CN109293741B - 一种鉴别阿胶及含阿胶制品中马皮源性成分的多肽 - Google Patents
一种鉴别阿胶及含阿胶制品中马皮源性成分的多肽 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一组鉴别阿胶及含阿胶制品中马皮源性成分的多肽，以及使用所述多肽通过质谱法鉴定阿胶及含阿胶制品中马皮源性成分的方法，所述的多肽组中的多肽具有特定的序列结构及特定m/z值(包括特定的母离子和一对子离子)，其序列如SEQ ID NO.1～31所示，所述肽段及其m/z为马皮源胶特有，在驴皮源阿胶、牛皮源、猪皮源、骡皮源熬制胶中未见存在。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一组鉴别阿胶及含阿胶制品中马皮源性成分的多肽及其使用方法。
背景技术
阿胶为马科动物驴的皮，经煎煮、浓缩制成的固体胶，原产自山东省东阿县，至今已有近三千年历史。阿胶是传统的滋补上品、补血圣药，味甘平，入肺、肝、肾经，具有补血止血、滋阴润燥等功效，药食两用，长期服用可补血养血、美白养颜、抗衰老、抗疲劳、提高免疫力，适用人群广泛。李时珍著《本草纲目》载：“阿胶《本经》上品。弘景曰：‘出东阿，故名阿胶’”。阿胶是中药材中典型的最讲究“地道性”的药材，道地阿胶必汲取东阿之水，得传承人之奇秘技艺炼制而成。道地阿胶表面平整，无油气孔，质硬而脆，断面光亮细腻，碎片对光照视呈棕色半透明状，李时珍赞其"黄透如琥珀色，光黑如瑿漆”。
早在1996年就曾曝光过假阿胶事件。时隔多年之后，阿胶造假不仅没有得到遏制，而且越演越烈。这些不法企业利用牛皮、马皮、猪皮下脚料等劣质材料冒充驴皮制作伪劣阿胶，并以次充好向市场销售。
导致阿胶造假事件屡禁不止的一部分原因是缺少鉴定的技术支持，动物皮经过熬制溶解之后，破坏了本身的特性，很难鉴别出动物皮的来源。目前国家也没有有效鉴别阿胶成分的方法，只能靠从生产源头进行控制，以上情况导致了许多不法企业钻空子。
迫切需要一种高效准确鉴定阿胶及含阿胶制品真伪的方法。随着代谢组学技术的发展，利用肽组学直接鉴定动物源成分成为可能。
发明内容
本发明对驴皮阿胶和马皮胶中的多肽进行了研究，并在牛皮胶、猪皮胶、骡皮胶中进行了验证，建立了从多肽水平对阿胶及含阿胶制品中马源性成分进行鉴别的技术，填补了国内外阿胶及含阿胶制品鉴别的空白。
本发明首先涉及一组用于单独或组合检测阿胶及含阿胶制品中马皮源性成分的多肽，所述的含阿胶制品包括但不限于阿胶糕、阿胶膏、阿胶浆、阿胶口服液、阿胶糖、阿胶补血颗粒，所述的多肽的序列为：
肽段1：SEQ ID NO.1：FSFGGSGR；
肽段2：SEQ ID NO.2：GPGGAWAAK；
肽段3：SEQ ID NO.3：EANYIGADK；
肽段4：SEQ ID NO.4：LSFLGEAAR；
肽段5：SEQ ID NO.5：ADQAANEWGR；
肽段6：SEQ ID NO.6：LLSFLGEAAR；
肽段7：SEQ ID NO.7：APEIPNGYVEHLVR；
肽段8：SEQ ID NO.8：TFPGEGSLDGLFHR；
肽段9：SEQ ID NO.9：FSFGGSGR；
肽段10：SEQ ID NO.10：LSFLGEAAR；
肽段11：SEQ ID NO.11：GTWDMLR；
肽段12：SEQ ID NO.12：GIVGEPGPAGSKGESGNK；
肽段13：SEQ ID NO.13：GPPGSAGAPGKDGINGIPGPIGPPGPR；
肽段14：SEQ ID NO.14：GEPGPPGEAGAAGPAGNPGADGQPGAK；
肽段15：SEQ ID NO.15：LLSFLGEAAR；
肽段16：SEQ ID NO.16：FSFGGSGR；
肽段17：SEQ ID NO.17：GPGGAWAAK；
肽段18：SEQ ID NO.18：EANYIGADK；
肽段19：SEQ ID NO.19：LSFLGEAAR；
肽段20：SEQ ID NO.20：APEIPNGYVEHLVR；
肽段21：SEQ ID NO.21：SEGDGVYALNSEK；
肽段22：SEQ ID NO.22：MELETAGR；
肽段23：SEQ ID NO.23：VSLLSDLLPADFK；
肽段24：SEQ ID NO.24：TFPGEGSLDGLFHR；
肽段25：SEQ ID NO.25：HPGSSEPGSDGLQK；
肽段26：SEQ ID NO.26：LLSFLGEAAR；
肽段27：SEQ ID NO.27：VSLLSDLLPADFK；
肽段28：SEQ ID NO.28：LLSFLGEAAR；
肽段29：SEQ ID NO.29：MMEEIVK；
肽段30：SEQ ID NO.30：PVPHGTGSVPESPR；
肽段31：SEQ ID NO.31：IHLISTQTTIPY。
其m/z分别为：
肽段1：407.7；
肽段2：407.7；
肽段3：490.7；
肽段4：482.2；
肽段5：559.2；
肽段6：560.3；
肽段7：532.3；
肽段8：511.6；
肽段9：407.9；
肽段10：482.5；
肽段11：440.0；
肽段12：552.9；
肽段13：808.4；
肽段14：1142.5；
肽段15：539.1；
肽段16：407.9；
肽段17：407.9；
肽段18：491.0；
肽段19：482.5；
肽段20：532.6；
肽段21：685.7；
肽段22：454.0；
肽段23：709.8；
肽段24：511.8；
肽段25：466.1；
肽段26：538.8；
肽段27：709.4；
肽段28：539.1；
肽段29：440.5；
肽段30：473.1；
肽段31：694.3。
31条多肽对应的母离子、部分子离子见下表1，
表1猪皮源性多肽序列及其对应的母离子、部分子离子
本发明所涉及前处理方法包括如下步骤：
(1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液：
(2)通过质谱法检测待测样本的多肽成分，分析样本中的动物皮来源成分。
所述的质谱前处理步骤如下：
(1)将待测样品均质成粉末状态，称取0.1g～0.5g阿胶样品或1.0-2.0g阿胶制品，加入1％NH4HCO3溶液，超声处理10～30min使样品完全溶解，定容至50mL；
(2)溶液过0.22μm滤膜；
(3)取10～20μLTrypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到100μL～200μL上述滤液中，37℃酶解16-18小时，待上机检测。
本发明还涉及两种检测阿胶及其制品的质谱方法，所述的质谱法检测为，
采用AB SCIEX
5600质谱检测，
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈溶液，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
TOF扫描范围：100-3000Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。
采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测，
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
所述的分析样本中的马皮源性成分为，将待测样品的质谱结果对比SEQ ID NO.1～31的各条特异性多肽的质谱谱图，出现SEQ ID NO.1～31的各条特异性多肽的质谱检测谱图时，即可判断该组织样本存在马皮源性成分。
附图说明
图1，在驴皮阿胶中检测SEQ ID NO.1～31所示多肽的色谱特征图
图2，在马皮胶中检测SEQ ID NO.1～31所示多肽的色谱特征图
图3，在牛皮胶中检测SEQ ID NO.1～31所示多肽的色谱特征图
图4，在猪皮胶中检测SEQ ID NO.1～31所示多肽的色谱特征图
图5，在骡皮胶中检测SEQ ID NO.1～31所示多肽的色谱特征图
图6，马皮胶代表性特征肽段在驴皮阿胶中质谱图
图7，马皮胶代表性特征肽段在马皮胶中质谱图
图8，马皮胶代表性特征肽段在牛皮胶中质谱图
图9，马皮胶代表性特征肽段在猪皮胶中质谱图
图10，马皮胶代表性特征肽段在骡皮胶中质谱图
图11，样品1中马皮胶特征肽质谱图
图12，样品1中驴皮阿胶特征肽质谱图
图13，样品2中马皮胶特征肽质谱图
图14，样品2中驴皮阿胶特征肽质谱图
图15，对照品中马皮胶特征肽质谱图
图16，对照品中驴皮阿胶特征肽质谱图
具体实施方式
实施例1，筛选马皮胶特异性多肽
通过质谱分析纯品马皮胶样本和驴皮阿胶样本，利用ProteinPilot软件对质谱结果进行检索比对分析，从而确定最优选的马皮胶专属特征多肽序列。
首先，对选取的纯品胶样本进行质谱分析，步骤包括：
(一)样本前处理步骤：
(1)称取0.1g～0.5g均质成粉末状态的纯品样品，加入1％NH4HCO3溶液，超声处理10～30min使样品完全溶解，定容至50mL；
(2)溶液过0.22μm滤膜；
(3)取10～20μLTrypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到100μL～200μL上述滤液中，37℃酶解16-18小时，待上机检测。
(二)上机检测，
(1)采用AB SCIEX
5600质谱检测方法如下，
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈溶液，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
TOF扫描范围：100-3000Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。
(2)采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测方法如下，
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
其次，依据纯品胶样本的质谱结果，利用ProteinPilot软件对质谱结果进行检索比对分析，筛选得到在马皮胶中确实存在的专属特征多肽组，组中的各条多肽序列信息如下：
肽段1：SEQ ID NO.1：FSFGGSGR；
肽段2：SEQ ID NO.2：GPGGAWAAK；
肽段3：SEQ ID NO.3：EANYIGADK；
肽段4：SEQ ID NO.4：LSFLGEAAR.；
肽段5：SEQ ID NO.5：ADQAANEWGR；
肽段6：SEQ ID NO.6：LLSFLGEAAR；
肽段7：SEQ ID NO.7：APEIPNGYVEHLVR；
肽段8：SEQ ID NO.8：TFPGEGSLDGLFHR；
肽段9：SEQ ID NO.9：FSFGGSGR；
肽段10：SEQ ID NO.10：LSFLGEAAR；
肽段11：SEQ ID NO.11：GTWDMLR；
肽段12：SEQ ID NO.12：GIVGEPGPAGSKGESGNK；
肽段13：SEQ ID NO.13：GPPGSAGAPGKDGINGIPGPIGPPGPR；
肽段14：SEQ ID NO.14：GEPGPPGEAGAAGPAGNPGADGQPGAK；
肽段15：SEQ ID NO.15：LLSFLGEAAR；
肽段16：SEQ ID NO.16：FSFGGSGR；
肽段17：SEQ ID NO.17：GPGGAWAAK；
肽段18：SEQ ID NO.18：EANYIGADK；
肽段19：SEQ ID NO.19：LSFLGEAAR；
肽段20：SEQ ID NO.20：APEIPNGYVEHLVR；
肽段21：SEQ ID NO.21：SEGDGVYALNSEK；
肽段22：SEQ ID NO.22：MELETAGR；
肽段23：SEQ ID NO.23：VSLLSDLLPADFK；
肽段24：SEQ ID NO.24：TFPGEGSLDGLFHR；
肽段25：SEQ ID NO.25：HPGSSEPGSDGLQK；
肽段26：SEQ ID NO.26：LLSFLGEAAR；
肽段27：SEQ ID NO.27：VSLLSDLLPADFK；
肽段28：SEQ ID NO.28：LLSFLGEAAR；
肽段29：SEQ ID NO.29：MMEEIVK；
肽段30：SEQ ID NO.30：PVPHGTGSVPESPR；
肽段31：SEQ ID NO.31：IHLISTQTTIPY。
上述31条多肽的m/z的数值如下：
肽段1：407.7；
肽段2：407.7；
肽段3：490.7；
肽段4：482.2；
肽段5：559.2；
肽段6：560.3；
肽段7：532.3；
肽段8：511.6；
肽段9：407.9；
肽段10：482.5；
肽段11：440.0；
肽段12：552.9；
肽段13：808.4；
肽段14：1142.5；
肽段15：539.1；
肽段16：407.9；
肽段17：407.9；
肽段18：491.0；
肽段19：482.5；
肽段20：532.6；
肽段21：685.7；
肽段22：454.0；
肽段23：709.8；
肽段24：511.8；
肽段25：466.1；
肽段26：538.8；
肽段27：709.4；
肽段28：539.1；
肽段29：440.5；
肽段30：473.1；
肽段31：694.3。
最后，用相同的方法处理并检测驴皮阿胶样本、牛皮胶、猪皮胶、骡皮胶样本，质谱检测结果进行匹配，结果显示，SEQ ID NO.1～31所示的各条多肽样本，在驴皮阿胶、牛皮胶、猪皮胶、骡皮胶中不存在。
图1-5是在驴皮阿胶、马皮胶、牛皮胶、猪皮胶、骡皮胶样本中检测上述多肽SEQ IDNO.1～31的色谱特征图，可见驴皮阿胶、牛皮胶、猪皮胶、骡皮胶样本谱图中未检出SEQ IDNO.1～31所述的色谱峰。
图6-10是马皮胶代表性特征肽段(SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12)分别在驴皮阿胶、马皮胶、牛皮胶、猪皮胶、骡皮胶样本中的质谱图，可见马皮胶代表性特征肽段在马皮胶谱图中明显存在，在驴皮阿胶、牛皮胶、猪皮胶、骡皮胶样本谱图中不存在。
实施例2，检测不特定阿胶样本，判断是否为马皮胶冒充产品
对送检的阿胶及含阿胶制品样本及市售阿胶产品进行质谱分析，确定是否为纯品驴皮阿胶。
对待测样品的处理和检测方法同实施例1中的处理和检测方法
步骤(一)样本前处理步骤：
(1)将待测样品均质成粉末状态，称取0.1的阿胶样品或称取2.0g阿胶制品，加入1％NH4HCO3溶液，超声处理10-30min使样品完全溶解，定容至50mL；
(2)溶液过0.22μm滤膜；
(3)取10μLTrypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到100μL上述滤液中，37℃酶解16-18小时，待上机检测。
步骤(二)上机检测，
采用AB SCIEX
5600质谱检测，
流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，
流速：0.25mL/min，
TOF扫描范围：350-1500Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。
采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测，
流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，
流速：0.3mL/min，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
检测结果对比实施例1中的各条马皮源特异性多肽的质谱谱图，出现实施例1所述质谱检测谱图时，即可判断该组织样本含有马皮源性成分。
经检测：送检的样品中，
样品1为仅检出马皮源性成分，未检出驴皮源性成分：
选取实施例1中的两条马皮胶特征多肽(SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12)和已知的两条驴皮胶特征多肽作为参考，相同的检测条件下，样品1中仅检出选取的两条马皮胶多肽的色谱峰(见图11)，未见驴皮胶特异性多肽色谱峰(见图12)；
样品2既检出驴皮源性成分也检出马皮源性成分：
选取实施例1中的两条马皮胶特征多肽(SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12)和已知两条驴皮胶特征多肽作为参考，相同的检测条件下，样品2中既检出选取的两条马皮胶特征多肽的色谱峰(见图13)，也可见驴皮胶特征多肽色谱峰(见图14)；
对照品仅检出驴皮源性成分，未检出马皮源性成分：
选取实施例1中的两条马皮胶特征多肽(SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12)和已知两条驴皮胶特征多肽作为参考，相同的检测条件下，对照品东阿阿胶出产的桃花姬制品中未检出选取的两条马皮胶特征多肽的色谱峰(见图15)，仅检出驴皮胶特征多肽色谱峰(见图16)。
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用作的本发明保护范围的限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种鉴别阿胶及含阿胶制品中马皮源性成分的多肽
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Phe Ser Phe Gly Gly Ser Gly Arg
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Lys
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ala Asp Lys
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Leu Ser Phe Leu Gly Glu Ala Ala Arg
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ala Asp Gln Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Leu Leu Ser Phe Leu Gly Glu Ala Ala Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ala Pro Glu Ile Pro Asn Gly Tyr Val Glu His Leu Val Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Thr Phe Pro Gly Glu Gly Ser Leu Asp Gly Leu Phe His Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Phe Ser Phe Gly Gly Ser Gly Arg
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Leu Ser Phe Leu Gly Glu Ala Ala Arg
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Gly Thr Trp Asp Met Leu Arg
1 5
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Gly Ile Val Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu Ser Gly
1 5 10 15
Asn Lys
<210> 13
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Ile Asn Gly
1 5 10 15
Ile Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg
20 25
<210> 14
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly
1 5 10 15
Asn Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys
20 25
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Leu Leu Ser Phe Leu Gly Glu Ala Ala Arg
1 5 10
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Phe Ser Phe Gly Gly Ser Gly Arg
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Gly Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Lys
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ala Asp Lys
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Leu Ser Phe Leu Gly Glu Ala Ala Arg
1 5
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Ala Pro Glu Ile Pro Asn Gly Tyr Val Glu His Leu Val Arg
1 5 10
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Ser Glu Gly Asp Gly Val Tyr Ala Leu Asn Ser Glu Lys
1 5 10
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Met Glu Leu Glu Thr Ala Gly Arg
1 5
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Val Ser Leu Leu Ser Asp Leu Leu Pro Ala Asp Phe Lys
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Thr Phe Pro Gly Glu Gly Ser Leu Asp Gly Leu Phe His Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
His Pro Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Asp Gly Leu Gln Lys
1 5 10
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Leu Leu Ser Phe Leu Gly Glu Ala Ala Arg
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Val Ser Leu Leu Ser Asp Leu Leu Pro Ala Asp Phe Lys
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Leu Leu Ser Phe Leu Gly Glu Ala Ala Arg
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Met Met Glu Glu Ile Val Lys
1 5
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Pro Val Pro His Gly Thr Gly Ser Val Pro Glu Ser Pro Arg
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Ile His Leu Ile Ser Thr Gln Thr Thr Ile Pro Tyr
1 5 10
Claims (3)
1.一组多肽组在制备检测阿胶及含阿胶制品中马皮源性成分的检测产品中的应用，所述的含阿胶制品包括阿胶糕、阿胶膏、阿胶浆、阿胶口服液、阿胶糖、阿胶补血颗粒，所述的多肽组的序列为：
肽段9：SEQ ID NO.9：FSFGGSGR；
肽段12：SEQ ID NO.12：GIVGEPGPAGSKGESGNK。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述多肽对应的m/z值及子离子分别为：
肽段9：407.9；
肽段12：552.9；
3.一种检测阿胶及含阿胶制品中是否含有马皮源性成分的检测方法，所述方法包括如下步骤：
步骤(1)，对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液：
步骤(2)，通过质谱法检测步骤(1)获得的多肽滤液，检测待测样本中是否含有权利要求1或2所述肽段的质谱峰；
其中，
步骤(1)所述的对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液的步骤如下：
1)将待测样品均质成粉末状态，称取0.1g～0.5g阿胶样品或1.0～2.0g含阿胶制品，加入1％NH4HCO3溶液，超声处理10～30min使样品完全溶解，定容至50mL；
2)溶液过0.22μm滤膜；
3)取10～20μLTrypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到上述100μL～200μL滤液中，37℃酶解16-18小时，待上机检测；
步骤(2)通过质谱法检验步骤(1)获得的多肽滤液的方法是下述方法A或方法B：
方法A：采用AB SCIEX
5600质谱检测多肽滤液中是否含有权利要求1或2所述的肽段的质谱峰，
上机参数为：
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈溶液，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
TOF扫描范围：100-3000Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10；
方法B：采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测多肽滤液中是否含有权利要求1或2所述的肽段的质谱峰，
上机参数为：
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
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| Development of a Method for Absolute Quantification of Equine Acute Phase Proteins Using Concatenated Peptide Standards and Selected Reaction Monitoring;L. Bundgaard等;《J. Proteome Res》;20140924;第13卷;第5635-5647页 * |
| 特征肽段检测技术用于胶类药材专属性鉴别方法研究;程显隆等;《中国药学杂志》;20150122;第50卷(第2期);第104-108页 * |
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