｉｇ
１２１ ｈａｇｈｐｅｖｅｇｔ ｍｇｑｙｓｎｐｅｇｇ ｍｙｌｖｅｓｐｄｄｖ ｗｋｌｔｖｋｎｅｅｋ ｌｓｆｍｔｑｔｔｌｓ ｖｄｄｔｓｄｖｉｄａ
１８１ ｌｒｋｒｆｐｋｉｖｇ ｐｒｋｄｄｉｃｙａｔ ｔｎｒｑｅａｖｒａｌ ａｅｑａｅｖｖｌｖｖ ｇｓｋｎｓｓｎｓｎｒ ｌａｅｌａｑｒｍｇｋ
２４１ ｒａｆｌｉｄｄａｋｄ ｉｑｅｅｗｖｋｅｖｋ ｃｖｇｖｔａｇａｓａ ｐｄｉｌｖｑｎｖｖａ ｒｌｑｑｌｇｇｇｅａ ｉｐｌｅｇｒｅｅｎｉ
３０１ ｖｆｅｖｐｋｅｌｒｖ ｄｉｒｅｖｄ（配列番号３６）
＞ＡＡＡ２４８１９．１ フィトエンシンターゼＣｒｔＥ
１ ｍｖｓｇｓｋａｇｖｓ ｐｈｒｅｉｅｖｍｒｑ ｓｉｄｄｈｌａｇｌｌ ｐｅｔｄｓｑｄｉｖｓ ｌａｍｒｅｇｖｍａｐ ｇｋｒｉｒｐｌｌｍｌ
６１ ｌａａｒｄｌｒｙｑｇ ｓｍｐｔｌｌｄｌａｃ ａｖｅｌｔｈｔａｓｌ ｍｌｄｄｍｐｃｍｄｎ ａｅｌｒｒｇｑｐｔｔ ｈｋｋｆｇｅｓｖａｉ
１２１ ｌａｓｖｇｌｌｓｋａ ｆｇｌｉａａｔｇｄｌ ｐｇｅｒｒａｑａｖｎ ｅｌｓｔａｖｇｖｑｇ ｌｖｌｇｑｆｒｄｌｎ ｄａａｌｄｒｔｐｄａ
１８１ ｉｌｓｔｎｈｌｋｔｇ ｉｌｆｓａｍｌｑｉｖ ａｉａｓａｓｓｐｓｔ ｒｅｔｌｈａｆａｌｄ ｆｇｑａｆｑｌｌｄｄ ｌｒｄｄｈｐｅｔｇｋ
２４１ ｄｒｎｋｄａｇｋｓｔ ｌｖｎｒｌｇａｄａａ ｒｑｋｌｒｅｈｉｄｓ ａｄｋｈｌｔｆａｃｐ ｑｇｇａｉｒｑｆｍｈ ｌｗｆｇｈｈｌａｄｗ
３０１ ｓｐｖｍｋｉａ（配列番号３７）
＞ＡＡＡ２４８２０．１ フィトエンデヒドロゲナーゼＣｒｔＩ
１ ｍｋｋｔｖｖｉｇａｇ ｆｇｇｌａｌａｉｒｌ ｑａａｇｉｐｔｖｌｌ ｅｑｒｄｋｐｇｇｒａ ｙｖｗｈｄｑｇｆｔｆ ｄａｇｐｔｖｉｔｄｐ
６１ ｔａｌｅａｌｆｔｌａ ｇｒｒｍｅｄｙｖｒｌ ｌｐｖｋｐｆｙｒｌｃ ｗｅｓｇｋｔｌｄｙａ ｎｄｓａｅｌｅａｑｉ ｔｑｆｎｐｒｄｖｅｇ
１２１ ｙｒｒｆｌａｙｓｑａ ｖｆｑｅｇｙｌｒｌｇ ｓｖｐｆｌｓｆｒｄｍ ｌｒａｇｐｑｌｌｋｌ ｑａｗｑｓｖｙｑｓｖ ｓｒｆｉｅｄｅｈｌｒ
１８１ ｑａｆｓｆｈｓｌｌｖ ｇｇｎｐｆｔｔｓｓｉ ｙｔｌｉｈａｌｅｒｅ ｗｇｖｗｆｐｅｇｇｔ ｇａｌｖｎｇｍｖｋｌ ｆｔｄｌｇｇｅｉｅｌ
２４１ ｎａｒｖｅｅｌｖｖａ ｄｎｒｖｓｑｖｒｌａ ｄｇｒｉｆｄｔｄａｖ ａｓｎａｄｖｖｎｔｙ ｋｋｌｌｇｈｈｐｖｇ ｑｋｒａａａｌｅｒｋ
３０１ ｓｍｓｎｓｌｆｖｌｙ ｆｇｌｎｑｐｈｓｑｌ ａｈｈｔｉｃｆｇｐｒ ｙｒｅｌｉｄｅｉｆｔ ｇｓａｌａｄｄｆｓｌ ｙｌｈｓｐｃｖｔｄｐ
３６１ ｓｌａｐｐｇｃａｓｆ ｙｖｌａｐｖｐｈｌｇ ｎａｐｌｄｗａｑｅｇ ｐｋｌｒｄｒｉｆｄｙ ｌｅｅｒｙｍｐｇｌｒ ｓｑｌｖｔｑｒｉｆｔ
４２１ ｐａｄｆｈｄｔｌｄａ ｈｌｇｓａｆｓｉｅｐ ｌｌｔｑｓａｗｆｒｐ ｈｎｒｄｓｄｉａｎｌ ｙｌｖｇａｇｔｈｐｇ ａｇｉｐｇｖｖａｓａ
４８１ ｋａｔａｓｌｍｉｅｄ ｌｑ（配列番号３８）
＞ＡＡＡ２４８２１．１ プレフィトエンピロリン酸シンターゼ［Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ］ＣｒｔＢ
ＭＳＱＰＰＬＬＤＨＡＴＱＴＭＡＮＧＳＫＳＦＡＴＡＡＫＬＦＤＰＡＴＲＲＳＶＬＭＬＹＴＷＣＲＨＣＤＤＶＩＤＤＱＴＨＧＦＡＳＥＡＡＡＥＥＥＡＴＱＲＬＡＲＬＲＴＬ
ＴＬＡＡＦＥＧＡＥＭＱＤＰＡＦＡＡＦＱＥＶＡＬＴＨＧＩＴＰＲＭＡＬＤＨＬＤＧＦＡＭＤＶＡＱＴＲＹＶＴＦＥＤＴＬＲＹＣＹＨＶＡＧＶＶＧＬＭＭＡＲＶＭＧＶＲＤ
ＥＲＶＬＤＲＡＣＤＬＧＬＡＦＱＬＴＮＩＡＲＤＩＩＤＤＡＡＩＤＲＣＹＬＰＡＥＷＬＱＤＡＧＬＴＰＥＮＹＡＡＲＥＮＲＡＡＬＡＲＶＡＥＲＬＩＤＡＡＥＰＹＹＩＳＳＱ
ＡＧＬＨＤＬＰＰＲＣＡＷＡＩＡＴＡＲＳＶＹＲＥＩＧＩＫＶＫＡＡＧＧＳＡＷＤＲＲＱＨＴＳＫＧＥＫＩＡＭＬＭＡＡＰＧＱＶＩＲＡＫＴＴＲＶＴＰＲＰＡＧＬＷＱＲＰ
Ｖ（配列番号３９）
＞ｓｐ｜Ｑ５０Ｌ３６．１｜ＩＳＰＳ＿ＰＯＰＡＬ 登録名：正式名称＝イソプレンシンターゼ、葉緑体；省略名＝ＰａＩｓｐＳ；ＩｓｐＳ．
ＭＡＴＥＬＬＣＬＨＲＰＩＳＬＴＨＫＬＦＲＮＰＬＰＫＶＩＱＡＴＰＬＴＬＫＬＲＣＳＶＳＴＥＮＶＳＦＴＥＴＥＴＥＡＲＲＳＡＮＹＥＰＮＳＷＤＹＤＹＬＬＳＳＤＴＤＥ
ＳＩＥＶＹＫＤＫＡＫＫＬＥＡＥＶＲＲＥＩＮＮＥＫＡＥＦＬＴＬＬＥＬＩＤＮＶＱＲＬＧＬＧＹＲＦＥＳＤＩＲＧＡＬＤＲＦＶＳＳＧＧＦＤＡＶＴＫＴＳＬＨＧＴＡＬＳ
ＦＲＬＬＲＱＨＧＦＥＶＳＱＥＡＦＳＧＦＫＤＱＮＧＮＦＬＥＮＬＫＥＤＩＫＡＩＬＳＬＹＥＡＳＦＬＡＬＥＧＥＮＩＬＤＥＡＫＶＦＡＩＳＨＬＫＥＬＳＥＥＫＩＧＫＥＬ
ＡＥＱＶＮＨＡＬＥＬＰＬＨＲＲＴＱＲＬＥＡＶＷＳＩＥＡＹＲＫＫＥＤＡＮＱＶＬＬＥＬＡＩＬＤＹＮＭＩＱＳＶＹＱＲＤＬＲＥＴＳＲＷＷＲＲＶＧＬＡＴＫＬＨＦＡＲ
ＤＲＬＩＥＳＦＹＷＡＶＧＶＡＦＥＰＱＹＳＤＣＲＮＳＶＡＫＭＦＳＦＶＴＩＩＤＤＩＹＤＶＹＧＴＬＤＥＬＥＬＦＴＤＡＶＥＲＷＤＶＮＡＩＮＤＬＰＤＹＭＫＬＣＦＬＡ
ＬＹＮＴＩＮＥＩＡＹＤＮＬＫＤＫＧＥＮＩＬＰＹＬＴＫＡＷＡＤＬＣＮＡＦＬＱＥＡＫＷＬＹＮＫＳＴＰＴＦＤＤＹＦＧＮＡＷＫＳＳＳＧＰＬＱＬＶＦＡＹＦＡＶＶＱＮ
ＩＫＫＥＥＩＥＮＬＱＫＹＨＤＴＩＳＲＰＳＨＩＦＲＬＣＮＤＬＡＳＡＳＡＥＩＡＲＧＥＴＡＮＳＶＳＣＹＭＲＴＫＧＩＳＥＥＬＡＴＥＳＶＭＮＬＩＤＥＴＷＫＫＭＮＫＥ
ＫＬＧＧＳＬＦＡＫＰＦＶＥＴＡＩＮＬＡＲＱＳＨＣＴＹＨＮＧＤＡＨＴＳＰＤＥＬＴＲＫＲＶＬＳＶＩＴＥＰＩＬＰＦＥＲ（配列番号４０）
本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書で具体的に開示していないあらゆる要素（複数可）、制限（複数可）が無くとも、適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、拡張的に解釈すべきであり、また、制限が付加されることはない。加えて、本明細書で使用する用語、及び、表現は、説明のための用語として使用しており、限定のために使用するものではなく、また、そのような用語、及び、表現の使用は、表示、及び、説明したものの将来の等価物、または、その一部を除外する意図もなく、また、特許請求した本発明の範囲内で様々な修正が可能であるものと認識する。
したがって、本発明は、好ましい実施形態、及び、任意の特徴で具体的に開示をしているが、当業者であれば、本明細書に開示した本発明の修正、及び、変更を行うことができ、そして、そのような修正、及び、変更は、本明細書に開示した発明の範囲内であると考えると理解されるべきである。本明細書では、本発明を広範に、かつ、一般的に説明した。一般的な開示の範囲内にある狭義の種、及び、亜属のそれぞれのグループ分けも、これらの発明の一部を形成する。そこでは、取り出した材料の具体的な存在の有無に関係なく、当該属からあらゆる対象物を取り除く条件、または、否定的な制限を伴った各発明の一般的な説明を含んでいる。
加えて、本発明の特徴または態様を、マーカッシュグループに関して説明している場合、当業者であれば、それにより、本発明が、マーカッシュグループの個々のメンバー、または、メンバーのサブグループに関しても説明しているものと認識する。また、上記した説明は、例示的なものでしかなく、限定的なものではない、ことも理解されたい。上記した説明を考慮すれば、数多くの実施形態が、当業者には自明である。したがって、本発明の範囲は、上記した説明を参照して決定すべきではなく、代わりに、添付した特許請求の範囲、ならびに、そのような特許請求の範囲の権利が及ぶ均等物の全範囲を参照して決定すべきである。特許公報、及び、データベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ）受託番号で参照できる内容を含めて、すべての論文、及び、参考文献の開示を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。

Claims (50)

  1. 二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセット。
  2. 前記二官能性ｉｓｐＤＦ酵素が、以下のｉｓｐＤＦ酵素、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ Ｊ９９ ｊｈｐ０４０４、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰＡＧ１ ＨＰＡＧ１＿０４２７、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ ＨＨ１５８２、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ ｓｔ．Ｓｈｅｅｂａ Ｈａｃ＿１１２４、Ｗ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ １７４０ ＷＳ１９４０、Ｓ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １２５１ Ｓｕｄｅｎ＿１４８７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８Ｃｊ１６０７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＲＭ１２２１ ＣＪＥ１７７９、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ ８１−１７６ ＣＪＪ８１１７６＿１５９４、及び、Ｃ．ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｅｔｕｓ ８２−４０ ＣＦＦ８２４０＿０４０９と、少なくとも１つのアミノ酸が異なる、請求項１に記載の発現カセット。
  3. 前記二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする前記核酸に機能的に連結した前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項１に記載の発現カセット。
  4. 前記二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする前記核酸に機能的に連結した前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１に記載の発現カセット。
  5. 前記二官能性ｉｓｐＤＦ酵素が、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３の３００個の連続したアミノ酸に対して、少なくとも５０％、または、５５％が同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。
  6. 前記二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸が、コドン最適化したものである、請求項１に記載の発現カセット。
  7. 前記発現カセットが、ｄｘｓ、ｉｄｉ、及び、ｉｓｐＥからなる群から選択した１つ以上、２つ以上、または、すべての酵素をコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載の発現カセット。
  8. 前記発現カセットが、ｄｘｓ、及び、ｉｄｉをコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載の発現カセット。
  9. 前記発現カセットが、ｄｘｓ、ｉｄｉ、及び、ｉｓｐＥをコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載の発現カセット。
  10. 前記二官能性ｉｓｐＤＦが、ＣＪ−ｉｓｐＤＦに対して、３１％以下が類似している、請求項１に記載の発現カセット。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発現セットを含むプラスミド。
  12. 前記プラスミドが、イソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）をコードする核酸を含む発現カセットをさらに含む、請求項１１に記載のプラスミド。
  13. 前記プラスミドが、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸を含む発現カセットをさらに含む、請求項１１に記載のプラスミド。
  14. 前記ＧＰＰシンターゼが、真核生物由来のＧＰＰシンターゼである、請求項１１に記載のプラスミド。
  15. 前記ＧＰＰシンターゼが、植物由来のＧＰＰシンターゼである、請求項１４に記載のプラスミド。
  16. 前記ＧＰＰシンターゼをコードする前記核酸が、コドン最適化したものである、請求項１４に記載のプラスミド。
  17. ＧＰＰシンターゼをコードする前記核酸を含む前記発現カセットが、リコピン合成経路（例えば、ｃｒｔＥ、ｃｒｔ１、及び／または、ｃｒｔＢ）、または、モノテルペンシンターゼの１つ以上の成分をコードする核酸をさらに含む、請求項１３に記載のプラスミド。
  18. ＧＰＰシンターゼをコードする前記核酸を含む前記発現カセットが、カレンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、または、リモネンシンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１３に記載のプラスミド。
  19. ＧＰＰシンターゼをコードする前記核酸を含む前記発現カセットが、カンナビノイドシンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１３に記載のプラスミド。
  20. 前記カンナビノイドシンターゼを、Ｃａｎｎａｂｉｓ ＣＢＧＡシンターゼ、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群から選択する、請求項１９に記載のプラスミド。
  21. 請求項１〜１０の発現カセットのいずれか１つ、及び／または、請求項１１〜２０のプラスミドのいずれか１つを含む宿主細胞。
  22. 宿主細胞であって：
    ａ．二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセット；及び
    ｂ．テルペノイドシンターゼをコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセット、を含む前記宿主細胞。
  23. 前記テルペノイドシンターゼが、イソプレンシンターゼである、請求項２２に記載の宿主細胞。
  24. 前記テルペノイドシンターゼが、リコピン合成経路の成分である、請求項２２に記載の宿主細胞。
  25. 前記テルペノイドシンターゼが、カンナビノイドシンターゼである、請求項２２に記載の宿主細胞。
  26. 前記カンナビノイドシンターゼを、ＣＢＧＡシンターゼ、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼ、好ましくは、Ｃａｎｎａｂｉｓ属のシンターゼからなる群から選択する、請求項２５に記載の宿主細胞。
  27. 前記カンナビノイドシンターゼが、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群から選択する切断したカンナビノイドシンターゼであり、前記切断が、シグナルペプチドの全部または一部の欠失である、請求項２６に記載の宿主細胞。
  28. ＧＰＰシンターゼをコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセットを含む、請求項２２に記載の宿主細胞。
  29. ａ）またはｂ）の前記発現カセットが、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項２２に記載の宿主細胞。
  30. 前記宿主細胞が、１つ以上の発現カセットの少なくとも１つを含まないコントロール細胞と比較して、ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加を示す、請求項２２に記載の宿主細胞。
  31. 前記宿主細胞が、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＧ、または、ｉｓｐＨをコードする異種核酸；それらの組み合わせ；または、それらのすべてを含まない、請求項２２に記載の宿主細胞。
  32. 前記細胞が、原核生物である、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  33. ａ）及び／またはｂ）の前記発現カセットが、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  34. 前記宿主細胞が、プロモーターに機能的に連結したカンナビノイドシンターゼをコードする核酸を含み、かつ、前記カンナビノイドシンターゼをコードする核酸に機能的に連結したプロモーターが、構成的プロモーターである、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  35. 前記宿主細胞が、プロモーターに機能的に連結したカンナビノイドシンターゼをコードする核酸を含み、かつ、前記カンナビノイドシンターゼをコードする核酸に機能的に連結したプロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  36. ａ）の前記発現カセット、及び、ｂ）の前記発現カセットが、単一のプラスミドに存在しており、または、単一の遺伝子座で前記宿主細胞のゲノムに挿入される、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  37. ａ）の前記発現カセット、及び、ｂ）の前記発現カセットが、異なるプラスミドにあり、または、異なる遺伝子座で前記宿主細胞のゲノムに挿入される、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  38. 前記宿主細胞が、オリベトール酸（ＯＡ）をさらに含む、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  39. 前記オリベトール酸が、前記宿主細胞に対して外因性である、請求項３８に記載の宿主細胞。
  40. 前記宿主細胞が、１つ以上のグリコシル化経路遺伝子をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセットを含む、請求項２２〜３９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  41. 前記宿主細胞が、ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｌｄｈＡ、ｄｌｄ、ａｄｈＥ、ｐｐｓ、及び、ａｔｏＤＡからなる群から選択する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または、すべての遺伝子に欠失を含む、請求項２２〜４０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  42. 標的代謝産物を得る方法であって、請求項２２〜４１のいずれか１項に記載の宿主細胞を、１つ以上の宿主細胞発現カセットで発現を誘導するのに適した条件下で、適切な培地で培養し、次いで、培養した細胞、または、使用済培地を回収し、それにより、前記標的代謝産物を得ることを含む、前記方法。
  43. 前記代謝産物が、カンナビノイドである、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記カンナビノイドが、ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ、ＣＢＮ、ＴＨＣ、ＣＢＤ、または、ＣＢＣ、または、それらの１つ以上の混合物である、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記代謝産物が、テルペノイド、または、イソプレンである、請求項４２に記載の方法。
  46. 前記方法が、前記培養細胞を回収、及び、溶解し、それにより、細胞溶解物を生産することを含む、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記方法が、前記細胞溶解物から前記標的代謝産物を精製し、それにより、精製した標的代謝産物を生産することを含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記方法が、前記使用済培地から前記標的代謝産物を精製し、それにより、精製した標的代謝産物を生産することを含む、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記精製した標的代謝産物が、カンナビノイドであり、かつ、前記方法が、医薬組成物にカンナビノイドを処方することを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
  50. 前記精製した標的代謝産物が、カンナビノイドであり、かつ、前記方法が、前記精製カンナビノイドの塩、プロドラッグ、または、溶媒和物を形成することを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
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