CN108732284A - 一种使用专属性肽段组鉴别对虾的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用专属性肽段组鉴别对虾(Penaeidae)种属的方法，所述专属性肽段组为一组通过单独使用或任意组合使用对对虾(Penaeidae)种属进行鉴别的特征多肽，优选为SEQ ID NO.1—31所示多肽，所述方法具体可为质谱法，本发明可用于鉴别对虾种属中的斑节对虾(Penaeus monodon)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、南美白对虾(Penaeus vannamei)、日本对虾(Penaeus japonicus)、墨吉对虾(Penaeus merguiensis)、和中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)。本发明不受蛋白稳定性和深加工技术的影响，是一种高效准确的鉴定对虾种属的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种使用专属性肽段组鉴别对虾(Penaeidae)种属的方法。
背景技术
对虾(Penaeidae)含丰富的蛋白质和氨基酸，是一种优质的蛋白来源。斑节对虾(Penaeus monodon)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、南美白对虾(Penaeus vannamei)、日本对虾(Penaeus japonicus)、墨吉对虾(Penaeus merguiensis)和中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)是我国常见的虾类，其中，中国对虾、南美白对虾和斑节对虾，又被称为世界养殖产量最高的三大虾类。
不同对虾的风味、营养价值和商业价值不同，但是由于它们的表型相似性，很难用肉眼对其进行区分，加之对虾在工业化生产中经常去除甲壳、头尾等，更增加了区分的难度。随着生活水平的提高，人们对食品营养和风味的要求越来越高，有必要对对虾的品种进行鉴定。
目前，对对虾种属的鉴别方法主要是基于DNA的PCR技术和蛋白质的电泳技术，其中，PCR技术以DNA检测为主，操作步骤繁琐，耗时，费力且昂贵，且经过加工的虾制品中的DNA容易遭到破坏，导致假阴性；在对虾加工过程中易导致蛋白质不稳定，会导致蛋白电泳技术或酶联免疫技术出现假阴性结果。
发明内容
鉴于上述技术的不足，本发明提供一种使用专属性肽段组鉴别对虾的方法该方法采用特征多肽的方法鉴别不同对虾种属，不受蛋白稳定性和深加工技术的影响，是一种高效准确的鉴定对虾种属的方法。
本发明对对虾(Penaeidae)的肽段进行了研究，建立了从多肽水平对对虾进行鉴别的技术，填补了国内对虾鉴别的空白。
本发明首先提供了一组通过单独使用或任意组合使用对对虾(Penaeidae)种属进行鉴别的特征多肽，所述特征多肽为对虾蛋白的低同源性多肽片段，所述低同源性多肽片段指该肽段为斑节对虾(Penaeus monodon)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、南美白对虾(Penaeus vannamei)、日本对虾(Penaeus japonicus)、墨吉对虾(Penaeusmerguiensis)、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)各自独有的，且长度在5～30个氨基酸的多肽片段，所述对虾蛋白选自对虾中的如下蛋白：
蛋白hemocyanin subunit Y、蛋白myosin heavy chain type 2、蛋白myosinheavy chain type 1、蛋白phosphopyruvate hydratase、蛋白myosin heavy chain typea、蛋白myosin heavy chain type b、蛋白arginine kinase、蛋白hemocyanin,partial、蛋白sarcoplasmic calcium-binding protein、蛋白fructose 1,6-biphosphate-aldolasea、蛋白triosephosphate isomerase、蛋白glycogen phosphorylase、蛋白myosin heavychain type 5。
优选的，所述斑节对虾(Penaeus monodon)的特征多肽来源于蛋白hemocyaninsubunit Y，其序列如SEQ ID NO.1所示；
优选的，所述刀额新对虾(Metapenaeus ensis)的特征多肽来源于蛋白myosinheavy chain type 2，其序列如SEQ ID NO.2所示；
优选的，所述南美白对虾(Penaeus vannamei)的特征多肽来源于蛋白myosinheavy chain type 1，其序列如SEQ ID NO.3所示；
优选的，所述日本对虾(Penaeus japonicus)的特征多肽来源于蛋白phosphopyruvate hydratase、蛋白myosin heavy chain type a、蛋白myosin heavychain type b、蛋白hemocyanin subunit Y、蛋白arginine kinase和蛋白hemocyanin,partial，其序列如SEQ ID NO.4—17所示；
优选的，所述墨吉对虾(Penaeus merguiensis)的特征多肽来源于蛋白phosphopyruvate hydratase和蛋白sarcoplasmic calcium-binding protein，其序列如SEQ ID NO.18—19所示；
优选的，所述中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的特征多肽来源于蛋白myosin heavy chain type 1、蛋白fructose 1,6-biphosphate-aldolase a、蛋白myosinheavy chain type 2、蛋白phosphopyruvate hydratase、蛋白arginine kinase、蛋白triosephosphate isomerase、蛋白glycogen phosphorylase、蛋白hemocyanin,partial和蛋白myosin heavy chain type 5，其序列如SEQ ID NO.20—31所示。
所述任意组合为利用SEQ ID NO.1-31所示多肽的任意2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种或全部31种多肽进行组合。
本发明还提供了一种检测对虾(Penaeidae)种属的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液；
(2)通过质谱法检验所述待测多肽滤液中的多肽成分，分析待测样本的质谱结果对比前述任一所述特征多肽的质谱图，当质谱结果中任一所述对虾种属的特征多肽的质谱图时，即可判断该待测样本为该特征多肽相应种属对虾样本或含有相应种属对虾蛋白。
在上述检测对虾(Penaeidae)种属的方法中，所述特征多肽为SEQ ID NO.1—31中任一所示的特征多肽，
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.1所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为斑节对虾(Penaeus monodon)或含有斑节对虾(Penaeus monodon)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.2所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为刀额新对虾(Metapenaeus ensis)或含有刀额新对虾(Metapenaeus ensis)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.3所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为南美白对虾(Penaeus vannamei)或含有南美白对虾(Penaeus vannamei)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.4—17中任一所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为日本对虾(Penaeus japonicus)或含有日本对虾(Penaeusjaponicus)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.18—19中任一所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为墨吉对虾(Penaeus merguiensis)或含有墨吉对虾(Penaeusmerguiensis)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.20—31中任一所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)或含有中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)蛋白。
在上述检测对虾(Penaeidae)种属的方法中，所述质谱法检测中，SEQ ID NO.1所示特征多肽的质荷比(m/z)为770.4；
SEQ ID NO.2所示特征多肽的质荷比为479.8；
SEQ ID NO.3所示特征多肽的质荷比为709.8；
SEQ ID NO.4—17所示特征多肽的质荷比分别为519.3、748.9、887.9、748.9、887.9、415.2、659.8、532.2、480.7、659.8、1060.5、1216.0、493.7、1155.1；
SEQ ID NO.18—19所示特征多肽的质荷比分别为530.3、508.2；
SEQ ID NO.20—31所示特征多肽的质荷比分别为602.8、556.3、473.3、465.3、811.4、805.0、863.4、766.9、659.8、833.9、966.5、599.3。
在上述检测对虾(Penaeidae)种属的方法中，所述的质谱前处理包括如下步骤：
(1)称取均质成粉末状态的对虾样品，加入蛋白提取液提取蛋白，高速低温离心，取上清液转移到EP管中；
(2)取DTT加入到上述蛋白溶液中，60℃反应1小时；
(3)取现配的IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；
(4)采用10K滤膜超滤离心，分三次冲洗滤膜上层蛋白，每次使用碳酸氢铵并超滤离心；
(5)取Trypsin酶溶液加入到上述蛋白溶液中37℃酶解16-18小时；
(6)在10K滤膜上层加入碳酸氢铵，超滤离心，收集下层的肽段滤液，待上机检测；
所述蛋白提取液配方为：8M尿素，50mM NH4HCO3。
在上述检测对虾(Penaeidae)种属的方法中，所述的质谱法检测为：采用AB SCIEX5600检测，
流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈，
流速：0.25mL/min，
梯度洗脱：0～2min,95％A；2～27min,95～80％A；27～37min,80～65％A；37～39min,65～20％A；39～42min,20％A；42～46min,95％A。
TOF扫描范围：350-1500Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。
在上述检测对虾(Penaeidae)种属的方法中，所述的质谱法检测为：采用AB SCIEX5500三重四级杆检测，
流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈，
流速：0.35mL/min，
梯度洗脱：0～0.5min,5％B；0.5～17min,5～35％B；17～17.5min,35～95％B；17.5～20min,95％B；20～20.1min,95～5％B；20.1～25min,5％B，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
本发明还保护上述任一所述的特征多肽在制备用于鉴别对虾(Penaeus monodon)种属的试剂/试剂盒中的应用。
本发明提供了一种用于鉴别对虾(Penaeus monodon)种属的试剂或试剂盒，所述的试剂或试剂盒中包含上述任一所述的特征多肽。
附图说明
图1，VAVTDGDADAAVADLH色谱图
图2，AEGLIQEAK色谱图
图3，QADLEEMLNEAR色谱图
图4，MILPTGATSF色谱图
图5，AAVELDDLHASAER色谱图
图6，TQQELEESEVIVSHF色谱图
图7，AAVELDDLHAS色谱图
图8，TQQELEESEVIVSH色谱图
图9，NAALLAEK色谱图
图10，ADLEAQLSDASAK色谱图
图11，DEFESTAHK色谱图
图12，TLNDFDVH色谱图
图13，AQLSDASAK色谱图
图14，STESGVTVPDVPSIQTLFDK色谱图
图15，DFGDVSSFVNVDPEGQYVISTR色谱图
图16，GTYFPLTGM色谱图
图17，LSNYLDPVDELHWEKPILQ色谱图
图18，IEEELGGNAK色谱图
图19，YGEFPGAFK色谱图
图20，TAEDLQGVEDK色谱图
图21，GYAGDAGLFIK色谱图
图22，TYPEPALR色谱图
图23，LPLVVELF色谱图
图24，LPLVVELFADHPGQS色谱图
图25，AVNNVNTIIAPEIIK色谱图
图26，DFGDVTSFVNVDPEGK色谱图
图27，NVFNEPDQLISEK色谱图
图28，ENVNAEVAESTR色谱图
图29，IGEEWVVHLDQLTK色谱图
图30，IEAGGAGLTEFASATGLPNR色谱图
图31，ELSFQSDEDK色谱图
图32，样品1色谱图
图33，样品2色谱图
图1—33中，纵坐标为Intensity(峰强度)，单位cps(每秒的计数)；横坐标为Retention Time(保留时间)，单位为min(分钟)。
具体实施方式
实施例1，斑节对虾(Penaeus monodon)特异性多肽的序列来源和比对信息
上述多肽SEQ ID NO.1：VAVTDGDADAAVADLH来自于蛋白hemocyanin subunit Y，其在NCBI上的Accesion number是ABR14694.1。经过质谱分析，多肽SEQ ID NO.1：VAVTDGDADAAVADLH在斑节对虾(Penaeus monodon)中有独立响应，且峰形好，强度高，在刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、南美白对虾(Penaeus vannamei)、日本对虾(Penaeusjaponicus)、墨吉对虾(Penaeus merguiensis)和中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)中无响应。
图1是多肽VAVTDGDADAAVADLH在斑节对虾中的色谱图，其m/z为770.4。
实施例2，刀额新对虾(Metapenaeus ensis)特异性多肽的序列来源和比对信息
上述多肽SEQ ID NO.2：AEGLIQEAK来自于蛋白myosin heavy chain type2，其在NCBI上的Accesion number是BAM65722.1。经过质谱分析，多肽SEQ ID NO.2：AEGLIQEAK在刀额新对虾(Metapenaeus ensis)中有独立响应，且峰形好，强度高，在斑节对虾(Penaeusmonodon)、南美白对虾(Penaeus vannamei)、日本对虾(Penaeus japonicus)、墨吉对虾(Penaeus merguiensis)和中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)中无响应。
图2是多肽AEGLIQEAK在刀额新对虾中的色谱图，其m/z为479.8。
实施例3，南美白对虾(Penaeus vannamei)特异性多肽的序列来源和比对信息
上述多肽SEQ ID NO.3：QADLEEMLNEAR来自于蛋白myosin heavy chain type 1，其在NCBI上的Accesion number是BAM65721.1。经过质谱分析，多肽SEQ ID NO.3：QADLEEMLNEAR在南美白对虾(Penaeus vannamei)中有独立响应，且峰形好，强度高，在斑节对虾(Penaeus monodon)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、日本对虾(Penaeusjaponicus)、墨吉对虾(Penaeus merguiensis)和中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)中无响应。
图3是多肽QADLEEMLNEAR在南美白对虾中的色谱图，其m/z为709.8。
实施例4，日本对虾(Penaeus japonicus)特异性多肽的序列来源和比对信息
上述多肽SEQ ID NO.4：MILPTGATSF来自于蛋白phosphopyruvate hydratase，其在NCBI上的Accesion number是AAC78141.1；多肽SEQ ID NO.5：AAVELDDLHASAER、SEQ IDNO.6：TQQELEESEVIVSHF、SEQ ID NO.7：AAVELDDLHAS、SEQ ID NO.8：TQQELEESEVIVSH、SEQID NO.9：NAALLAEK来自于蛋白myosin heavy chain type a，其在NCBI上的Accesionnumber是BAK61429.1；多肽SEQ ID NO.10：ADLEAQLSDASAK、SEQ ID NO.11：DEFESTAHK、SEQID NO.12：TLNDFDVH、SEQ ID NO.13：AQLSDASAK来自于蛋白myosin heavy chain type b，其在NCBI上的Accesion number是BAK61430.1；多肽SEQ ID NO.14：STESGVTVPDVPSIQTLFDK来自于蛋白hemocyanin subunit Y，其在NCBI上的Accesion number是ABR14694.1；多肽SEQ ID NO.15：DFGDVSSFVNVDPEGQYVISTR、SEQ ID NO.16：GTYFPLTGM来自于蛋白argininekinase，其在NCBI上的Accesion number是APU53308.1；多肽SEQ ID NO.17：LSNYLDPVDELHWEKPILQ来自于蛋白hemocyanin,partial，其在NCBI上的Accesion number是AAS92971.1。
经过质谱分析，多肽SEQ ID NO.4：MILPTGATSF、SEQ ID NO.5：AAVELDDLHASAER、SEQ ID NO.6：TQQELEESEVIVSHF、SEQ ID NO.7：AAVELDDLHAS、SEQ ID NO.8：TQQELEESEVIVSH、SEQ ID NO.9：NAALLAEK、SEQ ID NO.10：ADLEAQLSDASAK、SEQ ID NO.11：DEFESTAHK、SEQ ID NO.12：TLNDFDVH、SEQ ID NO.13：AQLSDASAK、SEQ ID NO.14：STESGVTVPDVPSIQTLFDK、SEQ ID NO.15：DFGDVSSFVNVDPEGQYVISTR、SEQ ID NO.16：GTYFPLTGM和SEQ ID NO.17：LSNYLDPVDELHWEKPILQ在日本对虾(Penaeus japonicus)中有独立响应，且峰形好，强度高，在斑节对虾(Penaeus monodon)、刀额新对虾(Metapenaeusensis)、南美白对虾(Penaeus vannamei)、墨吉对虾(Penaeus merguiensis)和中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)中无响应。
图4是多肽MILPTGATSF在日本对虾中的色谱图，其m/z为519.3。
图5是多肽AAVELDDLHASAER在日本对虾中的色谱图，其m/z为748.9。
图6是多肽TQQELEESEVIVSHF在日本对虾中的色谱图，其m/z为887.9。
图7是多肽AAVELDDLHAS在日本对虾中的色谱图，其m/z为748.9。
图8是多肽TQQELEESEVIVSH在日本对虾中的色谱图，其m/z为887.9。
图9是多肽NAALLAEK在日本对虾中的色谱图，其m/z为415.2。
图10是多肽ADLEAQLSDASAK在日本对虾中的色谱图，其m/z为659.8。
图11是多肽DEFESTAHK在日本对虾中的色谱图，其m/z为532.2。
图12是多肽TLNDFDVH在日本对虾中的色谱图，其m/z为480.7。
图13是多肽AQLSDASAK在日本对虾中的色谱图，其m/z为659.8。
图14是多肽STESGVTVPDVPSIQTLFDK在日本对虾中的色谱图，其m/z为1060.5。
图15是多肽DFGDVSSFVNVDPEGQYVISTR在日本对虾中的色谱图，其m/z为1216.0。
图16是多肽GTYFPLTGM在日本对虾中的色谱图，其m/z为493.7。
图17是多肽LSNYLDPVDELHWEKPILQ在日本对虾中的色谱图，其m/z为1155.1。
实施例5，墨吉对虾(Penaeus merguiensis)特异性多肽的序列来源和比对信息
上述多肽SEQ ID NO.18：IEEELGGNAK来自于蛋白phosphopyruvate hydratase，其在NCBI上的Accesion number是AAC78141.1；多肽SEQ ID NO.19：YGEFPGAFK来自于蛋白sarcoplasmic calcium-binding protein，其在NCBI上的Accesion number是BAL72725.1。经过质谱分析，多肽SEQ ID NO.18：IEEELGGNAK和SEQ ID NO.19：YGEFPGAFK在墨吉对虾(Penaeus merguiensis)中有独立响应，且峰形好，强度高，在斑节对虾(Penaeusmonodon)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、日本对虾(Penaeus japonicus)、南美白对虾(Penaeus vannamei)和中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)中无响应。
图18是多肽IEEELGGNAK在墨吉对虾中的色谱图，其m/z为530.3。
图19是多肽YGEFPGAFK在墨吉对虾中的色谱图，其m/z为508.2。
实施例6，中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)特异性多肽的序列来源和比对信息
上述多肽SEQ ID NO.20：TAEDLQGVEDK来自于蛋白myosin heavy chain type 1，其在NCBI上的Accesion number是BAM65719.1；多肽SEQ ID NO.21：GYAGDAGLFIK和SEQ IDNO.22：TYPEPALR来自于蛋白fructose1,6-biphosphate-aldolase a，其在NCBI上的Accesion number是AID61753.1；多肽SEQ ID NO.23：LPLVVELF和SEQ ID NO.24：LPLVVELFADHPGQS来自于蛋白myosin heavy chain type 2，其在NCBI上的Accesionnumber是BAM65720.1；多肽SEQ ID NO.25：AVNNVNTIIAPEIIK来自于蛋白phosphopyruvatehydratase，其在NCBI上的Accesion number是AIG59666.1；多肽SEQ ID NO.26：DFGDVTSFVNVDPEGK来自于蛋白arginine kinase，其在NCBI上的Accesion number是AAV83993.1；多肽SEQ ID NO.27：NVFNEPDQLISEK和SEQ ID NO.28：ENVNAEVAESTR来自于蛋白triosephosphate isomerase，其在NCBI上的Accesion number是ABB81879.1；多肽SEQID NO.29：IGEEWVVHLDQLTK来自于蛋白glycogen phosphorylase，其在NCBI上的Accesionnumber是BAJ23879.1；多肽SEQ ID NO.30：IEAGGAGLTEFASATGLPNR来自于蛋白hemocyanin,partial，其在NCBI上的Accesion number是AAS98887.1；多肽SEQ ID NO.31：ELSFQSDEDK来自于蛋白myosin heavy chain type 5，其在NCBI上的Accesion number是BAN17319.1。
经过质谱分析，多肽SEQ ID NO.20：TAEDLQGVEDK、SEQ ID NO.21：GYAGDAGLFIK、SEQ ID NO.22：TYPEPALR、SEQ ID NO.23：LPLVVELF、SEQ ID NO.24：LPLVVELFADHPGQS、SEQID NO.25：AVNNVNTIIAPEIIK、SEQ ID NO.26：DFGDVTSFVNVDPEGK、SEQ ID NO.27：NVFNEPDQLISEK、SEQ ID NO.28：ENVNAEVAESTR、SEQ ID NO.29：IGEEWVVHLDQLTK、SEQ IDNO.30、IEAGGAGLTEFASATGLPNR和SEQ ID NO.31：ELSFQSDEDK在中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)中有独立响应，且峰形好，强度高，在斑节对虾(Penaeus monodon)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、南美白对虾(Penaeus vannamei)、墨吉对虾(Penaeusmerguiensis)和日本对虾(Penaeus japonicus)中无响应。
图20是多肽TAEDLQGVEDK在中国对虾中的色谱图，其m/z为602.8。
图21是多肽GYAGDAGLFIK在中国对虾中的色谱图，其m/z为556.3。
图22是多肽TYPEPALR在中国对虾中的色谱图，其m/z为473.3。
图23是多肽LPLVVELF在中国对虾中的色谱图，其m/z为465.3。
图24是多肽LPLVVELFADHPGQS在中国对虾中的色谱图，其m/z为811.4。
图25是多肽AVNNVNTIIAPEIIK在中国对虾中的色谱图，其m/z为805.0。
图26是多肽DFGDVTSFVNVDPEGK在中国对虾中的色谱图，其m/z为863.4。
图27是多肽NVFNEPDQLISEK在中国对虾中的色谱图，其m/z为766.9。
图28是多肽ENVNAEVAESTR在中国对虾中的色谱图，其m/z为659.8。
图29是多肽IGEEWVVHLDQLTK在中国对虾中的色谱图，其m/z为833.9。
图30是多肽IEAGGAGLTEFASATGLPNR在中国对虾中的色谱图，其m/z为966.5。
图31是多肽ELSFQSDEDK在中国对虾中的色谱图，其m/z为599.3。
实施例7，对虾样本处理及检测步骤
对待测对虾样本进行分析的步骤包括：
(一)样本前处理步骤：
(1)称取1g均质成粉末状态的对虾样品，加入10mL蛋白提取液(8M尿素，50mMNH4HCO3)震荡提取蛋白，高速低温离心，取上清液转移到EP管中；
(2)取2μL DTT加入到上述蛋白溶液中，60℃反应1小时；
(3)取5μL现配的IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；
(4)采用10K滤膜15000转超滤离心20分钟，分三次冲洗滤膜上层蛋白，每次使用200μL碳酸氢铵并超滤离心；
(5)取Trypsin酶溶液加入到上述蛋白溶液中37℃酶解16-18小时；
(6)在10K滤膜上层加入200μL碳酸氢铵，15000转超滤离心20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。
(二)上机检测：
采用AB SCIEX5600检测，
流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈，
流速：0.25mL/min，
梯度洗脱：0～2min,95％A；2～27min,95～80％A；27～37min,80～65％A；37～39min,65～20％A；39～42min,20％A；42～46min,95％A。
TOF扫描范围：350-1500Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。
采用AB SCIEX三重四级杆检测，
流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈，
流速：0.35mL/min，
梯度洗脱：0～0.5min,5％B；0.5～17min,5～35％B；17～17.5min,35～95％B；17.5～20min,95％B；20～20.1min,95～5％B；20.1～25min,5％B。
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
质谱检测结果对比实施例1-6中的各条特异性多肽的质谱谱图，出现相应实施例1-6任一所述质谱检测谱图时，即可判断该组织样本为相应种属对虾样本。
经进一步鉴定，选取的两个对虾样本中，样品1质谱分析结果符合中国对虾特征肽段质谱图，在斑节对虾、刀额新对虾、南美白对虾、墨吉对虾和日本对虾中无响应，见图32，故样品1为中国对虾样品；样品2质谱分析结果符合日本对虾特征肽段质谱图，在斑节对虾、刀额新对虾、南美白对虾、墨吉对虾和中国对虾中无响应，见图33，故样品2为日本对虾样品。
经核实，上述鉴定结果与送样样本的种属一致。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
序列表
<110> 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种使用专属性肽段组鉴别对虾的方法
<141> 2018-05-29
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Penaeus monodon
<400> 1
Val Ala Val Thr Asp Gly Asp Ala Asp Ala Ala Val Ala Asp Leu His
1 5 10 15
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Metapenaeus ensis
<400> 3
Ala Glu Gly Leu Ile Gln Glu Ala Lys
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Penaeus vannamei
<400> 3
Gln Ala Asp Leu Glu Glu Met Leu Asn Glu Ala Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 4
Gln Ala Asp Leu Glu Glu Met Leu Asn Glu Ala Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 5
Ala Ala Val Glu Leu Asp Asp Leu His Ala Ser Ala Glu Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 6
Thr Gln Gln Glu Leu Glu Glu Ser Glu Val Ile Val Ser His Phe
1 5 10 15
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 7
Ala Ala Val Glu Leu Asp Asp Leu His Ala Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 8
Thr Gln Gln Glu Leu Glu Glu Ser Glu Val Ile Val Ser His
1 5 10
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 9
Asn Ala Ala Leu Leu Ala Glu Lys
1 5
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 10
Ala Asp Leu Glu Ala Gln Leu Ser Asp Ala Ser Ala Lys
1 5 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 11
Asp Glu Phe Glu Ser Thr Ala His Lys
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 12
Thr Leu Asn Asp Phe Asp Val His
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 13
Ala Gln Leu Ser Asp Ala Ser Ala Lys
1 5
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 14
Ser Thr Glu Ser Gly Val Thr Val Pro Asp Val Pro Ser Ile Gln Thr
1 5 10 15
Leu Phe Asp Lys
20
<210> 15
<211> 22
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 15
Asp Phe Gly Asp Val Ser Ser Phe Val Asn Val Asp Pro Glu Gly Gln
1 5 10 15
Tyr Val Ile Ser Thr Arg
20
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 16
Gly Thr Tyr Phe Pro Leu Thr Gly Met
1 5
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> Penaeus japonicus
<400> 17
Leu Ser Asn Tyr Leu Asp Pro Val Asp Glu Leu His Trp Glu Lys Pro
1 5 10 15
Ile Leu Gln
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> Penaeus merguiensis
<400> 19
Ile Glu Glu Glu Leu Gly Gly Asn Ala Lys
1 5 10
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> Penaeus merguiensis
<400> 19
Tyr Gly Glu Phe Pro Gly Ala Phe Lys
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 20
Thr Ala Glu Asp Leu Gln Gly Val Glu Asp Lys
1 5 10
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 21
Gly Tyr Ala Gly Asp Ala Gly Leu Phe Ile Lys
1 5 10
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 22
Thr Tyr Pro Glu Pro Ala Leu Arg
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 23
Leu Pro Leu Val Val Glu Leu Phe
1 5
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 24
Leu Pro Leu Val Val Glu Leu Phe Ala Asp His Pro Gly Gln Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 25
Ala Val Asn Asn Val Asn Thr Ile Ile Ala Pro Glu Ile Ile Lys
1 5 10 15
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 26
Asp Phe Gly Asp Val Thr Ser Phe Val Asn Val Asp Pro Glu Gly Lys
1 5 10 15
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 27
Asn Val Phe Asn Glu Pro Asp Gln Leu Ile Ser Glu Lys
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 28
Glu Asn Val Asn Ala Glu Val Ala Glu Ser Thr Arg
1 5 10
<210> 29
<211> 14
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 29
Ile Gly Glu Glu Trp Val Val His Leu Asp Gln Leu Thr Lys
1 5 10
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 30
Ile Glu Ala Gly Gly Ala Gly Leu Thr Glu Phe Ala Ser Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Asn Arg
20
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> Fenneropenaeus chinensis
<400> 31
Glu Leu Ser Phe Gln Ser Asp Glu Asp Lys
1 5 10
Claims (10)
1.一组通过单独使用或任意组合使用对对虾(Penaeidae)种属进行鉴别的特征多肽，所述特征多肽为对虾蛋白的低同源性多肽片段，所述低同源性多肽片段指该肽段为斑节对虾(Penaeus monodon)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、南美白对虾(Penaeusvannamei)、日本对虾(Penaeus japonicus)、墨吉对虾(Penaeus merguiensis)、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)各自独有的，且长度在5～30个氨基酸的多肽片段，所述对虾蛋白选自对虾中的如下蛋白：
蛋白hemocyanin subunit Y、蛋白myosin heavy chain type 2、蛋白myosin heavychain type 1、蛋白phosphopyruvate hydratase、蛋白myosin heavy chain type a、蛋白myosin heavy chain type b、蛋白arginine kinase、蛋白hemocyanin,partial、蛋白sarcoplasmic calcium-binding protein、蛋白fructose 1,6-biphosphate-aldolase a、蛋白triosephosphate isomerase、蛋白glycogen phosphorylase、蛋白myosin heavychain type 5。
2.根据权利要求1所述特征多肽，其特征在于，所述斑节对虾(Penaeus monodon)的特征多肽来源于蛋白hemocyanin subunit Y，其序列如SEQ ID NO.1所示；
所述刀额新对虾(Metapenaeus ensis)的特征多肽来源于蛋白myosin heavy chaintype 2，其序列如SEQ ID NO.2所示；
所述南美白对虾(Penaeus vannamei)的特征多肽来源于蛋白myosin heavy chaintype 1，其序列如SEQ ID NO.3所示；
所述日本对虾(Penaeus japonicus)的特征多肽来源于蛋白phosphopyruvatehydratase、蛋白myosin heavy chain type a、蛋白myosin heavy chain type b、蛋白hemocyanin subunit Y、蛋白arginine kinase和蛋白hemocyanin,partial，其序列如SEQID NO.4—17所示；
所述墨吉对虾(Penaeus merguiensis)的特征多肽来源于蛋白phosphopyruvatehydratase和蛋白sarcoplasmic calcium-binding protein，其序列如SEQ ID NO.18—19所示；
所述中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的特征多肽来源于蛋白myosin heavychain type 1、蛋白fructose 1,6-biphosphate-aldolase a、蛋白myosin heavy chaintype 2、蛋白phosphopyruvate hydratase、蛋白arginine kinase、蛋白triosephosphateisomerase、蛋白glycogen phosphorylase、蛋白hemocyanin,partial和蛋白myosin heavychain type 5，其序列如SEQ ID NO.20—31所示。
3.一种检测对虾(Penaeidae)种属的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液；
(2)通过质谱法检验所述待测多肽滤液中的多肽成分，分析待测样本的质谱结果对比权利要求1所述特征多肽的质谱图，当质谱结果中任一所述对虾种属的特征多肽的质谱图时，即可判断该待测样本为该特征多肽相应种属对虾样本或含有相应种属对虾蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述特征多肽为SEQ ID NO.1—31中任一所示的特征多肽，
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.1所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为斑节对虾(Penaeus monodon)或含有斑节对虾(Penaeus monodon)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.2所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为刀额新对虾(Metapenaeus ensis)或含有刀额新对虾(Metapenaeus ensis)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.3所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为南美白对虾(Penaeus vannamei)或含有南美白对虾(Penaeus vannamei)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.4—17中任一所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为日本对虾(Penaeus japonicus)或含有日本对虾(Penaeusjaponicus)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.18—19中任一所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为墨吉对虾(Penaeus merguiensis)或含有墨吉对虾(Penaeusmerguiensis)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.20—31中任一所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)或含有中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)蛋白。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述质谱法检测中，SEQ ID NO.1所示特征多肽的质荷比为770.4；
SEQ ID NO.2所示特征多肽的质荷比为479.8；
SEQ ID NO.3所示特征多肽的质荷比为709.8；
SEQ ID NO.4—17所示特征多肽的质荷比分别为519.3、748.9、887.9、748.9、887.9、415.2、659.8、532.2、480.7、659.8、1060.5、1216.0、493.7、1155.1；
SEQ ID NO.18—19所示特征多肽的质荷比分别为530.3、508.2；
SEQ ID NO.20—31所示特征多肽的质荷比分别为602.8、556.3、473.3、465.3、811.4、805.0、863.4、766.9、659.8、833.9、966.5、599.3。
6.根据权利要求3—5中任一所述的方法，其特征在于，所述的质谱前处理包括如下步骤：
(1)称取均质成粉末状态的对虾样品，加入蛋白提取液提取蛋白，高速低温离心，取上清液转移到EP管中；
(2)取DTT加入到上述蛋白溶液中，60℃反应1小时；
(3)取现配的IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；
(4)采用10K滤膜超滤离心，分三次冲洗滤膜上层蛋白，每次使用碳酸氢铵并超滤离心；
(5)取Trypsin酶溶液加入到上述蛋白溶液中37℃酶解16-18小时；
(6)在10K滤膜上层加入碳酸氢铵，超滤离心，收集下层的肽段滤液，待上机检测；
所述蛋白提取液配方为：8M尿素，50mM NH4HCO3。
7.根据权利要求3—6中任一所述的方法，其特征在于，所述的质谱法检测为：采用ABSCIEX5600检测，
流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈，
流速：0.25mL/min，
梯度洗脱：0～2min,95％A；2～27min,95～80％A；27～37min,80～65％A；37～39min,65～20％A；39～42min,20％A；42～46min,95％A。
TOF扫描范围：350-1500Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。
8.根据权利要求3—7中任一所述的方法，其特征在于，所述的质谱法检测为：
采用AB SCIEX 5500三重四级杆检测，
流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈，
流速：0.35mL/min，
梯度洗脱：0～0.5min,5％B；0.5～17min,5～35％B；17～17.5min,35～95％B；17.5～20min,95％B；20～20.1min,95～5％B；20.1～25min,5％B，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
9.权利要求1或2任一所述的特征多肽在制备用于鉴别对虾(Penaeus monodon)种属的试剂/试剂盒中的应用。
10.用于鉴别对虾(Penaeus monodon)种属的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的试剂或试剂盒中包含权利要求1或2所述的特征多肽。
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