CN101100479B

CN101100479B - 一种食用植物油中残留dna的提取方法

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Publication number: CN101100479B
Application number: CN200710025573XA
Authority: CN
Inventors: 陈彦; 王亚
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Shanghai new cloud data Technology Co., Ltd.
Priority date: 2007-08-03
Filing date: 2007-08-03
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2027-08-03
Also published as: CN101100479A

Abstract

一种食用植物油中残留DNA的提取方法，首先用水乳化法将油脂中的DNA逐次转移并富集至无菌水中，然后加入含有CTAB、Tris、NaCl和EDTA的提取缓冲液于63～67℃水浴中保温30～60min得到水提取液，向水提取液中加入由酚、氯仿和异丙醇混合的纯化剂进行纯化，分去有机相、水相即为纯化液，最后将沉淀剂加入预冷的纯化液中搅拌后于-25～-18℃静置至DNA沉淀析出完全后分离，经洗涤、干燥得到目标产物。本方法用实验室常用试剂即可对大豆油、玉米油、菜籽油和棉籽油中DNA实现提取，仅一次提取就可得到高纯度的模板DNA，产物纯度超过专用试剂盒，在PCR之前无需对模板进行纯化。

Description

一种食用植物油中残留DNA的提取方法

一、技术领域

本发明涉及化工过程中一个单元过程，特别涉及物理分离过程，确切地说是一种食用植物油中残留DNA的提取方法。

二、背景技术

目前转基因技术在农业上得到了推广与应用，比如转基因棉花(抗虫棉)、转基因大豆等。由于转基因植物存在的安全性问题使得转基因农作物的标签问题成为公众关注的主要热点，己有30多个国家制定了相应的法律法规对转基因作物及其衍生产品进行标签。随着我国市场的进一步开放，一些未经标签和认证的转基因生物及其深加工产品进入国内市场的可能性大为增加，这就迫切地需要合适的检测手段以确定这些产品中是否含有转基因成分。在需要检测的各类产品中，食用油脂首当其冲。

食用植物油是油脂作物的深加工产品。在加工过程中细胞经过了许多极端的处理，如高温、高压、有机溶剂长时间的萃取等，这些过程导致油脂中的基因组DNA含量成指数级降低，同时造成染色体的断裂和双链DNA的变性等破坏性结果，大量的基因组DNA被降解成单链或者大小不一的基因片段，这些片段与其他杂质如蛋白质、多糖、色素、胆碱等一起对提取方法构成干扰。

CTAB法被广泛用于植物DNA的提取。CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)是一种阳离子去污剂，它能与蛋白质和大多数的多糖(酸性多糖除外)形成复合物，从而使DNA与多糖分开，再用乙醇沉淀DNA可除去CTAB从而得到纯度较高的DNA，可以有效的除去多糖、蛋白等油脂中主要影响PCR扩增的主要杂质，得到高质量的DNA。但对富含酚类和脂肪类的植物DNA的提取效果多不够满意，而且对色素、胆碱等杂质的清除能力不够，使最终得到的DNA溶液呈淡黄色，且扩增效果差。

瑞士ROCHE公司出品的食品DNA提取专用试剂盒High Pure GMO Sample Preparation Kit可用于食用油脂中残留的DNA的提取，但价格昂贵，需要进口，不适用于商业化的市场监控。

三、发明内容

本发明旨在提供一种能获得高纯度目的基因组DNA的提取方法，所要解决的技术问题是在提取过程中成功地除去各种杂质。

本发明的技术方案包括油脂中DNA的富集，然后提取、纯化、分离、洗涤和干燥得到高纯度的目的基因组DNA。

所谓富集就是利用DNA溶于水的特性用水乳化法将油脂中残留的DNA逐次转移并富集至无菌水中，也就是将足够量油脂中的DNA转移至一定体积无菌水中，比如将至少25份体积油脂中的DNA分批转移至1份体积水中。所述的水乳化就是充分搅拌油水混合物。

所谓提取就是将提取缓冲液加入富集有DNA的水中，漩涡振荡后于63～67℃水浴中保温30～60min得到水提取液。

所述的提取缓冲液为每升水中含15～25gCTAB、0.05～0.15mol Tris，1～2mol NaCl和0.01～0.03mol EDTA。优选20gCTAB、0.1molTris、1.5molNaCl和0.02molEDTA。

实验表明，当提取缓冲液中添加有15～25g/Lβ-巯基乙醇或/和8～12g/L PVP时，目标产物DNA为白色沉淀，其PCR扩增结果更稳定。优选同时添加20g/Lβ-巯基乙醇和10g/LPVP。

所谓纯化就是将纯化剂加入水提取液中搅拌均匀后离心分离，分去有机相，保留水相即为纯化液。

所述的纯化剂选自酚、氯仿和异丙醇按25：24：1的体积比混合得到的有机溶剂或/和高浓度盐水饱和的乙醚，优选酚、氯仿和异丙醇按25：24：1的体积比混合得到的有机溶剂纯化至少两次。

所谓分离就是将沉淀剂加入预冷至-8～-12℃的纯化液中搅拌后于-25～-18℃条件下静置，待DNA沉淀析出完全后分离、洗涤、干燥得到目标产物。将DNA溶于TE缓冲液中，加入Rnase酶，低温保存，备用。

所述的沉淀剂为2.5～3.5mol的NH₄Ac溶液与异丙醇按1：5～6的体积比混合的沉淀剂，优选3mol NH₄Ac溶液与异丙醇按1：6的体积比混合，-20℃下静置至DNA沉淀完全。

本提取方法首先用水乳化法将DNA自油脂中转移至水中，同时也将其他水溶性组分如多糖、多酚、色素、胆碱等也转移至水中形成杂质，以后的处理过程均是除去杂质的过程。

CTAB一方面可以沉淀除去大部分多糖，另一方面通过65℃保温45min促进残留细胞的裂解和细胞内包括完整DNA组在内的内容物的释放。对水提取液进行纯化和沉淀可有效去除其他杂质，得到白色沉淀的DNA，且易溶于TE缓冲液中，本方法通用性好，用实验室常用试剂即可对大豆油、玉米油、菜籽油和棉籽油中DNA实现提取且都得到了满意的结果，仅一次提取即得到高纯度的模板DNA，成功率高，一般不需重复提取。用实验室常用试剂即可完成油脂DNA提取，同时产物纯度超过专用试剂盒，在PCR之前无需对模板进行纯化。

对所提取的DNA可用紫外吸收光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测其纯度。

用Ultrospec3100pro型紫外分光光度计扫描200nm～300nm样品的吸收曲线，若吸收峰出现在260nm处，表明杂质干扰少。测定DNA样品在260nm和280nm波长处读数，并根据比值OD260/OD280判断DNA纯度。为了测量的准确性和可靠性，测定时溶液的OD值(光密度)读数应在0.05～1之间。OD260/OD280值为1.7～1.9时DNA质量好，含杂质少。对于纯的DNA，OD260值为1时相当于50μg/mL双链DNA。故DNA(双链)含量为OD260nm值×50μg/mL×比色皿的稀释倍数。结果见表1。

表1：

四、附图说明

图1是两种提取方法提取4种油脂总DNA0.8％琼脂糖凝胶电泳图。A、B、C、D分别是大豆油、玉米油、油菜籽油、棉籽油的提取结果；1泳道是本方法提取结果，2泳道是试剂盒法提取结果。

五、具体实施方式

现以超市采购的大豆色拉油、玉米色拉油、油菜籽调和油、棉籽油为例，非限定实施例叙述如下：

(一)仪器

MINI小型高速离心机德国Eppendorf公司；

3K15型高速冷冻离心机德国Sigma公司；

Mycycler^TMthermal cycler型PCR扩增仪美国Bio-Rad公司；

Power Pac Basic型电泳仪美国Bio-Rad公司；

Gel Doc^TMXR型凝胶成像系统美国Bio-Rad公司；

MLS-3750型高压灭菌锅日本SANYO公司；

Ultrospec3100pro型紫外分光光度计瑞典Pharmacia biotech公司；

ELGA PURELAB Classic DI型超纯水仪英国ELGA Lab Water公司；

移液枪5mL、1mL、200μL、100μL、20μL、10μL、1μL德国Eppendorf公司；

超净工作台、超低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、漩涡振荡器各类枪头及耗材等。

(二)试剂

CTAB、NaOH、Tris、HCl、EDTA、β-巯基乙醇、可溶性PVP(MW40000)、NaCl、NH₄Ac、苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、异丙醇、70％乙醇、无水乙醇、TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)、Rnase酶贮液(10mg/mL)、琼脂糖、硼酸、MgCl₂、10倍PCR reaction buffer，引物、Taq DNA聚合酶，dNTPs、溶液High Pure GMOSample Preparation Kit、乙醚、溴化乙锭(EB)、6倍电泳加样缓冲液、无菌去离子超纯水。

(三)油脂中DNA的提取

1、乳化富集

取600mL食用油转入一个已灭菌的1000mL的烧杯中，再加入100mL无菌ddH₂O，用磁力搅拌器在4℃充分乳化2小时，4℃12000g离心3min，去除上层油脂层，再向下层水溶液中加入600mL食用油脂，乳化，离心，去除上层油脂层，反复五次，即将3000mL食用油中残留的DNA转移至100mL水中。取水相用保存在4℃冰箱，用于DNA提取。

2、DNA提取

取500μL水相至2mL离心管，立即加入等体积的预热至65℃的CTAB提取缓冲液[20g/LCTAB，0.1mol/L Tris，10g/L PVP，20g/Lβ-巯基乙醇1.4mol/L NaCl，0.02mol/L EDTA，(pH8.0)]，漩涡振荡30s，在65℃水浴中保温45min。放至室温，得到水提取液，待纯化。

3、纯化

向水提取液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24:1)，轻轻颠倒混匀5min，12000g室温下离心5min，重复纯化一次(如果上清液还比较浑浊，再重复此步骤)，将上清液转移至新的离心管中。

4、分离

将上述得到的上清液预冷至-15℃，加入0.7～1倍体积的沉淀剂搅拌后于-20℃静置，有白色DNA沉淀析出，待沉淀完全后离心分离，用70％乙醇洗涤沉淀两次，干燥后溶于TE缓冲液中，并加入Rnase酶，-20℃冷藏备用。沉淀剂为3mol NH₄Ac溶液与异丙醇按1：6的体积比混合的沉淀剂。

(四)试剂盒提取法

用High Pure GMO Sample Preparation Kit试剂盒，参照说明书。取500μL水相于2mLEP管中，加入1mLBufferI，涡旋30s，80℃水浴30min，期间颠倒两次。12000g离心10min。在另一2mLEP管中加入400μLBufferII，加入约1500μL离心后的上清液，再加入80μL的Buffer III，用枪头上下混匀，72℃水浴10min。等分水浴后的混合液，到另2mLEP管中，加入200μL的异丙醇，用枪头上下混匀。取600μL的混合液加入到带有套管的纯化柱中，5000g离心1min。弃去套管中的液体，重复此步骤直到混合液被完全去除。加入450μL的Buffer IV到纯化柱中，5000g离心1min，弃去滤管中的液体。重复此步骤。弃去滤管中的液体，13000g离心10s。将纯化柱放到一个新的1.5mLEP管中，加入70℃水浴过的30μLBufferV到纯化柱中，室温放置5min。5000g离心1min，弃去纯化柱，此时1.5mLEP管中即为提取的DNA，-20℃冷藏备用。

Claims

1. 一种食用植物油中残留DNA的提取方法，包括油脂水乳化富集、提取、纯化、分离、洗涤和干燥，其特征在于：所述的乳化富集就是用水乳化法将油脂中的DNA逐次转移并富集至无菌水中；所述的提取就是将提取缓冲液加入富集有DNA的水中，漩涡振荡后于63～67℃水浴中保温30～60min得到水提取液，提取缓冲液为每升水中含15～25gCTAB、0.05～0.15mol Tris，1～2mol NaCl和0.01～0.03mol EDTA；所述的纯化就是将纯化剂加入水提取液中，搅拌均匀后离心分离得到水纯化液，纯化剂选自酚、氯仿和异丙醇按25：24：1的体积比混合得到的有机溶剂或/和高浓度盐水饱和的乙醚；所述的分离就是将沉淀剂加入预冷至-8～-12℃的水纯化液中搅拌后于-25～-18℃条件下静置，当DNA沉淀析出完全后分离，沉淀剂为2.5～3.5mol的NH₄Ac溶液与异丙醇按1：5～6的体积比混合的沉淀剂。

2. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述的提取缓冲液为每升水中含20gCTAB、0.1molTris、1.5molNaCl和0.02molEDTA。

3. 根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于：所述的提取缓冲液中含15～25g/Lβ-巯基乙醇或/和8～12g/L PVP。

4. 根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述的提取缓冲液中含20g/Lβ-巯基乙醇和10g/L PVP。

5. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述的纯化就是用酚、氯仿和异丙醇按25：24：1的体积比混合有机溶剂纯化至少两次。

6. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述的沉淀是加入沉淀剂后于-20℃下静置至DNA沉淀析出完全。

7. 根据权利要求1或6所述的提取方法，其特征在于：所述的沉淀剂为3mol/L NH₄Ac溶液与异丙醇按1：6的体积比混合的沉淀剂。