CN106244581A - 一种单个细胞rna的提取方法 - Google Patents

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辛洪波
魏强
刘苏俊
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Abstract

一种单个细胞RNA的提取方法，是利用无限梯度稀释接种培养单细胞；显微镜下观察，加入RNA酶抑制剂和胰蛋白酶消化细胞，将其在液氮速冻后高温处理；再立即置于液氮速冻，速冻后加入蛋白酶K和RNA酶抑制剂，置于53℃的PCR仪中1h；最后对提取的RNA反转录后进行PCR检测。本发明的起始样本量低，适用于单个细胞或少量细胞，安全无毒、操作简单快速、提取高效、提取的RNA质量高，可用于后续如RT‑PCR等分子生物学实验。

Description

一种单个细胞RNA的提取方法
技术领域
本发明涉及一种单个细胞RNA的提取方法。
背景技术
在生命科学及相关研究领域，已经有越来越多的研究者将单个细胞作为研究对象。单个细胞的分析可以评价外界刺激如药物和毒素对细胞化学组成的影响，从而为药物设计有效地减小药物副作用提供重要依据。单个正常细胞的致病化学标记物的识别与表征使疾病的早期诊断成为可能。单个细胞的分析具有重要的理论意义和实际使用价值。然而，单个细胞的RNA提取可以解决用人或动物组织进行科学实验的材料来源问题。
分离提取高质量的RNA是基因表达、调控与基因工程等研究的基础，而RNA酶、多糖及多酚类物质严重干扰RNA的分离提取过程。目前已经有大量的RNA分离提取方法，且已有种类多样的RNA分离提取试剂盒。但是它们或多或少都存在起始样本量要求高、使用有毒溶剂、操作繁杂、RNA得率低等缺点。
针对目前RNA提取方法的不足，我们利用反复低温高温冻融联合酶消化法从单细胞中获得RNA，该方法得到的RNA可用于后续如RT-PCR等分子生物学实验。
发明内容
本发明的目的在于针对现有RNA提取方法的不足，提供一种单个细胞RNA的提取方法。
本发明是利用无限梯度稀释接种培养单细胞；显微镜下观察，加入RNA酶抑制剂和胰蛋白酶消化细胞，将其在液氮速冻后高温处理；再立即置于液氮速冻，速冻后加入蛋白酶K和RNA酶抑制剂，置于PCR仪中53℃，1h；最后对提取的RNA反转录后进行PCR检测。
本发明所述制备方法包括下列步骤：
1. 单个细胞接种培养：将已知浓度的细胞采用无限梯度稀释的方法稀释至5个/mL，再以每孔200μL加至96孔细胞培养板培养，保证1个细胞/孔；
2.细胞消化：显微镜下观察后，先小心吸弃细胞培养上清，用PBS洗一次，再每孔加入40μL的0.25%胰蛋白酶进行消化，镜下观察消化情况，然后每孔用5μL的FBS终止消化，用枪头吹打、刮下消化后的细胞，最后每管再加入2.25μL的40U/μL RNA酶抑制剂；
3. 细胞裂解：将消化后的细胞迅速放入液氮2min以上；再将细胞放入98℃的PCR仪中3min，随后立即放入液氮；速冻之后，每管加入0.5μL的20mg/mL蛋白酶K和2.25μL的40U/μLRNA酶抑制剂，置于53℃的PCR仪中1h；
4. 反转录后PCR检测：将提取的RNA测定浓度后，使用promega反转录试剂盒进行反转录后得到cDNA，再以此cDNA为模板，用PCR技术检测细胞中管家基因GAPDH的表达，最后用琼脂糖凝胶电泳观测目的条带;
具体步骤如下：
（1）取4μL RNA和1μL随机引物混合，该混合物即为反转录体系成分1，将此
混合物充分混匀后，70℃加热5min，立即置于冰上至少5min，简单离心10s后置于冰上放置。
（2）分别取4.5μL无核酶水，4μL GoScriptTM 5×Reaction Buffer，4μL MgCl2，1μLPCR Nucleotide Mix，0.5μL Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor和1μLGoScriptTM Reverse Transcriptase混合，该混合物即为反转录体系成分2，将此混合物充分混匀。
（3）将反转录体系成分1与反转录体系成分2充分混匀，简单离心, 置于RT-PCR
仪中，反转录程序为：25℃变性5min，42℃延伸1h，70℃使反转录酶失活5min，4℃直至反应结束，反转录程序结束后即得到cDNA。
（4）将步骤（3）得到的cDNA为模板进行PCR，PCR反应体系为：6.5μL无核酶水，12.5μL 2×Taq PCR MasterMix，10μM 的GAPDH上游引物和下游引物各0.5μL，5μL的cDNA模板；将其混匀后置于PCR仪中，PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，72℃后延伸7min，4℃直至反应结束。
（5）将步骤（4）的PCR产物置于1%的琼脂糖凝胶上，电泳观测条带。
所述的细胞可以是任意一种贴壁培养的细胞。
本发明的有益效果：利用无限梯度稀释接种培养单细胞；显微镜下观察，加入RNA酶抑制剂和胰蛋白酶消化细胞，将其在液氮速冻后高温处理；再立即置于液氮速冻，速冻后加入蛋白酶K和RNA酶抑制剂，置于PCR仪中53℃，1h；最后对提取的RNA反转录后进行PCR检测。本发明的优点是：起始样本量低，可用于单个细胞或少量细胞，安全无毒、操作简单快速、提取高效、提取的RNA质量高，可用于后续如RT-PCR等分子生物学实验。
附图说明
图1 为反转录后PCR电泳图。
具体实施方式
本发明所述制备方法包括下列步骤:
1. 单个细胞接种培养：将已知浓度的细胞采用无限梯度稀释的方法稀释至5个/mL，再以每孔200μL加至96孔细胞培养板培养，保证1个细胞/孔；
2. 细胞消化：显微镜下观察后，先小心吸弃细胞培养上清，用PBS洗一次，再每孔加入40μL的0.25%胰蛋白酶进行消化，镜下观察消化情况，然后每孔用5μL的FBS终止消化，用枪头吹打、刮下消化后的细胞，最后每管再加入2.25μL的40U/μL RNA酶抑制剂；
3.细胞裂解：将消化后的细胞迅速放入液氮2min以上；再将细胞放入98℃的PCR仪中3min，随后立即放入液氮；速冻之后，每管加入0.5μL的20mg/mL蛋白酶K和2.25μL的40U/μLRNA酶抑制剂，置于53℃的PCR仪中1h；
4. 反转录后PCR检测：表1 为单细胞提取的RNA浓度，测定 RNA浓度后，使用promega反转录试剂盒进行反转录后得到cDNA，再以此cDNA为模板，用PCR技术检测细胞中管家基因GAPDH的表达，最后用琼脂糖凝胶电泳观测目的条带。具体步骤如下：
（1）取4μL RNA和1μL随机引物混合，该混合物即为反转录体系成分1，将此混合物充分混匀后，70℃加热5min，立即置于冰上至少5min，简单离心10s后置于冰上放置。
（2）分别取4.5μL无核酶水，4μL GoScriptTM 5×Reaction Buffer，4μL MgCl2，1μLPCR Nucleotide Mix，0.5μL Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor和1μLGoScriptTM Reverse Transcriptase混合，该混合物即为反转录体系成分2，将此混合物充分混匀。
（3）将反转录体系成分1与反转录体系成分2充分混匀，简单离心, 置于RT-PCR仪中，反转录程序为：25℃变性5min，42℃延伸1h，70℃使反转录酶失活5min，4℃直至反应结束，反转录程序结束后即得到cDNA。
（4）将步骤（3）得到的cDNA为模板进行PCR，PCR反应体系为：6.5μL无核酶水，12.5μL 2×Taq PCR MasterMix，10μM 的GAPDH上游引物和下游引物各0.5μL，5μL的cDNA模板；将其混匀后置于PCR仪中，PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，72℃后延伸7min，4℃直至反应结束。其中GAPDH的上游引物序列为：5’-CTCAACTACATGGTTTACA-3’，下游引物序列为：5’-GAGATGATGACCCTTTTG-3’。
（5）将步骤（4）的PCR产物置于1%的琼脂糖凝胶上，电泳观测条带。

Claims (2)

1.一种单个细胞RNA的提取方法，其特征是：
A、单个细胞接种培养：将已知浓度的细胞采用无限梯度稀释的方法稀释至5个/mL，再以每孔200μL加至96孔细胞培养板培养，保证1个细胞/孔；
B、细胞消化：显微镜下观察后，先小心吸弃细胞培养上清，用PBS洗一次，再每孔加入40μL的0.25%胰蛋白酶进行消化，镜下观察消化情况，然后每孔用5μL的FBS终止消化，用枪头吹打、刮下消化后的细胞，最后每管再加入2.25μL的40U/μL RNA酶抑制剂；
C、细胞裂解：将消化后的细胞迅速放入液氮2min以上；再将细胞放入98℃的PCR仪中3min，随后立即放入液氮；速冻之后，每管加入0.5μL的20mg/mL蛋白酶K和2.25μL的40U/μLRNA酶抑制剂，置于53℃的PCR仪中1h；
D、反转录后PCR检测：将提取的RNA测定浓度后，使用promega反转录试剂盒进行反转录后得到cDNA，再以此cDNA为模板，用PCR技术检测细胞中管家基因GAPDH的表达，最后用琼脂糖凝胶电泳观测目的条带;
具体步骤如下：
（1）取4μL RNA和1μL随机引物混合，该混合物即为反转录体系成分1，将此混合物充分混匀后，70℃加热5min，立即置于冰上至少5min，简单离心10s后置于冰上放置;
（2）分别取4.5μL无核酶水，4μL GoScriptTM 5×Reaction Buffer，4μL MgCl2，1μL PCRNucleotide Mix，0.5μL Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor和1μL GoScriptTMReverse Transcriptase混合，该混合物即为反转录体系成分2，将此混合物充分混匀;
（3）将反转录体系成分1与反转录体系成分2充分混匀，简单离心, 置于RT-PCR仪中，反转录程序为：25℃变性5min，42℃延伸1h，70℃使反转录酶失活5min，4℃直至反应结束，反转录程序结束后即得到cDNA;
（4）将步骤（3）得到的cDNA为模板进行PCR，PCR反应体系为：6.5μL无核酶水，12.5μL 2×Taq PCR MasterMix，10μM 的GAPDH上游引物和下游引物各0.5μL，5μL的cDNA模板；将其混匀后置于PCR仪中，PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，72℃后延伸7min，4℃直至反应结束;
（5）将步骤（4）的PCR产物置于1%的琼脂糖凝胶上，电泳观测条带。
2.根据权利要求1所述的一种单个细胞RNA的提取方法，其特征是：所述细胞是任意一种贴壁培养的细胞。
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CN101220072A (zh) * 2007-12-10 2008-07-16 河北师范大学 从动物组织中提取病毒基因组rna的方法

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