CN111363694A - 一株停滞棒杆菌、筛选方法及其用途 - Google Patents

一株停滞棒杆菌、筛选方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株停滞棒杆菌、筛选方法及其用途。保藏号为CGMCC No.19005。该菌株具有产生吲哚乙酸，促进植物生长的能力，也对四季小白菜种子发芽具有促生的能力。

Description

一株停滞棒杆菌、筛选方法及其用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株停滞棒杆菌、筛选方法及其用途。
背景技术
好氧堆肥过程中，处于不同堆肥阶段的微生物更替迭代迅速，群落结构会发生剧烈变化，富集和强化其中具有促生能力的功能微生物是提高有机肥料肥效的关键。吲哚乙酸(IAA)作为一类重要的植物激素，可以产生调节植物生长素的信号物质，对植物的新陈代谢、生长发育都起着重要作用。吲哚乙酸除了由植物自体产生外，还可以通过存在于土壤、植物表面和海洋环境中的特定微生物代谢产生。目前，向堆肥中接种外源微生物菌剂以提高发酵效率的研究已有研究，但尚无从堆肥中分离吲哚乙酸产生菌的相关报道。考虑到用从堆肥中分离的吲哚乙酸产生菌作为微生物菌剂，施用于堆肥中会有较好的定殖和适应能力，能安全稳定的在堆肥中进行应用。因此，在堆肥体内寻获能够有效产吲哚乙酸的微生物菌种资源具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产吲哚乙酸的停滞棒杆菌Corynebacteriumstationis 29B。
为实现上述目的，本发明提供一株停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B，保藏号为CGMCC No.19005。
本发明还提供一种筛选所述停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的方法，其特征在于，
将从福建省厦门市城市环境研究所科研温室内收集的猪粪与玉米秸秆混合堆肥发酵后的物料置于盛有无菌水的锥形瓶中，置于摇床中震荡，静置后取其菌悬液进行梯度稀释，将10-5-10-7稀释度的菌液涂布至LB固体培养基上，放置于恒温箱中培养；挑取LB固体培养基上不同类型的单菌落，接种于LB液体培养基中，摇床中震荡培养；将培养后的菌液接种于含有L-色氨酸的LB液体培养基中，摇床中震荡培养后，取菌悬液滴于白色陶瓷板上，加入等量Salkowski试剂进行显色反应，室温下避光放置30min后观察，颜色变粉红色则表示菌株具产吲哚乙酸能力；
再取具产吲哚乙酸能力的菌株的菌悬液离心，取上清液加入等量Salkowski试剂，然后置于室温避光处，30min后用紫外可见分光光度计于波长530nm处测定其吸光度，根据吲哚乙酸标准关系曲线计算相应浓度，选取吲哚乙酸产量最高的即可。
本发明还提供一种所述停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的用途。
进一步，所述用途为具有产生吲哚乙酸的能力。
进一步，所述用途为能促进植物生长。
进一步，所述用途为能对四季小白菜种子的发芽具有促生效果。
进一步，所述用途为能增加堆肥产品的肥效；优选的，将含有停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的菌悬液加入到堆肥中正常管理堆肥即能增加堆肥产品的肥效；更优选的，堆肥质量和菌悬液的固液比为50：1的重量体积比，其中菌悬液的浓度为1.0×108-109cfu/mL。
本发明还提供一种生产吲哚乙酸的方法，其特征在于，接种停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B于培养基中发酵培养后收集菌液即可。
进一步，所述接种的接种量为2-4％，初始pH为6-9，所述发酵培养为温度为20-35℃，转速为100-150r/min，培养时长为96-120h；
优选的，接种的接种量为2-3％，初始pH为6-8，所述发酵培养为温度为20-35℃，转速为100-150r/min，培养时长为108-120h；
最优选的，接种的接种量为2％，初始pH为7，所述发酵培养为温度为35℃，转速为120r/min，培养时长为108h。
进一步，所述培养基为含有L-色氨酸的LB液体培养基；优选的，含有3mmol/L的L-色氨酸。
停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B，分类名为停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)，其保藏信息如下：
菌株名称：停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B。
保藏日期：2019年11月25日，
保藏单位：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，
保藏编号：CGMCC No.19005。
所述停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的菌落为较小淡黄色、隆起，表面光滑，边缘整齐。
所述停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的生理生化特征是：革兰氏阳性菌，兼性好氧，化能异养，过氧化氢酶试验呈阳性，硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验呈阳性，葡萄糖酸盐试验阳性，麦芽糖发酵试验阳性，明胶水解实验呈阴性。
本发明的停滞棒杆菌可在20-35℃，pH为6-9的环境下适宜产吲哚乙酸。
作为本发明的优化方案，所述停滞棒杆菌的发酵在接种量为2％，pH为7，温度为35℃，转速为120r/min的摇床条件下培养108h，其IAA产量最高可达138.87μg/mL。
本发明还提供所述的停滞棒杆菌在好氧堆肥中的应用。
堆肥pH在6-9间，堆肥进入降温期后，待堆体温度降至35℃度附近，取菌株29B菌悬液均匀喷施至堆肥中，堆肥质量和菌悬液固液比为50：1(w/v)，正常管理堆肥直至堆肥结束，所得堆肥产品即为肥效增强产品。
本发明所述的一种停滞棒杆菌产吲哚乙酸能力强，在接种量为2％，pH为7，温度为35℃，转速为120r/min的摇床条件下培养108h，其产IAA能力最高可达138.87μg/mL。在堆肥进入降温阶段后(堆体温度约35℃为宜)，接种上述停滞棒杆菌可有效增加堆肥产品肥效，促进植物生长发育。
上述停滞棒杆菌的富集培养基配方简单，制备操作容易，使用LB液体培养基即可。
上述停滞棒杆菌制备微生物菌剂的方法简便易操作，菌剂形式可为微生物菌悬液，通过喷洒菌悬液使其在堆肥中定殖富集，产生吲哚乙酸以提高堆肥肥效。
附图说明
图1停滞棒杆菌29B的菌落形态图；
图2停滞棒杆菌29B的扫描电镜图片；
图3表示不同发酵时长对菌株29B产吲哚乙酸的影响图；
图4表示不同初始pH对菌株29B产吲哚乙酸的影响图；
图5表示不同接种量对菌株29B产吲哚乙酸的影响图；
图6表示不同温度对菌株29B产吲哚乙酸的影响图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的筛选鉴定
三种培养基配方：
LB液体培养基(g/L)：胰化蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0，pH调至7.2-7.4，121℃灭菌20min；
LB固体培养基(g/L)：琼脂粉20.0，其余同液体LB培养基；
含L-色氨酸的LB液体培养基：LB液体培养基经高温灭菌后，将高浓度的L-色氨酸母液经由细菌过滤器注入，使培养基中L-色氨酸终浓度为3mmol/L并避光保存。
称取10g从福建省厦门市城市环境研究所科研温室内收集的猪粪与玉米秸秆混合堆肥发酵后的物料，置于盛有100mL无菌水的250mL锥形瓶中，于120r/min摇床中震荡20min，静置10min后取其菌悬液进行梯度稀释，将10-5-10-7稀释度的菌液涂布至LB固体培养基上，放置于30℃恒温箱中培养2d，挑取不同类型的单菌落，制成单菌落斜面放置于4℃冰箱中保存待用。
接着再通过定性测定和定量测定筛选出产吲哚乙酸的功能菌株。
定性测定：采用Salkowski比色法对产吲哚乙酸菌进行筛选。活化单菌落斜面上的细菌，接种于LB液体培养基中，在30℃、120r/min的摇床中震荡培养48h。按2％的接种量取上述菌液接种于含有L-色氨酸(3mmol/L)的LB液体培养基中，在30℃、120r/min的摇床中震荡培养48h后，取50μL菌悬液滴于96透明孔板中，加入等量Salkowski试剂(1mL0.5mol/LFeCl3与50mL 35％HClO4混合)进行显色反应，以50μL吲哚乙酸标准溶液(50μg/mL)作为阳性对照。将96透明孔板置于室温下避光放置30min后观察，颜色变粉红色则表示菌株具产吲哚乙酸能力。
定量测定：取2mL菌悬液，8000r/min离心5min，加入等量Salkowski试剂后置于室温避光处，30min后用紫外可见分光光度计于波长530nm处测定其吸光度(OD530)，并以未接菌的含有L-色氨酸的LB液体培养基与Salkowski试剂等体积混合溶液为对照。通过吲哚乙酸浓度与OD530的标准关系曲线计算相应的吲哚乙酸浓度。标准曲线的绘制采用分析纯的吲哚乙酸标准品稀释制备。
通过以上测定即筛选出一株高产吲哚乙酸菌株，如图1所示，该菌株形成的菌落为较小淡黄色、隆起，表面光滑，边缘整齐，生理生化特征是：革兰氏阳性菌，兼性好氧，化能异养，过氧化氢酶试验呈阳性，硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验呈阳性，葡萄糖酸盐试验阳性，麦芽糖发酵试验阳性，明胶水解实验呈阴性。命名为29B。该菌株在实验室摇瓶条件下，吲哚乙酸产量达87.39mg/L。
将上述方法筛选分离出的菌株，交由上海美吉生物医药科技有限公司测序。将测序结果提交到GenBank数据库，并利用Blast程序搜索同源序列，选出同源性高的典型菌株的16S rDNA序列为参比对象，利用MEGA7.0软件中Neighbor-Joining算法构建系统发育树。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)，同源性为99％。将该菌株于2019年11月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.19005。
保藏信息如下：
菌株名称：停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B。
保藏日期：2019年11月25日，
保藏单位：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，
保藏编号：CGMCC No.19005。
实施例2
为了进一步验证实施例1得到的停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B(CGMCC No.19005)产吲哚乙酸的能力和最适条件，下面针对不同培养时长、初始pH、接种量及培养温度探索对吲哚乙酸产量的影响。
培养时长试验：在含有L-色氨酸(3mmol/L)的LB液体培养基中，按2％(v/v)接种量接种处于对数生长期的停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B(CGMCC No.19005)，置于摇床30℃、120r/min条件下震荡培养。于12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168h破坏性采样，按照定量测定的方法检测吲哚乙酸含量，结果如图3所示。在培养时间为24-108h时，吲哚乙酸产量逐渐增加，培养时间96-120h，吲哚乙酸产量较高，为108h时，吲哚乙酸产量最高，停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B(CGMCCNo.19005)产吲哚乙酸的最适培养培养时间为96-120h，最优的是108h。
初始pH试验：将含有L-色氨酸(3mmol/L)的LB液体培养基分别调节到不同的pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，按2％(v/v)接种量接种处于对数生长期的停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B(CGMCC No.19005)，置于摇床30℃、120r/min条件下震荡培养。于108h破坏性采样，按照定量测定的方法检测吲哚乙酸含量，结果如图4所示。在LB液体培养基的初始pH为7.0时，产吲哚乙酸能力最强，次之为pH 6.0和8.0，9.0，说明停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B(CGMCC No.19005)产吲哚乙酸的适宜pH为6.0-9.0，最适宜的为6.0-8.0。
接种量试验：在含有L-色氨酸(3mmol/L)的LB液体培养基中，按不同的接种量(v/v，1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和10.0％)接种处于对数生长期的停滞棒杆菌Corynebacteriumstationis 29B(CGMCC No.19005)，置于摇床30℃、120r/min条件下震荡培养。于108h破坏性采样，按照定量测定的方法检测吲哚乙酸含量，结果如图5所示。当接种量为2-4％时，产吲哚乙酸能力较高；2-3％时，产吲哚乙酸能力更高；当接种量为2％时，产吲哚乙酸能力最高；当接种量大于2％后，吲哚乙酸产量逐渐降低。由于接种量较大时，菌体生长过快，导致培养液的黏度增加，在供氧量不变的情况下，会造成溶氧量不足而影响吲哚乙酸的生成，因此最适接种量为2％。
培养温度试验：在含有L-色氨酸(3mmol/L)的LB液体培养基中，按2％(v/v)接种量接种处于对数生长期的停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B(CGMCC No.19005)，置于不同温度的摇床(20、25、30、35、40、45℃)中，在120r/min条件下震荡培养。于108h破坏性采样，按照定量测定的方法检测吲哚乙酸含量，结果如图6所示。产吲哚乙酸的最适温度为35℃，在该温度下吲哚乙酸含量最高。在培养温度20-35℃时，吲哚乙酸产量随温度的升高而增加，最高达到138.87μg/mL，温度高于35℃时，吲哚乙酸产量急速下降。
实施例3
通过施加停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B(CGMCC No.19005)于二次堆肥体系中，增加堆肥产品肥效，提高养分促进植物生长。下面通过堆肥实验说明堆肥产品对四季小白菜种子发芽的促生效果。
堆肥实验在福建省厦门市城市环境研究所科研温室内进行，实验以来自厦门乐森生态农业有限公司生猪养殖场的菜猪猪粪和厦门成华超磨料有限公司生产的1mm粒径玉米芯为原料，堆肥材料为菜猪猪粪和玉米秸秆。堆置后初始C/N比为25：1、含水率为60-65％，整个堆肥过程在塑料泡沫箱中进行以维持温度。在堆肥进入降温阶段后(温度处于30-35℃)，将其均匀翻堆并等份分装至干净灭菌的泡沫箱中，并同时于实验室内制备微生物菌剂。
微生物菌剂制备：将保存在斜面上的停滞棒杆菌Corynebacterium stationis29B(CGMCC No.19005)用三区划线的方法活化在LB固体培养基上。挑取单菌落至相应的5mLLB液体培养基中，置于摇床35℃、120r/min条件下震荡培养48h。按2％接种量将上述种子液接种至相应的500mL LB液体培养基中进行培养扩增，置于摇床35℃、120r/min条件下震荡培养108h后，用于堆肥实验。
取上述菌悬液均匀喷施至堆肥基质中，堆肥质量和菌悬液(108CFU/mL)固液比为50：1(w/v)。以不接种菌液(浇灌相同量的培养基)作为对照，正常处理直至堆肥实验结束(堆置总时长为50-60天)。
待实验结束后，(1)取10g的堆肥样品放置、冷却，和蒸馏水以1:10(w/v)比例混合均匀，置于摇床120r/min条件下震荡1h，静置30min后，8000r/min离心10min，保留上层堆肥浸提液待用。用四季小白菜作发芽试验材料，采用培养皿内纸上发芽的方式，在玻底直径为90mm的玻璃培养皿内垫上直径为9cm的滤纸片，加入10mL堆肥浸提液，并均匀点播20粒四季小白菜种子。每个处理设3次重复，以蒸馏水为空白对照，盖上玻璃皿盖后置于30℃恒温培养箱内培养48h，进行种子发芽试验。48h后测定种子发芽率及发芽种子根长，计算种子发芽指数(GI)；
(2)称10g堆肥样品，加入100mL蒸馏水，于120r/min下摇床振荡1h，过滤，取滤液在紫外分光光度计下测量465nm和665nm的吸光度，得到E465和E665，计算E465/E665；
(3)取5g堆肥样品烘干，研磨后过100目筛，精确称取100mg样品经高温酸消解(硝酸、高氯酸、氢氟酸)，定容稀释后，用电感耦合等离子体发射光谱仪测定总磷总钾。
结果见表1。
表1停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B在堆肥中的作用结果表
Figure BDA0002376854210000071
注：实验组即为添加了停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的组。
由表1可知，添加停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B(CGMCC No.19005)的堆肥样品的浸提液能有效提高种子发芽指数：从75.85％提高到90.23％。此外，E465/E665的变化反映着腐植酸缩合度和芳构化程度，从2.831降到1.693，说明停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B作为微生物菌剂投加到堆肥中有利于腐殖酸分子间的缩合。且总磷总钾数据的增加也进一步表明添加菌株29B能有效提高堆肥产品肥效。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一株停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B，保藏号为CGMCC No.19005。
2.一种筛选权利要求1所述停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的方法，其特征在于，
将从福建省厦门市城市环境研究所科研温室内收集的猪粪与玉米秸秆混合堆肥发酵后的物料置于盛有无菌水的锥形瓶中，置于摇床中震荡，静置后取其菌悬液进行梯度稀释，将10-5-10-7稀释度的菌液涂布至LB固体培养基上，放置于恒温箱中培养；挑取LB固体培养基上不同类型的单菌落，接种于LB液体培养基中，摇床中震荡培养；将培养后的菌液接种于含有L-色氨酸的LB液体培养基中，摇床中震荡培养后，取菌悬液滴于白色陶瓷板上，加入等量Salkowski试剂进行显色反应，室温下避光放置30min后观察，颜色变粉红色则表示菌株具产吲哚乙酸能力；
再取具产吲哚乙酸能力的菌株的菌悬液离心，取上清液加入等量Salkowski试剂，然后置于室温避光处，30min后用紫外可见分光光度计于波长530nm处测定其吸光度，根据吲哚乙酸标准关系曲线计算相应浓度，选取吲哚乙酸产量最高的即可。
3.一种权利要求1所述停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的用途。
4.如权利要求3所述停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的用途，其特征在于，所述用途为具有产生吲哚乙酸的能力。
5.如权利要求3所述停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的用途，其特征在于，所述用途为能促进植物生长。
6.如权利要求3所述停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的用途，其特征在于，所述用途为能对四季小白菜种子的发芽具有促生效果。
7.如权利要求3所述停滞棒杆菌Corynebacterium stationis 29B的用途，其特征在于，所述用途为能增加堆肥产品的肥效；优选的，将含有停滞棒杆菌Corynebacteriumstationis29B的菌悬液加入到堆肥中正常管理堆肥即能增加堆肥产品的肥效；更优选的，堆肥质量和菌悬液的固液比为50：1的重量体积比，其中菌悬液的浓度为1.0×108-109cfu/mL。
8.一种生产吲哚乙酸的方法，其特征在于，接种停滞棒杆菌Corynebacteriumstationis 29B于培养基中发酵培养后收集菌液即可。
9.如权利要求8所述生产吲哚乙酸的方法，其特征在于，所述接种的接种量为2-4％，初始pH为6-9，所述发酵培养为温度为20-35℃，转速为100-150r/min，培养时长为96-120h；
优选的，接种的接种量为2-3％，初始pH为6-8，所述发酵培养为温度为20-35℃，转速为100-150r/min，培养时长为108-120h；
最优选的，接种的接种量为2％，初始pH为7，所述发酵培养为温度为35℃，转速为120r/min，培养时长为108h。
10.如权利要求8所述生产吲哚乙酸的方法，其特征在于，所述培养基为含有L-色氨酸的LB液体培养基；优选的，含有3mmol/L的L-色氨酸。
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