CN107058532A - 检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对 - Google Patents

检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对 Download PDF

Info

Publication number
CN107058532A
CN107058532A CN201710213488.XA CN201710213488A CN107058532A CN 107058532 A CN107058532 A CN 107058532A CN 201710213488 A CN201710213488 A CN 201710213488A CN 107058532 A CN107058532 A CN 107058532A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
sequence
paddy rice
rice
measured
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710213488.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN107058532B (zh
Inventor
张帆
周永力
王明明
卢家玲
高岭岭
黎志康
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Biology Breeding And Innovation Institute Chinese Academy Of Agricultural Sciences
Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Shenzhen Biology Breeding And Innovation Institute Chinese Academy Of Agricultural Sciences
Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Biology Breeding And Innovation Institute Chinese Academy Of Agricultural Sciences, Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Shenzhen Biology Breeding And Innovation Institute Chinese Academy Of Agricultural Sciences
Priority to CN201710213488.XA priority Critical patent/CN107058532B/zh
Publication of CN107058532A publication Critical patent/CN107058532A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107058532B publication Critical patent/CN107058532B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对。本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型，如果所述特异SNP位点的基因型为GG基因型、待测水稻为或候选为抗白叶枯病的水稻，如果所述特异SNP位点的基因型为AA基因型、待测水稻为或候选为感白叶枯病的水稻；所述特异SNP位点为水稻基因组中序列表的序列1自5’末端第62位核苷酸。本发明建立的检测方法可用于预测水稻对白叶枯病的抗性，在发掘抗白叶枯病水稻种质资源和选育抗白叶枯病水稻品种的研究中具有重要的应用价值。

Description

检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对
技术领域
本发明涉及一种检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物之一，目前我国65％以上的人口以此作为主食。随着人口与经济的快速增长，粮食生产面临着巨大的挑战。由黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo)引起的白叶枯病是水稻生产中一种毁灭性的细菌病害。该病在我国华南、华中和华东以及亚洲其他东南亚稻区，经常暴发成灾，是水稻高产、稳产的重要限制因子之一。长期以来，选育和种植抗病品种在防治白叶枯病害中起到了重要作用。开发检测水稻白叶枯病抗性的分子标记，对于筛选抗白叶枯病的水稻种质资源以及在育种过程中鉴定抗白叶枯病单株的研究中具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对。
本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型，如果所述特异SNP位点的基因型为GG基因型、待测水稻为或候选为抗白叶枯病的水稻，如果所述特异SNP位点的基因型为AA基因型、待测水稻为或候选为感白叶枯病的水稻；
所述“检测待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型”的实现方法，为方法A或方法B。
所述方法A包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序。
所述方法B包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物用Hpy188I限制性内切酶进行酶切，如果酶切产物中具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段且不具有121-141bp的DNA片段、待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型为GG，如果酶切产物中具有121-141bp的DNA片段且不具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段、待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型为AA。
本发明还保护鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性的方法，为方法C或方法D。
所述方法C包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物用Hpy188I限制性内切酶进行酶切，如果酶切产物中具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段且不具有121-141bp的DNA片段、待测水稻为或候选为抗白叶枯病水稻，如果酶切产物中具有121-141bp的DNA片段且不具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段、待测水稻为或候选为感白叶枯病水稻。
所述方法D包括如下步骤：检测待测水稻基因组DNA中是否含有特异DNA片段甲或特异DNA片段乙，如果所述基因组DNA中含有特异DNA片段甲、待测水稻为或候选为抗白叶枯病水稻，如果所述基因组DNA中含有特异DNA片段乙、待测水稻为或候选为感白叶枯病水稻。
所述特异DNA片段甲为序列表的序列4所示的DNA分子。
所示特异DNA片段乙为序列表的序列5所示的DNA分子。
本发明还保护检测待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型的方法，为方法E或方法F；
所述方法E包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序。
所述方法F包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物用Hpy188I限制性内切酶进行酶切，如果酶切产物中具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段且不具有121-141bp的DNA片段、待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型为GG，如果酶切产物中具有121-141bp的DNA片段且不具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段、待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型为AA。
以上任一所述引物F1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子。
以上任一所述引物R1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代且与序列3具有相同功能的DNA分子。
以上任一所述特异SNP位点为水稻基因组中序列表的序列1自5’末端第62位核苷酸。
以上任一所述60-80bp的DNA片段具体可为70bp的DNA片段。所述70bp的DNA片段具体可如序列表的序列6所示。
以上任一所述51-71bp的DNA片段具体可为61bp的DNA片段。所述61bp的DNA片段具体可如序列表的序列7所示。
以上任一所述121-141bp的DNA片段的DNA片段具体可为131bp的DNA片段。所述131bp的DNA片段具体可如序列表的序列5所示。
本发明还保护一种特异引物对，由引物F1和引物R1组成；
所述引物F1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物R1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代且与序列3具有相同功能的DNA分子。
本发明还保护所述特异引物对的应用，为如下(b1)-(b6)中的至少一种：
(b1)鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性；
(b2)筛选或辅助筛选抗白叶枯病的水稻；
(b3)筛选或辅助筛选感白叶枯病的水稻；
(b4)制备用于鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性的试剂盒；
(b5)制备用于筛选或辅助筛选抗白叶枯病的水稻的试剂盒；
(b6)制备用于筛选或辅助筛选感白叶枯病的水稻的试剂盒。
本发明还保护含有所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(c1)-(c3)中的至少一种：
(c1)鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性；
(c2)筛选或辅助筛选抗白叶枯病的水稻；
(c3)筛选或辅助筛选感白叶枯病的水稻。
本发明还保护一种特异DNA分子，如序列表的序列1所示。
本发明还保护所述特异DNA分子的应用，为如下(d1)-(d3)中的至少一种：
(d1)鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性；
(d2)筛选或辅助筛选抗白叶枯病的水稻；
(d3)筛选或辅助筛选感白叶枯病的水稻。
本发明还保护以上任一所述方法或所述特异引物对或所述试剂盒或所述特异DNA分子在水稻育种中的应用。
所述育种的目的为培育抗白叶枯病的水稻或培育感白叶枯病的水稻。
抗白叶枯病的水稻具体可为抗病性试验中叶片病斑长度小于等于6cm的水稻。
感白叶枯病的水稻具体可为抗病性试验中叶片病斑长度大于20cm的水稻。
所述抗病性试验为：将白叶枯病菌株的菌悬液接种至待测水稻分蘖盛期时的叶片中，培养待测水稻一段时间后测量叶片病斑长度(每个叶片沿叶脉有一个病斑)。
所述白叶枯病菌株具体可为菌株GX878桂。
所述菌悬液的浓度具体可为108cfu/mL。
所述菌悬液的制备方法具体可为：将菌株GX878桂接种于PSA固体培养基上，28℃静置培养48h，用无菌水将菌落洗脱，制备得到菌悬液。
所述“将白叶枯病菌株的菌悬液接种至待测水稻叶片”的方法具体可为人工剪叶法。
所述人工剪叶法具体可参照参考文献“Kauffman H E，Reddy A PK，Hsieh S P Y，et al.A improved technique for evaluation of resistance of rice varieties toXanthomonasoryzea[J].Plant Dis Rep，1973，57：537-541”。
所述“培养待测水稻一段时间”具体可为培养待测水稻21天。
以上任一所述待测水稻具体可为如下水稻材料中的任意一种：BR 116-3B-53：：IRGC 39559-2、IR 53650-2B-10-1-2-1、QING ER XIAO 2：：IRGC 67255-1、IR 19058-107-1：：IRGC 72997-1、IRGA 318-11-6-9-2B、WAS 170-B-B-1-1、WAS 21-B-B-20-4-3-3、HERATHBANDA：：IRGC 67630-1、WAS 199-B-1-2-1、3210：：IRGC 116950-1、FAN WU：：IRGC 70245-1、TAICHUNG SEN YU 214：：IRGC 38899-1、TOC 5430、E 4197：：IRGC 68004-1、IR 21015-72-3-3-3-1、E 2024、19：：IRGC 70786-1、IRRI 146：：G1、WAS 174-B-3-5、NULI：：IRGC 58824-1、MIARA、SAN CHIAO TSWEN、HAREM、GRAAL、KODIA PHUL：：IRGC 52168-1、BEGUM、SSANGDUJO、ARC 12690：：IRGC 22257-1、MALAGKIT(PINELIPE)：：IRGC 67444-1、AUS 84：：IRGC 28947-2、DORELLA、ARC 10825：：IRGC 21082-1、GILINGAN MARANGRAS：：IRGC 75213-1、SUPER、FRAGANCE、TSIMATAHOPAOSA：：IRGC 69884-1、HE GU TSAO、79UPLA、GLADIO、GRALDO、NAWANSATHRA BAGAR 344：：IRGC 28079-1、FAMILIA 181、AMAKOYALI：：IRGC 60878-1、CI 7061：：IRGC 968-1、T 757、BAMLA SUFFAID 320：：IRGC 27776-1、B 6311A 5553-16-2：：IRGC14541-1或ARC 12493：：IRGC 22098-1。
以上所述待测水稻为以如下水稻材料中的任意一种或两种为亲本得到的后代：BR116-3B-53：：IRGC 39559-2、IR 53650-2B-10-1-2-1、QING ER XIAO 2：：IRGC 67255-1、IR19058-107-1：：IRGC 72997-1、IRGA 318-11-6-9-2B、WAS 170-B-B-1-1、WAS 21-B-B-20-4-3-3、HERATH BANDA：：IRGC 67630-1、WAS 199-B-1-2-1、3210：：IRGC 116950-1、FAN WU：：IRGC 70245-1、TAICHUNG SEN YU 214：：IRGC 38899-1、TOC 5430、E4197：：IRGC 68004-1、IR 21015-72-3-3-3-1、E 2024、19：：IRGC 70786-1、IRRI 146：：G1、WAS 174-B-3-5、NULI：：IRGC 58824-1、MIARA、SAN CHIAO TSWEN、HAREM、GRAAL、KODIA PHUL：：IRGC 52168-1、BEGUM、SSANGDUJO、ARC 12690：：IRGC 22257-1、MALAGKIT(PINELIPE)：：IRGC 67444-1、AUS84：：IRGC 28947-2、DORELLA、ARC 10825：：IRGC 21082-1、GILINGAN MARANGRAS：：IRGC75213-1、SUPER、FRAGANCE、TSIMATAHOPAOSA：：IRGC 69884-1、HE GU TSAO、79UPLA、GLADIO、GRALDO、NAWAN SATHRA BAGAR 344：：IRGC 28079-1、FAMILIA 181、AMAKOYALI：：IRGC60878-1、CI 7061：：IRGC 968-1、T 757、BAMLA SUFFAID 320：：IRGC 27776-1、B 6311 A5553-16-2：：IRGC 14541-1或ARC 12493：：IRGC 22098-1。
以上任一所述引物F1和引物R1均以引物溶液形式加入至PCR反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为10μM。
以上任一所述PCR扩增的反应体系具体可为：模板DNA 1.0μL(50ng)，引物F10.4μL，引物R1 0.4μL，2×EasyTaq Mix10.0μL，ddH2O8.2μL。
以上任一所述所述PCR扩增的反应程序具体可为：95℃预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸10min。
以上任一所述酶切的反应体系具体可为：PCR扩增产物10μL，10×NEB buffer 2.5μL，Hpy188I限制性内切酶2.0μL，ddH2O10.5μL。
以上任一所述酶切的反应条件具体可为37℃酶切90min。
以上任一所述白叶枯病具体可为由菌株GX878桂引起的白叶枯病。
本发明提供了一种检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对，还提供了利用特异引物对检测水稻对白叶枯病抗性的方法。本发明建立的检测方法可用于预测水稻对白叶枯病的抗性，在发掘抗白叶枯病水稻种质资源和选育抗白叶枯病水稻品种的研究中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为48份水稻材料基因组DNA的PCR扩增产物酶切电泳检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下实施例中，各条引物均以引物溶液形式加入至PCR反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为10μM。
以下实施例中的水稻材料均已经在参考文献：3K RGP.The 3,000 rice genomesproject[J].Gigascience，2014，3：7.中公开记载；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
菌株GX878桂：参考文献：方中达，许志刚，过崇俭，等.中国水稻白叶枯病菌致病型的研究[J].植物病理学报，1990(2)：81-88.；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
2×EasyTaq Mix：北京全式金生物技术有限公司，货号：AS111-02。
10×NEB buffer：NEB公司，货号：R0617S。
实施例1、引物设计
1、从已测序(平均深度14×)的全球水稻核心种质资源(3K RGP.The 3,000 ricegenomes project[J].Gigascience，2014，3：7.)中选取618份水稻品种作为实验材料；针对618份水稻品种进行全基因组关联分析，发现一个与水稻对白叶枯病抗性相关的SNP位点。SNP位点及其附近的核苷酸如序列表的序列1所示，其中第62位核苷酸为SNP位点，为A/G多态。
2、针对步骤1的SNP位点设计了用于检测水稻对白叶枯病抗性的一对引物(5’→3’)：
F1(序列表的序列2)：CGGGATTAATGGCGGTTTTCAA；
R1(序列表的序列3)：CCCTACATTTTTCCTTGCTTCAT。
实施例2、水稻对白叶枯病抗性检测方法建立
提取待测水稻的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用实施例1设计的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物用Hpy188I限制性内切酶37℃酶切90min。如果酶切产物中只具有70bp的DNA片段和61bp的DNA片段、待测水稻为抗白叶枯病水稻，如果酶切产物中只具有131bp的DNA片段、待测水稻为感白叶枯病水稻。
PCR扩增体系(20μL)：模板DNA 1.0μL(含50ng DNA)，引物F1 0.4μL，引物R1 0.4μL，2×EasyTaq Mix10.0μL，ddH2O8.2μL。
PCR扩增反应程序：95℃预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸10min。
酶切反应体系(25μL)：PCR扩增产物10μL，10×NEB buffer 2.5μL，Hpy188I限制性内切酶2.0μL，ddH2O10.5μL。
实施例3、水稻抗白叶枯病鉴定
1、将菌株GX878桂接种于PSA固体培养基上，28℃静置培养48h，用无菌水将菌落洗脱，制备得到浓度为108cfu/mL的菌悬液。
2、选择表1中的48份水稻材料作为实验材料，将待测水稻的种子播于装有淋过土壤杀菌剂的营养土壤的育秧盘中，在温室中培养约25天后移栽至网室中进行种植，每个品种设置3次重复，每个重复种植2行，每行移栽6株。
3、在步骤2水稻植株的分蘖盛期时，取步骤1得到的菌悬液，采用人工剪叶法(方法参照文献：Kauffman H E，Reddy A P K，Hsieh S P Y，et al.A improved technique forevaluation of resistance of rice varieties to Xanthomonasoryzea[J].Plant DisRep，1973，57：537-541)对水稻植株进行人工接种，每株接种5-6张叶片。
4、完成步骤3后继续培养21天，21天后测量各植株叶片的病斑长度，每个叶片沿叶脉有一个病斑，每个植株测量3张接种叶片的病斑长度，每个重复调查6株，病斑长度取平均值。病斑长度小于等于6cm的为抗白叶枯病水稻，病斑长度大于20cm的为感白叶枯病水稻。
结果见表1。48份水稻材料中，20份为抗白叶枯病材料，28份为感白叶枯病材料。
表1水稻种质资源接种白叶枯病菌菌株GX878桂后的叶片病斑长度
5、分别提取表1中编号1-48号水稻的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用实施例1设计的引物对进行PCR扩增，将扩增产物测序，结果表明，编号为1-20的抗病水稻的扩增产物测序均如序列4所示(第62位均为G)，编号为21-48的感病水稻的扩增产物测序均如序列5所示(第62位均为A)。
6、分别提取表1中编号1-48号水稻的基因组DNA，按照实施例2的方法进行检测。结果如图1所示。图1中，M为DNA maker，泳道1-48分别对应表1中编号1-48的水稻品种。泳道1-20均得到两个条带(条带甲和条带乙)，条带甲经测序均如序列6所示，条带乙经测序均如序列7所示，泳道21-48均得到一个条带(条带丙)，条带丙经测序均如序列5所示。
上述结果表明，20份抗白叶枯病水稻SNP位点的基因型均为GG，且基因组DNA采用引物F1和引物R1进行PCR扩增的扩增产物经Hpy188I限制性内切酶酶切后的产物中均含有条带甲和条带乙；28份感白叶枯病水稻SNP位点的基因型为AA，且基因组DNA采用引物F1和引物R1进行PCR扩增的扩增产物经Hpy188I限制性内切酶酶切后的产物中均含有条带丙。
实施例4、敏感性
待测水稻为：表1中编号1的BR 116-3B-53：：IRGC 39559-2水稻和编号36的TSIMATAHOPAOSA：：IRGC 69884-1水稻。
1、提取待测水稻的基因组DNA。
2、用ddH2O稀释步骤1得到的DNA溶液，得到各个稀释液。
3、将步骤2得到的稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物对进行PCR扩增。
PCR扩增体系(20μL)：模板DNA 1.0μL，引物F1 0.4μL，引物R1 0.4μL，2×EasyTaqMix10μL和ddH2O8.2μL。
PCR扩增反应程序：95℃预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸10min。
由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
反应体系1中，水稻基因组DNA的初始含量为300ng；
反应体系2中，水稻基因组DNA的初始含量为200ng；
反应体系3中，水稻基因组DNA的初始含量为150ng；
反应体系4中，水稻基因组DNA的初始含量为100ng；
反应体系5中，水稻基因组DNA的初始含量为50ng。
4、将步骤2的扩增产物用Hpy188I限制性内切酶进行酶切，酶切产物用8％的琼脂糖凝胶进行电泳分析。
酶切反应体系(25μL)：PCR扩增产物10μL，10×NEB buffer 2.5μL，Hpy188I限制性内切酶2.0μL，ddH2O10.5μL。
结果：采用反应体系1-5扩增编号1的BR 116-3B-53：：IRGC 39559-2水稻基因组DNA，PCR产物经Hpy188I酶切后，均能形成70bp和61bp的两条特征条带；采用反应体系1-5扩增编号36的TSIMATAHOPAOSA：：IRGC 69884-1水稻基因组DNA，PCR产物经Hpy188I酶切后，均能形成131bp的特征条带。结果表明，当待测水稻基因组DNA含量低至50ng时，采用实施例2建立的检测方法依然能够检测出水稻对白叶枯病的抗性。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
中国农业科学院深圳生物育种创新研究院
<120> 检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对
<160> 7
<210> 1
<211> 131
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa）
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(62)
<223> r is a or g
<400> 1
cgggattaat ggcggttttc aactgatatt aaaggtgatt tctctcctgg tgtttcaatc 60
aragtttagg gtgatatttg gactctctcc tgcatataaa tgtactacat gaagcaagga 120
aaaatgtagg g 131
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
cgggattaat ggcggttttc aa 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ccctacattt ttccttgctt cat 23
<210> 4
<211> 131
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 4
cgggattaat ggcggttttc aactgatatt aaaggtgatt tctctcctgg tgtttcaatc 60
agagtttagg gtgatatttg gactctctcc tgcatataaa tgtactacat gaagcaagga 120
aaaatgtagg g 131
<210> 5
<211> 131
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 5
cgggattaat ggcggttttc aactgatatt aaaggtgatt tctctcctgg tgtttcaatc 60
aaagtttagg gtgatatttg gactctctcc tgcatataaa tgtactacat gaagcaagga 120
aaaatgtagg g 131
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 6
gagtttaggg tgatatttgg actctctcct gcatataaat gtactacatg aagcaaggaa 60
aaatgtaggg 70
<210> 7
<211> 61
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 7
cgggattaat ggcggttttc aactgatatt aaaggtgatt tctctcctgg tgtttcaatc 60
a 61

Claims (10)

1.一种鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型，如果所述特异SNP位点的基因型为GG基因型、待测水稻为或候选为抗白叶枯病的水稻，如果所述特异SNP位点的基因型为AA基因型、待测水稻为或候选为感白叶枯病的水稻；
所述特异SNP位点为水稻基因组中序列表的序列1自5’末端第62位核苷酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“检测待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型”的实现方法，为方法A或方法B；
所述方法A包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序；
所述方法B包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物用Hpy188I限制性内切酶进行酶切，如果酶切产物中具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段且不具有121-141bp的DNA片段、待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型为GG，如果酶切产物中具有121-141bp的DNA片段且不具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段、待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型为AA；
所述引物F1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物R1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代且与序列3具有相同功能的DNA分子。
3.鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性的方法，为方法C或方法D；
所述方法C包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物用Hpy188I限制性内切酶进行酶切，如果酶切产物中具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段且不具有121-141bp的DNA片段、待测水稻为或候选为抗白叶枯病水稻，如果酶切产物中具有121-141bp的DNA片段且不具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段、待测水稻为或候选为感白叶枯病水稻；
所述引物F1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物R1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述方法D包括如下步骤：检测待测水稻基因组DNA中是否含有特异DNA片段甲或特异DNA片段乙，如果所述基因组DNA中含有特异DNA片段甲、待测水稻为抗白叶枯病水稻，如果所述基因组DNA中含有特异DNA片段乙、待测水稻为感白叶枯病水稻；
所述特异DNA片段甲为序列表的序列4所示的DNA分子；
所示特异DNA片段乙为序列表的序列5所示的DNA分子。
4.检测待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型的方法，为方法E或方法F；
所述方法E包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序；
所述方法F包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物用Hpy188I限制性内切酶进行酶切，如果酶切产物中具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段且不具有121-141bp的DNA片段、待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型为GG，如果酶切产物中具有121-141bp的DNA片段且不具有60-80bp的DNA片段和51-71bp的DNA片段、待测水稻的基因组DNA中特异SNP位点的基因型为AA；
所述引物F1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物R1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述特异SNP位点为水稻基因组中序列表的序列1自5’末端第62位核苷酸。
5.特异引物对，由引物F1和引物R1组成；
所述引物F1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物R1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代且与序列3具有相同功能的DNA分子。
6.权利要求5所述的特异引物对的应用，为如下(b1)-(b6)中的至少一种：
(b1)鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性；
(b2)筛选或辅助筛选抗白叶枯病的水稻；
(b3)筛选或辅助筛选感白叶枯病的水稻；
(b4)制备用于鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性的试剂盒；
(b5)制备用于筛选或辅助筛选抗白叶枯病的水稻的试剂盒；
(b6)制备用于筛选或辅助筛选感白叶枯病的水稻的试剂盒。
7.含有权利要求5所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(c1)-(c3)中的至少一种：
(c1)鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性；
(c2)筛选或辅助筛选抗白叶枯病的水稻；
(c3)筛选或辅助筛选感白叶枯病的水稻。
8.一种特异DNA分子，如序列表的序列1所示。
9.权利要求8所述的特异DNA分子的应用，为如下(d1)-(d3)中的至少一种：
(d1)鉴定或辅助鉴定水稻对白叶枯病抗性；
(d2)筛选或辅助筛选抗白叶枯病的水稻；
(d3)筛选或辅助筛选感白叶枯病的水稻。
10.权利要求1-4任一所述的方法，或，权利要求5所述的特异引物对，或，权利要求7所述的试剂盒，或，权利要求8所述的特异DNA分子在水稻育种中的应用。
CN201710213488.XA 2017-04-01 2017-04-01 检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对 Expired - Fee Related CN107058532B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710213488.XA CN107058532B (zh) 2017-04-01 2017-04-01 检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710213488.XA CN107058532B (zh) 2017-04-01 2017-04-01 检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107058532A true CN107058532A (zh) 2017-08-18
CN107058532B CN107058532B (zh) 2020-07-14

Family

ID=59602094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710213488.XA Expired - Fee Related CN107058532B (zh) 2017-04-01 2017-04-01 检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107058532B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108004335A (zh) * 2017-12-08 2018-05-08 江汉大学 一种白叶枯菌小种分离鉴定方法
CN112501346A (zh) * 2020-12-28 2021-03-16 中国水稻研究所 一种与水稻白叶枯病抗性相关的snp分子标记、检测引物对及应用
CN114410828A (zh) * 2022-03-07 2022-04-29 中国农业科学院作物科学研究所 鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的引物组合物及其方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100381465C (zh) * 2005-01-19 2008-04-16 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种检测水稻白叶枯病抗性的方法
CN106498058A (zh) * 2016-10-27 2017-03-15 中国农业科学院作物科学研究所 水稻耐盐基因及其紧密连锁分子标记的育种应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100381465C (zh) * 2005-01-19 2008-04-16 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种检测水稻白叶枯病抗性的方法
CN106498058A (zh) * 2016-10-27 2017-03-15 中国农业科学院作物科学研究所 水稻耐盐基因及其紧密连锁分子标记的育种应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FAN ZHANG 等: "Genome-wide association analysis identifies resistance loci for bacterial blight in a diverse collection of indica rice germplasm", 《PLOS ONE》 *
G. RAMKUMAR 等: "Development and validation of SNP-based functional codominant markers for two major disease resistance genes in rice (O. sativa L.)", 《MOL BREEDING》 *
KAWAHARA,Y. 等: "AP014967.1 Oryza sativa Japonica Group DNA, chromosome 11, cultivar: Nipponbare, complete sequence", 《NCBI》 *
卓大龙 等: "水稻抗白叶枯病新基因Xa39分子标记有效性的评价", 《作物学报》 *
潘英华 等: "白叶枯病抗性基因Xa23的分子检测", 《广西农业科学》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108004335A (zh) * 2017-12-08 2018-05-08 江汉大学 一种白叶枯菌小种分离鉴定方法
CN108004335B (zh) * 2017-12-08 2021-07-02 江汉大学 一种白叶枯菌小种分离鉴定方法
CN112501346A (zh) * 2020-12-28 2021-03-16 中国水稻研究所 一种与水稻白叶枯病抗性相关的snp分子标记、检测引物对及应用
CN112501346B (zh) * 2020-12-28 2022-08-02 中国水稻研究所 一种与水稻白叶枯病抗性相关的snp分子标记、检测引物对及应用
CN114410828A (zh) * 2022-03-07 2022-04-29 中国农业科学院作物科学研究所 鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的引物组合物及其方法
CN114410828B (zh) * 2022-03-07 2023-11-17 中国农业科学院作物科学研究所 鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的引物组合物及其方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107058532B (zh) 2020-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Anciro et al. FaRCg1: a quantitative trait locus conferring resistance to Colletotrichum crown rot caused by Colletotrichum gloeosporioides in octoploid strawberry
CN106755481A (zh) 一种鉴定嘎拉苹果后代植株的ssr分子标记vi及其应用
Thakur et al. Identification of allele specific AFLP markers linked with bacterial wilt [Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.] resistance in hot peppers (Capsicum annuum L.)
CN106868182A (zh) 特异引物对及其在检测水稻对白叶枯病抗性中的应用
Lv et al. Breeding of cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata) with fusarium wilt resistance based on microspore culture and marker-assisted selection
CN105886644A (zh) 密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用
CN107058532A (zh) 检测水稻对白叶枯病抗性的分子标记及特异引物对
CN105794631A (zh) 硬粒小麦-长穗偃麦草7e抗赤霉病双体附加系的创建方法
CN113475392B (zh) 一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法
Birithia et al. Identification of root-knot nematode species occurring on tomatoes in Kenya: use of isozyme phenotypes and PCR-RFLP
CN106929594A (zh) 梨果皮全红芽变性状位点的分子标记及其引物和应用
CN104946630B (zh) 黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记及其专用引物和应用
CN110257545B (zh) 一种用于鉴定杂交构树的分子标记及其应用
Meng et al. Molecular identification of Xanthomonas albilineans infecting elephant grass (Pennisetum purpureum) in China
Pescott The genetics of host adaptation in the parasitic plant Striga hermonthica
Tamang et al. Molecular insights into the variability and pathogenicity of Fusarium odoratissimum, the causal agent of Panama wilt disease in banana
Akbar et al. Marker-assisted selection and pyramiding of I1 and Ph3 genes for multiple disease resistance in tomato through PCR analysis
CN112752843A (zh) 甘蔗属植物的黑穗病抗性相关标记及其利用
Darabakula et al. Brinjal Little Leaf Disease Epidemiology in Insect Proof Conditions
Omoigui et al. Molecular characterization of cowpea breeding line for Strigaresistance using FTA technology
Panwar et al. Genetic diversity and pathogenic variability among different isolates of Fusarium udum causing wilt disease in pigeonpea (Cajanus cajan (L.) Millsp.)
CN114410828B (zh) 鉴定或辅助鉴定水稻白叶枯病抗性的引物组合物及其方法
Chen et al. The fungal pathogen Fusarium solani poses an increasing threat to tomato production in Northern China
JP2012050429A (ja) サトウキビ属植物の茎長関連マーカーとその利用
CN107058496A (zh) 一种适于大豆磷效率筛选的ssr引物序列及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200714