CN112903791B - 一种基于化学振荡指纹图谱技术鉴定胶类药材的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于化学振荡指纹图谱技术鉴定胶类药材的方法，包括如下步骤：(1)将胶类药材加入酸液中进行酸水解，酸水解完成后向其中加振荡体系溶液混合均匀，然后将混合溶液通过电极与电化学工作站连通，得到化学振荡指纹图谱；(2)对所述的化学振荡指纹图谱进行预处理与特征参数提取，进行主成分分析和或系统相似度分析；(3)建立特征参数与胶类药材的含量的回归关系即成。本发明所述的基于化学振荡指纹图谱技术鉴定胶类药材的方法具有测试步骤简单，特征参数丰富，灵敏度高，检测成本低等特点，为胶类药材的鉴定分析提供了新方法。

Description

一种基于化学振荡指纹图谱技术鉴定胶类药材的方法
技术领域
本发明属于阿胶检测技术领域，尤其是涉及一种基于化学振荡指纹图谱技术鉴定胶类药材的方法。
背景技术
阿胶为马科动物驴的干燥皮或鲜皮配以黄酒、豆油等十几种辅料经煎煮、浓缩制成的固体胶，是我国传统的名贵中药材，有“补血圣药”之美誉。阿胶的主要成分包括蛋白质、多肽、氨基酸及微量元素等，现代药理学研究表明阿胶具有抗疲劳、耐缺氧、提高免疫力等药理作用，受到大量消费者的追捧。
消费者对阿胶的大量需求与驴的数量增长速度严重不对等，使得市场上阿胶乱象加剧。一些不法商贩以牛皮、马皮等原料熬胶冒充阿胶，欺诈消费者。胶类药材均为不同动物的皮熬制的明胶类物质，其外观性状高度相似，所含成分相似性也较高，但是最新研究表明，阿胶里面含有一些其他动物来源皮胶所不具备的特征肽和微量元素等成分，这为阿胶的分析鉴别和质量标准确定提出了更高要求。目前，阿胶的检测方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、凝胶渗透色谱(GPC)等方法。这类测试方法还存在两个突出问题：一、检测成本高，不适宜企业的广泛应用。二、这些方法是针对不同动物来源皮胶中的某几种成分进行分析检测，这种单凭若干个成分的分析指标来对阿胶进行全方位质量控制的方法，极容易给不法商贩提供可乘之机。因此，亟待需要针对阿胶及不同动物来源皮胶开发整体性和综合性的评价方法，以来规避市场乱象，提高胶类药材的质量标准。
化学振荡指纹图谱是一种将被测物质作为整体考虑，从氧化还原活性角度反应被测物质整体特性的指纹图谱分析技术。这种方法可有效避免单一指标质量控制造成的大量物质基础信息丢失，在中药材的整体质控分析中发挥着重要作用。目前，基于化学振荡指纹图谱技术快速鉴别阿胶及不同动物来源皮胶药材的分析应用还比较少。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于化学振荡指纹图谱技术鉴别不同胶类药材的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于化学振荡指纹图谱技术鉴定胶类药材的方法，包括如下步骤：
(1)将胶类药材加入第一酸液中进行酸水解，酸水解完成后向其中加振荡体系溶液混合均匀，然后将混合溶液通过电极与电化学工作站连通，得到化学振荡指纹图谱；
(2)对所述的化学振荡指纹图谱进行预处理与特征参数提取，进行主成分分析和或系统相似度分析；
(3)建立特征参数与胶类药材的含量的回归关系即成。
进一步，所述的步骤(1)中的第一酸液为稀硫酸溶液或稀硝酸溶液中的至少一种；所述的步骤(1)中的酸液的浓度为0.2-1.0mol/L；所述的步骤(1)中的胶类药材与酸液的固液比为(0.005-0.02)：1；所述的步骤(1)中的酸水解步骤的时间为5-120min，温度为55-65℃；
进一步，所述的步骤(1)中的胶类药材与振荡体系溶液的固液比为1：(20-150)；所述的步骤(1)中的振荡体系溶液包括第二酸液、催化剂、耗散物与氧化剂；所述的第二酸液为稀硫酸溶液；所述的催化剂为铜离子溶液、铈离子溶液、锰离子溶液或铁离子溶液中的至少一种；所述的耗散物为丙酮、丙二酸、柠檬酸、丁二酸或双氧水中的至少一种；所述的氧化剂为高氯酸根离子溶液、碘酸根离子溶液、溴酸根离子溶液或溴酸中的至少一种；所述的第二酸液与催化剂、耗散物、氧化剂的体积比为1：(0.75-1)：(0.5-0.75)：(0.25-0.5)；所述的第二酸液的浓度为0.75-2.0mol/L；所述的催化剂的浓度为0.25-1.5mol/L；所述的氧化剂的浓度为0.1-0.4mol/L；所述的步骤(1)中的混合步骤具体为：向水解液中加入第二酸液、催化剂和耗散物，搅拌后加入氧化剂，混合均匀后即成；所述的搅拌步骤具体为：在温度为35-42℃，转速为800-1200r/min的条件下搅拌8-15min。
进一步，所述的步骤(2)中的预处理步骤的方法为：Savitzky-Golay平滑滤波函数、Gauss模糊处理或最小二乘平滑处理中的至少一种；所述的步骤(2)中的特征参数为起始电位、起始电位时刻、诱导时间、最高电位、最高电位时刻、最高电位时刻到诱导期结束时长、振荡期时长、振荡寿命、周期、最大振幅、波动次数、平衡电位、平衡时间、起始振荡时间或起始振荡电位中的至少一种；优选的，所述的特征参数为起始电位、诱导时间、最高电位、振荡寿命、振荡期、周期、最大振幅、波动次数或平衡电位中的至少一种；再优选的，所述的特征参数为诱导时间。
进一步，所述的步骤(1)中的胶类药材经粉碎过筛后加入到酸液中；所述的过筛步骤的筛网的粒径为40-70目；所述的步骤(1)中的电极具体为：以铂丝电极为指示电极，饱和甘汞电极为参比电极；所述的步骤(1)中的化学振荡指纹图谱的记录时间范围为0-15000秒，采样间隔为0.1-0.2秒；所述的步骤(1)中的化学振荡指纹图谱的终止时间为3000-15000秒。
所述的方法在鉴别不同产地的胶类药材中的应用。
所述的产地包括山东、河北、新疆、河南与安徽。
所述的方法在鉴别不同动物来源的胶类药材中的应用。
所述的动物来源包括阿胶、龟甲胶、鹿角胶、新阿胶、黄明胶、马皮熬制的胶与骡子皮熬制的胶。
所述的方法在鉴别不同年份的胶类药材中的应用。
所述的年份为1990-2020年。
所述的方法在胶类药材定量分析中的应用，所述的胶类药材的加入剂量分别与诱导时间和最高电位呈线性关系。
优选的，所述的胶类药材的加入剂量与诱导时间呈线性关系，所述的线性关系具体为：Y＝a1+b1X，其中，X为胶类药材的加入剂量，Y为诱导时间，a1的范围为5000-10000，b1的范围为-6000--12000；所述的胶类药材的加入剂量与最高电位呈线性关系，所述的线性关系具体为：Y＝a2+b2X,其中，X为胶类药材的加入剂量，Y为最高电位，a2的范围为1.0-1.5，b2的范围为-0.1--0.5。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的基于化学振荡指纹图谱技术鉴定胶类药材的方法具有测试步骤简单，特征参数丰富，灵敏度高，检测成本低等特点，为胶类药材的鉴定分析提供了新方法。
本发明所述的基于化学振荡指纹图谱技术鉴定胶类药材的方法不仅可以用于不同动物来源胶类的鉴别，也可以用于不同地区阿胶药材的鉴别分析，且临近四年阿胶样品的起始电位、平衡电位的相对分布较为集中，进一步证实了阿胶药材五年保质期的可靠性。诱导时间和最高电位与阿胶的加入量呈良好的线性关系，为阿胶的定量分析提供了新方法
附图说明
图1为本发明实施例1所述的不同动物来源的胶类药材的化学振荡指纹图谱：曲线A为阿胶药材，曲线B为鹿角胶药材，曲线C为龟甲胶药材；
图2为本发明实施例1所述的不同动物来源的胶类药材的主成分分析示意图；
图3为本发明实施例2所述的不同地区来源的阿胶药材的化学振荡指纹图谱：曲线A为山东地区阿胶药材，曲线B为河北地区阿胶药材，曲线C为新疆地区阿胶药材；
图4为本发明实施例2所述的不同地区来源的胶类药材的主成分分析示意图；
图5为本发明实施例3所述的不同年份的阿胶药材的平衡电位与起始电位的相对分布结果示意图；
图6为本发明实施例4所述的不同阿胶加入量与诱导时间特征参数的线性回归关系示意图；
图7为本发明实施例4所述的不同阿胶加入剂量与最高电位特征参数的线性回归关系示意图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例1中所述的阿胶、龟甲胶和鹿角胶购自山东，年份均为2018年。
本发明实施例2中所述的阿胶的年份均来自于为2018年，产区分别为山东，河北和新疆。
本发明实施例3中所述的阿胶购自山东，年份为2007-2018年。
本发明实施例4中所述的阿胶购自山东，年份为2018年。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1不同动物来源的胶类药材的化学振荡指纹图谱测试与定性判别分析
在温度为55℃时，向三口瓶中加入粉碎过40目筛后的阿胶样本0.4g，再加入0.2mol/L的稀硫酸溶液40mL，进行酸水解反应60min后反应结束。
酸水解步骤结束后，在温度为35℃，转速为800r/min的条件下，向水解液中加入振荡体系溶液：包括0.75mol/L的稀硫酸溶液、0.25mol/L的硫酸铜催化剂溶液、丙酮耗散物、搅拌8min后加入0.1mol/L的溴酸钾氧化剂溶液，所加入的稀硫酸溶液、催化剂、耗散物与氧化剂的体积分别为16mL、12mL、8mL、4mL。以铂丝电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，立即开启电化学工作站，记录化学振荡指纹图谱到14000秒，采样间隔为0.1秒。图1中曲线A为阿胶药材的化学振荡指纹图谱示意图。
在重复上述操作，不同之处在于：将阿胶样本替换为鹿角胶，记录化学振荡指纹图谱调整到5600秒，其他条件不变，得到鹿角胶药材的化学振荡指纹图谱，如图1中B曲线所示。
重复上述操作，不同之处在于：将阿胶样本替换为龟甲胶，记录化学振荡指纹图谱调整到4500秒，其他条件不变，得到龟甲胶药材的化学振荡指纹图谱，如图1中C曲线所示。
对得到的不同动物来源的胶类药材的化学振荡指纹图谱进行最小二乘平滑处理，提取起始电位，起始电位时刻，诱导时间，最高电位，最高电位时刻，最高电位时刻到诱导期结束时长，振荡期时长，振荡寿命，周期，最大振幅，波动次数，平衡电位，平衡时间、起始振荡时间或起始振荡电位中特征参数，对包括起始电位，诱导时间，最高电位，振荡寿命，振荡期，周期，最大振幅，波动次数或平衡电位在内的9个特征参数分别进行主成分分析，图2为不同动物来源的胶类药材的主成分分析示意图。
上述实验表明本方法可以用于不同动物来源的胶类药材的定性判别，区别明显。
实施例2不同地区的胶类药材的化学振荡指纹图谱测试与定性判别分析
在温度为60℃时，向三口瓶中加入粉碎过60目筛后的山东地区阿胶样本0.2g，再加入0.4mol/L的稀硫酸溶液40mL，进行酸水解反应100min后反应结束。
酸水解步骤结束后，在温度为40℃，转速为1000r/min的条件下，向水解液中加入振荡体系溶液：包括1.0mol/L的稀硫酸溶液、0.50mol/L的硫酸铜催化剂溶液、丙二酸耗散物，搅拌10min后加入0.2mol/L的溴酸钾氧化剂溶液，所加入的稀硫酸溶液、催化剂、耗散物与氧化剂的体积分别为8mL、6mL、4mL、2mL。以铂丝电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，立即开启电化学工作站，记录化学振荡指纹图谱到14000秒，采样间隔为0.1秒。图3A为山东地区阿胶药材的化学振荡指纹图谱示意图。
重复上述操作，不同之处在于：将山东地区阿胶样本替换为河北地区阿胶样本，记录化学振荡指纹图谱到8000秒，其他条件不变，得到河北地区阿胶的化学振荡指纹图谱，如图3中B曲线所示。
重复上述操作，不同之处在于：将山东地区阿胶样本替换新疆地区阿胶样本，记录化学振荡指纹图谱到10000秒，其他条件不变，得到新疆地区阿胶的化学振荡指纹图谱，如图3中C曲线所示。
对得到的不同动物来源的胶类药材的化学振荡指纹图谱进行最小二乘平滑处理，提取起始电位，起始电位时刻，诱导时间，最高电位，最高电位时刻，最高电位时刻到诱导期结束时长，振荡期时长，振荡寿命，周期，最大振幅，波动次数，平衡电位，平衡时间、起始振荡时间或起始振荡电位中特征参数，对包括起始电位，诱导时间，最高电位，振荡寿命，振荡期，周期，最大振幅，波动次数或平衡电位在内的9个特征参数分别进行主成分分析，图4为不同地区来源的阿胶药材的主成分分析示意图。
上述实验表明本方法可以用于不同地区来源的阿胶药材的定性判别，区别明显。
实施例3不同年份的胶类药材的化学振荡指纹图谱测试与定性判别分析
在温度为55℃时，向三口瓶中加入粉碎过40目筛后的2007年阿胶样本0.4g，再加入0.2mol/L的稀硫酸溶液40mL，进行酸水解反应60min后反应结束。
酸水解步骤结束后，在温度为35℃，转速为800r/min的条件下，向水解液中加入振荡体系溶液：包括0.75mol/L的稀硫酸溶液、0.25mol/L的硫酸铜催化剂溶液、丙酮耗散物，搅拌8min后加入0.1mol/L的溴酸钾氧化剂溶液，所加入的稀硫酸溶液、催化剂、耗散物与氧化剂的体积分别为16mL、12mL、8mL、4mL。以铂丝电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，立即开启电化学工作站，记录化学振荡指纹图谱到14000秒，采样间隔为0.1秒。
重复上述操作，不同之处在于：将2007年阿胶样本依次替换为2008年、2009年、2010年、2011年、2012年、2013年、2014年、2015年、2016年、2017年与2018年的阿胶样本，其他条件不变，得到不同年份阿胶药材的化学振荡指纹图谱。
对得到的不同年份的阿胶药材的化学振荡指纹图谱进行Savitzky-Golay平滑滤波函数处理，提取起始电位，起始电位时刻，诱导时间，最高电位，最高电位时刻，最高电位时刻到诱导期结束时长，振荡期时长，振荡寿命，周期，最大振幅，波动次数，平衡电位，平衡时间、起始振荡时间或起始振荡电位中特征参数，考察平衡电位与起始电位的相对分布。图5为不同年份的阿胶药材的平衡电位与起始电位的相对分布结果图，据此可以看出不同年份的阿胶药材的差异性，更为重要的是，临近四年阿胶样品的起始电位、平衡电位的相对分布较为集中，这进一步证实了阿胶药材五年保质期的可靠性。
实施例4阿胶药材的定量分析
在温度为60℃时，向三口瓶中加入粉碎过60目筛后的山东地区阿胶样本0.2g，再加入0.4mol/L的稀硫酸溶液40mL，进行酸水解反应100min后反应结束。
酸水解步骤结束后，在温度为40℃，转速为1000r/min的条件下，向水解液中加入振荡体系溶液：包括1.0mol/L的稀硫酸溶液、0.50mol/L的硫酸铜催化剂溶液、丙二酸耗散物，搅拌10min后加入0.2mol/L的溴酸钾氧化剂溶液，所加入的稀硫酸溶液、催化剂、耗散物与氧化剂的体积分别为8mL、6mL、4mL、2mL。以铂丝电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，立即开启电化学工作站，记录化学振荡指纹图谱到14000秒，采样间隔为0.1秒。
重复上述操作，不同之处在于：依次将待测样本的质量调整为0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g。其他条件不变，得到不同加入量的阿胶的化学振荡指纹图谱。
对上述得到的化学振荡指纹图谱进行最小二乘平滑处理，提取起始电位，起始电位时刻，诱导时间，最高电位，最高电位时刻，最高电位时刻到诱导期结束时长，振荡期时长，振荡寿命，周期，最大振幅，波动次数，平衡电位，平衡时间、起始振荡时间或起始振荡电位中特征参数。考察诱导时间和最高电位特征参数与阿胶样品加入剂量的线性关系。图6为阿胶加入剂量与诱导时间特征参数间的线性回归关系，回归方程为Y＝8236.5-9297.6X，(R2＝0.99)，图7为阿胶加入剂量与最高电位特征参数间的回归关系，回归方程为Y＝1.2-0.2X(R2＝0.99)。
上述实验表明本方法可以用于阿胶药材的定量分析，准确度高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于化学振荡指纹图谱技术鉴定胶类药材的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将胶类药材加入第一酸液中进行酸水解，酸水解完成后向其中加振荡体系溶液混合均匀，然后将混合溶液通过电极与电化学工作站连通，得到化学振荡指纹图谱；
（2）对所述的化学振荡指纹图谱进行预处理与特征参数提取，进行主成分分析和/或系统相似度分析；
（3）建立特征参数与胶类药材的含量的回归关系即成；
所述的步骤（1）中的胶类药材与振荡体系溶液的固液比为1：（20-150）；所述的步骤（1）中的振荡体系溶液包括第二酸液、催化剂、耗散物与氧化剂；所述的第二酸液为稀硫酸溶液；所述的催化剂为硫酸铜；所述的耗散物为丙酮或丙二酸；所述的氧化剂为溴酸钾；所述的第二酸液与催化剂、耗散物、氧化剂的体积比为1：（0.75-1）：（0.5-0.75）：（0.25-0.5）；所述的第二酸液的浓度为0.75-2.0 mol/L；所述的催化剂的浓度为0.25-1.5 mol/L；所述的氧化剂的浓度为0.1-0.4 mol/L；所述的步骤（1）中的混合步骤具体为：向水解液中加入第二酸液、催化剂和耗散物，搅拌后加入氧化剂，混合均匀后即成；所述的搅拌步骤具体为：在温度为35-42℃，转速为800-1200 r/min的条件下搅拌8-15 min；
所述的胶类药材为阿胶、龟甲胶、鹿角胶或黄明胶中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（2）中的预处理步骤的方法为：Savitzky-Golay平滑滤波函数、Gauss模糊处理或最小二乘平滑处理中的至少一种；所述的步骤（2）中的特征参数为起始电位、起始电位时刻、诱导时间、最高电位、最高电位时刻、最高电位时刻到诱导期结束时长、振荡期时长、振荡寿命、周期、最大振幅、波动次数、平衡电位、平衡时间、起始振荡时间或起始振荡电位中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的特征参数为起始电位、诱导时间、最高电位、振荡寿命、振荡期时长 、周期、最大振幅、波动次数或平衡电位中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的特征参数为诱导时间。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中的胶类药材经粉碎过筛后加入到酸液中；所述的过筛步骤的筛网的粒径为40-70目；所述的步骤（1）中的电极具体为：以铂丝电极为指示电极，饱和甘汞电极为参比电极；所述的步骤（1）中的化学振荡指纹图谱的时间范围为0-15000秒，采样间隔为0.1-0.2秒；所述的步骤（1）中的化学振荡指纹图谱的终止时间为3000-15000秒。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法在鉴别不同产地的胶类药材中的应用。
7.权利要求1-5中任一项所述的方法在鉴别不同动物来源的胶类药材中的应用。
8.权利要求1-5中任一项所述的方法在鉴别不同年份的胶类药材中的应用。
9.权利要求1-5中任一项所述的方法在胶类药材定量分析中的应用，其特征在于：所述的胶类药材的加入剂量分别与诱导时间和最高电位呈线性关系。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的胶类药材的加入剂量与诱导时间呈线性关系，所述的线性关系具体为：Y= a1+b1X，其中，X为胶类药材的加入剂量，Y为诱导时间，a1的范围为5000-10000，b1的范围为-6000--12000；所述的胶类药材的加入剂量与最高电位呈线性关系，所述的线性关系具体为：Y=a2+b2X,其中，X为胶类药材的加入剂量，Y为最高电位，a2的范围为1.0-1.5，b2的范围为-0.1--0.5。
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