CN105754993B - 一种用于干木材的dna提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于干木材的DNA提取方法，通过低温研磨、加热、离心、沉淀吸附、溶解和PCR扩增等处理步骤，从干木材尤其是其心材组织中高效提取DNA。本发明不仅增加了从干木材尤其是其心材组织中提取的DNA数量，而且提高了所提取的DNA纯度，可直接应用于分子生物学研究，为木材物种的鉴定提供了新的方法。

Description

一种用于干木材的DNA提取方法
技术领域
本发明涉及木材的DNA提取方法，具体涉及本发明涉及一种从干木材中高效提取已降解DNA的方法。
背景技术
由于木材是树木的茎干部分，如不结合根、叶、花与果实进行识别，单纯依据木材及其解剖构造特征，一般只能识别到“属”或“类”，而无法实现木材“种”的识别，这也是世界范围内仍未解决的科学问题。
近年来，在木材物种识别技术发展前沿，DNA分子标记新技术得到了重点关注和发展，并开始逐步应用于木材树种的识别。经采伐、长期储存或加工后的木材中残留的DNA物质为木材的分子标记识别提供了可能，因此，从木材组织中成功提取DNA，是实现分子标记技术成功用于木材识别的重要前提。
新鲜植物DNA提取一般包括植物细胞裂解、多糖多酚等次生代谢物的去除、蛋白变性及核酸沉淀等常规步骤。然而，采用常规的植物DNA提取方法却难以从干木材尤其是其心材中获得较高产量和纯度的DNA，直接阻碍了分子标记技术在木材识别领域的应用。
影响DNA有效提取的主要因素包括：1)物理因素。木材是一种较坚硬的植物组织，为了使木材组织中的木纤维、导管及薄壁细胞等细胞破裂，通常采用钻、切片和研磨等机械加工方法。但这些操作产生的热量，会使试样的DNA片段发生降解；2)化学成分。木材中含有的某些化合物，如酚类化合物等，干扰DNA的提取质量，进而影响DNA目的片段的PCR扩增；3)生物因素。附着在木材上的真菌及微生物会分解木材，进而使木材DNA发生降解；同时，长期储存的木材表面，亦会被外界微生物的DNA所污染；4)存储时间。树木被采伐以后，随着植物细胞的死亡，DNA会慢慢降解。木材存储时间愈长，DNA降解愈严重；5)加工程度。当木材组织处于新鲜状态时，提取DNA较容易。但木材经过高温干燥等处理后，DNA降解很严重，影响DNA的提取与分析。
总体来说，现有技术仍无法完全解决木材组织中DNA的有效提取。针对干木材，开发与形成高效的DNA提取方法是木材识别技术的研究热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从干木材中提取DNA的方法，有效去除木材组织中抑制DNA提取的干扰成分，并实现小片段、低含量木材DNA的高效富集，为实现分子标记技术成功用于木材识别奠定重要基础。
为了解决上述问题，本发明公开了一种用于干木材的DNA提取方法：利用DNA裂解液处理研磨的木粉，并通过加热、离心、沉淀吸附、溶解和PCR扩增有效提取DNA。
一种用于干木材的DNA提取方法：包括以下步骤：
(1)将干木材样品研磨处理成木粉，将研磨好的木粉装入离心管中；
(2)向步骤(1)得到的装有木粉的离心管中加入DNA裂解液，涡旋振荡混匀后水浴加热，将离心管冷却，再加入除杂缓冲液，混匀后离心；
(3)将步骤(2)得到的上清液转移至新离心管中，向新离心管中加入DNA沉淀缓冲液，用移液器混匀后离心；
(4)将步骤(3)中得到的上清液弃掉，向离心管中加入清洗缓冲液，离心清洗；
(5)向步骤(4)得到的沉淀有DNA的离心管中加入双蒸水(ddH2O)，静置溶解，即可得到DNA提取液；
(6)将步骤(5)得到的DNA作为模板，加入到反应体系中进行PCR扩增反应，得到DNA目的片段。
上述的DNA提取方法，还可以包括以下步骤：
(1)将干木材样品外表面去除，将剩余样品研磨处理成木粉，研磨好后装入离心管中；
(2)向步骤(1)得到的装有木粉的离心管中加入DNA裂解液，涡旋振荡混匀后水浴加热，将离心管冷却，再按照体积比加入0.5-1.0倍体积的除杂缓冲液，混匀后离心，离心速率为5000-16000rpm，离心时间为5-15min；
(3)将步骤(2)得到的上清液转移至新离心管中，向新离心管中按照体积比加入1.5倍的DNA沉淀缓冲液，混匀，低温静置后离心，离心速率为5000-16000rpm，离心时间为1-15min；
(4)将步骤(3)中得到的上清液弃掉，向离心管中加入清洗缓冲液，离心清洗，离心速率为5000-16000rpm，离心时间为1-15min；
(5)向步骤(4)得到的沉淀有DNA的离心管中加入ddH2O，4℃环境下静置溶解，即可得到DNA提取液；
(6)将步骤(5)得到的DNA作为模板，加入到50μl反应体系中进行PCR扩增反应，得到DNA目的片段。
优选地，所述步骤(1)中的干木材包括但不限于气干木材、干燥窑处理木材、木材标本、考古木材、长期存储木材的边材、心材。
优选的，所述步骤(1)中在研磨木粉前，干木材需经过无菌化处理，并在超净工作环境中进行研磨；采用-20℃及以下的低温研磨处理，包括但不限于机械研磨/石英研磨/盘磨；研磨好的木粉过200目及以上筛后再装入离心管。
优选地，所述步骤(2)中的DNA裂解液为：3％(w/v)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、0.1M的PTB(N-phenacylthiazolium bromide)、6M的GuSCN、10mg/ml的蛋白酶K和1mg/ml的PVP，体积比为25:10-15:1-8:1-8:1-5，所加入的DNA裂解液与木粉的比例为5-15μl/mg。
优选的，所述步骤(2)中DNA裂解液水浴温度为50-65℃，加热期间翻转离心管数次，反应时间为300-720min；步骤(2)中除杂缓冲液成分为氯仿和异戊醇，体积比为24:1。
优选的，所述步骤(3)中的DNA沉淀缓冲液包括异丙醇、醋酸钠和沉淀助剂Glycogen，体积比为500-800:100-300:1-5；步骤(3)中的DNA沉淀缓冲液成分醋酸钠浓度为1-5M，pH为3-6；步骤(3)中沉淀DNA应置于-20℃低温环境300min-720min。
优选的，所述步骤(4)中清洗缓冲液成分为75％酒精；需离心清洗两次；步骤(5)中加入ddH2O 10-100μl。
优选的，所述步骤(6)中的PCR扩增反应体系包括：0.5-3U DNA聚合酶、1.0-2.0mMMgCl2、200μM单一dNTP、0.1-5.0μM单一引物、pH7.0-8.0的0.1-1.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和10-1000ng模板DNA；步骤(6)中的PCR扩增反应体系中DNA聚合酶应选择缺少3’-5’外切酶活性的聚合酶；PCR扩增反应程序为94-96℃预变性0.5-10min；94-96℃变性0.5-2min，40-65℃退火0.5-2min，72℃延伸0.5-2min，循环20-50次；72℃终延伸2-15min。
本发明具有如下优点：
1、本发明适用范围广，可以对气干木材、干燥窑处理木材、木材标本、考古木材、其他长期存储木材的边材、心材进行DNA高效提取；
2、本发明DNA提取操作均在无菌超净环境中进行，可以有效避免外源污染；
3、本发明采用低温冷冻研磨木粉，避免因常规机械研磨产生高温导致DNA进一步发生降解；
4、本发明研磨的木粉均在200目以上，显著提高木材DNA的裂解效率；
5、本发明通过向常规DNA裂解液(CTAB)中添加一定优化比例的PTB、PVP、蛋白酶K和GuSCN等化学成分，能够有效切断还原性糖和蛋白质之间的交联键，释放出被多糖衍生物包裹的DNA，同时可以除去酚类、蛋白等杂质，提高木材DNA提取产量和纯度；
6、本发明通过增大DNA裂解液体积与木粉量比例，使木粉溶解完全；
7、本发明通过延长DNA裂解时间，使DNA裂解液与木材细胞充分接触，DNA得到充分释放，可显著提高DNA得率；
8、本发明通过添加一定比例的DNA沉淀助剂Glycogen和适当延长DNA沉淀时间，实现DNA有效富集；
9、与常规植物DNA提取方法比较，采用改进的DNA提取方法进行干木材DNA提取，DNA得率可提高40％以上；
10、本发明通过向PCR反应体系中加入一定浓度的牛血清白蛋白(BSA)，能够有效提高低含量木材DNA的PCR扩增效率；
11、本发明PCR反应体系中DNA聚合酶选择缺少3’-5’校对功能的聚合酶，有助于提高木材DNA的扩增效率；
12、本发明将为DNA分子标记技术成功用于木材识别奠定关键技术基础。
附图说明
图1本发明方法与常规方法提取干木材DNA产量比较；
图2牛血清白蛋白(BSA)对干木材DNA的PCR扩增效率的影响图注：M-500bp DNAmarker；1-PCR扩增产物(添加BSA)；2-PCR扩增产物(未添加BSA)。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的发明范围。该技术领域的技术工程师可根据上述发明的内容作出一些非本质性的改进和调整。
实施例1：一种用于干木材的DNA提取方法
(1)选取干燥木材试样，利用70％酒精消毒后的解剖刀片将木材试样外表面切除，以避免外源污染；将木材试样切成10mm(L)×3mm(R)×3mm(T)大小的若干木条，并置于低温冷冻研磨仪中低温预冷3min，研磨3min，运行频率10cps；研磨结束后，过200目筛网，将细木粉分装到若干2ml的微量离心管中，每管木粉量100mg，并置于-80℃低温冰箱保存备用；
(2)在消毒处理的超净工作环境中，向装有木粉的离心管中分别加入1000μl DNA裂解液(包括3％(w/v)CTAB、0.1M PTB、6M GuSCN、10mg/ml蛋白酶K和1mg/ml PVP，体积比为25:12:5:5:3)，涡旋振荡混匀；55℃水浴480min，期间翻转离心管数次；冷却2min，向离心管加入500μl除杂缓冲液氯仿:异戊醇(体积比24:1)，混匀后14000rpm离心5min；
(3)将步骤(2)得到的上清液轻转移至另一新离心管中，向每管离心管中加入1.5倍体积的DNA沉淀缓冲液(包括异丙醇、醋酸钠(3M,pH5.2)和沉淀助剂Glycogen，体积比为300:149:1)，并用移液器混匀，置于-20℃低温环境720min，14000rpm离心15min；
(4)将步骤(3)中得到的上清液弃掉，向离心管中加入400μl清洗缓冲液75％酒精，离心清洗，离心速率为10000rpm，离心时间为10min；重复清洗1次；
(5)向步骤(4)得到的沉淀有DNA的离心管中加入30μl ddH2O，4℃环境下静置溶解，即可得到DNA提取液；
(6)以步骤(5)得到的黄檀属木材DNA提取物为模板进行PCR扩增，反应体系为50μl：其中Premix Ex Taq 25μl(包括l.25U Ex Taq DNA聚合酶，2mM MgCl2，200μM单一dNTP)，0.4μM单一引物，pH 7.2的1.0mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和约20ng模板DNA。所有PCR反应均在PCR扩增仪上进行。反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，49℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次；72℃终延伸10min，即可获得高效扩增的DNA目的片段。
实施例2：一种用于干木材的DNA提取方法
(1)将木材标本样品研磨处理成木粉，将研磨好的木粉装入离心管中；
(2)向步骤(1)得到的装有木粉的离心管中加入DNA裂解液(包括3％(w/v)CTAB、0.1M PTB、6M GuSCN、10mg/ml蛋白酶K和1mg/ml PVP，体积比为25:12:5:5:3)，涡旋振荡混匀后水浴加热，将离心管冷却，再按照体积比加入0.5倍体积的除杂缓冲液，混匀后离心，离心速率为12000rpm，离心时间为10min；
(3)将步骤(2)得到的上清液转移至新离心管中，向新离心管中按照体积比加入1.5倍的DNA沉淀缓冲液，混匀，低温静置后离心，离心速率为12000rpm，离心时间为10min；
(4)将步骤(3)中得到的上清液弃掉，向离心管中加入清洗缓冲液，离心清洗，离心速率为8000rpm，离心时间为5min；
(5)向步骤(4)得到的沉淀有DNA的离心管中加入ddH2O，4℃环境下静置溶解，即可得到DNA提取液；
(6)将步骤(5)得到的DNA作为模板，加入到50μl反应体系中进行PCR扩增反应，得到DNA目的片段。
实施例3：一种用于考古木材的DNA提取方法
(1)将考古木材样品研磨处理成木粉，将研磨好的木粉装入离心管中；在研磨木粉前，干木材需经过无菌化处理，并在超净工作环境中进行研磨；采用-20℃及以下的低温球研磨处理，包括但不限于机械研磨/石英研磨/盘磨；研磨好的木粉过200目及以上筛后再装入离心管；
(2)向步骤(1)得到的装有木粉的离心管中加入DNA裂解液，涡旋振荡混匀后水浴加热，将离心管冷却，再按照体积比加入0.5倍体积的除杂缓冲液，混匀后离心，离心速率为14000rpm，离心时间为10min；DNA裂解液为：3％(w/v)CTAB、0.1M的PTB、6M的GuSCN、10mg/ml的蛋白酶K和1mg/ml的PVP，体积比为25:12:5:5:3，所加入的DNA裂解液与木粉的比例为10μl/mg。DNA裂解液水浴温度为55℃，加热期间翻转离心管数次，反应时间为480min；步骤(2)中除杂缓冲液成分为氯仿和异戊醇，体积比为24:1；
(3)将步骤(2)得到的上清液转移至新离心管中，向新离心管中按照体积比加入1.5倍的DNA沉淀缓冲液，混匀，低温静置后离心，离心速率为14000rpm，离心时间为10min；DNA沉淀缓冲液包括异丙醇、醋酸钠和沉淀助剂Glycogen，体积比为500-800:100-300:1-5；步骤(3)中的DNA沉淀缓冲液成分醋酸钠浓度为3M，pH为5.2；步骤(3)中沉淀DNA应置于-20℃低温环境600min；
(4)将步骤(3)中得到的上清液弃掉，向离心管中加入清洗缓冲液，离心清洗，离心速率为8000rpm，离心时间为5min；离心清洗两次；
(5)向步骤(4)得到的沉淀有DNA的离心管中加入ddH2O，4℃环境下静置溶解，即可得到DNA提取液；
(6)将步骤(5)得到的DNA作为模板，加入到50μl反应体系中进行PCR扩增反应，得到DNA目的片段。PCR扩增反应体系包括：0.5-3U DNA聚合酶、1.0-2.0mM MgCl2、200μM单一dNTP、0.1-5.0μM单一引物、pH7.0-8.0的0.1-1.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和10-1000ng模板DNA；步骤(6)中的PCR扩增反应体系中DNA聚合酶应选择缺少3’-5’外切酶活性的聚合酶；PCR扩增反应程序为94-96℃预变性0.5-10min；94-96℃变性0.5-2min，40-65℃退火0.5-2min，72℃延伸0.5-2min，循环20-50次；72℃终延伸2-15min。
实施例4：一种用于干木材的DNA提取方法，包括以下步骤：
(1)将干木材样品研磨处理成木粉，将研磨好的木粉装入离心管中；
(2)向步骤(1)得到的装有木粉的离心管中加入DNA裂解液，涡旋振荡混匀后水浴加热，将离心管冷却，再加入除杂缓冲液，混匀后离心；所述的DNA裂解液为：3％(w/v)CTAB、0.1M的PTB(N-phenacylthiazolium bromide)、6M的GuSCN、10mg/ml的蛋白酶K和1mg/ml的PVP，体积比为25:10:1:1:5，所加入的DNA裂解液与木粉的比例为5-15μl/mg；
(3)将步骤(2)得到的上清液转移至新离心管中，向新离心管中加入DNA沉淀缓冲液，用移液器混匀后离心；
(4)将步骤(3)中得到的上清液弃掉，向离心管中加入清洗缓冲液，离心清洗；
(5)向步骤(4)得到的沉淀有DNA的离心管中加入双蒸水(ddH2O)，静置溶解，即可得到DNA提取液；
(6)将步骤(5)得到的DNA作为模板，加入到反应体系中进行PCR扩增反应，得到DNA目的片段。
实施例5：一种用于考古木材的DNA提取方法，包括以下步骤：
(1)将干木材样品外表面去除，将剩余样品研磨处理成木粉，研磨好后装入离心管中；
(2)向步骤(1)得到的装有木粉的离心管中加入DNA裂解液，涡旋振荡混匀后水浴加热，将离心管冷却，再按照体积比加入0.5-1.0倍体积的除杂缓冲液，混匀后离心，离心速率为5000-16000rpm，离心时间为5-15min；所述的DNA裂解液为：3％(w/v)CTAB、0.1M的PTB(N-phenacylthiazolium bromide)、6M的GuSCN、10mg/ml的蛋白酶K和1mg/ml的PVP，体积比为25:15:8:5:5，所加入的DNA裂解液与木粉的比例为5-15μl/mg；
(3)将步骤(2)得到的上清液转移至新离心管中，向新离心管中按照体积比加入1.5倍的DNA沉淀缓冲液，混匀，低温静置后离心，离心速率为5000-16000rpm，离心时间为1-15min；
(4)将步骤(3)中得到的上清液弃掉，向离心管中加入清洗缓冲液，离心清洗，离心速率为5000-16000rpm，离心时间为1-15min；
(5)向步骤(4)得到的沉淀有DNA的离心管中加入ddH2O，4℃环境下静置溶解，即可得到DNA提取液；
(6)将步骤(5)得到的DNA作为模板，加入到50μl反应体系中进行PCR扩增反应，得到DNA目的片段。

Claims (9)

1.一种用于干木材的DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将干木材样品研磨处理成木粉，研磨好的木粉过200目筛后再装入离心管；
(2)向步骤(1)得到的装有木粉的离心管中加入DNA裂解液，涡旋振荡混匀后水浴加热，将离心管冷却，再加入除杂缓冲液，混匀后离心；所述的DNA裂解液为：3％w/v CTAB、0.1M的PTB(N-phenacylthiazolium bromide)、6M的GuSCN、10mg/ml的蛋白酶K和1mg/ml的PVP，体积比为25:10-15:1-8:1-8:1-5，所加入的DNA裂解液与木粉的比例为5-15μl/mg；
(3)将步骤(2)得到的上清液转移至新离心管中，向新离心管中加入DNA沉淀缓冲液，用移液器混匀后离心；
(4)将步骤(3)中得到的上清液弃掉，向离心管中加入清洗缓冲液，离心清洗；
(5)向步骤(4)得到的沉淀有DNA的离心管中加入双蒸水，静置溶解，即可得到DNA提取液；
(6)将步骤(5)得到的DNA作为模板，加入到反应体系中进行PCR扩增反应，得到DNA目的片段。
2.如权利要求1所述的DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将干木材样品外表面去除，将剩余样品研磨处理成木粉，研磨好后装入离心管中；
(2)向步骤(1)得到的装有木粉的离心管中加入DNA裂解液，涡旋振荡混匀后水浴加热，将离心管冷却，再按照体积比加入0.5-1.0倍体积的除杂缓冲液，混匀后离心，离心速率为5000-16000rpm，离心时间为5-15min；
(3)将步骤(2)得到的上清液转移至新离心管中，向新离心管中按照体积比加入1.5倍的DNA沉淀缓冲液，混匀，低温静置后离心，离心速率为5000-16000rpm，离心时间为1-15min；
(4)将步骤(3)中得到的上清液弃掉，向离心管中加入清洗缓冲液，离心清洗，离心速率为5000-16000rpm，离心时间为1-15min；
(5)向步骤(4)得到的沉淀有DNA的离心管中加入ddH2O，4℃环境下静置溶解，即可得到DNA提取液；
(6)将步骤(5)得到的DNA作为模板，加入到50μl反应体系中进行PCR扩增反应，得到DNA目的片段。
3.根据权利要求1-2任一所述的提取方法，其特征在于：所述的干木材包括但不限于气干木材、干燥窑处理木材、木材标本、考古木材、长期存储木材的边材、心材。
4.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于步骤(1)中在研磨木粉前，干木材需经过无菌化处理，并在超净工作环境中进行研磨；采用-20℃及以下的低温研磨处理，包括但不限于机械研磨/石英研磨/盘磨。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：DNA裂解液为：3％w/v CTAB、0.1M的PTB(N-phenacylthiazolium bromide)、6M的GuSCN、10mg/ml的蛋白酶K和1mg/ml的PVP，体积比为25:12:5:5:3，所加入的DNA裂解液与木粉的比例为5-15μl/mg。
6.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于步骤(2)中DNA裂解液水浴温度为50-65℃，加热期间翻转离心管数次，反应时间为300-720min；步骤(2)中除杂缓冲液成分为氯仿和异戊醇，体积比为24:1。
7.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于步骤(3)中的DNA沉淀缓冲液包括异丙醇、醋酸钠和沉淀助剂Glycogen，体积比为500-800:100-300:1-5；步骤(3)中的DNA沉淀缓冲液成分醋酸钠浓度为1-5M，pH为3-6；步骤(3)中沉淀DNA应置于-20℃低温环境300min-720min。
8.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于步骤(4)中清洗缓冲液成分为75％酒精；需离心清洗两次；步骤(5)中加入ddH2O 10-100μl。
9.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于步骤(6)中的PCR扩增反应体系包括：0.5-3U DNA聚合酶、1.0-2.0mM MgCl2、200μM单一dNTP、0.1-5.0μM单一引物、pH7.0-8.0的0.1-1.5mg/ml牛血清白蛋白和10-1000ng模板DNA；步骤(6)中的PCR扩增反应体系中DNA聚合酶应选择缺少3’-5’外切酶活性的聚合酶；PCR扩增反应程序为94-96℃预变性0.5-10min；94-96℃变性0.5-2min，40-65℃退火0.5-2min，72℃延伸0.5-2min，循环20-50次；72℃终延伸2-15min。
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