CN101220072A - 从动物组织中提取病毒基因组rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从动物组织中提取单链RNA病毒基因组的方法，包括以下步骤：(1)组织匀浆取病变组织剪碎后加入无菌水，匀浆器内高速匀浆至单细胞悬液；(2)细胞裂解、病毒释放将所得单细胞悬液反复冻融、超声破碎，使细胞裂解、病毒释放；(3)离心分离将上述处理液在低温下，离心分离，收集病毒沉淀；(4)RNA提取向沉淀物中加入RNAiso Reagent试剂，重悬，分离后提取得到RNA。用本发明提取病毒基因组RNA既可以避免宿主细胞物质的干扰，又可以得到高丰度、高纯度、高完整性的病毒RNA，方便后续实验。用于病毒检测，可以检测到极微量病毒离子的存在。本发明为动物源性病毒病的诊断、监控提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种从动物组织中提取病毒基因组RNA的方法，属于微生物病原检测技术领域。
背景技术
随着动物贸易的飞速发展，养殖业养殖规模、养殖密度越来越高，也带来了大规模的动物疾病频频爆发。2004年爆发的禽流感及2006年爆发的猪高致病性蓝耳病给养殖业造成了致命创伤。当前，养殖业的疾病爆发呈现多病原混合感染特点，爆发周期越来越短，对病原的诊断检测提出了更高的要求。现有技术中，对动物病原的诊断主要方法是：首先分离病菌或病毒，然后分析病原的生理生化特性，再进行基因组学、蛋白质组学研究。而对于病毒，尤其是突发的新病毒，进行病原的分离鉴定需要一个非常长的时间，而且极易对研究人员造成危险。放射免疫法、酶联免疫分析或免疫电镜法总体而言缺乏检测低浓度病毒的灵敏度，加上病毒高变异性的特点，常用的血清学及免疫学诊断方法往往造成漏检。目前，采用聚合酶链反应(PCR)对DNA或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来检测RNA病毒方法具有最好的敏感性。但是相对于DNA病毒来说，RNA病毒在处理过程中死亡，组织以及环境中存在的大量RNA酶会快速降解其基因组；病毒含量极少时往往得不到完整的病毒RNA。
国内他人的实验研究直接提取少量组织、血液或尿囊液中的RNA进行检测，同样因为处理样品量太小的原因，不能提取得到完整的病毒基因组RNA，进而无法检测到极微量的病毒。为此，研制一种简单灵敏的病毒基因组RNA提取方法对于重大畜禽疾病的早期测具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从动物组织中提取病毒基因组RNA的方法，解决了当前各种检测、诊断病毒方法中耗时长、灵敏度低的问题。
本发明的方法包括以下步骤：
(1)组织匀浆
取病变组织剪碎后加入无菌水，匀浆器内高速匀浆至单细胞悬液；
(2)细胞裂解、病毒释放
将单细胞悬液反复冻融、超声破碎，使细胞裂解、病毒释放出来；
(3)离心分离
将上述处理液在低温下离心分离，收集病毒沉淀；
(4)RNA提取
向沉淀物中加入RNAiso Reagent试剂，重悬，分离后提取得到RNA。
在本发明的步骤(3)中，离心分离时，控制温度4℃，首先低速离心分离去除宿主细胞物质，然后再高速离心分离收集病毒沉淀，效果更好。
利用随机或者特异引物RT-PCR扩增基因，扩增产物经序列测定及生物信息学研究，结果显示用该方法提取RNA病毒基因组既可以避免宿主细胞物质的干扰，又可以得到高丰度、高纯度、高完整性的病毒RNA，方便后续实验研究。
利用本发明从ELISA试剂盒鉴定为猪繁殖与呼吸综合症病毒阴性的猪肝脏提取RNA，1mLRNAiso Reagent可提取OD260/280值为2.0左右的RNA约250μg，进行琼脂糖凝胶电泳分析后可得到清晰的RNA条带；根据GenBank公布的ATCC VR2332全基因序列设计GP5及N蛋白的引物各1对，经RT-PCR后电泳观察到大小分别约600bp和400bp的基因片段；测序后进行同源性比较，与ATCC VR2332目的序列的同源性分别为89.74％、93.83％。证明该方法适宜于从含有极微量病毒的组织中提取大量高完整性的病毒RNA。
本发明取得的有益效果是：用该方法从组织中提取RNA病毒基因组，既可以缩短分离、鉴定病毒所耗费的时间，又可以获得丰度高、完整性好而且极少细胞RNA污染的RNA样品；本发明克服了以往方法操作中对实验检验人员的大量危害，并且节约了开支；处理样品量大，检测下限远低于目前常用方法。
附图说明
图1是PRRSV各目的基因的RT-PCR产物电泳结果图。
图中2.1，2.2，2，3，4，5，6和7分别代表NSP2.1，NSP2.2，GP2，GP3，GP4，GP5，M及N蛋白基因的RT-PCR扩增产物，M.DNA marker：2000，1000，750，500，250，100bp。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。
实施例1 猪病肺中病毒基因组RNA的提取实验(1)
(1)组织匀浆
称取200g猪病肺，剪成碎块后加入500mL无菌水，于组织匀浆器内高速匀浆至单细胞悬液；
(2)细胞裂解、病毒释放
将匀浆液置于试剂瓶中，密封后-20℃，15℃反复冻融三次；移取30mL悬液于50mL无RNA酶的离心管，300W超声破碎2min，工作8s间歇8s；
(3)离心分离
上述处理液控制温度4℃、8000g离心15min，上清移至新离心管后控制温度4℃、35000g离心3h，弃上清，收集病毒沉淀；
(4)RNA提取
向沉淀中加入2mLRNAiso Reagent(1mLRNAiso Reagent/60mg沉淀)将沉淀重悬，移入邓氏匀浆器匀浆，按RNAiso Reagent说明书要求进行RNA的分离纯化操作得到RNA。
(5)丰度与完整性检验
将RNA用60μL DEPC水溶解后，微量核酸测定仪测得OD260/280值分别为1.98、1.87，200倍稀释后浓度分别为47.0μg/mL，42.3μg/mL；取5μL RNA溶液进行非变性琼脂糖凝胶电泳，可以观察到清晰的RNA条带。
实施例2 猪病肺中病毒基因组RNA的提取实验(2)
(1)组织匀浆
称取200g猪病肺，剪成碎块后加入500mL无菌水，于组织匀浆器内高速匀浆至单细胞悬液；
(2)细胞裂解、病毒释放
将匀浆液置于试剂瓶中，密封后-20℃，30℃反复冻融五次；移取30mL悬液于50mL无RNA酶的离心管，600W超声破碎2min，工作8s间歇8s；
(3)离心分离
上述处理液控制温度4℃、8000g离心15min，上清移至新离心管后控制温度4℃、35000g离心3h，弃上清，收集病毒沉淀；
(4)RNA提取
向沉淀中加入2mLRNAiso Reagent(1mLRNAiso Reagent/60mg沉淀)将沉淀重悬，移入邓氏匀浆器匀浆，按RNAiso Reagent说明书要求进行RNA的分离纯化操作提取RNA。
(5)丰度与完整性检验
将RNA用30μL DEPC水溶解后，微量核酸测定仪测得OD260/280值为2.1，80倍稀释后浓度分别为23.0μg/mL；取5μL RNA溶液进行非变性琼脂糖凝胶电泳，观察到RNA条带呈弥散状；证明细胞裂解、病毒释放过程中条件过于剧烈，致使部分病毒死亡，RNA释放于组织悬液中并在后续的实验操作中被降解。
实施例3兔病肝中病毒基因组RNA的提取实验
(1)组织匀浆
称取50g兔病肝，剪成碎块后加入100mL无菌水，于组织匀浆器内高速匀浆至单细胞悬液。
(2)细胞裂解
将匀浆液置于试剂瓶中，密封后-20℃，10℃反复冻融三次；移取30mL悬液于50mL无RNA酶的离心管，200W超声破碎4min，工作8s间歇8s。
(3)离心分离
将上述处理液控制温度4℃、8000g离心10min，上清移至新离心管后控制温度4℃、12000g离心30min，弃上清，收集病毒沉淀；
(4)RNA提取
向沉淀中加入3mLRNAiso Reagent(1mLRNAiso Reagent/60mg沉淀)将沉淀重悬，移入邓氏匀浆器匀浆，按RNAiso Reagent说明书要求进行RNA的分离纯化操作。
(5)丰度与完整性检验
将RNA用60μL DEPC水溶解后，微量核酸测定仪测得OD260/280值为2.03，取5μLRNA溶液进行非变性琼脂糖凝胶电泳，观察到RNA条带呈弥散状；证明离心分离不充分，宿主细胞物质没有完全去除、病毒没能完全离心沉淀下来，致使提取的RNA中含有大量的组织RNA碎片。
实施例4 RT-PCR扩增及序列分析
(1)RT-PCR扩增
取RT-PCR试剂盒要求的适量RNA溶液，分别加入据GenBank公布的ATCCVR2332全基因序列设计的8对特异性引物进行梯度PCR扩增。琼脂糖电泳观察，获得大小分别约1200bp、1400bp、800bp、750bp、580bp、600bp、500bp和400bp的基因片段(见附图1)。
(2)序列测定及分析
将RT-PCR产物分别连接到pUCm-T载体上，转化到感受态细胞DH5α中，经IPTG/X-gal琼脂平板蓝白斑筛选，随机挑选白色菌落，提取质粒后进行双酶切鉴定。将克隆的阳性质粒送上海生工生物技术服务有限公司进行序列测定。用DNAMAN序列分析软件将所得序列与ATCC VR2332目的基因的核苷酸序列进行同源性分析，结果表明7个完整基因的同源性分别为79.45％、93.26％、88.76％、89.76％、89.57％、95.62％、93.83％。
实施例5 灵敏度比对实验
取猪繁殖与呼吸综合症病毒ELISA检测试剂盒鉴定为阴性的猪肝脏，经组织匀浆，细胞裂解，病毒富集与RNA提取后，分别用例2的8对特异性引物进行RT-PCR，结果同样得到大小与预期相同的基因片段；测序并进行同源性分析后认为所扩基因均为猪繁殖与呼吸综合症病毒基因。证明该份病料中含有微量的猪繁殖与呼吸综合症病毒，该方法的灵敏度高于ELISA试剂盒。
Claims (4)
1.一种从动物组织中提取病毒基因组RNA的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)组织匀浆
取病变组织剪碎后加入无菌水，匀浆器内高速匀浆至单细胞悬液；
(2)细胞裂解、病毒释放
将单细胞悬液反复冻融、超声破碎，使细胞裂解、病毒释放；
(3)离心分离
将上述相处理液低温下，离心分离收集病毒沉淀；
(4)RNA提取
向沉淀物中加入RNAiso Reagent试剂，重悬，分离后提取得到RNA。
2.按权利要求1所述的从动物组织中提取病毒基因组RNA的方法，其特征在于：步骤(3)中，控制温度4℃，首先低速离心分离去除宿主细胞物质，然后再高速离心分离收集病毒沉淀。
3.按权利要求2所述的从动物组织中提取病毒基因组RNA的方法，其特征在于：步骤(3)中，8000g低速离心分离15min，35000g高速离心分离3h。
4.按权利要求1所述的从动物组织中提取病毒基因组RNA的方法，其特征在于：步骤(2)中，反复冻融3次、300W超声破碎2min。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105602944A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-05-25 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种鱼类卵母细胞总rna的提取方法 |
| CN106244581A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-12-21 | 南昌大学 | 一种单个细胞rna的提取方法 |
| CN107904233A (zh) * | 2017-12-31 | 2018-04-13 | 贵州大学 | 一种用于动物组织总rna提取的方法 |
| CN109182329A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-01-11 | 求臻医学科技（北京）有限公司 | 一种用于石蜡包埋组织样本的rna提取方法及其在高通量测序中的应用 |
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2007
- 2007-12-10 CN CNA2007101853567A patent/CN101220072A/zh active Pending
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| CN105602944B (zh) * | 2016-04-01 | 2017-05-10 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种鱼类卵母细胞总rna的提取方法 |
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| PB01 | Publication | ||
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