CN107034213A - 一种花生组织的dna快速提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于DNA提取方法技术领域，具体涉及一种花生组织的DNA快速提取方法。包括材料预处理、DNA提取液研磨、加入β‑巯基乙醇和20g/100mL的SDS、65℃水浴加热、异丙醇沉淀、75％乙醇清洗等步骤。本发明的方法提取花生组织DNA耗时短、DNA纯度高，并且提取过程中不使用苯酚等挥发性有毒有机溶剂，减少有机溶剂对人体健康的损害，安全性高。

Description

一种花生组织的DNA快速提取方法
技术领域
本发明属于DNA提取方法技术领域，具体涉及一种花生组织的DNA快速提取方法。
背景技术
花生一直是我国传统的农作物种植品种之一，也是主要的油料作物，花生种含有丰富的油酸和亚油酸，营养丰富，由花生制备而成的花生压榨油是人们的常用的食用油。传统的花生育种过程为自然杂交、自交或者转基因分子育种，分子育种首先涉及的就是花生DNA的提取，转化、转化体的鉴定筛选。大量的分子育种工作已经很繁杂，简便快速的DNA提取方法一直是广大科研工作者的需求。
目前，由于花生组织包括根、茎、叶、种子等，干扰基因组DNA的提取的因子也很多，传统的基因组DNA提取方法包括CTAB和酚类法，这些方法提取DNA过程中，步骤操作繁琐、耗时，通常CTAB法制备提取DNA需要数小时甚至更长的时间，极大的浪费了时间资源。因此，有必要寻求一种快速的DNA的快速提取方法。
发明内容
本发明提供的一种花生组织的DNA快速提取方法，解决了传统的CTAB和酚类法提取基因组DNA，步骤操作繁琐、耗时的问题。
本发明目的是提供一种花生组织的DNA快速提取方法，包括以下步骤：
S1，材料预处理：采集花生组织，洗净晾干，交替置于-20℃5min和20℃5min，每个温度各两次，再次晾干，得到待测样品；
S2，取待测样品，加入玻璃珠研磨至粉末状，然后加入DNA提取液研磨，后置于40±1℃条件下水浴30min，然后加入β-巯基乙醇和20g/100mL的SDS，65℃水浴加热20min，离心，收集第一次上清液；
其中，1L DNA提取贮藏液中含有0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol NaCl、10g CTAB、pH 8.0；使用时，每毫升DNA提取贮藏液中加入40μL 100mg/mL纤维素酶和40μL50mg/mL脂肪酶，作为DNA提取液使用；
S3，向第一次上清液中，加入0.8倍体积经4℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置≥20min的时间，离心，弃上清，收集DNA沉淀；
S4，在DNA沉淀中加入75％乙醇，离心，弃上清，最后置于通风处风干；
S5，风干的DNA沉淀用TE溶解，-20℃保存备用。
优选的，上述的花生组织的DNA快速提取方法，S2中，所述脂肪酶为碱性脂肪酶或者中性脂肪酶。
优选的，上述的花生组织的DNA快速提取方法，S2中，待测样品、DNA提取液、β-巯基乙醇和20g/100mL的SDS的比例为1g：2mL：50μL：20μL。
优选的，上述的花生组织的DNA快速提取方法，S2、S4中离心的条件均为4℃、12000rpm离心10min，S3中离心的条件均为4℃、12000rpm离心15min。
优选的，上述的花生组织的DNA快速提取方法，S2与S3之间还包括有机溶剂萃取步骤，具体为：S2中收集第一次上清液后，取第一次上清液转入新的离心管中，加入等体积的体积比为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇溶液，在4℃下12000rpm离心10min，收集第二次上清液；然后向第二次上清液中，加入0.8倍体积经4℃预冷的异丙醇。
优选的，上述的花生组织的DNA快速提取方法，S6中，风干的DNA沉淀用50μLpH8.0TE溶解，然后加入1μl 10ng/μl的RNase A，常温过夜后置于-20℃保存备用。
与现有技术相比，本发明提供的一种花生组织的DNA快速提取方法，具有以下有益效果：
1、适用于花生的根、茎、叶、花、种子等不同组织，DNA提取液中添加纤维素酶用于溶解植物中纤维素，添加脂肪酶用于溶解样品中脂肪，尤其是溶解花生种子中脂肪，使DNA更容易释放，提高DNA纯度；20g/100mL的SDS用于裂解细胞，β-巯基乙醇一方面具有抗氧化效果，另一方面，其与SDS联合使用，可以沉淀掉蛋白质，比单独使用SDS效果更佳，避免蛋白质对DNA纯度的影响。
2、传统CTAB方法排除人为操作时间误差，提取植物DNA耗时120min以上，而本发明的方法取花生组织DNA耗时70min左右，耗时短、DNA纯度高，并且提取过程中不使用苯酚等挥发性有毒有机溶剂，减少有机溶剂对人体健康的损害，安全性高。
附图说明
图1为花生叶片基因组DNA的酶切电泳图谱；
其中，1号泳道均为BamHⅠ酶切结果，2号泳道为KpnⅠ酶切结果，3号泳道为PstⅠ酶切结果，4号泳道为花生叶片基因组DNA。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中涉及到数据范围的，在该数据范围内包括两个端点的任何数值均可实现，由于效果和步骤相同，故不赘述。
实施例1
一种花生组织的DNA快速提取方法，包括以下步骤：
S1，材料预处理：采集根、茎、叶、花或者种子等花生组织，洗净晾干，置于-20℃5min，再置于20℃5min，再置于-20℃5min，再置于20℃5min，最后再次晾干，得到待测样品。
S2，取1g待测样品置于研磨中，加入玻璃珠研磨至粉末状，玻璃珠的直径Φ:0.4-0.6mm，然后加入2mL DNA提取液研磨5-10min，后置于40±1℃条件下水浴30min，然后加入50μLβ-巯基乙醇和20μL 20g/100mL的SDS，65℃水浴加热20min，4℃、12000rpm离心10min，收集第一次上清液。
其中，1L DNA提取贮藏液中含有0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol NaCl、10g CTAB、pH 8.0；使用时，每毫升DNA提取贮藏液中加入40μL 100mg/mL纤维素酶和40μL50mg/mL碱性脂肪酶，作为DNA提取液使用。
S3，将第一次上清液转入新的1.5ml离心管中，加入0.8倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min，12000rpm离心15min，弃上清，收集DNA沉淀。
S4，在DNA沉淀中加入75％乙醇600μL，轻摇5min，以清洗DNA，12000rpm离心10min，弃上清，重复清洗步骤1次，最后置于通风处风干。
S5，风干的DNA沉淀用50μL pH8.0TE溶解，然后加入1μl 10ng/μl的RNase A，常温过夜后置于-20℃冰箱保存备用。
我们以花生种子为对象，利用实施例1的方法提取基因组DNA，图1为花生种子基因组DNA的酶切电泳图谱；其中，1号泳道均为BamHⅠ酶切结果，2号泳道为KpnⅠ酶切结果，3号泳道为PstⅠ酶切结果，4号泳道为花生叶片基因组DNA。各个泳道均可见清晰条带，说明本发明方法提取的DNA不会影响后续酶切、PCR等步骤。
取2μl实施例1溶解的DNA溶液，在Eppendorf Biophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据OD 260/OD 280值、OD 260/OD 230值来判断DNA的纯度，结果如表1所示。表1结果显示，采用实施例1的方法提取花生不同组织的DNA均具有较高的纯度。
表1实施例1花生不同组织提取的DNA检测信息
实施例2
一种花生组织的DNA快速提取方法，包括以下步骤：
S1，材料预处理：采集根、茎、叶、花或者种子等花生组织，洗净晾干，置于-20℃5min，再置于20℃5min，再置于-20℃5min，再置于20℃5min，最后再次晾干，得到待测样品。
S2，取0.5g待测样品置于研磨中，加入玻璃珠研磨至粉末状，玻璃珠的直径Φ:0.4-0.6mm，然后加入1mL DNA提取液研磨5-10min，后置于40±1℃条件下水浴30min，然后加入25μLβ-巯基乙醇和10μL 20g/100mL的SDS，65℃水浴加热20min，4℃、12000rpm离心10min，收集第一次上清液；
其中1L DNA提取贮藏液中含有0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol NaCl、10gCTAB、pH 8.0；使用时，每毫升DNA提取贮藏液中加入40μL100mg/mL纤维素酶和40μL 50mg/mL中性脂肪酶，作为DNA提取液使用。
取第一次上清液转入新的2.0ml的离心管中，加入等体积的体积比为24:1的氯仿:异戊醇溶液，轻摇萃取使蛋白质变性，在4℃下12000rpm离心10min，收集第二次上清液。
S3，将第二次上清液转入新的1.5ml离心管中，加入0.8倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min，12000rpm离心15min，弃上清，收集DNA沉淀。
S4，在DNA沉淀中加入75％乙醇600μL，轻摇5min，以清洗DNA，12000rpm离心10min，弃上清，重复清洗步骤1次，置于通风处风干。
S5，风干的DNA沉淀用50μL pH8.0TE溶解，然后加入1μl 10ng/μl的RNase A，常温过夜后置于-20℃冰箱保存备用。
取2μl实施例2溶解的DNA溶液，在Eppendorf Biophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据OD 260/OD 280值、OD 260/OD 230值来判断DNA的纯度，结果参见表2。表2结果显示，采用实施例2的方法提取花生不同组织的DNA均具有较高的纯度。
表2实施例2花生不同组织提取的DNA检测信息
根 茎 叶 花 种子
样品质量(g) 0.532 0.531 0.535 0.529 0.528
浓度(ng/μl) 400 351.4 390.7 380 387.1
OD260/OD 280 1.80 1.78 1.80 1.77 1.82
OD260/OD 230 2.08 2.11 2.10 2.08 2.05
传统CTAB方法排除人为操作时间误差，提取植物DNA耗时120min以上，而本发明的方法取花生组织DNA耗时70min左右，耗时短、DNA纯度高，并且提取过程中不使用苯酚等挥发性有毒有机溶剂，减少有机溶剂对人体健康的损害，安全性高。
为了验证本发明提取方法的效果，我们以花生种子为样品，设计了对照一组、对照二组、对照三组和实验组。其中实验组采用实施例1的试剂和方法。对照一组与实施例1的方法相似，只是将DNA提取液的配方替换为1L DNA提取液中含有0.1mol Tris-HCl、0.1molEDTA、1.5mol NaCl、10g CTAB、pH 8.0。对照二组与实施例1的方法相似，只是将“加入50μLβ-巯基乙醇和20μL 20g/100mL的SDS，65℃水浴加热20min”改为“加入20μL 20g/100mL的SDS，65℃水浴加热20min”。对照三组采用授权公告号为CN101805730B，名称为《花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法》中述及的方法。
在Eppendorf Biophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据OD 260/OD 280值来判断DNA的纯度，结果如下：实验组的OD260/OD280值为1.82，纯度高；对照一组、对照二组的OD260/OD 280值分别为1.45、1.50，说明有不同程度的蛋白质污染；对照三组的OD260/OD 280值为1.99，说明RNA干扰比实验组较严重，再者，对照三组中使用了苯酚等挥发性有毒有机溶剂，且用量较大，危害性较大，不适合大量样本的DNA提取。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种花生组织的DNA快速提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，材料预处理：采集花生组织，洗净晾干，交替置于-20℃5min和20℃5min，每个温度各两次，再次晾干，得到待测样品；
S2，取待测样品，加入玻璃珠研磨至粉末状，然后加入DNA提取液研磨，后置于40±1℃条件下水浴30min，然后加入β-巯基乙醇和20g/100mL的SDS，65℃水浴加热20min，离心，收集第一次上清液；
其中，1L DNA提取贮藏液中含有0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol NaCl、10gCTAB、pH 8.0；使用时，每毫升DNA提取贮藏液中加入40μL100mg/mL纤维素酶和40μL 50mg/mL脂肪酶，作为DNA提取液使用；
S3，向第一次上清液中加入0.8倍体积经4℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置≥20min的时间，离心，弃上清，收集DNA沉淀；
S4，在DNA沉淀中加入75％乙醇，离心，弃上清，最后置于通风处风干；
S5，风干的DNA沉淀用TE溶解，-20℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的花生组织的DNA快速提取方法，其特征在于，S2中，所述脂肪酶为碱性脂肪酶或者中性脂肪酶。
3.根据权利要求1所述的花生组织的DNA快速提取方法，其特征在于，S2中，待测样品、DNA提取液、β-巯基乙醇和20g/100mL的SDS的比例为1g：2mL：50μL：20μL。
4.根据权利要求1所述的花生组织的DNA快速提取方法，其特征在于，S2、S4中离心的条件均为4℃、12000rpm离心10min，S3中离心的条件均为4℃、12000rpm离心15min。
5.根据权利要求1所述的花生组织的DNA快速提取方法，其特征在于，S2与S3之间还包括有机溶剂萃取步骤，具体为：S2中收集第一次上清液后，取第一次上清液转入新的离心管中，加入等体积的体积比为24:1的氯仿:异戊醇溶液，在4℃下12000rpm离心10min，收集第二次上清液；然后向第二次上清液中，加入0.8倍体积经4℃预冷的异丙醇。
6.根据权利要求1所述的花生组织的DNA快速提取方法，其特征在于，S6中，风干的DNA沉淀用50μL pH8.0TE溶解，然后加入1μl 10ng/μl的RNase A，常温过夜后置于-20℃保存备用。
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