CN101984054A

CN101984054A - 从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交总rna的方法

Info

Publication number: CN101984054A
Application number: CN 201010551781
Authority: CN
Inventors: 伍婷; 汪以真; 袁章琴
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-11-19
Filing date: 2010-11-19
Publication date: 2011-03-09
Anticipated expiration: 2030-11-19
Also published as: CN101984054B

Abstract

本发明公开了一种从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法，包括以下步骤：1)组织研磨和Trizol裂解；2)氯仿抽提：在裂解组织中加入氯仿进行RNA提取；3)氯仿再次抽提：取步骤2)所得的上清，加入氯仿抽提；4)异丙醇沉淀：取步骤3)所得的水相，加入与水相等体积的异丙醇，均匀混合；5)总RNA洗涤：在步骤4)所得的沉淀中加入质量浓度75％的乙醇，将沉淀吹打悬浮；6)总RNA溶解：将步骤5)所得的沉淀于室温超净台内进行干燥，得总RNA沉淀；再用RNase-free水溶解总RNA沉淀。采用该方法提取用于基因芯片杂交的总RNA具有方便、快捷的特点。

Description

从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交总RNA的方法

技术领域

本发明属于一种从动物脂肪组织中提取总RNA的方法，特别是一种涉及到提取动物脂肪组织中总RNA样品用于基因芯片研究的方法。

背景技术

脂肪组织不仅是机体的能量储存库，还是体内最大的内分泌器官。动物脂肪组织在生后初期有细胞数量的增生，但仍以细胞体积的增大为主，特别是在后期或成年期极易在体内贮积。脂肪代谢包括脂肪动员(脂肪降解)、体内运转和脂肪贮存(脂肪合成)。动物体脂的沉积量是脂肪合成代谢和分解代谢的一种平衡状态。当合成代谢增强，或分解代谢降低时，会打破原有的平衡而导致脂肪沉积量的增加。当脂肪分解多于合成时，则体内脂肪减少。深入了解脂肪代谢的调控机制，将有助于控制动物脂肪的沉积量和提高胴体品质。为了寻找调控指脂肪沉积的关键新基因，将采用基因芯片、生物信息学分析、等现代分子生物学技术筛选一批与肌内脂肪沉积相关的差异表达新基因，而其首要任务则为高质量、高纯度RNA的提取。

目前RNA的提取技术已非常成熟，也有大量利用各种方法和商业化试剂成功提取高质量RNA的文献报道，尽管这些方法和试剂具有诸多优点，如方法简单、提取的RNA质量高等，但当遇到组织RNA的丰度极低，且RNA产品中常伴有基因组DNA污染等问题时，按照常规步骤操作往往不能取得理想的结果；由于组织的特异性，脂肪组组织富含脂类物质，单位体积细胞数较少，成熟脂肪细胞内含有各种细胞器、细胞核以及与其他类型细胞不同的一个大的中央脂滴。且单位细胞RNA含量也相对较少，每毫克组织样品所含总RNA的量小于0.05μg，因而所提RNA的得率较低，这增加了从脂肪组织提取RNA的难度。而且用于基因芯片的脂肪组织中的RNA一般都是用试剂盒提取的，价格比较昂贵，试剂盒的购买都是来自国外，购买起来也十分不方便。因此，摆脱试剂盒的束缚，寻求一种常规、经济和快捷的方法提取动物脂肪组织中的总RNA以用于基因芯片研究，并且在实际操作中应根据试验的需要选择或改进相应的方法，以期达到预期的目的，显得尤为迫切。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种方便、快捷的从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法，包括以下步骤：

1)、组织研磨和Trizol裂解：

选择以下任意一种方式：

取0.4～0.6g液氮速冻脂肪，于液氮条件下研磨成组织粉末，然后将组织粉末用5ml Trizol进行充分裂解，得裂解组织；

取1g的脂肪，于液氮条件下进行研磨；然后加入9～11ml的Trizol进行裂解，得裂解组织；

2)、氯仿抽提：在裂解组织中加入1.8～2.2ml氯仿进行RNA提取，剧烈震荡后于4℃高速离心15min；

3)、氯仿再次抽提：取步骤2)所得的上清，加入氯仿，氯仿与上清的体积比为1∶2～4；剧烈震荡后于4℃高速离心15min；

4)、异丙醇沉淀：取步骤3)所得的水相(位于上层)，加入与水相等体积的异丙醇，均匀混合(轻柔上下颠倒5-6次)后，然后于冰上放置5分钟，再4℃高速离心10min；

5)、总RNA洗涤：在步骤4)所得的沉淀中加入质量浓度75％的乙醇，将沉淀吹打悬浮，于4℃高速离心8min；质量浓度75％的乙醇是步骤1)中Trizol体积的55～65％；

6)、总RNA溶解：将步骤5)所得的沉淀于室温超净台内进行干燥，得总RNA沉淀；再用RNase-free水溶解总RNA沉淀。

作为本发明的从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法的改进：步骤2)～5)中的高速离心的速度为15300×g。

作为本发明的从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法的改进：步骤1)～步骤6)在无RNA酶污染状态下进行。且上述所有步骤连续无间隔的进行；若因突发事件无法继续试验，可暂将Trizol裂解后的组织液(即步骤1)所得的裂解组织)直接保存于-80℃保存。

在本发明中，步骤3)为必须的一个关键步骤。

在本发明中，动物是是畜类，优选猪。

本发明方法的检测结果表明：所得总RNA样品完全满足RT-PCR、构建cDNA文库，制基因芯片等相关实验的要求，为进一步从分子水平研究猪脂肪沉积及其代谢特性提供方法上的参考依据。

本发明具有如下有益效果：

1.通过此方法提取的总RNA，质量高，1g脂肪组织中约可提出120μg总RNA，浓度达1μg/μl，可以完全满足并可直接用于后续研究基因芯片杂交用。

2.本方法操作简单，所用试剂经济实惠，方法简单易行。

3、本方法相对于昂贵的试剂盒提取总RNA用于基因芯片实验，成本低。

附图说明

结合附图对本发明的具体实施方案作进一步详细说明：

图1是本发明的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的降解结果；

图2是Agilent 2100bioanalyzer检测RNA的完整性结果。

具体实施方式

实施例1、一种从猪皮下脂肪中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法，依次进行以下步骤，下述步骤1)～步骤6)均在无RNA酶污染的状态下进行：

1)、组织研磨和Trizol裂解：

将猪皮下脂肪组织切取100mg左右放入研钵，在液氮环境中研成粉末，装入1.5ml的eppendorf管，再加入1ml的Trizol剧烈摇晃约5min；使其充分裂解，得裂解组织；

2)、氯仿抽提：

在步骤1)所得的裂解组织中加入200μl氯仿进行RNA提取，剧烈振荡3分钟待其充分混合后，于室温放置5min，再于4℃，15300rmp离心15min；离心后可见明显分层，吸取上层清澈液体(即上清，约600μl)；

3)、氯仿再次抽提：

在步骤2)所得的上清中加入200μl氯仿，剧烈振荡片刻(约3分钟)后，于室温放置5min，于4℃，15300rmp离心15min，离心后可见明显分层，吸取上层清澈液体(作为水相，约500μl)；

4)、异丙醇沉淀：

在步骤3)所得的水相中加入等体积的异丙醇轻轻混匀(轻柔上下颠倒5-6次)，然后于冰上放置5分钟，再于4℃，15300rmp离心10min；

5)、总RNA洗涤：

弃步骤4)所得的上清，在步骤4)所得的沉淀中加入质量浓度75％乙醇(经DEPC处理，无RNA酶)0.6ml，振荡混匀后，4℃，15300rmp离心8min；

6)、总RNA溶解：

弃步骤5)所得的上清，将步骤5)所得的沉淀用滤纸吸干残余液体，置超净台面自然风干(约20min左右)；加入20～30μl RNase-free水溶解。

实施例2、提取的总RNA浓度测定和以期用于基因芯片杂交的质量检测(以实施例1所得的溶液作为样品)：

1)nanodrop-1000spectrophotometry测定样品在260、280及230nm的光密度及RNA浓度，并计算RNA的纯度。

2)电泳检测：①RNA变性：取RNase-free 1.5ml离心管，加入1.5μL RNA，5.5μL RNA变性缓冲液，65℃变性20min，稍离心，加入1.5μL 6×loading buffer(RNA专用)。

②琼脂糖凝胶电泳：配制2％的琼脂糖凝胶，100V恒压，10min电泳。③RNA电泳图拍照及分析。

3)RNA完整性分析：Agilent 2100 bioanalyzer检测RNA的完整性，并对RNA质量进行评分。

总RNA质量检测结果：采用nanodrop-1000spectrophotometry进行检测，所获得RNA的OD(260nm)/OD(280nm)比值在1.90-2.00之间，OD(260nm)/OD(230nm)比值在1.60-1.90之间。RNA浓度在600-1000ng/μL之间。所获得的浓度及产量完全满足基因芯片杂交的要求。因此，可推算得知实施例1所得的总RNA为12～20μg。

通过电泳结果检测，发现RNA基本没有降解，电泳条带清晰无拖尾现象，且纯度高、完整性好。

进一步RNA完整性检测结果显示，RNA完整性好，总RNA质量评分均在8.0以上，完全可满足并可直接用于基因芯片杂交的要求。上述样品耗费不超过10元，大大节约了成本。

对比例1、将同实施例1的100mg左右的猪皮下脂肪组织按照目前常规的Trizol/氯仿一次性12000×g离心提取法提取RNA，结果如下：

总RNA质量检测结果：采用nanodrop-1000spectrophotometry进行检测，所获得RNA的OD(260nm)/OD(280nm)比值在1.90-2.00之间，但OD(260nm)/OD(230nm)比值在1.00-1.30之间。所提取的RNA量小于2μg。所得产物不适宜直接用于芯片杂交。

通过电泳结果检测，发现RNA基本没有降解，电泳条带较为清晰无拖尾现象，纯度一般，完整性一般。

进一步RNA完整性检测结果显示，RNA完整性一般，总RNA质量评分均在7.0-8.0之间，不可直接用于基因芯片杂交的要求。

对比例2、将同实施例1的100mg左右的猪皮下脂肪组织按照Qiagen公司生产的RNeasyLipid Tissue Mini Kit试剂盒进行提取RNA(3580元/kit)，每个样品制备至少需要70元，结果如下：

总RNA质量检测结果：采用nanodrop-1000spectrophotometry进行检测，所获得RNA的OD(260nm)/OD(280nm)比值在1.90-2.00之间，但OD(260nm)/OD(230nm)比值在1.70-2.00之间。约500mg的脂肪组织样品提取的RNA量约在12-25μg左右。所得产物可直接用于芯片杂交。

通过电泳结果检测，发现RNA完全没有降解，电泳条带清晰无拖尾现象，纯度高、完整性好。

进一步RNA完整性检测结果显示，RNA完整性好，总RNA质量评分均在8.5-9.5之间，并完全满足且可直接用于基因芯片杂交的要求。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、组织研磨和Trizol裂解：

选择以下任意一种方式：

2)、氯仿抽提：在裂解组织中加入1.8～2.2ml氯仿进行RNA提取，震荡后于4℃高速离心15min；

3)、氯仿再次抽提：取步骤2)所得的上清，加入氯仿，氯仿与上清的体积比为1∶2～4；震荡后于4℃高速离心15min；

4)、异丙醇沉淀：取步骤3)所得的水相，加入与水相等体积的异丙醇，均匀混合后，然后于冰上放置5分钟，再4℃高速离心10min；

5)、总RNA洗涤：在步骤4)所得的沉淀中加入质量浓度75％的乙醇，将沉淀吹打悬浮，于4℃高速离心8min；所述质量浓度75％的乙醇是步骤1)中Trizol体积的55～65％；

2.根据权利要求1所述的从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法，其特征是：所述步骤2)～5)中的高速离心的速度为15300×g。

3.根据权利要求2所述的从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法，其特征是：所述步骤1)～步骤6)在无RNA酶污染状态下进行。