CN104630208B - 提取基因组dna的试剂盒和提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了提取基因组DNA的试剂盒和方法，所述试剂盒包括试剂1、试剂2和试剂3。所述试剂1包括十六烷基三甲基溴化铵、Tris、EDTA、PVP、NaCl；试剂2包括盐酸胍、乙醇、柠檬酸钠；试剂3包括盐酸胍、甘氨酸。本发明所述试剂盒增强了所提取基因组DNA的纯度和完整性，提高产物得率。所用试剂无毒无害，保证操作人员的健康，减少环境的污染。本发明所述方法可提取微量样本中的基因组DNA，实现了被检测的物体的无损伤取样，且提取方法简单，提取时间短，提高了提取效率。

Description

提取基因组DNA的试剂盒和提取方法

技术领域

本发明涉及分子生物学的生物样品提取领域，尤其涉及一种提取基因组DNA的试剂盒和提取方法。

背景技术

目前常采用CTAB法、PTB法、QIAGEN试剂盒法、高盐低pH法等方法提取基因组DNA。CTAB法采用CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，它是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液中，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，产生沉淀，但却不能与核酸形成复合物产生沉淀。通过离心获得含有核酸的上清液，通过加入氯仿等有机试剂进行抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB法需要用到β-巯基乙醇、氯仿、酚等试剂。但酚和氯仿的使用会对人体有一定的危害，并污染环境。且提取大概需要花费2-3天时间。PTB法需要使用EDTA、蛋白酶K、PTB、酚、氯仿等试剂，其操作步骤异常繁琐，操作时间需5-7天，操作过程中会使用到酚、氯仿多种有害物质。高盐低pH法：需要使用EDTA、NaCl、醋酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、氯仿、醋酸钾等试剂。操作步骤与CTAB法类似，但是提取的DNA得率较低且杂质较多。试剂盒法：使用方便但是提取的得率较低，在样品本身DNA含量低的情况下具有明显的局限性，并且成本较高。以上这些提取方法和方法本身的不足在很多文献中有报道。

在人们的生产、生活中，木材的保护和合理利用成为人们所关注的焦点。随着时代发展和人们生活水平的不断提高，木制材料在生活中的应用越来越受到人们的青睐，特别是一些高档名贵木材制品也跻身于奢侈品行列，成为人们追求生活品质的象征。正是由于这些珍惜名贵木材与普通木材在价格上存在巨大的差额，导致一些不法分子将一些容易混淆和不易区分的树种和木材制品当做名贵珍惜树种和木材制品进行销售，极大地扰乱了红木市场、仿古木市场、古典家具市场和名贵乐器市场的正常秩序，在经济上和精神上给消费者带来了巨大的损失和打击。而一些禁止砍伐的珍贵树种也被乔装成普通木材进行运输和走私，这无疑给林业检查和海关人员的识别工作增加了难度。因此，在木材加工、利用、使用和贸易活动中，对木材进行科学、快速、准确地识别和鉴定就显得尤为重要和迫切。

传统的木材识别方法要求鉴定者有丰富的植物学知识和木材构造方面的专业知识。通常以传统的木材鉴定手段，解剖切片观察木材的构造以及形态特征从而得出判定结果。由于鉴定者对具体形态特征的主观感受不一样，有时候即使是专业的人员得出的鉴定结果也不完全一致，尤其是形态特征比较相似的木材品种。随着分子生物学技术的发展，基因组DNA分析也被运用到鉴定木材的方法中。而运用基因组DNA分析技术识别和鉴定木材的前提是从木材组织中提取到足够数量和高质量的DNA，以满足后续的PCR扩增、基因测序等分子生物学鉴定方法。

现有的提取方法和试剂盒通常只能用于一般的植物基因组DNA，例如叶片、茎等植物的幼嫩组织。相比鲜嫩且具有分生能力的植物组织而言，从木材组织中提取和扩增DNA要困难很多。主要原因为以下几个方面：(1)木材组织中存在的DNA数量较少，且常常降解成小片段。(2)木材组织中存在有厚壁的管状分子，导致在碾磨处理这些坚硬组织时会产生高温，这进一步损伤DNA分子。(3)木材中存在一些如蛋白质、酚类、多糖、单宁和色素等物质，这些物质往往会影响DNA聚合酶的活性，干扰引物与模板结合，导致PCR扩增失败。(4)木材受存放环境地影响，如潮湿环境下会造成木材腐朽和真菌污染，导致DNA降低和污染。目前还没有针对植物木质部基因组DNA的提取试剂盒和提取方法。在木材交易中，木材的茎叶往往都已经摘除。成品家具自然更不会有茎叶等幼嫩组织，且通常都经过熏、蒸、挤压等加工。因此现有植物的DNA提取方法并不适合木材和家具的DNA提取。另一方面，木材和家具交易是一个快速的交易过程。在木材和家具的进出口过程中，也需要在短时间内完成木材的鉴定。而现有的植物DNA提取方法通常需要至少2天以上，有的甚至要一周的时间。因此现有的提取方法不能满足快速鉴定木材基因组DNA的要求。现有的提取试剂和方法也不能提取出微量样本中DNA，例如采用现有的提取试剂和提取方法提取利用微创方法采集到的样本中的DNA，其产物得率很差。

发明内容

为了克服上述现有技术中的问题，本发明提供了提取基因组DNA的试剂盒，包括试剂1、试剂2和试剂3，其中所述试剂1包括以下组分：0.1％-5％的十六烷基三甲基溴化铵(质量百分比)、10mM-200mM的Tris、10mM-200mM的EDTA、0.1％-10％的PVP(质量百分比)、0.1M-5M的NaCl、溶剂为去离子水；试剂2包括以下组分：0.1M-6.5M的盐酸胍、1％-50％的乙醇(体积百分比)、0.1M-2M的柠檬酸钠、溶剂为去离子水；试剂3包括以下组分：0.1M-8M的盐酸胍、0.05M-0.2M的甘氨酸、溶剂为去离子水。

进一步地，所述试剂盒还包括洗涤液。

进一步地，所述试剂盒还包括洗脱液。

进一步地，所述的洗涤液包括去蛋白洗涤液和去离子洗涤液。

进一步地，所述去蛋白洗涤液包括1M-6M的盐酸胍，1mM-50mM的EDTA·2Na·2H2O，溶剂为去离子水；所述去盐洗涤液包括20mM-200mM的NaAC·3H2O，溶剂为去离子水；洗脱液为去离子水。

优选地，所述的试剂包括以下组分：3.5％的十六烷基三甲基溴化铵、120mM的Tris、110mM的EDTA、6％的PVP、3M的NaCl、溶剂为去离子水；试剂2包括以下组分：2.5M的盐酸胍、25％的乙醇、1M的柠檬酸钠、溶剂为去离子水；试剂3包括以下组分：4M的盐酸胍、0.1M的甘氨酸、溶剂为去离子水。

本发明还提供提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：

(1)采样；

(2)裂解样品细胞：加入65℃预热的试剂1和Proteinase K，涡旋振荡，混合均匀，65℃水浴0.5h-过夜；

(3)沉淀非DNA的杂质：将步骤2中的混合物冷却至室温，加入试剂2，混合均匀，冰浴；

(4)离心步骤3所得混合物，取上清，加入carrier RNA和试剂3，混合均匀后加入异丙醇，混匀；

(5)将步骤4所得混合物中的DNA与纯化载体结合，经过洗涤液的去蛋白洗涤和去盐洗涤，以及洗脱液的洗脱步骤，获得可用于检测的样本基因组DNA；

其中，所述的试剂1包括以下组分：0.1％-5％的十六烷基三甲基溴化铵(质量百分比)、10mM-200mM的Tris、10mM-200mM EDTA、0.1％-10％的PVP(质量百分比)、0.1M-5M的NaCl、溶剂为双蒸去离子水；试剂2包括以下组分：0.1M-6.5M的盐酸胍、1％-50％的乙醇(体积百分比)、0.1M-2M的柠檬酸钠、溶剂为双蒸去离子水；试剂3包括以下组分：0.1M-8M的盐酸胍、0.05M-0.2M的甘氨酸、溶剂为双蒸去离子水。

进一步地，其中步骤4所述的纯化载体选自核酸提取纯化柱或磁珠。

优选地，所述步骤2中65℃水浴时间为0.5h-2h。

优选地，在步骤3冰浴时间为10min。

本发明的有益效果是：本发明所述试剂和方法只需要非常少的样本用量，就能提取到需要的DNA。例如利用本发明所述试剂和方法，能够提取采样量仅为0.1g样本中的基因组DNA。因此本发明可以应用于微创的样品检测方法，对木材样品进行无损伤取样。可对已加工后的实木成品样品进行提取，例如可用于各种实木家具、实木工艺品、实木古玩等木材DNA的提取，这即不破坏家具等的材料，又实现了分子生物学层面的物种鉴定工作。在对珍贵物种中的鉴定中，本发明起到了尤为重要的作用。本发明对传统的CTAB基因组提取方法的裂解液进行了改良，提高CTAB的浓度的同时，增加了配套试剂，提高了裂解液的裂解能力以及纯化后DNA的完整性。由于本发明所述试剂1的水浴时间一般为0.5-2h即可满足DNA提取要求，因此提取时间大大缩短。本发明所用试剂无毒无害，保证操作人员的健康，避免职业病，对环境无污染，便于运输。加入试剂3试剂可以进一步增加DNA与纯化载体的结合能力，降低杂质含量、提高产物纯度，提纯效率更高。本发明所述方法操作步骤简单，能大幅度减少操作时间、可进行规模化操作。

附图说明

图1是楠木样本提取实验结果。

图2是不同样本用量测试实验结果。

图3是样本处理时间测试实验结果。

图4是加入试剂1后水浴与否，以及加入试剂2后冰浴与否的实验结果。

图5是加入Carrier RNA及试剂3的实验结果。

图6是利用本发明提取不同种类木材中的基因组DNA实验结果。

图7是经过不同处理方式得到的木材基因的提取实验结果。

图8是木材不同部位的基因提取实验结果。

图9是不同生长年限木材的基因提取实验结果。

图10是木材不同组织部位的基因提取实验结果。

图11是试剂选择性实验结果。

图12是实施例13的实验结果。

图13是实施例14的实验结果。

图14是实施例15的实验结果。

具体实施方式

本发明所述的提取基因组DNA的试剂盒包括试剂1、试剂2和试剂3。其中所述试剂1包括以下组分：

十六烷基三甲基溴化铵0.1％-5％(质量百分比)

Tris 10mM-200mM

EDTA 10mM-200mM

PVP 0.1％-10％(质量百分比)

NaCl 0.1M-5M

溶剂为去离子水

试剂2包括以下组分：

盐酸胍 0.1M-6.5M

乙醇 1％-50％(体积百分比)

柠檬酸钠 0.1M-2M

溶剂为去离子水

试剂3包括以下组分：

盐酸胍 0.1M-8M

甘氨酸 0.05M-0.2M

溶剂为去离子水

提取基因组DNA的试剂包括试剂1、试剂2和试剂3，蛋白酶K、Carrier RNA、异丙醇、洗涤液和洗脱液。

在一个实施例中，所述去蛋白洗涤液包括1M-6M的盐酸胍，1mM-50mM的EDTA·2Na·2H₂O，pH为5.0-8.5，溶剂为去离子水。所述去盐洗涤液包括20mM-200mM的NaAC·3H₂O，pH为3.5-7.5，溶剂为去离子水。洗脱液为去离子水。目前市面上可以购买到的DNA提取用洗涤液和洗脱液也可用于本发明。

在另一个实施例中，试剂1的pH值为4.5-8.5，试剂2的pH值为3.3-7.5，试剂3的pH值为2.5-8.0。

利用本发明所述的试剂盒和试剂快速提取样品基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1.采样：采集要检测的样本，并经处理后获得符合DNA提取要求的样品，并将所述样品转移至离心管中。

2.裂解样品细胞：加入65℃预热的试剂1和Proteinase K，封严离心管口，涡旋振荡，混合均匀，65℃水浴0.5h-过夜。

3.沉淀非DNA的杂质：将步骤2中的混合物冷却至室温，加入试剂2，涡旋振荡，混合均匀，冰浴。

4.将步骤3所得混合物离心，取上清，加入carrier RNA和试剂3，混合均匀后加入异丙醇，涡旋混匀。

5.将步骤4所得混合物中的DNA与纯化载体结合，经过洗涤液的去蛋白洗涤和去盐洗涤，以及洗脱液的洗脱步骤，获得可用于检测的样本基因组DNA。

其中在步骤2中优选的65℃水浴时间为0.5h-2h。在步骤3中优选冰浴时间为10min。优选的，所述的离心时间为12,000×g离心10min。优选的，所述的异丙醇加入量为约0.5倍上清液体积。

所述的纯化载体选自核酸提取纯化柱、磁珠等。

本发明所述试剂和方法在柱法(制备管法)提取植物基因组DNA的方法上的应用，其方法包括以下步骤：

1.称取植物材料，加入液氮，在研钵中研磨成粉末，立即转移至离心管中。

2.加入65℃预热的试剂1和Proteinase K，盖上管盖并封严管口，涡旋振荡30s，混合均匀，65℃水浴0.5h-过夜。

3.冷却至室温，加入试剂2，涡旋1min后冰浴10min。

4.12,000×g离心10min，取上清液至新的离心管中，加入试剂3和Carrier RNA，混合均匀后加入约0.5倍上清液体积的异丙醇(例如360μl的异丙醇)，涡旋混匀30s。

5.将DNA制备管置于新的离心管中，取步骤4中的混合液并转移至制备管中，12,000×g离心1min，弃滤液。

6.将制备管置回到原来的离心管中，加入去蛋白洗涤液，12,000×g离心1min，弃滤液。

7.弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入去盐洗涤液，12,000×g离心1min，弃滤液。

8.重复步骤7。

9.将制备管置回到原来的离心管中，12,000×g离心1min。

10.将DNA制备管置于另一洁净的离心管中，在制备管膜中央加去离子水，室温静置10min，12,000×g离心1min洗脱DNA，获得基因组DNA。

本发明所述试剂和方法在磁珠法提取植物基因组DNA的应用，其方法包括以下步骤：

1.称取植物材料，加入液氮，在研钵中研磨成粉末，立即转移至离心管中。

2.加入65℃预热的试剂1和20μl Proteinase K，盖上管盖，用封口膜封严管口，涡旋振荡30s，混合均匀，65℃水浴0.5h-过夜。

3.冷却至室温，加入试剂2，涡旋1min后冰浴10min。

4.12,000×g离心10min，取上清液至新的离心管中，加入磁珠、Carrier RNA，涡旋混匀后加入约1.25倍上清液体积的异丙醇(例如900μl的异丙醇)，涡旋混匀10min。

5.将离心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸弃上清。

6.加去蛋白洗涤液，涡旋洗涤1min。

7.将离心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸弃上清。

8.加去盐洗涤液，涡旋洗涤1min。

9.将离心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸弃上清。

10.重复步骤8-9。

11.短暂离心后吸弃残余液体，通风橱干燥。

12.加去离子水，混匀后，洗脱5min，获得基因组DNA。

实施例1提取楠木木材木质部基因组DNA

提取楠木木材木质部基因组DNA的试剂盒包括试剂1、试剂2和试剂3。提取楠木木材木质部基因组DNA的试剂包括试剂1、试剂2、试剂3、蛋白酶K、Carrier RNA、异丙醇、洗涤液和洗脱液。其中试剂1包括以下组分：3.5％的十六烷基三甲基溴化铵，120mM的Tris，110mM的EDTA，6％的PVP，3M的NaCl，溶剂为去离子水。试剂2包括以下组分：2.5M的盐酸胍，25％的乙醇，1M的柠檬酸钠，溶剂为去离子水。试剂3包括以下组分：4M的盐酸胍，0.1M的甘氨酸，溶剂为去离子水。

提取和检测楠木木材基因组DNA的方法包括以下步骤：

1.称取木材100mg，加入液氮，在研钵中研磨成粉末，立即转移至2ml离心管中。

2.加入900μl 65℃预热的试剂1和20μl Proteinase K，盖上管盖并封严管口，涡旋振荡30s，混合均匀，65℃水浴2h。

3.冷却至室温，加入125μl试剂2，涡旋1min后冰浴10min。

4.12,000×g离心10min，取上清液700μl至新的2ml离心管中，加入20μl试剂3和2μl Carrier RNA，混合均匀后加入360μl的异丙醇，涡旋混匀30s。

5.将DNA制备管置于新的2ml离心管中，取600μl步骤4中的混合液并转移至制备管中，12,000×g离心1min，弃滤液。

6.将制备管置回到原来的2ml离心管中，将步骤4中剩余的混合液转移至制备管中，12,000×g离心1min，弃滤液。

7.将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700μl去蛋白洗涤液，12,000×g离心1min，弃滤液。

8.将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700μl去盐洗涤液，12，000×g离心1min，弃滤液。

9.重复步骤8。

10.将制备管置回到原来的2ml离心管中，12,000×g离心1min。

11.将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加100μl去离子水，室温静置10min，12,000×g离心1min洗脱DNA，获得基因组DNA。

将提取的DNA进行qPCR检测。其中扩增条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。本实施例所述qPCR扩增是在ABI公司的ABI 7500 Real Time PCR System完成。也可以在其他的扩增仪器上完成。所述qPCR检测的反应体系为：20μl的体系包括：

其中引物和探针为：

Primer UP：5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’

Primer Down：5’-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3’

Prober：5’-GCAATCCTGAGCCAAATCC-3’

阳性对照为水稻基因组。

根据qPCR检测原则，当提取的DNA进行qPCR检测时，检测Ct值小于35个循环，则表明已成功提取基因组DNA。如图1所示本实施例的Ct值为22.83，这表明利用本发明所述DNA提取试剂和提取方法能够成功提取0.1g楠木木质部中的基因组DNA。

实施例2不同提取方法在提取基因组DNA效果上的对比实验

称取干燥的楠木木材粉末分别利用本发明所述试剂组分和方法建立三个实验组，分别为实验组1、实验组2和实验组3。并以改良的CTAB法、PTB法、高盐低pH法和Qiagen试剂盒法提取木材DNA为对照组，依据实验组和对照组各自的方法提取DNA后分别进行qPCR检测。其中：

实验组1的试剂和方法参见实施例1；

实验组2的试剂组分和方法同实施例1，试剂中各组分的浓度不同于实施例1。其中试剂中的试剂1包括：0.1％的十六烷基三甲基溴化铵，15mM的Tris，20mM的EDTA，0.2％的PVP，0.2M的NaCl，溶剂为双蒸去离子水。试剂2包括：0.5M的盐酸胍，5％的乙醇，0.1M的柠檬酸钠，溶剂为双蒸去离子水。试剂3包括：0.5M的盐酸胍，0.01M的甘氨酸，溶剂为双蒸去离子水。

实验组3的试剂组分和方法同实施例1，试剂中各组分的浓度不同于实施例1。其中试剂中的试剂1包括：4.5％的十六烷基三甲基溴化铵，180mM的Tris，200mM的EDTA，8％的PVP，4.5M的NaCl，溶剂为双蒸去离子水。试剂2包括：6M的盐酸胍，45％的乙醇，1.5M的柠檬酸钠，溶剂为双蒸去离子水。试剂3包括：6M的盐酸胍，0.15M的甘氨酸，溶剂为双蒸去离子水。

改良的CTAB法参见：王关林、方洪筠。植物基因工程(第二版)，北京科学出版社，2002.744。

PTB法所用试剂和步骤为：PTB法主要试剂包括：PTB(溴化N-苯乙酰胺)、EDTA、蛋白酶K、酚氯仿、氯仿异戊醇、无水乙醇、醋酸铵、TE。PTB法操作步骤包括：(1)用EDTA浸泡木材粉末48h使木材脱矿。(2)脱矿结束后，加蛋白酶K和PTB溶液在65度水浴12h。(3)水浴结束后加酚氯仿抽提一次。(4)离心后取上清，加氯仿异戊醇抽提一次。(5)重复步骤4。(6)加入无水乙醇及醋酸铵，在-20度冰箱中存储12h沉淀DNA。(7)离心得DNA沉淀用80％乙醇洗涤2次并在80％乙醇中静置过夜。(8)离心得干净的DNA沉淀，干燥后用TE溶液溶解DNA。

高盐低pH法所用试剂和步骤如下：高盐低pH法主要试剂包括：CTAB、5M NaCl、EDTA、Tris、35％乙醇、70％乙醇、无水乙醇及TE。高盐低pH法操作步骤包括：(1)在木材粉末中加CTAB提取液，混匀后65度水浴2h。(2)在水浴结束后加35％乙醇混匀后离心。(3)取上清液，加酚氯仿抽提一次。(4)离心后取上清，加氯仿异戊醇抽提一次。(5)重复步骤4。(6)取上清液，加5M的NaCl和无水乙醇，混匀后沉淀DNA，离心收集DNA。(7)DNA沉淀用70％乙醇洗涤。(8)干燥后用TE溶解DNA。

Qiagen试剂盒法：试剂盒名称为DNeasy Plant Mini Kit以及需要使用DNeasyPlant Maxi Kit中的QIAshreder Maxi spin column。

表1：

检测结果如表1所示。从对比实验结果得出：利用本发明所述试剂和方法可以提取微量样本中的DNA，提取所用时间短，实验操作步骤简单容易掌握。且利用本发明所述试剂和方法只需要很少的木材用量，就可以提取出足够量的DNA用于后续的分子检测。

实施例3木材样品不同采样量的实验

以同一根干燥的楠木木材为材料，木材样本采样量分别为0.05g、0.1g、0.5g、1.0g和2.0g。采用实施例1所述试剂1、试剂2和试剂3，并采用磁珠提取法提取DNA。所述的磁珠提取法包括以下步骤：

1.称取相应量的木材粉末，加入液氮，在研钵中研磨成粉末，立即转移至2ml离心管中。

2.加入900μl 65℃预热的试剂1和20μl Proteinase K，盖上管盖，用封口膜封严管口，涡旋振荡30s，混合均匀，65℃水浴0.5h-过夜。

3.冷却至室温，加入125μl试剂2，涡旋1min后冰浴10min。

4.12,000×g离心10min，取上清液700μl至新的2ml离心管(提供)中，加入20μl磁珠、2μl Carrier RNA，涡旋混匀后加入900μl的异丙醇，涡旋混匀10min。

5.将2ml离心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸弃上清。

6.加700μl去蛋白洗涤液，涡旋洗涤1min。

7.将2ml离心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸弃上清。

8.加700μl去盐洗涤液，涡旋洗涤1min。

9.将2ml离心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸弃上清。

10.重复步骤8-9。

11.短暂离心后吸弃残余液体，通风橱干燥。

12.加50-100μl去离子水，用枪吹打混匀后涡旋洗脱5min，获得基因组DNA。

将提取的DNA进行qPCR检测，结果如图2所示。图2结果表明：随着样品量的增加，本方法提取的木质部基因组DNA的产量成线性增加，对应qPCR的Ct值成比例下降，样品上样量与结果对应性强。

实施例4不同水浴时间对提取效果的实验

提取方法中除了水浴时间不同于实施例1，其他按实施例1所述试剂和方法实施，本实施例所用水浴裂解时间分别为0.5h、1h、2h、4h、8h、16h和24h。

采用不同的裂解时间，所得qPCR结果如图3所示，结果表明：适当延长水浴时间，可有限度的提高基因组DNA的获得量。因此，在送检标本数量大的时候，可以采用较短的水浴时间，以加快检测速度。以便在半日或更短时间内完成送检样本的检测。而在取样的样本量少，或针对异常珍贵样本进行检测时，可以采用较长水浴时间，提高提取的产物得率，以便获得足够的基因组DNA供后续分子生物学检测。

实施例5加入试剂1后水浴与否，以及加入试剂2后冰浴与否的实验

在本实施例中，除了步骤2中加入试剂1后分别采用水浴与不水浴、步骤3中加入试剂2后采用冰浴与不冰浴，其他的提取试剂和方法按实施例1方法实施，完成对比实验。其中对照为加入试剂1后正常水浴过夜，加入试剂2后正常冰浴10min处理。测实验组1为加入试剂1后不水浴，常温放置处理，加入试剂2后正常冰浴10min处理。实验组2为加入试剂1后正常水浴过夜，加入试剂2不冰浴处理。

所得qPCR结果如图4所示，结果表明：加入试剂1，水浴处理是必要的，如果不水浴处理，首先试剂1就无法起到破碎细胞的作用，其次蛋白酶K就无法消化蛋白，最终核酸就无法释放出来，因此实验结果就显示没有数据，说明没有得到DNA。实验结果还表明：加入试剂2，冰浴处理是必须的。加入试剂2后冰浴的作用是在低温环境下让蛋白等杂质得到充分的沉淀以达到去除杂质的作用，如果不冰浴则试剂2的沉淀效果就大幅度减弱，杂质的去除就不完全，因此也影响到了DNA的得率。

实施例6加入Carrier RNA及试剂3的实验

在本实施例中，除了Carrier RNA及试剂3的添加方法不同实施例1，其他的均按实施例1的方法实施。分别测试在离心后取得的上清液中加入Carrier RNA及试剂3的效果。

所得qPCR结果如图5所示，其中，对照为上清液中不加Carrier RNA与试剂3。实验组1为在上清液中不加Carrier RNA，加试剂3。实验组2为在上清液中加Carrier RNA但是不加试剂3。实验组3为在上清液中同时加Carrier RNA与试剂3。结果表明，单独加入CarrierRNA或者试剂3，均不能起到促进DNA与硅胶膜的高效结合，只有同时加入Carrier RNA及试剂3，才能使硅胶膜高效结合更多的DNA。

实施例7利用本发明提取不同种类木材中的DNA

对15种不同的木材种类(见表2)进行提取测试，木材用量均为100mg。提取的试剂组分和方法同按实施例1，所用试剂1、试剂2和试剂3中个组分浓度见表3。其中提取阔叶黄檀、奥氏黄檀、微凹黄檀、巴里黄檀这些黄檀类木材的提取采用表3中黄檀这列中的试剂。大红酸枝、墨西哥酸枝、巴拿马红酸枝这些酸枝类木材的提取试剂采用表3中酸枝这列中的试剂。非洲花梨、缅甸花梨这些花梨类木材提取试剂采用表3中花梨这列中的试剂。非洲酸枝、缅甸酸枝这些酸枝类木材提取试剂采用表3中酸枝这列中的试剂。楠木、黄金檀、印尼菠萝格、大叶紫檀则分别采用表3中各自对应的试剂。提取所得DNA完成qPCR检测。

表2

样品编号	样品名称	样品编号	样品名称	样品编号	样品名称
						1#	楠木	6#	大叶紫檀	11#	巴拿马红酸枝
2#	阔叶黄檀	7#	微凹黄檀	12#	非洲花梨
						3#	黄金檀	8#	大红酸枝	13#	非洲酸枝
4#	奥氏黄檀	9#	巴里黄檀	14#	缅甸花梨
						5#	印尼菠萝格	10#	墨西哥酸枝	15#	缅甸酸枝

表3：

实验结果如图6，实验结果表明本发明所述方法和试剂可以提取不同种类木材的DNA。

实施例8经过不同处理方式得到的楠木木材基因的提取实验

以同一种木材原木为原料，并经过不同方式处理得到的加工木材作为本实施例的样本。按实施例1所述方法和试剂提取并进行qPCR。

对木材原木的不同加工方法包括分别利用25℃、65℃和105℃三种温度干燥木材所的样本；干燥木材，即经25℃室温干燥后的木材；潮湿木材即受潮木材；分别采用挤压、熏蒸或气干处理的木材样本。

实验结果如图7所示：本发明所述方法和试剂可以提取利用不同方法处理后的木材DNA。

实施例9木材不同部位的基因提取实验

以杉木木材为材料，分别取其边材与心材，边材1表示边材的最外围部分，边材2表示边材内部靠近心材的部分；心材1表示心材的外围，靠近边材的部分，心材2表示心材的最中心部分。边材：树木次生木质部的外围活层，位于树干的外围部分，细胞中水分较心材多，色浅，较软，无心材中常见深色沉积物质。心材：多年生的树木其近中心部分的木材，不含生活细胞，其贮藏物质已不存在或转化为心材物质，色深，材质较硬且致密，含水量少，无输导输液与贮藏营养物质的功能，主要对整株植物起支持作用。商业上心材通常指树心部分有显著材色者。

按实施例1所述方法和试剂提取并进行qPCR。

实验结果如图8所示：本发明所述方法和试剂可以提取利用木材不同部位的DNA。

实施例10不同生长年限木材的基因提取实验

以杉木木材为材料，根据砍伐的不同年限进行测试。所述杉木分别为现生木材、生长1年后砍伐的木材、生长2年后砍伐的木材、生长3年后砍伐的木材、生长5年后砍伐的木材、生长10年后砍伐的木材、生长10年以上砍伐的木材。按实施例1所述方法和试剂提取并进行qPCR。实验结果如图9所示：本发明所述方法和试剂可以提取利用木材不生长年限的基因组DNA。

实施例11木材不同组织部位的基因提取实验

按照实施例1所述方法和试剂，分别提取鹅掌楸木质部、海桐木质部、枫香树木质部、红叶石楠木质部、夹竹桃木质部和鹅掌楸韧皮部(树皮)的基因组DNA，qPCR扩增后，进行电泳检测。电泳结果如图10所示，泳道1为鹅掌楸木质部，泳道2为海桐木质部，泳道3为枫香树木质部，泳道4为红叶石楠木质部，泳道5为夹竹桃木质部和泳道6为鹅掌楸韧皮部(树皮)。结果显示，所提取的木材DNA其基因组主带清晰，由此可以判定，利用本发明所述试剂和方法提取木材基因组DNA的完整性非常好。

实施例12试剂选择性实验

按照实施例1所述的方法，分别利用表4-6中的选择方案1中和选择方案2中的试剂A组分、试剂B组分和试剂C组分，提取楠木、印尼菠萝格、大叶紫檀、墨西哥酸枝和非洲梨花中的基因组DNA，并完成qPCR测定。

表4：

试剂A	选择方案1	选择方案2
			十六烷基三甲基溴化铵	3.5％	3.5％
Tris	120mM	120mM
			EDTA	110mM	110mM
PVP	6％	6％
			NaCl	3M	3M
L-酪氨酸	0	0.2％(质量百分比)

表5：

试剂B	选择方案1	选择方案2
			盐酸胍	2.5M	2.5M
乙醇	25％	25％
			柠檬酸钠	0	0.8M

表6：

试剂C	选择方案1	选择方案2
			盐酸胍	1M	1M
甘氨酸	0	0.1M

从图11可以看出，选择方案1的试剂A-B已经能够满足本实验的测试需求，而选择方案2中的试剂A-B其效果更佳，尤其是在大叶紫檀样本的提取中，其Ct值提高了1.41。同样的，在实施例2实验组2的基础上，在试剂A中增加0.1％的L-酪氨酸，在试剂B中增加0.1M的柠檬酸钠，在试剂C中增加0.01M甘氨酸。在实施例2实验组3的基础上，在试剂A中增加0.5％的L-酪氨酸，在试剂B中增加2M的柠檬酸钠，在试剂C中增加0.2M甘氨酸。其Ct值也均优于利用实施例2中的实验组2和3的试剂提取DNA后进行qPCR的Ct值。

实施例13试剂1使用与否的对比

在本实施例中，除了试剂1的添加不同于实施例1外，其他的均按实施例1的方法实施。对比测试在加入试剂1与不加入试剂1的效果。

所得qPCR结果如图12所示，结果表明：加入试剂1是必须的，没有试剂1就无法对木材样本的细胞进行破碎裂解。因此实验结果就显示没有数据，说明没有得到DNA。

实施例14试剂2使用与否的对比

在本实施例中，除了试剂2的添加不同于实施例1外，其他的均按实施例1的方法实施。对比测试在加入试剂2与不加入试剂2的效果。

所得qPCR结果如图13所示，结果表明：加入试剂2能有效提高木材DNA的纯化效率。加入试剂2可以有效地对破碎样本中的非DNA杂质进行沉淀去除。

实施例15试剂3使用与否的对比

在本实施例中，除了试剂3的添加不同于实施例1外，其他的均按实施例1的方法实施。对比测试在加入试剂3与不加入试剂3的效果。

所得qPCR结果如图14所示，结果表明：加入试剂3能有效提高木材DNA与纯化效率。加入试剂3可以有效促进DNA与纯化载体的结合。

本发明所述基因组DNA试剂盒、试剂和提取方法还能成功提取蜂皇浆、昆虫、蚕等动物中基因组DNA。

以上这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。

Claims (8)

1.提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：

(1)采样；

(2)裂解样品细胞：加入65℃预热的试剂1和Proteinase K，涡旋振荡，混合均匀，65℃水浴0.5h-过夜；

(3)沉淀非DNA的杂质：将步骤2中的混合物冷却至室温，加入试剂2，混合均匀，冰浴；

(4)离心步骤3所得混合物，取上清，加入Carrier RNA和试剂3，混合均匀后加入异丙醇，混匀；

(5)将步骤4所得混合物中的DNA与纯化载体结合，经过洗涤液的去蛋白洗涤和去盐洗涤，以及洗脱液的洗脱步骤，获得可用于检测的样本基因组DNA；

其中，所述的试剂1包括以下组分：0.1％-5％的十六烷基三甲基溴化铵(质量百分比)、10mM-200mM的Tris、10mM-200mM EDTA、0.1％-10％的PVP(质量百分比)、0.1M-5M的NaCl、溶剂为去离子水；试剂2包括以下组分：0.1M-6.5M的盐酸胍、1％-50％的乙醇(体积百分比)、0.1M-2M的柠檬酸钠、溶剂为去离子水；试剂3包括以下组分：0.1M-8M的盐酸胍、0.05M-0.2M的甘氨酸、溶剂为去离子水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤4所述的纯化载体选自核酸提取纯化柱或磁珠。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中65℃水浴时间为0.5h-2h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3冰浴时间为10min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，试剂1的pH值为4.5-8.5，试剂2的pH值为3.3-7.5，试剂3的pH值为2.5-8.0。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的试剂1包括以下组分：3.5％的十六烷基三甲基溴化铵、120mM的Tris、110mM的EDTA、6％的PVP、3M的NaCl、溶剂为去离子水；试剂2包括以下组分：2.5M的盐酸胍、25％的乙醇、1M的柠檬酸钠、溶剂为去离子水；试剂3包括以下组分：4M的盐酸胍、0.1M的甘氨酸、溶剂为去离子水。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的洗涤液包括去蛋白洗涤液和去盐洗涤液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述去蛋白洗涤液包括1M-6M的盐酸胍，1mM-50mM的EDTA·2Na·2H₂O，溶剂为去离子水；所述去盐洗涤液包括20mM-200mM的NaAC·3H₂O，溶剂为去离子水；洗脱液为去离子水。