CN102070692B

CN102070692B - 食用油中脱氧核糖核酸的提取方法

Info

Publication number: CN102070692B
Application number: CN 201010596930
Authority: CN
Inventors: 潘建青; 吴慧英; 王立平
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2010-12-20
Filing date: 2010-12-20
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2030-12-20
Also published as: CN102070692A

Abstract

本发明涉及一种食用油中脱氧核糖核酸的提取方法，首先向食用油中加入脱氧核糖核酸提取液，超声乳化后分离出含脱氧核糖核酸的水相；然后向水相中加入脱氧核糖核酸沉淀剂，沉淀出脱氧核糖核酸。提取过程中通过低能量超声乳化富集样品中的DNA，缩短了样品的前处理时间，耗时短，提高了DNA的提取效率，并且避免了待检测样品之间的交叉污染，提取结果更准确可靠。

Description

食用油中脱氧核糖核酸的提取方法

【技术领域】

本发明涉及化工分离过程，尤其是一种食用油中脱氧核糖核酸(DNA)的提取方法。

【背景技术】

随着转基因技术的发展，各种转基因产品逐步进入人们的生活。2002年3月20日，中国开始实行《农业转基因生物标识管理办法》，规定国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。2004年，中国批准了耐除草剂转基因大豆(转基因抗农达大豆)的进口，各种转基因大豆相关的产品开始全面进入中国市场。截止2008年5月底，中国进口的转基因大豆达9.0×10⁶吨左右。转基因生物因其抗逆性好，产量较高，生产成本较低，具有较好的市场竞争性和应用前景。但转基因生物的广泛应用是否会对生态环境和人类自身的健康造成不良影响，至今仍无定论。目前各国相继出台各种政策，对转基因生物及其产品进行严格的标识管理和控制。因此，建立准确的转基因检测方法对于落实相关政策和保护消费者的知情权和选择权有着非常重要的意义。

精炼植物食用油的加工工艺复杂，终产品中仅含有极微量的DNA。传统的用于食用油中DNA的提取方法，如CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)法，样品需要进行长时间的机械搅拌，耗时长，效率低下，且过程繁琐，准确率不高。

【发明内容】

基于此，有必要提供一种快速准确的食用油中脱氧核糖核酸的提取方法。

一种食用油中脱氧核糖核酸的提取方法，包括如下步骤：

步骤一：向食用油中加入脱氧核糖核酸提取液，超声乳化后分离出含脱氧核糖核酸的水相；

步骤二：向所述水相中加入脱氧核糖核酸沉淀剂，沉淀出所述脱氧核糖核酸。

优选的，所述脱氧核糖核酸提取液为40～60mmol/L的乙二胺四乙酸溶液(或40～60mmol/L的乙二胺四乙酸钠溶液)、400～600mmol/L的氯化钠溶液、质量浓度为1.8％～2.5％的十二烷基磺酸钠溶液、质量浓度为0.8％～1.2％的聚乙烯吡咯烷酮溶液与pH为7.8～8.2、浓度为80～120mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-氯化氢溶液组成的混合溶液。

优选的，所述脱氧核糖核酸提取液与所述食用油的体积比为1∶8～12。

优选的，所述超声功率为50～180瓦、频率为20～40kHz，超声处理时间为30秒～2分钟。

优选的，所述脱氧核糖核酸沉淀剂为异丙醇与浓度为2.0～4.0mol/L的乙酸盐溶液的混合物，其中，异丙醇与乙酸盐溶液的体积比为1∶4～8。

优选的，所述步骤一中，加入脱氧核糖核酸提取液之前，还包括将所述脱氧核糖核酸提取液加热至50～80℃的预热处理步骤。

优选的，所述步骤一中，超声乳化前还包括剧烈震荡使脱氧核糖核酸提取液在所述食用油中分散均匀的步骤。

优选的，所述步骤一中，分离出含脱氧核糖核酸的水相是通过离心分离，收集含脱氧核糖核酸的水相。

优选的，所述步骤二中，加入脱氧核糖核酸沉淀剂之前，还包括如下步骤：向水相中加入食用油萃取剂对所述水相中残存的食用油进行萃取，充分混匀后进行离心处理，收集水相；其中，食用油萃取剂与萃取前的水相的体积比为1～2∶1。

优选的，所述步骤二中，加入脱氧核糖核酸沉淀剂之前，还包括对所述脱氧核糖核酸沉淀剂进行冷却至-30～-10℃的预冷处理步骤。

优选的，所述步骤二中，沉淀出脱氧核糖核酸之后还包括如下步骤：首先，使用脱氧核糖核酸洗涤剂洗涤所述脱氧核糖核酸；然后使用缓冲液溶解洗涤后的所述脱氧核糖核酸，并加入核糖核酸酶去除残留的核糖核酸。

上述提取过程中通过低能量超声乳化富集样品中的DNA，缩短了样品的前处理时间，耗时短，提高了DNA的提取效率，并且避免了待检测样品之间的交叉污染，提取结果更准确可靠。此外，提取过程中没有用到传统方法使用的剧毒物质，如正己烷、β-巯基乙醇等，实验过程更安全。同时，使用上述方法提取的DNA符合PCR定性检测的要求，对设备要求低，可广泛推广应用。

【附图说明】

图1为提取的一级大豆油DNA内源性凝血素(Lectin)基因的电泳图；

图2为提取的一级大豆油DNA转CaMV35S基因的电泳图。

【具体实施方式】

下面主要结合附图及具体实施例对食用油中DNA的提取方法作进一步详细的说明。

一实施方式的食用油中脱氧核糖核酸的提取方法，包括如下步骤：

步骤S1：向食用油中加入预热的DNA提取液，剧烈震荡使DNA提取液在食用油中分散均匀，然后超声乳化，得到分散均匀的乳化液。

针对不同种类的转基因食用油，如转基因大豆食用油、转基因调和油、转基因菜籽油等，可以量取不同体积的待测样品，体积过小，其中含有的DNA含量太低，不利用提取和检测；体积过大，也不利于实验操作，同时造成浪费。优选的，针对市售的大豆油，可以量取10-200mL作待测样品。

DNA提取液可以为40～60mmol/L的乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na₂)或乙二胺四乙酸(EDTA)溶液、400～600mmol/L的氯化钠(NaCl)溶液、质量浓度为1.8％～2.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液、质量浓度0.8％～1.2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液与pH为7.8～8.2、浓度为80～120mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(Tris-HCl)溶液组成的混合溶液。优选的，DNA提取液组成为：pH 8.0的100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，50mmol/L EDTA-Na₂，2％SDS及1％PVP。

DNA提取液在加入至食用油之前，还需进行预热处理，以使DNA提取液在食用油中较容易分散开，减少震荡及超声的时间，提高提取效率。优选的，预热至50～80℃，进一步优选65℃。

DNA提取液的加入量与待测样品的体积比为1∶8～12，优选体积比为1∶10。

超声乳化的时间随不同的超声处理仪器的设置而不同，超声时间过长会导致待测样品过热，不利于提取且会损坏DNA，时间过短，乳化不彻底，后续提取产率不高。针对功率为50～180瓦、频率为20～40kHz的超声清洗机，优选的，超声处理时间为30秒～2分钟。

步骤S2：将乳化液分装至离心管中，离心，收集下层的水相，水相中溶解有DNA。

离心机转速可以控制为6000～12000转/分钟，优选的，离心过程选用转速为12000转/分钟，离心10分钟。

步骤S3：向水相中加入食用油萃取剂以萃取水相中残留的食用油成分，充分混匀后，离心，收集上层的水相。

食用油萃取剂可以为氯仿与异戊醇的混合溶剂，混合溶剂中氯仿与异戊醇的体积比为18～30∶1，优选的，混合溶剂中氯仿与异戊醇的体积比为24∶1。

食用油萃取剂与萃取前的水相的体积比为1～2∶1。优选的，食用油萃取剂与萃取前的水相的体积比为1∶1。

步骤S4：向水相中加入预冷的DNA沉淀剂，-30～-10℃环境中静置10～30分钟后，离心，沉淀DNA。

DNA沉淀剂为异丙醇与浓度为2.0～4.0mol/L的乙酸盐溶液的混合物，其中，异丙醇与乙酸盐溶液的体积比为1∶4～8。优选的，DNA沉淀剂为异丙醇与浓度为3mol/L的乙酸盐溶液的混合物，异丙醇与乙酸盐溶液的体积比为1∶6。乙酸盐可以为乙酸钠、乙酸钾及乙酸铵等物质中的至少一种。

DNA沉淀剂在使用前先进行低温预冷处理，控制温度在-30～-10℃。

离心机转速可以控制为6000～12000转/分钟，离心过程选用转速为12000转/分钟，离心10分钟。

步骤S5：使用DNA洗涤剂洗涤DNA沉淀2～3次，以清除杂质。

DNA洗涤剂为浓度为50％～90％的乙醇，优选浓度为70％的乙醇。多次洗涤过程中，可以使用离心分离乙醇与DNA。离心机转速可以控制为6000～12000转/分钟，优选的，离心过程选用转速为12000转/分钟，离心1分钟。

步骤S6：使用缓冲液溶解乙醇洗涤后的DNA，并加入核糖核酸酶(RNase酶)溶液去除残留的RNA，低温保存备用。

优选的，缓冲液为TE缓冲液(组成为：10mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0、1mmol/LEDTA-Na₂，或者组成为：10mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0、1mmol/L EDTA)。

以下为食用油中DNA的提取及检测实施例部分：

一、主要仪器：

梯度PCR仪(型号：5332，德国Eppendorf公司)

超声清洗机(型号：SB-3200DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司)

核酸蛋白分析仪(型号：Biophotomter，德国Eppendorf公司)

高效离心机(型号：AVANTIJ-26XP，美国BECKMAN公司)

台式微量离心机(型号：MICROFUGE22R，美国BECKMAN公司)

凝胶成像仪(型号：DOLPHIN-Plus，美国Wealtec公司)

微量移液器(规格：0.5μL、2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL及5mL等，德国Eppendorf公司)。

二、主要试剂：

除另有规定外，所有试剂均采用分析纯或生化试剂。

实验用水：符合GB/T6682中一级水的规格。

RNase酶溶液：使用消毒过的去离子水或双蒸水溶解RNase-A酶冻干品，溶解后的浓度为10g/L，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。

DNA提取液：0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5mol/L NaCl，0.05mol/LEDTA-Na₂，2％SDS，1％PVP。

DNA沉淀剂：3mol/L NaAc溶液与异丙醇按体积比为6∶1的混合溶液。

无水乙醇、异丙醇等有机试剂。

TE缓冲液：Tris 0.01mol/L，EDTA-Na₂ 1.0mmol/L，用盐酸或氢氧化钠调节pH至8.0。

LA Taq酶、2×GC缓冲液、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP Mixture，四种脱氧核糖核苷酸各2.5mmol/L)(购自宝生物工程(大连)有限公司)。

50bp、100bp的Ladder DNAMarker(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

PCR引物设计：

一级大豆油DNA内源性Lectin基因：正向引物：5′-gccctctactccacccccatcc-3′

反向引物：5′-gcccatctgcaagcctttttgtg-3′

一级大豆油DNA转CaMV35S基因：正向引物：5′-tcatcccttacgtcagtgag-3′

反向引物：5′-ccatcattgcgataaaggaaa-3′

三、DNA提取过程：

(1).取100mL市售大豆食用油(金龙鱼第二代食用调和油5升装)加入500mL锥形瓶中，加入1/10体积的65℃预热的DNA提取液，剧烈摇晃20次后，放入超声清洗机(功率50W，频率20kHz)乳化混匀1分钟，得到乳化液。

(2).分装乳化液到离心管中，以12000转/分钟离心10分钟，取出下层水相转移至新的离心管中，加入等体积的氯仿与异戊醇的混合溶剂(混合溶剂中氯仿与异戊醇的体积比为24∶1)，充分混匀，12000转/分钟离心10分钟。

(3).取上层水相加入等体积的预冷的DNA沉淀剂，-20℃静置20min，12000转/分钟离心10分钟，沉淀DNA。

(4).弃去离心管中液体，用1mL70％的乙醇溶液充分吹打洗涤离心管底部的DNA沉淀，将洗涤液转移至新的离心管中，12000转/分钟离心1分钟，弃去洗涤液，重复乙醇溶液洗涤DNA沉淀一次。

(5).弃去洗涤液，将离心管倒置于吸水纸上5～10分钟，待风干后加入30μLTE缓冲液溶解DNA沉淀，再加入RNase酶溶液，-20℃低温保存备用。

四、DNA检测过程：

(1).紫外分光光度法对DNA进行定量分析：

紫外分光光度法检测DNA浓度的最佳范围是2μg/mL～50ug/mL，OD值(optical density，光密度值)在0.5～1的区间内。

将上述保存备用的DNA溶液进行稀释处理，放入紫外分光光度计的比色皿中，于260nm处测定其吸收峰。1OD 260nm＝50ug/mL双链DNA或38ug/mL单链DNA。PCR扩增使用的DNA溶液的OD260/OD 280比值为1.7～2.0。

选择合适稀释浓度的DNA溶液用于PCR扩增。

(2).内源性Lectin基因和转CaMV35S基因的PCR扩增：

PCR反应体系见下表：

PCR反应条件：

内源性Lectin基因：95℃变性5分钟→扩增(95℃30秒→60℃30秒→72℃60秒)35个循环→72℃后延伸3分钟；

转CaMV35S基因：94℃变性5分钟→扩增(95℃20秒→54℃40秒→72℃60秒)40个循环→72℃后延伸3分钟；

(3).PCR扩增产物的凝胶电泳检测：

制备2.5％的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液(Loading Buffer)和PCR扩增产物，然后将混有上样缓冲液的PCR扩增产物加入样品孔中，并用50bp或100bp的Ladder DNAMarker作分子量标记，进行电泳分析。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍摄并记录。

图1中所示的118bp位置即为内源性Lectin基因。图2中所示165bp位置即为转CaMV35S基因。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种食用油中脱氧核糖核酸的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤二：向所述水相中加入脱氧核糖核酸沉淀剂，沉淀出所述脱氧核糖核酸；

所述脱氧核糖核酸提取液为40～60mmol/L的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸钠溶液、400～600mmol/L的氯化钠溶液、质量浓度为1.8%～2.5%的十二烷基磺酸钠溶液、质量浓度为0.8%～1.2%的聚乙烯吡咯烷酮溶液与pH为7.8～8.2、浓度为80～120mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-氯化氢溶液组成的混合溶液，

所述脱氧核糖核酸提取液与所述食用油的体积比为1:8～12，

所述超声功率为50～180瓦、频率为20～40kHz，超声处理时间为30秒～2分钟，

所述脱氧核糖核酸沉淀剂为异丙醇与浓度为2.0～4.0mol/L的乙酸盐溶液的混合物，其中，异丙醇与乙酸盐溶液的体积比为1:4～8，

所述步骤二中，加入脱氧核糖核酸沉淀剂之前，还包括如下步骤：向水相中加入食用油萃取剂对所述水相中残存的食用油进行萃取，充分混匀后进行离心处理，收集水相；其中，食用油萃取剂与萃取前的水相的体积比为1～2:1，

食用油萃取剂为氯仿与异戊醇的混合溶剂，混合溶剂中氯仿与异戊醇的体积比为18～30:1。

2.如权利要求1所述的食用油中脱氧核糖核酸的提取方法，其特征在于，所述步骤一中，加入脱氧核糖核酸提取液之前，还包括将所述脱氧核糖核酸提取液加热至50～80℃的预热处理步骤。

3.如权利要求1所述的食用油中脱氧核糖核酸的提取方法，其特征在于，所述步骤一中，超声乳化前还包括剧烈震荡使脱氧核糖核酸提取液在所述食用油中分散均匀的步骤。

4.如权利要求1所述的食用油中脱氧核糖核酸的提取方法，其特征在于，所述步骤一中，分离出含脱氧核糖核酸的水相是通过离心分离，收集含脱氧核糖核酸的水相。

5.如权利要求1所述的食用油中脱氧核糖核酸的提取方法，其特征在于，所述步骤二中，加入脱氧核糖核酸沉淀剂之前，还包括对所述脱氧核糖核酸沉淀剂进行冷却至-30～-10℃的预冷处理步骤。

6.如权利要求1所述的食用油中脱氧核糖核酸的提取方法，其特征在于，所述步骤二中，沉淀出脱氧核糖核酸之后还包括如下步骤：

使用脱氧核糖核酸洗涤剂洗涤所述脱氧核糖核酸；

使用缓冲液溶解洗涤后的所述脱氧核糖核酸，并加入核糖核酸酶去除残留的核糖核酸。