JP2020532307A5 - - Google Patents
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Claims (28)
- 二官能性ispDF酵素をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセット。
- 前記二官能性ispDF酵素が、以下のispDF酵素、H.pylori HP1020、H.pylori J99 jhp0404、H.pylori HPAG1 HPAG1_0427、H.hepaticus HH1582、H.acinonychis st.Sheeba Hac_1124、W.succinogenes DSM 1740 WS1940、S.denitrificans DSM 1251 Suden_1487、C.jejuni subsp.jejuni NCTC 11168Cj1607、C.jejuni RM1221 CJE1779、C.jejuni subsp.jejuni 81−176 CJJ81176_1594、及び、C.fetus subsp.fetus 82−40 CFF8240_0409と、少なくとも1つのアミノ酸が異なる、請求項1に記載の発現カセット。
- 前記二官能性ispDF酵素をコードする前記核酸に機能的に連結した前記プロモーターが、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターから選択される、請求項1に記載の発現カセット。
- 前記二官能性ispDF酵素が、配列番号1、配列番号2、または、配列番号3の300個の連続したアミノ酸に対して、少なくとも50%、または、55%が同一であるアミノ酸配列を含むか;あるいは、前記二官能性ispDF酵素をコードする核酸が、コドン最適化したものであるか;あるいは、前記二官能性ispDFが、CJ−ispDFに対して、31%以下が類似している、請求項1に記載の発現カセット。
- 前記発現カセットが、dxs、idi、及び、ispEからなる群から選択した1つ以上、2つ以上、または、すべての酵素をコードする核酸をさらに含むか;あるいは、前記発現カセットが、dxs、及び、idiをコードする核酸をさらに含むか;あるいは、前記発現カセットが、dxs、idi、及び、ispEをコードする核酸をさらに含む、請求項1に記載の発現カセット。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の発現カセットを含むプラスミド。
- 前記プラスミドが、(1)イソプレンシンターゼ(ispS)をコードする核酸を含む発現カセット;(2)GPPシンターゼをコードする核酸を含む発現カセット;(3)真核生物由来のGPPシンターゼをコードする核酸を含む発現カセット;又は(4)植物由来のGPPシンターゼをコードする核酸を含む発現カセット、をさらに含む、請求項6に記載のプラスミド。
- 前記GPPシンターゼをコードする核酸を含む発現カセットが、真核生物由来であり、かつ、前記GPPシンターゼをコードする前記核酸が、コドン最適化したものである、請求項7に記載のプラスミド。
- GPPシンターゼをコードする前記核酸を含む前記発現カセットが、(1)リコピン合成経路(例えば、crtE、crt1、及び/または、crtB)、または、モノテルペンシンターゼの1つ以上の成分をコードする核酸;(2)カレンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、または、リモネンシンターゼをコードする核酸;あるいは(3)カンナビノイドシンターゼをコードする核酸、をさらに含む、請求項7に記載のプラスミド。
- 前記カンナビノイドシンターゼを、Cannabis CBGAシンターゼ、THCAシンターゼ、CBDAシンターゼ、及び、CBCAシンターゼからなる群から選択する、請求項9に記載のプラスミド。
- (1)請求項1〜5のいずれか1項に記載の発現カセットのいずれか1つ;(2)請求項6〜10のいずれか1項に記載のプラスミドのいずれか1つ;あるいは(3)請求項1〜5のいずれか1項に記載の発現カセットのいずれか1つ、及び請求項6〜10のいずれか1項に記載のプラスミドのいずれか1つを含む宿主細胞。
- 宿主細胞であって:
a.二官能性ispDF酵素をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセット;及び
b.テルペノイドシンターゼをコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセット、を含む前記宿主細胞。 - 前記テルペノイドシンターゼが、イソプレンシンターゼであるか;又は、リコピン合成経路の成分であるか;又は、カンナビノイドシンターゼである、請求項12に記載の宿主細胞。
- 前記テルペノイドシンターゼが、カンナビノイドシンターゼであり、前記カンナビノイドシンターゼが、CBGAシンターゼ、THCAシンターゼ、CBDAシンターゼ、及び、CBCAシンターゼ、好ましくは、Cannabis属のシンターゼからなる群から選択されるか;あるいは、前記カンナビノイドシンターゼが、THCAシンターゼ、CBDAシンターゼ、及び、CBCAシンターゼからなる群から選択する切断したカンナビノイドシンターゼであり、前記切断が、シグナルペプチドの全部または一部の欠失である、請求項13に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、GPPシンターゼをコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセットを含むか;あるいは、a)またはb)の前記発現カセットが、GPPシンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項12に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、1つ以上の発現カセットの少なくとも1つを含まないコントロール細胞と比較して、MEP経路を通るフラックスの増加を示す、請求項12に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、ispC、ispE、ispG、または、ispHをコードする異種核酸;それらの組み合わせ;または、それらのすべてを含まない、請求項12に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、原核生物であるか;あるいは、a)及び/またはb)の前記発現カセットが、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれているか;あるいは、a)及び/またはb)の前記発現カセットが、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれており、かつ前記宿主細胞が、原核生物である、請求項12〜17のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、プロモーターに機能的に連結したカンナビノイドシンターゼをコードする核酸を含み、かつ、前記カンナビノイドシンターゼをコードする核酸に機能的に連結したプロモーターが、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターから選択される、請求項12〜18のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- a)の前記発現カセット、及び、b)の前記発現カセットが、単一のプラスミドに存在しており、または、単一の遺伝子座で前記宿主細胞のゲノムに挿入されるか;あるいは、a)の前記発現カセット、及び、b)の前記発現カセットが、異なるプラスミドにあり、または、異なる遺伝子座で前記宿主細胞のゲノムに挿入される、請求項12〜19のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、オリベトール酸(OA)をさらに含む、請求項12〜20のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリベトール酸が、前記宿主細胞に対して外因性である、請求項21に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、(1)1つ以上のグリコシル化経路遺伝子をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセット;(2)ackA−pta、poxB、ldhA、dld、adhE、pps、及び、atoDAからなる群から選択する1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または、すべての遺伝子における欠失;あるいは(3)1つ以上のグリコシル化経路遺伝子をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーター、並びに、ackA−pta、poxB、ldhA、dld、adhE、pps、及び、atoDAからなる群から選択する1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または、すべての遺伝子における欠失を含む発現カセット、を含む、請求項12〜22のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 標的代謝産物を得る方法であって、請求項12〜23のいずれか1項に記載の宿主細胞を、1つ以上の宿主細胞発現カセットで発現を誘導するのに適した条件下で、適切な培地で培養し、次いで、培養した細胞、または、使用済培地を回収し、それにより、前記標的代謝産物を得ることを含む、前記方法。
- 前記代謝産物が、カンナビノイドであるか;あるいは、THCA、CBDA、CBCA、CBN、THC、CBD、または、CBC、または、それらの1つ以上の混合物から選択されるカンナビノイドであるか;あるいは、テルペノイド、または、イソプレンである、請求項24に記載の方法。
- 前記方法が、前記培養細胞を回収、及び、溶解し、それにより、細胞溶解物を生産することを含む、請求項24又は25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞溶解物、又は前記使用済培地、又は前記細胞溶解物及び前記使用済培地から、前記標的代謝産物を精製し、それにより、精製した標的代謝産物を生産することを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記精製した標的代謝産物が、カンナビノイドであり、かつ、前記方法が、(1)医薬組成物にカンナビノイドを処方すること;あるいは(2)前記精製カンナビノイドの塩、プロドラッグ、または、溶媒和物を形成すること;あるいは(3)前記精製カンナビノイドの塩、プロドラッグ、または、溶媒和物を形成すること、並びに医薬組成物にカンナビノイドを処方すること、を含む、請求項27に記載の方法。
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