CN106727018A - 一种人参提取物的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物提取物及其应用领域，尤其涉及一种人参提取物的提取方法。该方法对水提醇沉后的人参粗提物进行低温热转化，复溶后经D101或AB8型大孔树脂分离获得人参提取物。实验表明，本发明获得的人参提取物能够有效地抑制酪氨酸酶的活性，并显著降低黑色素含量，具有显著的美白护肤的作用，其美白护肤的功效明显优于经典美白剂熊果苷。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物及其应用领域，尤其涉及一种人参提取物的提取方法。
背景技术
人体皮肤内黑色素分为褐黑素和真黑素两种，前一种为棕黑色，后一种为红棕色，皮肤颜色由这两种色素比例所决定。当皮肤受到紫外线照射后，最外层的角质细胞为保护皮肤，产生黑色素生成刺激因子(α-MSH)与黑色素细胞中的特异性受体结合，从而启动系列信号转导途径，最终引起黑色素合成的关键酶——酪氨酸酶合成，进而氧化酪氨酸生成黑色素生成的前体物质多巴、多巴醌。在半胱氨酸/谷胱甘肽存在条件下多巴醌生成半胱胺多巴并进一步氧化聚合生成可溶性的微红-黄的褐黑素，而当半胱氨酸耗尽，多巴醌自发脱羧，氧化聚合生成不可溶的棕-黑色真黑素，超出皮肤的清除能力，并沉积在皮肤表面引起皮肤变黑。目前，美白剂主要采取干扰黑色素生成的过程，降低色素沉着而达到美白功效。
我国对美白化妆品的研究和使用有着悠久的历史，随着人们生活质量的提高，公众对美白化妆品的需求量也与日俱增。伴随着“回归大自然”倡导的呼声“绿色”的呼声，从天然植物中寻找和提取功能性物质，逐渐成为当前化妆品领域研究的热点。
拥有“百草之王”美誉的人参理所当然地成为了研究者制备美白产品的研究对象。人参的成分复杂多样，含有皂苷、糖类、挥发油、蛋白质、维生素、氨基酸、脂肪酸、无机元素等多种有效成分，其具有美白护肤功效由来已久，且已被全世界广泛认可，无论是在韩国、日本等亚洲国家，还是在欧美国家，含有人参成分的化妆品均受到广大消费者的青睐。
虽然，现有技术中已有关于人参美白活性成分的研究报道，如转化后稀有皂苷F1以及人参叶中稀有皂苷Rh6、R4降低黑色素含量，以及人参叶中对香豆酸具有体外抑制酪氨酸酶活性，但关于这些美白功效成分的提取方法的研究却很少见。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种人参提取物的提取方法，该方法提取得到的提取物具有良好的美白功效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种人参提取物的提取方法，包括如下步骤：
步骤1：取人参须根，经水提醇沉、干燥，得到人参粗提物；
步骤2：取所述人参粗提物进行热转化；
步骤3：取所述热转化后的人参粗提物复溶，过滤，收集滤液，经D101或AB8型大孔树脂，依次采用水和乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压去除乙醇，干燥，获得人参提取物。
优选地，本发明提供的提取方法中，步骤2所述热转化具体为：置于40-70℃真空干燥条件下48-120小时。更优选地，所述热转化具体为：置于50-60℃真空干燥条件下64-96小时。
优选地，步骤3所述乙醇的洗脱浓度为10-70％。
优选地，步骤1所述水提具体为：按照人参须根和去离子水的质量比为1:5-1:15的比例加入去离子水浸泡过夜，加热至100℃提取1-3小时，提取1-4次，合并上清液。
优选地，步骤1所述醇沉具体为：采用50％-85％的乙醇进行沉淀。
优选地，步骤1所述水提后、醇沉前还包括浓缩至18～25℃时相对密度为1.005-1.150的步骤。
本发明还提供了上述提取方法获得的人参提取物在制备抑制酪氨酸酶活性的化妆品、保健品或药物中的应用。
本发明还提供了上述提取方法获得的人参提取物在制备具有美白功效的化妆品、保健品或药物中的应用。
本发明提供了一种人参提取物的提取方法，该方法提取得到的人参提取物浓度为0.25mg/mL时对酪氨酸酶的抑制活性与3mg/mL的经典美白成分熊果苷相当，当人参提取物浓度为0.125mg/mL与熊果苷3.00mg/mL时刺激B16细胞后，黑色素含量相当。以上结果表明，本发明提供的提取方法获得的人参提取物能够有效地抑制酪氨酸酶的活性，显著降低黑色素的含量，美白护肤的功效明显优于熊果苷。
附图说明
图1示本发明实施例1～4制备的人参提取物人参对于小鼠黑色素瘤B16内酪氨酸酶活性的影响；其中，数据均表示为数值±标准偏差(n＝3)，***表示P＜0.001；
图2示本发明实施例1～4制备的人参提取物对于小鼠黑色素瘤B16内黑色素含量的影响；其中，数据均表示为数值±标准偏差(n＝3)，***表示P＜0.001；
图3示本发明实施例1不同热转化时间获得的人参提取物的体外酪氨酸酶活性的变化；其中，数据均表示为数值±标准偏差(n＝3)，***表示P＜0.001。
具体实施方式
本发明公开了一种人参提取物的提取方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的人参提取物的提取方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
取人参干燥须根切成小块，按着1:10的比例加入去离子水浸泡过夜，加热至100℃提取2小时，提取3次，合并上清液，浓缩至22℃时相对密度为1.100，冷却后用乙醇浓度为75％沉淀，收集上清液，减压去除乙醇，干燥，即得人参粗提物。将人参粗提物放入40℃真空干燥箱内热转化72小时。将热转化后的人参粗提物用去离子水复溶后，加入预处理的D101型大孔树脂，水洗脱后，采用10％浓度乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，减压去除乙醇，干燥，获得人参提取物。
实施例2
取人参干燥须根切成小块，按着1:15的比例加入去离子水浸泡过夜，加热至100℃提取1小时，提取2次，合并上清液，浓缩至18℃时相对密度为1.112，冷却后用乙醇浓度为75％沉淀，收集上清液，减压去除乙醇，干燥，即得人参粗提物。将人参粗提物放入50℃真空干燥箱内热转化48小时。将热转化后的人参粗提物复溶后，加入预处理的D101大孔树脂，水洗脱后，采用40％浓度乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，减压去除乙醇，干燥，获得人参提取物。
实施例3
取人参干燥须根切成小块，按着1:5的比例加入去离子水浸泡过夜，加热至100℃提取3小时，提取3次，合并上清液，浓缩至25℃时相对密度为1.150，冷却后用乙醇浓度为75％沉淀，收集上清液，减压去除乙醇，干燥，即得人参粗提物。将人参粗提物放入60℃真空干燥箱内热转化48小时。将热转化后的人参粗提物复溶后，加入预处理的AB8型大孔树脂，水洗脱后，采用30％浓度乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，减压去除乙醇，干燥，获得人参提取物。
实施例4
取人参干燥须根切成小块，按着1:10的比例加入去离子水浸泡过夜，加热至100℃提取2小时，提取2次，合并上清液，浓缩至20℃时相对密度为1.040，冷却后用乙醇浓度为75％沉淀，收集上清液，减压去除乙醇，干燥，即得人参粗提物。将人参粗提物放入65℃真空干燥箱内热转化24小时。将热转化后的人参粗提物复溶后，加入预处理的AB8型大孔树脂，水洗脱后，采用50％浓度乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，减压去除乙醇，干燥，获得人参提取物。
实施例5人参提取物的美白活性评价试验
(一)人参提取物对体外酪氨酸酶活性影响
取本发明实施例1～4制备的人参提取物，用PB缓冲液配置成50.00mg/ml样品溶液，稀释为1.5mg/ml、3mg/ml、6mg/ml、12mg/ml、24mg/ml5个浓度，将人参提取物溶液及相应试剂按表1所示体积准确加入96孔板中，混匀，37℃孵育25min，492nm检测吸光度值。
表1体外酪氨酸酶活性实验加样表
按如下公式所述计算方法，分别计算实施例1～4获得的人参提取物不同样品浓度下样品对酪氨酸酶活性的抑制率，以抑制率作为纵坐标，样品稀释倍数对数为横坐标，绘制标准曲线，计算IC50值，结果如表2所示。
表2人参提取物体外酪氨酸酶活性影响
由表2可知，本发明实施例1～4获得的人参提取物对体外酪氨酸酶活性具有显著地抑制作用。
(二)人参提取物对小鼠黑色素瘤B16内酪氨酸酶活性的影响
取对数期生长的B16细胞(浓度为6.00×104～8.00×104个/mL)接种于96孔板中，培养24h后换为含α-MSH及0.25mg/mL实施例1～4提供的人参提取物完全培养液，继续培养48h，以Ar(美白剂熊果苷浓度为3.00mg/mL)作阳性药物。收集细胞，用1％Triton X-100溶液，于4℃裂解2h，并于10,000rpm离心10min，收集上清液，Bradford法检测蛋白含量。取细胞蛋白裂解液(蛋白总量为80.00μg)及80.00μL 5.00mML-多巴(L-DOPA)加入96孔板中，补充PB缓冲液(0.01M)至200.00μL，混合均匀，37℃孵育30min，利用酶标仪检测492nm吸光度值。通过492nm吸光度值的变化计算酪氨酸酶的相对活性，结果见图1。
由图1可知，本发明实施例1～4提供的人参提取物可以显著降低α-MSH刺激B16细胞内酪氨酸酶活力，且呈现浓度依赖关系。当提取物浓度为0.25mg/mL时抑制活性与3mg/mL熊果苷相当，表明本发明提供的提取方法获得的人参提取物能够有效地抑制酪氨酸酶的活性，
(三)人参提取物对于小鼠黑色素瘤B16内黑色素含量的影响
取对数期生长的B16细胞(浓度为6.00×104～8.00×104个/mL)于96孔中培养24h。用含α-促黑激素(α-MSH)及)0.125mg/mL实施例1～4提取方法获得的人参提取物完全培养液培养48h，熊果苷(Ar)(3.00mg/mL)为阳性药物。收集细胞，每组细胞加入100.00μL1.00mol/L NaOH(含10.00％DMSO)，于80℃水浴裂解2h,利用酶标仪检测405nm处的吸光度值。通过建立黑色素含量和吸光度值的标准曲线，计算黑色素的含量，结果见图2。
由图3可知，本发明实施例1～4提取方法获得的人参提取物作用于α-MSH刺激B16细胞后可显著降低细胞内黑色素的含量，且呈现浓度依赖关系。且当人参提取物浓度为0.125mg/mL与美白剂熊果苷3.00mg/mL时刺激B16细胞后黑色素含量相当，表明，本发明实施例1～4提供的提取方法获得的人参提取物能够显著降低黑色素的含量，美白护肤的功效明显优于熊果苷。
(四)不同热转化时间获得的人参提取物的体外酪氨酸酶活性的变化
取实施例1制备的人参粗提物，等量3份放入真空干燥箱中，分别于恒温干燥24h、48h、72h后，然后按照实施例1热转化后的步骤进行提取，获得人参提取物，按照“人参提取物对体外酪氨酸酶活性影响”中的方法，对体外酪氨酸酶活性进行测定，结果见图3。
由图3可知，本发明实施例1～4提供的人参提取物对体外酪氨酸酶活性的抑制作用随着加热时间的增加而增强。
结论：由表2、图1～3的试验结果可知，本发明提供的制备方法提供的人参提取物能够有效地抑制体外酪氨酸酶的活性和小鼠黑色素瘤B16内酪氨酸酶的活性，并显著降低黑色素的含量，美白护肤的功效明显优于经典美白成分熊果苷。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种人参提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取人参须根，经水提醇沉、干燥，得到人参粗提物；
步骤2：取所述人参粗提物进行热转化；
步骤3：取所述热转化后的人参粗提物复溶，过滤，收集滤液，经D101或AB8型大孔树脂，依次采用水和乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压去除乙醇，干燥，获得人参提取物。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤2所述热转化具体为：置于40-70℃真空干燥条件下48-120小时。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述热转化具体为：置于50-60℃真空干燥条件下64-96小时。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤3所述乙醇的洗脱浓度为10-70％。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1所述水提具体为：按照人参须根和去离子水的质量比为1:5-1:15的比例加入去离子水浸泡过夜，加热至100℃提取1-3小时，提取1-4次，合并上清液。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1所述醇沉具体为：采用50％-85％的乙醇进行沉淀。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1所述水提后、醇沉前还包括浓缩至18～25℃时相对密度为1.005-1.150的步骤。
8.如权利要求1～7任一项所述的提取方法获得的人参提取物。
9.如权利要求1～7任一项所述的提取方法获得的人参提取物在制备抑制酪氨酸酶活性的化妆品、保健品或药物中的应用。
10.如权利要求1～7任一项所述的提取方法获得的人参提取物在制备具有美白功效的化妆品、保健品或药物中的应用。
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