CN111662940A - 一种定向制备右旋糖酐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定向制备右旋糖酐的方法，其采用的原料为青稞提取物，通过控制右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶二者的比例，可以定向制备不同分子量的右旋糖酐产品，即可制备得到右旋糖酐10、右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70、右旋糖酐100和右旋糖酐1000等产品。
Description
技术领域
本发明属于医药原料制备技术领域，具体涉及一种定向制备右旋糖酐的方法。
背景技术
青稞是一种高原谷类作物，主要是作为粮食食用、饲料，以及酿酒。研究发现，青稞中含有丰富的葡聚糖，是麦类作物中β-葡聚糖含量最高的作物。青稞在提取β葡聚糖时，通过水提法、酸法、减法等得到青稞多糖提取物，其中除含有一定量的β-葡聚糖外，还含有大量的其他多糖。现有的研究主要集中于青稞β-葡聚糖的提取制备与功能研究，中国专利申请CN107226871A公开了一种青稞β葡聚糖的制备方法，其以青稞麸皮为原料，经调浆，糊化后，接入商品化酿酒活性干酵母，利用酵母发酵，所得的发酵液经离心、浓缩、醇沉、水溶、过滤、真空冷冻干燥，最终得到得率为4.32-4.92％，纯度为85.25-91.61％，收得率为82-95％的青稞β-葡聚糖产品。中国专利申请CN105777932A公开了一种具有辅助降血糖功效的低分子量青稞β-葡聚糖的制备方法，是首先将青稞米粉碎成10～50目，然后加水，调节pH至8～10后提取1～2小时，回调pH至2.5～6.5，离心后在上清液中加入物料总重量0.1～0.4％的α-淀粉酶酶解40～60分钟，再加入物料总重量0.13％～0.4％糖化酶酶解40～60分钟，灭酶，离心、浓缩后醇沉、干燥即得数均分子量为6.827×102～7.968×104β-葡聚糖。
药用的右旋糖酐分子量在1万到10万之间，对人体具有扩增血容量、抗凝血、降低血液粘度的作用，被公认为优质的人工血浆制品和器官保护液并应用于临床。在食品行业中，右旋糖酐主要用于饮料和糕点的稳定剂、保湿剂、增稠剂和增量剂。面包中添加右旋糖酐提高柔软度；右旋糖酐能提高冷冻乳制品热冲击稳定性和熔融温度。右旋糖酐铁片可以口服，用于治疗缺铁性贫血。中国专利申请CN 102676615A公开了双酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐，其产品种类包括右旋糖酐70，右旋糖酐40以及右旋糖酐20；其制备步骤分为两大步，第一大步为高分子右旋糖酐的合成，首先是采用右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖制备高分子右旋糖酐，该新方法使蔗糖转化为右旋糖酐的转化率达到95％以上；第二大步为高分子右旋糖的可控性降解，采用高酶活性的右旋糖酐酶催化降解高分子右旋糖酐为药用右旋糖酐，实现右旋糖酐的分子量可控降解。该专利申请中右旋糖酐的生产原料一直都是以蔗糖为主，酶法生产右旋糖酐与发酵法生产右旋糖酐相比，酶法具有更好的可控性以及分子量的可调节性。
目前，还未出现采用青稞多糖提取物在制备右旋糖酐中的应用。
发明内容
本发明目的是提供一种新原料制备右旋糖酐的技术，以青稞的多糖提取物为原料定向制备不同分子量的右旋糖酐。
一种定向制备右旋糖酐的方法，该方法按照如下步骤进行：
(1)右旋糖酐蔗糖酶提取
制备得到肠膜明串珠菌培养液，获取粗酶液；
(2)青稞提取物酶解
采用纯水配制质量浓度为10％的青稞提取物混合液100mL，加入5％多糖水解酶，控制pH为5～6，放置于恒温振荡器反应4～6h，煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min，取上清液，采用95％的酒精醇沉，除去沉淀；醇沉清液通过减压旋蒸回收乙醇，得到浓缩的糖液；
(3)双酶法合成右旋糖酐
向步骤(2)中得到的浓缩糖液中加入pH为5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至100mL，依次加入右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶，调控二者比例为10:1～1:10范围内，控制反应时间2～40h，反应温度为25～30℃，反应结束后恢复室温。
(4)去除杂质
上述步骤(3)的反应液煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min除去杂质，过滤，得到澄清透明的糖液用于右旋糖酐产品分离。
(5)乙醇醇沉
采用95％的酒精进行醇沉，沉淀物即为右旋糖酐产品。
优选地，步骤(1)具体为：将肠膜明串珠菌培养至对数期，按照0.4％的接种量接种到产酶培养基；培养基为：蔗糖50g/L、酵母膏12.5g/L、牛肉膏20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、磷酸氢二钠3.6g/L，121℃高压蒸汽灭菌15～20min；培养条件为20～30℃、100～200r/min，时间为20～30h；通过离心机进行离心处理，离心速度为8000～10000r/min，时间为15～20min，离心后弃去沉淀，收集上清液即为粗酶液。
优选地，步骤(2)中所述青稞提取物的葡聚糖含量为60％。
优选地，步骤(2)中所述多糖水解酶主要包括淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、糖化酶、胰酶、蛋白酶、右旋糖酐酶。
优选地，步骤(1)中粗酶液在保存过程中加入0.004％～0.010％CaCl2，保存于4℃条件下，备用。
优选地，步骤(3)中右旋糖酐蔗糖酶用量为3.5～4.5U/mL。
本发明采用青稞提取物为原料、右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶组合用酶，实现定向制备不同分子量的右旋糖酐，方法具有如下优点：
(1)本发明首次提出采用青稞提取物为原料制备右旋糖酐的方法；
(2)本发明通过控制右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的比例为1:10、1:8:、1:4、3:1、5:1、9:1，从而现对右旋糖酐分子量的控制，可以定向制备右旋糖酐10、右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70、右旋糖酐100和右旋糖酐1000等产品。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明技术方案做进一步解释说明。
实施例1
(1)右旋糖酐蔗糖酶提取
将肠膜明串珠菌培养至对数期，按照0.4％的接种量接种到产酶培养基；培养基为：蔗糖50g/L、酵母膏12.5g/L、牛肉膏20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、磷酸氢二钠3.6g/L，121℃高压蒸汽灭菌15～20min；培养条件为20～30℃、100～200r/min，时间为20～30h。培养结束后得到含有粗酶液的肠膜明串珠菌培养液。通过离心机离心获取粗酶液，离心速度一般为8000～10000r/min，时间为15～20min，离心后弃去沉淀，收集上清液即为粗酶液。
(2)青稞提取物酶解
采用纯水配制质量浓度为10％的青稞提取物混合液100mL，加入5％淀粉酶，控制pH条件为5.5，放置于50℃恒温振荡器反应4h，煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min，除酶取上清液，采用95％的酒精醇沉，除去沉淀。醇沉清液通过减压旋蒸回收乙醇，得到浓缩的糖液。
(3)双酶法合成右旋糖酐
向步骤2)中得到的浓缩糖液中加入pH为5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至100mL，依次加入右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶，调控二者比例为5：1范围内，右旋糖酐蔗糖酶用量为4U/mL，控制反应时间32h，反应温度为30℃，反应结束后恢复室温。
(4)去除杂质
上述步骤3)的反应液煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min除去杂质，离心清液再用定性滤纸过滤，得到澄清透明的糖液用于右旋糖酐产品分离。
(5)乙醇醇沉
采用95％的酒精进行醇沉，沉淀物即为右旋糖酐产品100。
实施例2
(1)右旋糖酐蔗糖酶提取
将肠膜明串珠菌培养至对数期，按照0.4％的接种量接种到产酶培养基；培养基为：蔗糖50g/L、酵母膏12.5g/L、牛肉膏20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、磷酸氢二钠3.6g/L，121℃高压蒸汽灭菌15～20min；培养条件为20～30℃、100～200r/min，时间为20～30h。培养结束后得到含有粗酶液的肠膜明串珠菌培养液。通过离心机离心获取粗酶液，离心速度一般为8000～10000r/min，时间为15～20min，离心后弃去沉淀，收集上清液即为粗酶液。
粗酶液在保存过程中加入0.005％的CaCl2，保存于4℃条件下，可以延长其保存时间。
(2)青稞提取物酶解
采用纯水配制质量浓度为10％的青稞提取物混合液100mL，加入5％淀粉酶，控制pH条件为5.5，放置于50℃恒温振荡器反应6h，煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min，除酶取上清液，采用95％的酒精醇沉，除去沉淀。醇沉清液通过减压旋蒸回收乙醇，得到浓缩的糖液。
(3)双酶法合成右旋糖酐
向步骤2)中得到的浓缩糖液中加入pH为5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至100mL，依次加入右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶，调控二者比例为1:10，右旋糖酐蔗糖酶用量为4U/mL，控制反应时间12h，反应温度为30℃，反应结束后恢复室温。
(4)去除杂质
上述步骤3)的反应液煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min除去杂质，离心清液再用定性滤纸过滤，得到澄清透明的糖液用于右旋糖酐产品分离。
(5)乙醇醇沉
采用95％的酒精进行醇沉，沉淀物即为右旋糖酐产品10。
实施例3
(1)右旋糖酐蔗糖酶提取
将肠膜明串珠菌培养至对数期，按照0.4％的接种量接种到产酶培养基；培养基为：蔗糖50g/L、酵母膏12.5g/L、牛肉膏20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、磷酸氢二钠3.6g/L，121℃高压蒸汽灭菌15～20min；培养条件为20～30℃、100～200r/min，时间为20～30h。培养结束后得到含有粗酶液的肠膜明串珠菌培养液。通过离心机离心获取粗酶液，离心速度一般为8000～10000r/min，时间为15～20min，离心后弃去沉淀，收集上清液即为粗酶液。粗酶液在保存过程中加入0.005％的CaCl2，保存于4℃条件下，可以延长其保存时间。
(2)青稞提取物酶解
采用纯水配制质量浓度为10％的青稞提取物混合液100mL，加入5％淀粉酶，控制pH条件为5.5，放置于50℃恒温振荡器反应6h，煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min，除酶取上清液，采用95％的酒精醇沉，除去沉淀。醇沉清液通过减压旋蒸回收乙醇，得到浓缩的糖液。
(3)双酶法合成右旋糖酐
向步骤2)中得到的浓缩糖液中加入pH为5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至100mL，依次加入右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶，右旋糖酐蔗糖酶用量为4U/mL，调控二者比例为1:8，控制反应时间12h，反应温度为30℃，反应结束后恢复室温。
(4)去除杂质
上述步骤3)的反应液煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min除去杂质，离心清液再用定性滤纸过滤，得到澄清透明的糖液用于右旋糖酐产品分离
(5)乙醇醇沉
采用95％的酒精进行醇沉，沉淀物即为右旋糖酐产品20。
实施例4
(1)右旋糖酐蔗糖酶提取
将肠膜明串珠菌培养至对数期，按照0.4％的接种量接种到产酶培养基；培养基为：蔗糖50g/L、酵母膏12.5g/L、牛肉膏20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、磷酸氢二钠3.6g/L，121℃高压蒸汽灭菌15～20min；培养条件为20～30℃、100～200r/min，时间为20～30h。培养结束后得到含有粗酶液的肠膜明串珠菌培养液。通过离心机离心获取粗酶液，离心速度一般为8000～10000r/min，时间为15～20min，离心后弃去沉淀，收集上清液即为粗酶液。
(2)青稞提取物酶解
采用纯水配制质量浓度为10％的青稞提取物混合液100mL，加入5％淀粉酶，控制pH条件为5.5，放置于50℃恒温振荡器反应6h，煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min，除酶取上清液，采用95％的酒精醇沉，除去沉淀。醇沉清液通过减压旋蒸回收乙醇，得到浓缩的糖液。
(3)双酶法合成右旋糖酐
向步骤2)中得到的浓缩糖液中加入pH为5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至100mL，依次加入右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶，右旋糖酐蔗糖酶用量为4U/mL，调控二者比例为1:4，控制反应时间12h，反应温度为30℃，反应结束后恢复室温。
(4)去除杂质
上述步骤3)的反应液煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min除去杂质，离心清液再用定性滤纸过滤，得到澄清透明的糖液用于右旋糖酐产品分离
(5)乙醇醇沉
采用95％的酒精进行醇沉，沉淀物即为右旋糖酐产品40。
实施例5
(1)右旋糖酐蔗糖酶提取
将肠膜明串珠菌培养至对数期，按照0.4％的接种量接种到产酶培养基；培养基为：蔗糖50g/L、酵母膏12.5g/L、牛肉膏20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、磷酸氢二钠3.6g/L，121℃高压蒸汽灭菌15～20min；培养条件为20～30℃、100～200r/min，时间为20～30h。培养结束后得到含有粗酶液的肠膜明串珠菌培养液。通过离心机离心获取粗酶液，离心速度一般为8000～10000r/min，时间为15～20min，离心后弃去沉淀，收集上清液即为粗酶液。
(2)青稞提取物酶解
采用纯水配制质量浓度为10％的青稞提取物混合液100mL，加入5％淀粉酶，控制pH条件为5.5，放置于50℃恒温振荡器反应6h，煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min，除酶取上清液，采用95％的酒精醇沉，除去沉淀。醇沉清液通过减压旋蒸回收乙醇，得到浓缩的糖液。
(3)双酶法合成右旋糖酐
向步骤2)中得到的浓缩糖液中加入pH为5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至100mL，依次加入右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶，右旋糖酐蔗糖酶用量为4U/mL，调控二者比例为3:1，控制反应时间32h，反应温度为30℃，反应结束后恢复室温。
(4)去除杂质
上述步骤3)的反应液煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min除去杂质，离心清液再用定性滤纸过滤，得到澄清透明的糖液用于右旋糖酐产品分离
(5)乙醇醇沉
采用95％的酒精进行醇沉，沉淀物即为右旋糖酐产品70。
实施例6
(1)右旋糖酐蔗糖酶提取
将肠膜明串珠菌培养至对数期，按照0.4％的接种量接种到产酶培养基；培养基为：蔗糖50g/L、酵母膏12.5g/L、牛肉膏20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、磷酸氢二钠3.6g/L，121℃高压蒸汽灭菌15～20min；培养条件为20～30℃、100～200r/min，时间为20～30h。培养结束后得到含有粗酶液的肠膜明串珠菌培养液。通过离心机离心获取粗酶液，离心速度一般为8000～10000r/min，时间为15～20min，离心后弃去沉淀，收集上清液即为粗酶液。
(2)青稞提取物酶解
采用纯水配制质量浓度为10％的青稞提取物混合液100mL，加入5％淀粉酶，控制pH条件为5.5，放置于50℃恒温振荡器反应6h，煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min，除酶取上清液，采用95％的酒精醇沉，除去沉淀。醇沉清液通过减压旋蒸回收乙醇，得到浓缩的糖液。
(3)双酶法合成右旋糖酐
向步骤2)中得到的浓缩糖液中加入pH为5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至100mL，依次加入右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶，右旋糖酐蔗糖酶用量为4U/mL，调控二者比例为9:1，控制反应时间32h，反应温度为30℃，反应结束后恢复室温。
(4)去除杂质
上述步骤3)的反应液煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min除去杂质，离心清液再用定性滤纸过滤，得到澄清透明的糖液用于右旋糖酐产品分离
(5)乙醇醇沉
采用95％的酒精进行醇沉，沉淀物即为右旋糖酐产品1000。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种定向制备右旋糖酐的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)右旋糖酐蔗糖酶提取
制备得到肠膜明串珠菌培养液，获取粗酶液；
(2)青稞提取物酶解
采用纯水配制质量浓度为10％的青稞提取物混合液100mL，加入5％多糖水解酶，控制pH为5～6，放置于恒温振荡器反应4～6h，煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min，取上清液，采用95％的酒精醇沉，除去沉淀；醇沉清液通过减压旋蒸回收乙醇，得到浓缩的糖液。
(3)双酶法合成右旋糖酐
向步骤(2)中得到的浓缩糖液中加入pH为5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至100mL，依次加入右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶，调控二者比例为10:1～1:10范围内，控制反应时间2～40h，反应温度为25～30℃，反应结束后恢复室温。
(4)去除杂质
上述步骤(3)的反应液煮沸30min灭酶，8000r/min离心10min除去杂质，过滤，得到澄清透明的糖液用于右旋糖酐产品分离。
(5)乙醇醇沉
采用95％的酒精进行醇沉，沉淀物即为右旋糖酐产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：将肠膜明串珠菌培养至对数期，按照0.4％的接种量接种到产酶培养基；培养基为：蔗糖50g/L、酵母膏12.5g/L、牛肉膏20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、磷酸氢二钠3.6g/L，121℃高压蒸汽灭菌15～20min；培养条件为20～30℃、100～200r/min，时间为20～30h；通过离心机进行离心处理，离心速度为8000～10000r/min，时间为15～20min，离心后弃去沉淀，收集上清液即为粗酶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述青稞提取物的葡聚糖含量为60％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述多糖水解酶主要包括淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、糖化酶、胰酶、蛋白酶、右旋糖酐酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中粗酶液在保存过程中加入0.004％～0.010％CaCl2，保存于4℃条件下，备用。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中右旋糖酐蔗糖酶用量为3.5～4.5U/mL。
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| CN113201513A (zh) * | 2021-06-22 | 2021-08-03 | 广西产研院生物制造技术研究所有限公司 | 一种耐热右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用 |
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