CN105316325B - 一种基于HMGR 3’-UTR和rRNA ITS的引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种基于HMGR 3'‑UTR和rRNA ITS的引物及其应用提供了三对引物，同时提供了引物获取方法和应用。本发明的三对引物基于高度特异的3'‑UTR和rRNA ITS序列，引物序列特异性高，能够精确的鉴定五加皮和香加皮样品。三对引物在五加皮和香加皮全基因组序列未知的情况下采用RACE技术扩增得到下游序列，并通过高通量测序获得，属于新发现的序列片段，并具有中药鉴定的功能。本发明的引物的应用时，样品提取DNA而不是RNA，这样对样品要求较低，可以是鲜品、干品或者简单炮制后（对DNA破坏低的炮制方法）的样品。
Description
技术领域
本发明专利涉及分子生物学技术领域，具体地说是一种基于HMGR 3'-UTR和rRNAITS的引物及其应用。
背景技术
3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶（HMGR）催化3-羟基-3-甲基戊二单酰辅酶A生成甲羟戊酸，HMGR是刺五加苷生物合成中的限速酶。刺五加苷是五加皮和刺五加的有效成分，也是品种鉴别和质量鉴定的目标化合物。mRNA 3'端非编码区（3'-UTR）是mRNA编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的前端的一段核苷酸序列。真核生物的3'-UTR在基因表达调控中发挥重要作用，可调控mRNA的稳定性、控制其翻译、协助辨认密码子等，3'-UTR在不同基因和不同物种中间具有高度特异性，还可以作为分子标记，特别是植物的次生代谢相关酶。内转录间隔区（ITS）是rDNA中18S rRNA基因和28S rRNA基因之间的序列。rDNA上的5.8S、18S和28S rRNA基因有极大的保守性，即存在着广泛的异种同源性。而ITS区不加入成熟核糖体，所以ITS片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小，因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性，即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异。研究表明，ITS片段的进化速率是18S rDNA的10倍。这就是ITS序列应用在中药材鉴定分析中的理论基础。
五加皮系五加科植物细柱五加的干燥根皮，为常用中药。又名白刺、目骨、追风使、南五加皮等。该植物主要分布于湖北，河北，安徽，四川等地。五加皮性温，味辛、苦，归肝、肾经，具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、通游血、利水肿、镇痛解热等功效，临床主要用于治疗风湿瘦痛、腰膝软弱、小儿行迟、跌打，骨折等病症，为常用的重要中药材之一。现代研究证明本品还具有抗肿瘤、抗疲劳、降低全血粘度、防止动脉粥样硬化形成等作用。
香加皮亦称北五加皮，来源于萝藦科植物杠柳的干燥根皮，为常用传统中药。本品性温，味辛苦，有毒，归肝、肾、心经。有祛风湿、强筋骨的功效。用于风寒湿痹，腰膝酸软，心悸气短，下肢浮肿。主产于甘肃、陕西、河南、山西等地。与五加皮药理作用有异，药物功效也不相同，五加皮有补肺肾、强筋骨、祛风除湿的功效；香加皮虽也有柱风湿、强筋骨的功效，但与五加皮作用机制不同。香加皮中含有杠柳毒苗，它有剧烈的强心作用但同时又为毒性成分，过量服用甚至会导致死亡。2010版《中国药典》一部五加皮项下仅规定了性状、显微鉴别、水分、总灰分等检查项，不能准确鉴别，因此应用分子标记和基因工程技术鉴定五加皮和香加皮能够精确的辨别、鉴定，避免混淆。
发明内容
一、引物序列
本发明提供了一种基于HMGR 3'-UTR和rRNA ITS的引物及其应用。用于鉴定的引物为：
1、基于五加皮HMGR 3'-UTR的引物：上游F1：5，-ggcatcatgtactaggatacagtcg-3，
，下游F2：5，- gtagacagattacattcagtctgactatg -3，
2、基于五加皮rRNA ITS的引物：上游F3：5，-cacgacgtgtgcacgactctagtacg-3，
，下游F4：5，- gtggcatcgtctcgtatagcgacgcag -3，
3、基于香加皮rRNA ITS的引物：上游F5：5，-cggactagtgcgagtatcgtcgcag-3，
，下游F6：5，- cgtgcattcactgctgagtgcatgcc -3，
采用DNA合成仪对上述引物进行合成，即得到鉴定引物的白色晶体。
上述引物序列经NCBI的nucleotide blast比对后Max score均不超过41，Query
cover均不超过75%，并且在公布的五加科植物中未检出Query cover超过50%的序列，说明
引物序列特异性高；最大Max score和Query cover数据如下：
| 引物序号 | 引物序列 | Max score | Query cover |
| F1 | 5<sup>，</sup>- ggcatcatgtactaggatacagtcg -3<sup>，</sup> | 40.1 | 64% |
| F2 | 5<sup>，</sup>- gtagacagattacattcagtctgactatg-3<sup>，</sup> | 38.2 | 65% |
| F3 | 5<sup>，</sup>-cacgacgtgtgcacgactctagtacg-3<sup>，</sup> | 38.2 | 73% |
| F4 | 5<sup>，</sup>- gtggcatcgtctcgtatagcgacgcag-3<sup>，</sup> | 36.2 | 66% |
| F5 | 5<sup>，</sup>-cggactagtgcgagtatcgtcgcag-3<sup>，</sup> | 34.2 | 68% |
| F6 | 5<sup>，</sup>- cgtgcattcactgctgagtgcatgcc -3<sup>，</sup> | 38.2 | 73% |
二、引物序列获得的方法
1、同源序列的获得和同源引物设计
通过NCBI进行检索，分别获得刺五加（注册号：JQ905593）、拟南芥（注册号：AY488113）、三七（注册号：KP702301）、人参（注册号：GU565098）、西洋参（注册号：FJ755158HMGR）的HMGR序列并在NCBI上应用blast进行同源序列分析，再采用Clustal X软件进行多序列同源性比对，根据HMGR ORF区的保守区设计HMGR同源PCR引物（HMGR引物序列：上游Fa：5，-agtaaattcagggggagtcata-3， 和下游Fb：5，-caccattttcaactttaactggtg-3，），该引物在后续五加皮DNA样品PCR中验证能够扩增得到DNA片段，说明PCR引物在五加皮同样具有保守性。18S rRNA在不同物种间具有高度保守性，通过NCBI进行检索，分别获得刺五加（注册号：AB080245）、拟南芥（注册号：X16077）、三七（注册号：AB027525）、人参（注册号：D83275）、西洋参（注册号：D85172）18S rRNA基因序列，并在NCBI上应用blast进行同源序列分析，再采用Clustal X软件进行多序列同源性比对，根据18S rRNA的保守区设计同源PCR引物(18S rRNA引物：上游Fc：5，-ggtcgacgcgggctctggct-3， 和下游Fd：5，-gcggttcgccgccggcgacgtcg-3，)，该引物在后续五加皮和香加皮DNA样品PCR中验证能够扩增得到DNA片段，说明PCR引物在五加皮同样具有保守性。
2、样品总RNA提取
分别取五加皮和香加皮鲜根组织100 mg置于研钵中，加入l.0 mL Trizol充分研磨，研磨过程中不断加入液氮。将匀浆移入1.5 mL EP管，冰浴5分钟。每管加入0.2 mL氯仿，震荡15 s，冰浴2~3 min。12000 r/min，4℃离心5 min，吸取上清液移入1.5 mL新EP管中，加入0.5 mL异丙醇，轻轻地上下颠倒混匀，冰浴10 min。12000 r/min，4℃离心5 min，弃去上清液，加1 mL 75％ DEPC水配制的乙醇，震荡拍匀使RNA沉淀重新悬浮。12000 r/min，4℃离心5 min，缓慢倾倒EP管弃去上清液，超净工作台下EP管倒置于无菌吸水纸上，自然干燥30min，加入0.1% DEPC水20~50 μL混匀、溶解RNA，-80℃冰箱中保存备用。
3、总RNA检测
取琼脂糖粉末80 g和1.0×TAE 80 mL置于三角烧杯中，然后放于微波炉中缓慢加热，直至琼脂糖粉末完全溶于TAE溶液中呈现透明液体状态，取出烧杯，自然冷却至50℃~60℃之间时，加入极少量的EB，轻轻摇动烧杯使其混匀溶解，再沿着凝胶槽边缓缓倒入已插入梳子的凝胶槽，等待10~20min后完全冷却凝固后，拔出梳子。
取RNA样品5 μL和1 μL Lording buffer混合均匀后加入凝胶块样品孔，置于电泳槽中80 V电泳1.5 h，取出凝胶块置于凝胶成像系统中观察RNA分离情况。另取5 μL RNA样品溶解于690 μL蒸馏水中，混匀，紫外分光光度计中测定OD值。取RNA样品 OD260/OD280>1.8进行后续实验操作。
4、3'-RACE扩增获取ORF下游UTR和ITS
（1）反转录合成cDNA第一链
在100μL PCR管中建立3'-RACE cDNA第一链合成体系（如下表），其中3'-CDS 引物为试剂盒所带引物：
| 反应试剂 | 用量 |
| 总 RNA | 30 μL |
| 3'-CDS 引物 | 10 μL |
| Nuclease-free Water | 10 μL |
| Total | 50 μL |
将以上反应体系混匀，70℃水浴120s后，冰浴120s，迅速离心后分别加入下表的试剂。混合各组分并离心，恒温金属浴中42℃反应90 min,每管中加入0.1mL TE缓冲液稀释反应体系，72℃反应7min，所得样品-70℃保存。
| 反应试剂 | 用量 |
| 上述反应液 | 10 μL |
| DL-Dithiothreitol | 5 μL |
| dNTP Mix | 5 μL |
| 反转录酶 | 5 μL |
| Nuclease-free Water | 25 μL |
| Total | 50 μL |
（2）RACE PCR反应
按照下表加入各成分，其中通用引物是与CDS配对的引物，3'-RACE的上游引物（试剂盒所带引物），3'GSP为3'-RACE的下游引物，即为上述设计合成的引物Fa和Fb（或Fc和Fd）。变性温度94℃，退火温度55℃，每循环一次温度下降1℃，总共30循环。
| 反应试剂 | 用量 |
| 上述反应液 | 2 μL |
| 3'GSP | 2 μL |
| 通用引物Fa和Fb（或Fc和Fd） | 10 μL |
| 10X PCR Buffer | 10 μL |
| dNTP Mix | 2 μL |
| DNA聚合酶 | 2 μL |
| Nuclease-free Water | 22μL |
| Total | 50μL |
5、PCR产物测序
采用高通量测序仪Hiseq 2500对PCR产物进行测序。五加皮HMGR样品测序数据包括部分ORF和全部 3'-UTR序列。五加皮和香加皮18s rRNA样品测序数据包括部分18s rRNA序列和3'下游部分ITS序列。测序所得五加皮HMGR 3'-UTR序列如序列表SEQ ID NO.1、五加皮rRNA ITS SEQ ID NO.2、香加皮rRNA ITS的引物SEQ ID NO.3。
6、引物设计及BLAST检验
将测序数据利用 NCBI的BLAST功能进行序列同源性比对，寻找特异性序列，采用Primer 3 Input 设计引物。设计引物时，GC%设置在45~55%，解链温度（Tm）设置在60~65℃所得引物序列分别为：
(1)基于五加皮HMGR 3'-UTR的引物：F1：5，-ggcatcatgtactaggatacagtcg-3，
，F2：5，- gtagacagattacattcagtctgactatg -3，
(2)基于五加皮rRNA ITS的引物：F3：5，-cacgacgtgtgcacgactctagtacg-3，
，F4：5，- gtggcatcgtctcgtatagcgacgcag -3，
(3)基于香加皮rRNA ITS的引物：F5：5，-cggactagtgcgagtatcgtcgcag-3，
，F6：5，- cgtgcattcactgctgagtgcatgcc -3，
采用DNA合成仪对上述引物进行合成，即得到鉴定引物的白色晶体。
上述引物序列经NCBI的nucleotide blast比对后Max score均不超过41，Querycover均不超过75%，并且在公布的五加科植物中未检出Query cover超过50%的序列，说明引物序列特异性高；最大Max score和Query cover数据如下：
| 引物序号 | 引物序列 | Max score | Query cover |
| F1 | 5<sup>，</sup>- ggcatcatgtactaggatacagtcg -3<sup>，</sup> | 40.1 | 64% |
| F2 | 5<sup>，</sup>- gtagacagattacattcagtctgactatg-3<sup>，</sup> | 38.2 | 65% |
| F3 | 5<sup>，</sup>-cacgacgtgtgcacgactctagtacg-3<sup>，</sup> | 38.2 | 73% |
| F4 | 5<sup>，</sup>- gtggcatcgtctcgtatagcgacgcag-3<sup>，</sup> | 36.2 | 66% |
| F5 | 5<sup>，</sup>-cggactagtgcgagtatcgtcgcag-3<sup>，</sup> | 34.2 | 68% |
| F6 | 5<sup>，</sup>- cgtgcattcactgctgagtgcatgcc -3<sup>，</sup> | 38.2 | 73% |
三、引物序列的应用
本发明所得三对引物序列，用于对五加皮和香加皮的检验，检验样品可以是鲜品也可以是干品或不破坏DNA的炮制品。
1、样品DNA提取，具体步骤如下：
Ⅰ、取1.0~1.5g的样品置于研钵中，在研钵中加入液氮没过样品，快速研磨；
Ⅱ、研磨后的样品装至2.0mL的EP管中，加入800μL的CTAB抽提液（pH 8.0 65℃）至浸没样本，轻轻晃动混匀；
Ⅲ、将EP管65℃水浴，30min~60min，每10min将EP管轻摇混匀溶液，4℃，12000rpm，离心10min；
Ⅳ、取上清液于新的2.0mL离心管，并加入等体积的苯酚：氯仿溶液（V/V=1：1），轻摇2min使其充分混匀，静置10min；4℃，12000rpm，离心15min；
Ⅴ、取上清液于新的2.0mL离心管，并加入等体积的氯仿：异戊醇溶液（V/V=24：1），轻摇混匀，将试管放入离心机中离心，4℃，12000rpm，离心10min；
Ⅵ、取上清液于新的1.5mL离心管，加入2倍体积的无水乙醇并放置于-20℃冰箱中冷冻30min，沉淀DNA；取出，4℃，12000rpm，离心10min；
Ⅶ、加70%的乙醇清洗EP管中的DNA，置于净化台上风干；
Ⅷ、将风干后装有DNA的试管加入200μL的1×TE溶液溶解，通过A260值计算DNA的质量浓度，并将其统一稀释至50.0ng/μl。
2、鉴定PCR：
将鉴定引物F1、F2以及引物F3、F4和F5、F 6分别用0.1% DEPC水溶解得6μmol/L溶液，在EP管中按下表顺序依次加入PCR反应试剂：
| 试剂 | 加入体积（μL） |
| 模板DNA（50 ng/μL） | 4.0 |
| 引物F1和F2（或F3、F4或F5、F 6）（6 μmol/L） | 2.0 |
| Mg<sup>2+</sup>（3 mmol/L） | 1.0 |
| dNTP（0.1 mmol/L） | 4.0 |
| Taq DNA 聚合酶（2 U） | 4.0 |
| 双蒸水 | 5.0 |
将EP管置于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应：
预变性：95℃ 30秒，1个循环；
PCR反应：95℃ 5秒，60℃ 30秒，40个循环。
3、PCR产物电泳检测
取琼脂糖粉末80 g和加入1.0×TAE 80mL置于三角烧杯中，然后放于微波炉中缓慢加热，直至琼脂糖粉末完全溶于TAE溶液中呈现透明液体状态，取出烧杯，自然冷却至50℃-60℃之间时，加入极少量的EB，轻轻摇动烧杯使其混匀溶解，再沿着凝胶槽边缓缓倒入已插入梳子的凝胶槽，等待10-20min后完全冷却凝固后，拔出梳子。
取PCR产物5 μL和1 μL Lording buffer混合均匀后加入凝胶块样品孔，置于电泳槽中80 V电泳1.5 h，取出凝胶块置于凝胶成像系统中观察DNA分离情况。若样品五加皮HMGR 3'-UTR（F1和F2）和五加皮rRNA ITS（F3和F4）均为阳性（电泳有条带），则为五加皮。若仅香加皮rRNA ITS（F5和F6）为阳则为香加皮（如附图2）。若三对引物扩增均为阴性，则为除五加皮和香加皮外其他材料。
本发明的有益效果：一、本发明的三对引物基于高度特异的3'-UTR和rRNA ITS序列，经同源性分析，超过50%同源性的序列未检索到，引物序列特异性高，能够精确的鉴定五加皮和香加皮样品。二、本发明中的三对引物在五加皮和香加皮全基因组序列未知的情况下采用RACE技术扩增获得下游序列，并通过高通量测序获得，属于新发现的序列片段，并具有中药鉴定的功能。三、本发明的引物的应用时，样品提取DNA而不是RNA，这样对样品要求较低，可以是鲜品、干品或者简单炮制后（对DNA破坏低的炮制方法）的样品。
附图说明
图1是本发明引物序列的获得方法及引物序列的应用的流程图。
图2是本发明PCR鉴定的电泳图。
具体实施方式
实施例一：引物序列获得的方法
1、同源序列的获得和同源引物设计
通过NCBI进行检索，分别获得刺五加（注册号：JQ905593）、拟南芥（注册号：AY488113）、三七（注册号：KP702301）、人参（注册号：GU565098）、西洋参（注册号：FJ755158HMGR）的HMGR序列并在NCBI上应用blast进行同源序列分析，再采用Clustal X软件进行多序列同源性比对，根据HMGR ORF区的保守区设计HMGR同源PCR引物（HMGR引物序列：上游Fa：5，-agtaaattcagggggagtcata-3， 和下游Fb：5，-caccattttcaactttaactggtg-3，），该引物在后续五加皮DNA样品PCR中验证能够扩增得到DNA片段，说明PCR引物在五加皮同样具有保守性。18S rRNA在不同物种间具有高度保守性，通过NCBI进行检索，分别获得刺五加（注册号：AB080245）、拟南芥（注册号：X16077）、三七（注册号：AB027525）、人参（注册号：D83275）、西洋参（注册号：D85172）18S rRNA基因序列，并在NCBI上应用blast进行同源序列分析，再采用Clustal X软件进行多序列同源性比对，根据18S rRNA的保守区设计同源PCR引物(18S rRNA引物：上游Fc：5，-ggtcgacgcgggctctggct-3， 和下游Fd：5，-gcggttcgccgccggcgacgtcg-3，)，该引物在后续五加皮和香加皮DNA样品PCR中验证能够扩增得到DNA片段，说明PCR引物在五加皮同样具有保守性。
2、样品总RNA提取
分别取五加皮和香加皮鲜根组织100 mg置于研钵中，加入l.0 mL Trizol充分研磨，研磨过程中不断加入液氮。将匀浆移入1.5 mL EP管，冰浴5分钟。每管加入0.2 mL氯仿，震荡15 s，冰浴2~3 min。12000 r/min，4℃离心5 min，吸取上清液移入1.5 mL新EP管中，加入0.5 mL异丙醇，轻轻地上下颠倒混匀，冰浴10 min。12000 r/min，4℃离心5 min，弃去上清液，加1 mL 75％ DEPC水配制的乙醇，震荡拍匀使RNA沉淀重新悬浮。12000 r/min，4℃离心5 min，缓慢倾倒EP管弃去上清液，超净工作台下EP管倒置于无菌吸水纸上，自然干燥30min，加入0.1% DEPC水20~50 μL混匀、溶解RNA，-80℃冰箱中保存备用。
3、总RNA检测
取琼脂糖粉末80 g和1.0×TAE 80 mL置于三角烧杯中，然后放于微波炉中缓慢加热，直至琼脂糖粉末完全溶于TAE溶液中呈现透明液体状态，取出烧杯，自然冷却至50℃~60℃之间时，加入极少量的EB，轻轻摇动烧杯使其混匀溶解，再沿着凝胶槽边缓缓倒入已插入梳子的凝胶槽，等待10~20min后完全冷却凝固后，拔出梳子。
取RNA样品5 μL和1 μL Lording buffer混合均匀后加入凝胶块样品孔，置于电泳槽中80 V电泳1.5 h，取出凝胶块置于凝胶成像系统中观察RNA分离情况。另取5 μL RNA样品溶解于690 μL蒸馏水中，混匀，紫外分光光度计中测定OD值。取RNA样品 OD260/OD280>1.8进行后续实验操作。
4、3'-RACE扩增获取ORF下游UTR和ITS
（1）反转录合成cDNA第一链
在100μL PCR管中建立3'-RACE cDNA第一链合成体系（如下表），其中3'-CDS 引物为试剂盒所带引物：
| 反应试剂 | 用量 |
| 总 RNA | 30 μL |
| 3'-CDS 引物 | 10 μL |
| Nuclease-free Water | 10 μL |
| Total | 50 μL |
将以上反应体系混匀，70℃水浴120s后，冰浴120s，迅速离心后分别加入下表的试剂。混合各组分并离心，恒温金属浴中42℃反应90 min,每管中加入0.1mL TE缓冲液稀释反应体系，72℃反应7min，所得样品-70℃保存。
| 反应试剂 | 用量 |
| 上述反应液 | 10 μL |
| DL-Dithiothreitol | 5 μL |
| dNTP Mix | 5 μL |
| 反转录酶 | 5 μL |
| Nuclease-free Water | 25 μL |
| Total | 50 μL |
（2）RACE PCR反应
按照下表加入各成分，其中通用引物是与CDS配对的引物，3'-RACE的上游引物（试剂盒所带引物），3'GSP为3'-RACE的下游引物，即为上述设计合成的引物Fa和Fb（或Fc和Fd）。变性温度94℃，退火温度55℃，每循环一次温度下降1℃，总共30循环。
| 反应试剂 | 用量 |
| 上述反应液 | 2 μL |
| 3'GSP | 2 μL |
| 通用引物Fa和Fb（或Fc和Fd） | 10 μL |
| 10X PCR Buffer | 10 μL |
| dNTP Mix | 2 μL |
| DNA聚合酶 | 2 μL |
| Nuclease-free Water | 22μL |
| Total | 50μL |
5、PCR产物测序
采用高通量测序仪Hiseq 2500对PCR产物进行测序。五加皮HMGR样品测序数据包括部分ORF和全部 3'-UTR序列。五加皮和香加皮18s rRNA样品测序数据包括部分18s rRNA序列和3'下游部分ITS序列。测序所得五加皮HMGR 3'-UTR序列如序列表SEQ ID NO.1、五加皮rRNA ITS SEQ ID NO.2、香加皮rRNA ITS的引物SEQ ID NO.3。
6、引物设计及BLAST检验
将测序数据利用 NCBI的BLAST功能进行序列同源性比对，寻找特异性序列，采用Primer 3 Input 设计引物。设计引物时，GC%设置在45~55%，解链温度（Tm）设置在60~65℃所得引物序列分别为：
(1)基于五加皮HMGR 3'-UTR的引物：F1：5，-ggcatcatgtactaggatacagtcg-3，
，F2：5，- gtagacagattacattcagtctgactatg -3，
(2)基于五加皮rRNA ITS的引物：F3：5，-cacgacgtgtgcacgactctagtacg-3，
，F4：5，- gtggcatcgtctcgtatagcgacgcag -3，
(3)基于香加皮rRNA ITS的引物：F5：5，-cggactagtgcgagtatcgtcgcag-3，
，F6：5，- cgtgcattcactgctgagtgcatgcc -3，
采用DNA合成仪对上述引物进行合成，即得到鉴定引物的白色晶体。
上述引物序列经NCBI的nucleotide blast比对后Max score均不超过41，Query
cover均不超过75%，并且在公布的五加科植物中未检出Query cover超过50%的序列，说明
引物序列特异性高；最大Max score和Query cover数据如下：
| 引物序号 | 引物序列 | Max score | Query cover |
| F1 | 5<sup>，</sup>- ggcatcatgtactaggatacagtcg -3<sup>，</sup> | 40.1 | 64% |
| F2 | 5<sup>，</sup>- gtagacagattacattcagtctgactatg -3<sup>，</sup> | 38.2 | 65% |
| F3 | 5<sup>，</sup>-cacgacgtgtgcacgactctagtacg-3<sup>，</sup> | 38.2 | 73% |
| F4 | 5<sup>，</sup>- gtggcatcgtctcgtatagcgacgcag -3<sup>，</sup> | 36.2 | 66% |
| F5 | 5<sup>，</sup>-cggactagtgcgagtatcgtcgcag-3<sup>，</sup> | 34.2 | 68% |
| F6 | 5<sup>，</sup>- cgtgcattcactgctgagtgcatgcc -3<sup>，</sup> | 38.2 | 73% |
实施例二：引物序列的应用
本发明所得三对引物序列，用于对五加皮和香加皮的检验，检验样品可以是鲜品也可以是干品或不破坏DNA的炮制品。
1、样品DNA提取，具体步骤如下：
Ⅰ、取1.0~1.5g的样品置于研钵中，在研钵中加入液氮没过样品，快速研磨；
Ⅱ、研磨后的样品装至2.0mL的EP管中，加入800μL的CTAB抽提液（pH 8.0 65℃）至浸没样本，轻轻晃动混匀；
Ⅲ、将EP管65℃水浴，30min~60min，每10min将EP管轻摇混匀溶液，4℃，12000rpm，离心10min；
Ⅳ、取上清液于新的2.0mL离心管，并加入等体积的苯酚：氯仿溶液（V/V=1：1），轻摇2min使其充分混匀，静置10min；4℃，12000rpm，离心15min；
Ⅴ、取上清液于新的2.0mL离心管，并加入等体积的氯仿：异戊醇溶液（V/V=24：1），轻摇混匀，将试管放入离心机中离心，4℃，12000rpm，离心10min；
Ⅵ、取上清液于新的1.5mL离心管，加入2倍体积的无水乙醇并放置于-20℃冰箱中冷冻30min，沉淀DNA；取出，4℃，12000rpm，离心10min；
Ⅶ、加70%的乙醇清洗EP管中的DNA，置于净化台上风干；
Ⅷ、将风干后装有DNA的试管加入200μL的1×TE溶液溶解，通过A260值计算DNA的质量浓度，并将其统一稀释至50.0ng/μl。
2、鉴定PCR：
将鉴定引物F1、F2以及引物F3、F4和F5、F 6分别用0.1% DEPC水溶解得6μmol/L溶液，在EP管中按下表顺序依次加入PCR反应试剂：
| 试剂 | 加入体积（μL） |
| 模板DNA（50 ng/μL） | 4.0 |
| 引物F1和F2（或F3、F4或F5、F 6）（6 μmol/L） | 2.0 |
| Mg<sup>2+</sup>（3 mmol/L） | 1.0 |
| dNTP（0.1 mmol/L） | 4.0 |
| Taq DNA 聚合酶（2 U） | 4.0 |
| 双蒸水 | 5.0 |
将EP管置于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应：
预变性：95℃ 30秒，1个循环；
PCR反应：95℃ 5秒，60℃ 30秒，40个循环。
3、PCR产物电泳检测
取琼脂糖粉末80 g和加入1.0×TAE 80mL置于三角烧杯中，然后放于微波炉中缓慢加热，直至琼脂糖粉末完全溶于TAE溶液中呈现透明液体状态，取出烧杯，自然冷却至50℃-60℃之间时，加入极少量的EB，轻轻摇动烧杯使其混匀溶解，再沿着凝胶槽边缓缓倒入已插入梳子的凝胶槽，等待10-20min后完全冷却凝固后，拔出梳子。取PCR产物5 μL和1 μLLording buffer混合均匀后加入凝胶块样品孔，置于电泳槽中80 V电泳1.5 h，取出凝胶块置于凝胶成像系统中观察DNA分离情况。
如附图2所示，加样如下表所示：
| 泳道 | 样品 | 引物 | PCR扩增长度 |
| 1 | A | F1和F2 | 259 bp |
| 2 | A | F3和F4 | 217 bp |
| 3 | A | F5和F6 | 286 bp |
| 4 | B | F1和F2 | 259 bp |
| 5 | B | F3和F4 | 217 bp |
| 6 | B | F5和F6 | 286 bp |
结合附图2和上表，样品A在引物F1和F2扩增下为阳性，在引物F3和F4扩增下为阳性，以及F5和F6扩增下为阴性，则样品A为五加皮。样品B在引物F1和F2以及F3和F4扩增下为阴性，在引物F5和F6扩增下为阳性，则样品B为香加皮。
SEQ ID NO.1：五加皮HMGR 3'-UTR序列
agtaaattca gggggagtca taggatagat cattacgtgt cagtcgtagc cgatcgtacg
gctagcatgc gctagcagct cgatgctagc cgatgcatgc ggtagcacgt gcatgctagc
cgatcgggtg gctagctgag gctagctagt cgatcgatgc gctagctagc cgatgctagg
cagtcgatcg tacgtacgtg caccattttc aactttaact ggtgactggt gcgctacggt
gcatcgtacg cagtcgatcg gcatagctag cgatcgatcg cgatgctagc cagctaggtg
ggcatcatgt actaggatac agtcgtacgg gcatgctacg gctacggtac gcatgcgtac
cagtcgatcg gctagctagg cagtcgatcg cgatcgatgc actatacgtg tagctagcta
cgatcgacgt cgatcgatgc cacgtacggt ccgtacgtgt gctgatgctg cgatgctagg
gctacgtagg ctgagctagg gctagctagc acgatcgatg cgatcgatcg catagtcaga
ctgaatgtaa tctgtctaca cgatgcatgc cgatcgataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa
SEQ ID NO.2：五加皮rRNA ITS序列
ggtaatcttt gaaatttcat cgtgatgggg gatagatcat tgcaattgtt ggtcttcaac
gaggaattcc tagtaagcgc gagtcatcag ctcgcgttga ctacgtccct gccctttgta
cacaccgccc gtcgctccta ccgattgaat ggtccggtga agtgttcgga tcgcggcgac
gtgggcggtt cgccgccggc gacgtcgcga gaagttcact gaaccttatc atttagagga
aggagaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt gaacctgcag aaggatcaga tacgtagtca
acccgtacgt tcgacaaggt ttgggcagag tatagctagt aacgtcgtca actcgtagct
actttggtgc tgtgtgtaac tttgtgtggt acattcgtag cacgacgtgt gcacgactct
agtacgcatc tgtacgtgtg tgctagctag tgcatgctgt tagctgatcg taccctaggt
tagctgatgt ccgatgcttt atcgtagcgt tagctacgat tacgatcggt tacggcgtgt
tgctatgttg gcatgctagc gctagcatgc cccgttttaa cgatcgtatt ctgcgtcgct
atacgagacg atgccacact tggcatgcat acggtagcgt acgatcgatg acgatcatat
tacgatcgta atctatttgc actgtaggtg tacgtagtgt cagctacggg acgatttgca
atgctag
SEQ ID NO.3：香加皮rRNA ITS序列
Ggtaatcttt gaaatttcat cgtgatggga gatagatcat tgcaattgtt ggtcttcaac
gaggaattcc tagtaagcgc gagtcatcag ctcgcgttga ctacgtccct gccctttgta
cacaccgccc gtcgctccta ccgattgaat ggtccggtga agtgttcgga tcgcggcgac
gtgggcggtt cgccgccggc gacgtcgcga gaagttcact gaaccttatc atttagagga
aggagaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt gaacctgcag aaggatcaga aacgtacggc
acgtacggct cacggtggtg atcgttgtgt acgtacggtg acgtcagtgg gcatgctagc
cgatgctacg cggactagtg cgagtatcgt cgcagtgtgt gtgctagcga tggtgtgtgg
cacgatcgta gctagctgtg gctagctagc ggtgcgttgg cagctagctg gctagctggt
gctagctaga cacgtagctg ttgtgtggtg gtgatgttta cacaggtgtg cacgtggtgt
tgctagctga cagtcgtagc cagctgatgt tgtgtgtagc cgatcgtagc cacgatcgtc
cagctagcta gtgtgtgacg gcatcggtag ggcatgcact cagcagtgaa tgcacgactg
cgatgcatgc cgatcgatag tagctagctg cgatcgtagt cgatcgtagc gctagctagc
gctagctagg atcgtagccg cagttttaca atcgtgtggt
SEQ ID NO.4： 基于五加皮HMGR 3'-UTR的上游引物F1：
5，-ggcatcatgtactaggatacagtcg-3，
SEQ ID NO.5： 基于五加皮HMGR 3'-UTR的下游引物F2：
5，- gtagacagattacattcagtctgactatg -3，
SEQ ID NO.6：基于五加皮rRNA ITS的上游引物F3：
5，-cacgacgtgtgcacgactctagtacg-3，
SEQ ID NO.7：基于五加皮rRNA ITS的下游引物F4：
5，- gtggcatcgtctcgtatagcgacgcag -3，
SEQ ID NO.8：基于香加皮rRNA ITS的上游引物F5：
5，-cggactagtgcgagtatcgtcgcag-3，
SEQ ID NO.9：基于香加皮rRNA ITS的下游引物F6：
5，- cgtgcattcactgctgagtgcatgcc -3，
Claims (1)
1.一种基于HMGR 3'-UTR和rRNA ITS引物在鉴别五加皮和香加皮中的应用，其特征在于，通过如下步骤实现：（1）样品DNA提取，（2）鉴定PCR，（3）PCR产物电泳检测；其中，所述鉴定PCR所用引物序列如序列表SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.9所示。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN201510693701.2A CN105316325B (zh) | 2015-10-24 | 2015-10-24 | 一种基于HMGR 3’-UTR和rRNA ITS的引物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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Publications (2)
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Family Applications (1)
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| CN201510693701.2A Active CN105316325B (zh) | 2015-10-24 | 2015-10-24 | 一种基于HMGR 3’-UTR和rRNA ITS的引物及其应用 |
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-
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Non-Patent Citations (4)
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| Microsatellite variability and its use in the characterization of cultivated clones of Hevea brasiliensis;T. Saha等;《Plant Breeding》;20051231;第124卷;第86-92页 * |
| 三七3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A 还原酶基因的克隆和生物信息学分析;张萍等;《中草药》;20140930;第45卷(第18期);第2684-2690页 * |
| 刺五加 HMGR 基因的克隆与表达分析;邢朝斌等;《江苏农业学报》;20121231;第28卷(第6期);第1258-1262页 * |
| 应高度重视五加皮和香加皮的区别;谢斌;《中国药业》;20101231;第19卷(第12期);第81页 * |
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