CN107904233A - 一种用于动物组织总rna提取的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取动物组织总RNA的方法。本发明适用于任何畜禽品种，其提取效率高效、方便快捷、减少去RNA酶离心管和移液枪头的使用量，有效降低经济成本，也减少了实验耗材的去RNA酶的处理步骤，尤其对于实验环境条件较差或实验新手而言尤为有用。

Description

一种用于动物组织总RNA提取的方法

技术领域

本发明涉及生命科学技术和自然科学技术领域，尤其是一种用于动物组织总RNA提取的方法。

背景技术

随着现代分子生物学技术的飞速发展，对于RNA的研究已成为目前的研究热点之一，但是由于RNA与DNA分子不一样，它一般为单链结构，不形成双螺旋结构，因此它的稳定性较差，极易发生降解现象，直接影响后续实验结果。

目前，虽然市场上有众多的总RNA提取试剂(试剂盒)，且根据说明书描述均能获得很好的效果，但是在实际操作过程中，由于受到实验操作环境、实验室条件和实验操作手法等诸多因素的影响，往往很难获得理想效果，特别对于实验新手来说更是一个极大的难题。为了获得高质量的总RNA就需要大量的重复实验或者委托第三方进行提取；此外，通常情况下RNA的提取工作都需要在严格的无菌、无酶环境中进行，所用到的实验耗材也需要进行无RNA酶处理，这无形中也就增加了实验成本，因此，寻找一种高效、经济的总RNA提取方法显得尤为必要。

发明内容

本发明的目的是：提供一种用于动物(畜禽)组织总RNA提取的方法，它操作简单，无需纯化也能获得较好结果，所得总RNA根据后续实验要求可直接用于分子试验，显著降低了总RNA提取成本。

本发明是这样实现的：一种用于动物(畜禽)组织总RNA提取的方法，包括如下步骤：

1)样品采集：在干净的环境中采集动物组织，控制动物组织在空气中的暴露时间在1-2min以内，将所采集的组织样品装入离心管中，迅速将装有组织样品的离心管投入液氮中速冻，以减少总RNA的降解和降低细胞内酶的活性；样品在-80℃下保存；

2)打开超净工作台，用酒精对超净工作台进行消毒，将灭菌后的研钵、剪刀、镊子，试剂，普通灭菌离心管、无RNA酶或普通灭菌移液枪头、微量移液枪及乳胶手套一起放入超净工作台，关闭日光灯，打开紫外灯，照射30min，通风10min；

3)分别取30-50mg冷冻保存组织于研钵中，加入液氮将组织充分研磨至粉末，每个样品研磨时间不超过4min，研磨过程中必须保持有液氮；

4)将研磨好的样品加入已装有1mL Trizol试剂的离心管中，在2000-2800r/min振荡混匀，冰上放置5-10min，使得核酸与蛋白完全分离；

5)加入0.22mL氯仿，漩涡振荡15s或上下颠倒摇晃1min，冰上放置3min，在4℃离心机12000×g离心15min。

6)离心完成的溶液分为三层，上层为水相层，中间为白色杂质层，下层为粉红色有机层；悬空吸取上层水相层转移至干净的离心管中，分别加入600μL异丙醇、600μL氯化钠和柠檬酸钠混合液，轻柔上下颠倒混匀，冰上放置10min或-20℃放置20min；

7)12000×g 4℃离心10min，弃上清；

8)加入1.2mL质量百分比为75％乙醇洗涤沉淀，轻柔上下颠倒，使白色沉淀悬浮；12000×g 4℃离心3min，弃上清；

9)重复采用1.2mL质量百分比为75％乙醇洗涤沉淀，轻柔上下颠倒，使白色沉淀悬浮，置于冰上静置5min，7500×g 4℃离心5min，弃上清；

10)7500×g 4℃离心30s，用移液枪头吸掉多余液体，室温干燥3-5min；

11)加入30-50μL RNase-free H₂O或DEPC处理水，55-60℃水浴2min，充分溶解RNA，立即冰浴2min，4000×g 4℃离心10-15s，将所得到的RNA溶液置于-80℃保存。

本发明的它操作简单，无需纯化也能获得较好结果，所得总RNA根据后续实验要求可直接用于分子试验，显著降低了总RNA提取成本。本发明适用于任何畜禽品种，其提取效率高效、方便快捷、减少去RNA酶离心管和移液枪头的使用量，有效降低经济成本，也减少了实验耗材的去RNA酶的处理步骤，尤其对于实验环境条件较差或实验新手而言尤为有用。

附图说明

附图1为本发明的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图；

具体实施方式

提取动物组织总RNA的方法，包括如下步骤：

1、实验样品采集

采取兴义鸭新鲜肌肉组织与1.5mL离心管中，投入到液氮中进行速冻，带回实验室保存于-80℃超低温冰箱备用；

2、具体操作步骤

1)打开超净工作台，用酒精棉球把台面及内壁擦拭一遍，将事先在180℃烘箱中灭菌完成的研钵、剪刀、镊子，所用到的试剂(Trizol试剂、DEPC水处理75％酒精、异丙醇、氯仿、RNase-free H2O)及普通灭菌离心管(1.5mL、2mL)、无RNA酶或普通灭菌移液枪头(1000μL和200μL)、微量移液枪、乳胶手套一起放入超净工作台，关闭日光灯，打开紫外灯，照射30min，通风10min。

2)分别取30-50mg的-80℃冷冻保存组织于研钵中，加入适量液氮充分研磨至粉末(先用研棒用力压碎样品在旋转研磨)，每个样品研磨时间不应超过4min，切勿让液氮完全挥发后还在继续研磨。

3)将研磨好的样品加入已装有1mL Trizol试剂的无RNA酶1.5mL离心管中，剧烈振荡混匀，冰上放置5-10min，使得核酸与蛋白完全分离。

4)加入0.22mL氯仿，漩涡振荡15s或用手上下颠倒用力摇晃1min，冰上放置3min，4℃离心机12000×g离心15min。

5)离心完成的溶液分为三层，上层水相曾，中间白色杂质曾，下层为粉红色有机层；悬空吸取上层水相转移至干净的无RNA酶2.0mL离心管中(整个转移过程中，枪头不能碰到离心管管壁)，分别加入600μL异丙醇、600μL氯化钠和柠檬酸钠混合液，轻柔上下颠倒混匀，冰上放置10min或-20℃放置20min。

6)12000×g 4℃离心10min，弃上清。

7)加入1.2mL75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，轻柔上下颠倒，使白色沉淀悬浮。12000×g 4℃离心3min，弃上清。

8)重复1.2mL75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，轻柔上下颠倒，使白色沉淀悬浮，置于冰上静置5min，7500×g 4℃离心5min，弃上清。

9)简短离心(7500×g 4℃离心30s)，用无RNA酶枪头吸掉多余液体，室温干燥3-5min。

10)悬空加入30-50μL的RNase-free H2O(或DEPC处理水)，55-60℃水浴2min，充分溶解RNA，立即冰浴2min，简短离心(4000×g 4℃离心10-15s)，将所得到的RNA溶液置于-80℃保存备用。

11)将所获得的总RAN进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。

Claims (1)

1.一种用于动物组织总RNA提取的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)样品采集：在干净的环境中采集动物组织，控制动物组织在空气中的暴露时间在1-2min以内，将所采集的组织样品装入离心管中，迅速将装有组织样品的离心管投入液氮中速冻，以减少总RNA的降解和降低细胞内酶的活性；样品在-80℃下保存；

2)打开超净工作台，用酒精对超净工作台进行消毒，将灭菌后的研钵、剪刀、镊子，试剂，普通灭菌离心管、无RNA酶或普通灭菌移液枪头、微量移液枪及乳胶手套一起放入超净工作台，关闭日光灯，打开紫外灯，照射30min，通风10min；

3)分别取30-50mg冷冻保存组织于研钵中，加入液氮将组织充分研磨至粉末，每个样品研磨时间不超过4min，研磨过程中必须保持有液氮；

4)将研磨好的样品加入已装有1mL Trizol试剂的离心管中，在2000-2800r/min振荡混匀，冰上放置5-10min，使得核酸与蛋白完全分离；

5)加入0.22mL氯仿，漩涡振荡15s或上下颠倒摇晃1min，冰上放置3min，在4℃离心机12000×g离心15min。

6)离心完成的溶液分为三层，上层为水相层，中间为白色杂质层，下层为粉红色有机层；悬空吸取上层水相层转移至干净的离心管中，分别加入600μL异丙醇、600μL氯化钠和柠檬酸钠混合液，轻柔上下颠倒混匀，冰上放置10min或-20℃放置20min；

7)12000×g 4℃离心10min，弃上清；

8)加入1.2mL质量百分比为75％乙醇洗涤沉淀，轻柔上下颠倒，使白色沉淀悬浮；12000×g 4℃离心3min，弃上清；

9)重复采用1.2mL质量百分比为75％乙醇洗涤沉淀，轻柔上下颠倒，使白色沉淀悬浮，置于冰上静置5min，7500×g 4℃离心5min，弃上清；

10)7500×g 4℃离心30s，用移液枪头吸掉多余液体，室温干燥3-5min；

11)加入30-50μL RNase-free H₂O或DEPC处理水，55-60℃水浴2min，充分溶解RNA，立即冰浴2min，4000×g 4℃离心10-15s，将所得到的RNA溶液置于-80℃保存。