CN102776175A - 一种有效快速提取海洋微藻rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种有效快速提取海洋微藻RNA的方法，其步骤如下：将液氮研磨后的微藻样品加入到温度为60-65℃的十六烷基三甲基溴化铵和β-巯基乙醇的混合提取液中，再在60-65℃加热；加热结束后再加入氯仿、异戊醇混合液，混合后离心；取上清液后再次加入氯仿、异戊醇混合液；混合后离心；取上清液后加入LiCl，混均后放入-80℃条件下沉淀，再离心去除上清液，将沉淀用75%的乙醇洗涤1-2次，待乙醇挥发完全后加入DEPC水溶解完成提取；其中β-巯基乙醇是在使用的时候才与十六烷基三甲基溴化铵混合制成混合提取液。本发明克服了海洋微藻含盐量高和所含糖类物质较多对提取植物RNA的影响，较市场上的植物RNA提取试剂盒提取效果更好，不出现杂带，操作步骤简便、快速、效果好。
Description
技术领域
本发明属于微藻开发利用技术领域，特别是涉及一种有效快速的提取海洋微藻RNA的方法。
背景技术
海洋微藻是水体生态系统中主要的初级生产者，占海洋生物物种的40.86%，有体积小、数量大、细胞结构简单、生长周期短、生物量大、光合效率高、适应力强、不受气候限制、易培养等优点，因此受到了人们的广泛关注。微藻中所含有的微藻油脂、多糖、色素等在水产养殖饵料、能源、医药、保健品、化工和环保等方面具有重要经济价值，因此开发和利用海洋微藻具有重要的意义。而且，微藻中含有大量与有效活性成分相关的基因，因此提取其RNA，再反转录成cDNA进行PCR扩增目的基因的方法对于研究相关基因提供了有效途径。但由于海洋微藻含盐量高和糖类物质较多等特点，采用提取动物RNA和陆生植物RNA的试剂盒效果不够理想。因此，开发出一种快速高效提取海洋微藻RNA的新方法是十分必要的。
目前市场上还没有专门针对海洋微藻的RNA提取试剂盒，而采用已有的植物RNA提取试剂盒的提取效果并不好。原因可能是由于海洋微藻含盐量高和所含糖类物质较多，从而影响其RNA的提取效果。且现有的方法大都操作步骤繁琐、需要时间较长、价格较高，而且电泳结果中有杂带。因此，有必要提供一种简便、快速、经济并且效果好的提取海洋微藻RNA的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效快速提取海洋微藻RNA的方法，使提取微藻RNA步骤简便、快速、经济实用，能满足现有技术的上述需求。
本发明的提取海洋微藻RNA的方法，其步骤如下：将液氮研磨后的微藻样品加入到温度为60-65℃的十六烷基三甲基溴化铵和β-巯基乙醇的混合提取液中，再在60-65℃加热；加热结束后再加入氯仿、异戊醇混合液，混合后离心；取上清液后再次加入氯仿、异戊醇混合液；混合后离心；取上清液后加入LiCl，混均后放入-80℃条件下沉淀，再离心去除上清液，将沉淀用75%的乙醇洗涤1-2次，待乙醇挥发完全后加入DEPC水溶解完成提取；其中β-巯基乙醇是在使用的时候才与十六烷基三甲基溴化铵混合制成混合提取液。
上述混合提取液中十六烷基三甲基溴化铵和β-巯基乙醇体积比为60：1。
上述的氯仿、异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
本发明克服了海洋微藻含盐量高和所含糖类物质较多对提取植物RNA的影响，较市场上的植物RNA提取试剂盒提取效果更好，不出现杂带，操作步骤简便、快速、效果好。
具体实施方式
下面对本发明快速高效的提取海洋微藻RNA的方法做进一步说明。
首先所有试剂瓶均需进行DEPC与超纯水的混合溶液进行灭菌，两者的体积比为1：1000，灭菌条件为37℃摇床中灭菌24h，目的是去除环境中的RNA酶，防止提取的目的RNA被降解；其次在1.5ml离心管中加入600μl十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和10μl β-巯基乙醇，β-巯基乙醇必须现用现加，原因是β-巯基乙醇是一种还原剂，可降低氧对细胞产生的氧化损伤，若提前加入则没有还原作用，在60-65℃的水浴锅中进行预热。与此同时将离心好的新鲜藻体放入液氮中，待藻体可以固体状态取出后，倒出研磨，研磨过程保持一直有液氮，研磨过程防止迸溅而造成样品损失。将研磨后的微藻样品放入预热好的离心管中，加热10min，每隔2min摇匀1次；再加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），涡旋混合后，在4℃条件下进行离心（12000rpm，10min）；取上清液再次加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），涡旋混合后，在4℃条件下进行离心（12000rpm，10min）；取上清液放入新的离心管中，加入10mol/L的LiCl，使其终浓度为2mol/L；放入-80℃条件下沉淀1h，在4℃条件下进行离心（12000rpm，30min），去除上清液，用75%的乙醇洗涤2次，带其挥发完全后加入30μlDEPC水溶解10-20min；测定其纯度，准备进行反转录。整个过程样品应始终在碎冰中，操作者带口罩和手套，防止RNA降解。
实施例1
首先在1.5ml离心管中用移液枪加入600μl十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和10μl β-巯基乙醇，在60-65℃的水浴锅中进行预热；其次离心0.5g新鲜藻体（球等鞭金藻、绿色巴夫藻、小球藻、杜氏盐藻以及三角褐指藻）放入液氮中，待藻体可以固体状态取出后，倒出研磨，将研磨后的微藻样品放入预热好的离心管中，加热10min；用移液枪再加入610μl的氯仿/异戊醇（24:1），涡旋混合后，在4℃条件下进行离心（12000rpm，10min）；取上清液500μl再次加入500μl的氯仿/异戊醇（24:1），涡旋混合后，在4℃条件下进行离心（12000rpm，10min）；取上清液400μl放入新的离心管中，加入100μl的10mol/L的LiCl，使其终浓度为2mol/L；放入-80℃条件下沉淀1h，在4℃条件下进行离心（12000rpm，30min），去除上清液，用75%的乙醇洗涤2次，带其挥发完全后加入30μlDEPC水溶解10-20min，完成RNA的提取。
采用NanoDrop 2000紫外-可见分光光度计测定提取的RNA纯度和浓度，RNA纯度为1.868，浓度为1070ng/μl。
一般RNA纯度均保持在1.8-2.0的有效区间范围内。若实验开始未在水浴锅中进行加热，其纯度往往偏高在2.1左右并且RNA的浓度与加热后相比较而言要降低50%以上。
Claims (3)
1.一种有效快速提取海洋微藻RNA的方法，其步骤如下：将液氮研磨后的微藻样品加入到温度为60-65℃的十六烷基三甲基溴化铵和β-巯基乙醇的混合提取液中，再在60-65℃加热；加热结束后再加入氯仿、异戊醇混合液，混合后离心；取上清液后再次加入氯仿、异戊醇混合液；混合后离心；取上清液后加入LiCl，混均后放入-80℃条件下沉淀，再离心去除上清液，将沉淀用75%的乙醇洗涤1-2次，待乙醇挥发完全后加入DEPC水溶解完成提取；其中β-巯基乙醇是在使用的时候才与十六烷基三甲基溴化铵混合制成混合提取液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的混合提取液中十六烷基三甲基溴化铵和β-巯基乙醇的体积比为60：1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的氯仿、异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
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2012
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